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Summary
ここで提示されるNa+/K+ポンプの役割と、動的クランプを用いたリーチ心臓インターニューロンにおける持続Na+電流の調査方法を示す。
Abstract
Na+/K+ポンプは、しばしば神経活動の背景機能と考え、Na+の内部濃度に応答する外向きの電流(Iポンプ)に寄与する([Na+]i)。リズミカルな動きを生む中心パターン発生器(CPG)ニューロンネットワークのようなバーストニューロンでは、[Na+]iとIポンプは、バーストサイクルを通して変化することが期待できます。この電気的活動への応答性は、膜電位からの独立性と相まって、チャネルベースの電流(例えば、電圧または送信機ゲートまたはリークチャネル)に共通しない動的特性を有するIポンプを与える。さらに、多くのニューロンにおいて、ポンプの活動は様々な変調器によって変調され、リズミカルな破裂活動におけるIポンプの潜在的役割をさらに拡大する。この論文では、モデリングと動的クランプ法の組み合わせを使用して、ポンプの方法と、その持続的なNa+電流との相互作用がCPGのリズミカルな活動に影響を与える方法を示します。具体的には、薬用リーチの心臓インターニューロンにおける動的クランププロトコルと計算モデリング法に焦点を当てる。
Introduction
リーチの心拍は、多くの中半体の分節性神経節に分布する9つの両側対の心臓インターニューロン(HN)からなるCPGによって駆動される。CPGの中核は、半中心発振器(HKO)を形成する第3および 第4の セグメント性神経節に位置するニューロン間の相互阻害対である(図1A)。これらのニューロンは、共分的に単離された薬理学的にビキュリン1を使用すると破裂し続ける。第7の セグメント性神経節(このプロトコルの焦点)のペアのような他のものは、バーバーサでもあり、同種分離時にバースト活動を生じさせることができる。それらは相互に接続されておらず、下降入力のみを受け取るため、神経節を神経コードの残りの部分から切断することによって容易に単離される。この独立したバースト活動は、記録用の鋭い微小電極での浸透によって引き起こされる導入されたリーク電流に敏感であるが、緩いパッチ法1で記録されると激しく破裂する。
個々のHNニューロンとHNHCOの両方がモデル化されている(全ての実験的に同定された電圧ゲート電流及びシナプス電流を含むHNニューロンのホジキン・ハクスリーベースの単一イソポテンシャルコンパートメントモデル)、及び生きているシステムのすべてのバースト特性が正常に捕捉された2。ミオモジュリンは、リーチ中の内因性神経ペプチドであり、孤立したHNニューロンおよびHNHKOのバーストリズムの期間(T)を著しく減少させる。この変調器は、h-電流を増加させる(超分極活性化内流、Ih)とIポンプ3を減少させる作用をする。この観察は、私がポンプがIhとどのように相互作用するか、そしてそれらの共変調がHNニューロンのリズミカルな活動にどのように寄与するかを探求することにつながった。[Na+]iを増加させることによるポンプの活性化(イオノフォアモネンシンを使用)は、HNHKOと単離されたHNニューロン4の両方でHNバーストリズムを高速化する。この高速化はIhに依存していましたが、hがブロックされたとき(2mM Cs+)、バースト期間はこのポンプ活性化の方法によって変更されませんでした。しかし、バースト持続時間(BD)は縮小され、HN HKOと単離されたHNニューロン4の両方でインターバースト間隔(IBI)が増加した。
このプロトコルでは、ポンプ電流を含む生きているHN(7)ニューロンのすべての電流は、次のようにHNモデルに組み込まれています。
(1)
ここでCは膜容量(nF)、Vは膜電位(V)、tは時間(s)である。 詳細なイオン電流の記述と方程式は、他の2,4に記載されています。完全なHNモデルニューロンはリアルタイムで実行されます(図2)。ソフトウェアは公開時にGitHubで利用可能になり、資料一覧に記載されているデジタル信号処理ボードで実行するのに適しています。ここでは、問い合わせの焦点は、Na+/K+ポンプ電流(Iポンプ) と重要な Na+フラックスに寄与する電圧ゲート電流です: 高速 Na+電流 (INa) と持続的な Na+電流 (IP).これらの電流の最大の伝導度 
は、それぞれです。Na+/K+ポンプは、2つの細胞外K+イオンに対して3つの細胞内Na+イオンを交換し、したがって正味の外流を生成する。重要なことに、この電流が示すニューロンの3倍のNa+をポンプで送り出し、これは細胞内Na+濃度を計算するために重要である。
Na+/K+ ポンプ電流は細胞内Na+ 濃度に依存し、以下のシグモイド関数によって表されます。
(2)
ここで[Na]i は細胞内Na+濃度 
、最大Na+/K+ポンプ電流、及び[Na]ihはNa+/K+ポンプの半活性化のための細胞内Na+濃度であり、[Na]はNa+/K+ポンプの感度である。 [Na]Iは 、IPとINaによって運ばれるNa+流入の結果として構築され、Na+/K+ポンプのNa+流出によって減少する。Na+フラックスの合計に対するIhとIリークの寄与は小さく、リアルタイムモデルでは考慮されません。
(3)
ここで、vは細胞内Na+ 貯留層の体積(約6.7pL)であり、Fはファラデーの一定であり、細胞外Na+ 濃度は一定に保たれている。
電圧ゲート付きおよびリーク伝導度は、膜電位に対する応答が分化されており、計算された細胞内Na+濃度によって調節されるポンプ電流とは異なっている([Na+]i)。[ナ+]iは、アクションポテンシャル(スパイク)と、スパイクをサポートする脱分極を提供する持続Na+電流(IP)を生成する高速Na+電流(INa)を介してNa+エントリを介して構築されます。[ナ+]iは、今度は、Na+の押出を通してポンプの作用によって減少する。ベースラインの生きているHN値 
(5nS)と 
(150 nS)が想定されており、追加された動的クランプを考慮に入れます 。
ここで説明するプロトコルの目的は、私が正確かつ可逆的にリアルタイムでポンプを操作して、電圧ゲート電流(電流プロトコル内の持続的なNa+電流)とどのように相互作用するかを発見し、単一のHNsでリズミカルな破裂を制御することです。この目標を達成するために、動的クランプを使用し、これは、モデルの実行中に計算できる電流の正確な量を、コマンドで人為的に導入しました。この方法は、組織全体に影響を与えるポンプの薬理学的操作よりも利点があり、しばしば逆転しにくいオフターゲット効果を有し、正確に操作することができない。動的クランプ5、6は、記録されたニューロンの電圧をリアルタイムで読み取り(図1B)、モデル方程式に基づいて任意の電流量および任意のまたはのいずれかの設定値に基づいて、リアルタイムで、任意の電流量を計算し、注入 
する。同様の方法は、細胞内で記録することができる任意のニューロンに簡単に適用することができます。しかし、パラメーターは選択されたニューロンに再スケールする必要があり、ニューロンはシナプス入力から分離する必要があります, 例えば, 薬理学的.
Protocol
注:無脊椎動物実験対象は、NIHまたはエモリーおよびジョージア州立大学によって規制されていません。それにもかかわらず、この研究で使用されるリーチの苦しみを最小限に抑えるためにすべての措置が講じられました。
1. リーチ神経コードから孤立した神経節7を準備する
- 12:12の明暗サイクルで16°Cで脱イオン水で希釈した人工池水(海塩の0.05%を含む)でヒル ド・ヴェルバナ を脱液に維持します。
- 砕いた氷のベッドで冷たい麻酔をして、動かくなるまで10分間>して解剖のためにリーチを準備します。
- 黒の樹脂張りの解剖皿を、115 mM NaCl、4 mM KCl、1.7 mM CaCl 2、10 mM D-グルコース、および10 mM HEPESを含む冷たい生理食類で〜1cmの深さまで、脱イオン水で充填します。pHは1 M NaOHで7.4に調整した。リーチの裏側を黒い樹脂裏打ち室にピン留めします(少なくとも2cmの厚さの樹脂の上に少なくとも2cmの深さで、少なくとも20cm x 10cm)。
- 斜めの導光灯照明で20倍の倍率でステロ顕微鏡の下で、身体の1/3番目 の部分の胴壁を通して5mmのスプリングハサミで長さ3cm以上の長手切りを行います。ピンを使用して体壁を脇に引っ張り、内臓を露出させます。
注:保存された血液の食事は、火で磨かれたパスツールピペットで吸引することによって除去することができます。 - 個々の中型神経節7(脳に7番目の自由な分節性神経節尾体)を分離する。
- 5mmスプリングハサミを使用して、神経コードが存在する大台を開きます。正気で正気を切り裂き、腹腔を2本の部分に残してください。切断を導き、しなじを保持するために鋭い#5鉗子を使用してください。
- 神経節から出てくる2つの両側神経根のそれぞれに根本の根根を取り付けて(各根にしっかりと付着する)、これらの根本の部分を使用して神経節を固定する。
- 神経節(可能な限り7番目 の神経節から離れた)と鼻のストリップを結ぶ羅門と尾骨結合神経束を切断することによって、体から神経節を取り除き、根を横に切って、根を鼻から出てくる場所に切ります。
- 短いミニットン昆虫ピン、腹側、透明な樹脂が並ぶペトリ皿で、ガングリオン(古い鈍い#5鉗子を使用して)をピン留めします。根と、できるだけ神経節から離れた、根と鼻孔および尾子結合に付着する緩い組織のストリップにピンを挿入します。
注:録音中に下からの良好な照明を達成する場合は、樹脂は3mm以上の厚さにする必要があります。ガングリオンが縦方向にも横方向にも緊張していることを確認してください - 立体顕微鏡の倍率を40倍以上に増やし、神経細胞体が会縁部のすぐ下の神経節の腹側表面に容易に見られるように斜めの照明を調整する。
- マイクロシザーでガングリオン(デシース)のペリネリウムを取り除きます。
- 片側の根の間の緩い鞘を切断して脱皮を開始し、反対側に横方向にカットを続け、はさみ刃を表面的に保ち、鞘の真下の神経細胞体に害を与えないようにします。
- 正線に沿って横切りから同様の表面的なカットを行います。
- 今、細かい#5鉗子で片側の鞘のコードラテラフラップをつかみ、ガングリオンから引き離し、マイクロシザーでそれを遮断します。
- 反対側で繰り返します。この手順は、マイクロ電極で記録するための両方のHN(7)ニューロンを公開します。
- 録音セットアップに準備皿を置き、室温で5mL/分の流量で生理食物でスーパーフューズします。
2. 鋭利な微小電極を用いたリーチ心拍間を識別し記録する
- HN(7)ニューロンの記録(記録は30〜60分の間)の間、デジタルデータ取得(アナログからデジタル、AからD)および刺激(アナログ、DからA)システムを用いて5kHzの速度で、神経生理学的電気計のサンプリングから細胞内電流および電圧トレースを取得し、デジタル化し、 をクリックして、コンピュータの画面に表示します。
注: 商用またはカスタム構築のソフトウェア、および A から D から A へのボードは、データの取得 (A ~ D) に使用できます。D から A へのソフトウェアとカスタム構築ソフトウェアは、動的クランプに必要です。 - 下から暗視野照明を備えた50-100xのステロ顕微鏡の下で、中間神経節7の後方位置にある正準位置によって、両側対のHN(7)ニューロンを暫定的に同定する。
- 今度は、2 M酢酸カリウムと20 mM KClをマイクロマニピュレータを使用して満たされた鋭い微小電極を持つ推定HN(7)ニューロンを貫通することを目指します。
- マイクロ電極をターゲットセル本体の近くに置きます。
- 電計で記録電位を継続的に観察し、ニューロンを貫通する前にこの電位をゼロmVに設定します。
- マイクロ電極でニューロンを貫通し、マニピュレータで長軸に沿って電極をゆっくりと駆動する。電解波機能を使用して、膜電位の負のシフトと活発なスパイク活性が観察されるまで、100 msのバズ持続時間に設定する。
- 3kHz ≥の不連続電流クランプモード(DCC)に電計を設定して膜電位を同時に記録し、単一のマイクロ電極で電流を通過します(容量補償はリングのすぐ下に設定され、10%ダイヤルバックされます)。
- オシロスコープ上のDCC中の電極の沈降を監視します。
- 1~2分間、電気計安定電流インジェクターで-0.1 nAの安定電流を注入し、記録を安定させます。
- 特徴的なスパイク形状と弱い破裂活性によってHN(7)ニューロンを明確に特定する(図1Ci)。
- 実験が完了した後、データ分析をオフラインで実行し、すべてのデータをディスクに保存します。
3. リアルタイムのHNまたは他のモデルニューロンを構築する
- デジタル信号処理ボード(DSB)を使用してカスタムソフトウェアを構築します。D to AおよびA to D)は、他のニューロンまたは実験のために2、4または異なるモデル電流に記載されているモデル電流をリアルタイムで実装するデスクトップコンピュータで。
- モデル電流を表現する一般的に好ましい方法として、ホジキン-ハクスリースタイル方程式を使用します。
- ポンプ電流を追加する前のリアルタイムHNモデルとダイナミッククランプの実装の詳細については、7 を参照してください。HNモデルにおける生きているHN(7)ニューロンの電流、細胞内Na+ 濃度、および伝導度の説明については、導入セクションを参照してください。
4. ダイナミッククランプのコンダクタンス/電流を実装し、変化
- DSB 用のカスタムメイドのダイナミック クランプ ソフトウェアを使用して、グラフィカル ユーザ インターフェイス (図 3) (GUI) でアクセス可能なプログラムされたコンダクタンスと HN(7) ニューロンの HN リアルタイム モデルの電流をリアルタイムで動的クランプで実装および変更します。
注:リマインダーとして
、 
および持続Na+ 電流(IP)と最大ポンプ電流(Iポンプ)の最大の伝導度です。 - ソフトウェアの GUI 入力ボックスを使用して、モデルの実行中に (PumpMaxL ボックス) および (GpinHNLive ボックス) (図 3)を変更します。
注: GUI 入力ボックスは型指定された値を受け入れ、0.1 nA のステップを推奨 し、1 nS のステップを推奨 します。- 図1Ciiに示すように、微小電極誘発リークによって弱まるHN(7)ニューロンの破裂を安定させるために、少量のダイナミッククランプを加える。
注:鋭い微小電極の貫通は、漏れ伝導度の増加または入力抵抗の低下として表現される膜損傷を引き起こします。 - マイクロ電極誘発リークを補う0.1-0.2 nAの値を加算することから始めるが、興奮性を低下させ、その後徐々に増加し 、通常の破裂が続くまで、興奮性が増加し、通常は ~1-4 nSである(図4A)。
- 動的クランプを使用して記録されたHN(7)ニューロンにこれらの電流(0.1 nAの増分と1 nSの増分)を体系的に共に変化 させ、バースト特性に及ぼす影響を評価する:スパイク周波数(f:バースト中のインタースパイク間隔の平均の逆数)、インターバースト間隔(IBI:次のバーストの最初のスパイクまでの最後のスパイク間の時間) バースト期間(BD:バーストの最初のスパイクとバーストの最後のスパイクの間の時間)、バースト期間(T:バーストの最初のスパイクと後続のバーストの最初のスパイクの間の時間)。
- と の値 を変更して、ビデオ デモのように、この手法に慣れてから、冒険を始めます。
- 特定の固定値で保持し、通常のバースト活動をサポートする範囲にわたって 1 nS 単位でスイープ します。
- 0.1 nA の固定値を増やし、定期的なバースト活動をサポートする範囲を再びスイープ します。
- 実装されたパラメータペアごとに、少なくとも8つのバーストを含むデータを収集して、f、IBI、BD、およびTの信頼性の高い平均測定値を作成できるようにします。
- 強いスパイクと振動の安定したベースライン電位によって評価されるように、ニューロンが生存可能である限り、スイープを続けます。
- 複数のニューロンからデータを収集 (異なる動物から) 合成グラフを生成する (図 5)。
- と の値
Representative Results
Iポンプ4を追加したモデリングは、導入部で提示された実験所見をより鋭い焦点に持ち込み、破裂のポンプ支援機構を説明し始めた。ここで示したリアルタイムモデルは、 実験で観察された正常な活動の範囲内に位置する定期的なリズミカルな活動(f、IBI、BD、T)を生成し、ミオモジュリン変調パラメータ (最大ポンプ電流)および 
(h電流の最大伝導率)がモデル内で変化または共変されたときにそのような活動を引き続き生成するように調整されています(およびパラメータを選択しました)。決定されたパラメータ値は、モデリング実験のベンチマークまたは正規セットとして使用できます。これらのモデルインスタンスでは、ベースラインレベルの周りに [Na+]iとしてバーストサイクル全体を通して振動をポンプで送ります。私はバーストフェーズ中にバースト終了に寄与するポンプ、およびそれが生成する超分極はIBI中にIhを活性化します。バースト開始に近いIhの最大レベルに注意してください(図2)。
リアルタイムの HN モデルは、動的クランプに使用可能な電流2、4を実装していますが、ここでのフォーカス は、 動的クランプ GUI でモデルが実行されている間に変更に使用できます (図3)。ダイナミッククランプにより、実験者は 、実際のコンダクタンスまたは電流の電圧とイオン依存を模倣する任意のコンダクタンスまたは電流を人工的にニューロンに加算(または負または負で減算)することができます。したがって、特定のコンダクタンス/電流が細胞内の内因性の伝導度/電流とどのように相互作用するかを完全に調べることができます(図1)。リアルタイムHNモデルは、HNニューロンにおける持続的なNa+電流(IP)がNa+i(図2)に強く影響を及ぼすNa+エントリの多くを寄与していることを示し、したがって、私はポンプする。IPは比較的陰性の膜電位で活性であるので、IBI中でもポンプに反対する。
これらの観察は、 前に8,9,10で説明したように、動的クランプを用いて孤立したHNニューロンとの相互作用を探索することが有益であることを示しています。これらの実験(進行中)は、単一の同種分離HN(7)ニューロン(神経コードから切断された7番目の神経節)で鋭い微小電極記録で行われる。現在までに、これらの実験は、I PとIポンプを動的クランプで共加することにより、(微小電極浸透導入リークによる)トーン的に活性なHNニューロンで堅牢なバーストが回復することを示している(図4)。これは、IポンプとI Pの相互作用から生じる(リークが損なわれた場合でも)これらのニューロンでバーストメカニズムが利用可能であることを示す重要な観察である。予備的な結果は、モデルと実験で探求することができる強力な複雑な相互作用を示しています(図5)。
結論として、バースト活動中の[Na+]iの周期的な増加に応じてポンプを行い、バースト終了(BDの減少)を通してバーストリズムに寄与する。IPとIポンプの相互作用は、内因性の破裂活性をサポートするのに十分なメカニズムを構成する。このメカニズムは、神経節7で細胞内に記録されたHNインターニューロンにおける堅牢な破裂を復活させることができる。[Na+] を介してIPとIポンプの相互作用は、HN バースト期間に非単調に影響し、自律バーストの堅牢性を保証します。これらの結論は、脊椎動物システム11,12における実験とモデリングと一致している。
図1:リーチ心臓ニューロンの電気活動とIポンプとI Pの動的クランプによる実装(A)は、細胞外(上)および細胞内(下)に、第3の神経節からのリーチ心拍HCOにおいて、記録されたニューロンおよびそれらの相互阻害性シナプス結合の概略である。(B) 孤立した神経節 7 で HN(7) インターニューロンを記録する場合の動的クランプ回路図。2 つの HN(7) インターニューロン間にシナプス相互作用はありません。(Ci)漏れ損HN(7)インターニューロンで破裂。(Cii)より堅牢なバーストは、 マイクロ電極誘導漏れを補う動的クランプIポンプ(=0.1 nA)を加えることによって生成することができますが、興奮性を 低下させ、(1 nS)、興奮性を高める。黒い破線はベースライン値を示します。略語: HN = 心臓インターニューロン;HCO = ハーフセンターオシレータ;私はポンプ=外向き電流;IP =持続的な Na+電流;= 最大 Na+/K+ポンプ電流; = 持続Na+電流の最大コンダクタンス;Vm = 膜電位;[ナ+]i = Na+の内部濃度。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:膜電位(Vm)の痕跡を示す単一HNインターニューロンモデル、Ih、Iポンプ、[Na+]i、およびI P.外向きの過分極電流は陰性であり、内向きの脱分極電流は正である。黒い破線はベースライン値を示します。略語: HN = 心臓インターニューロン;私はポンプ=外向き電流;IP =持続的な Na+電流;= 最大 Na+/K+ポンプ電流;Ih =超分極活性化内流れ;= 持続Na+電流の最大コンダクタンス; = 超分極活性化内流の最大伝導;Vm = 膜電位;[ナ+]i = Na+の内部濃度。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:リアルタイム心臓インターニューロン(HN)モデルのグラフィカルユーザーインターフェースとデジタル信号処理ボードに実装されたダイナミッククランプ 左上:赤の数学ボックスはリアルタイムモデルのユーザー定義のパラメータボックスで、Blue Liveボックスは動的クランプで使用されるユーザー定義のパラメータボックスです。El = リーク電流の反転電位;Gl = リークコンダクタンス;Gh = h-current 最大コンダクタンス;Gp = P電流最大コンダクタンス;GCaS = 遅いカルシウム電流最大伝導;ポンプマックス=ポンプの最大電流;[GSyn2 それぞれのニューロンへの最大シナプス伝導率;シナプスポテンシャルを媒介するためのThreshSyn2スパイク交差閾値 - これらは、ハイブリッド(リビング/モデル)ハーフセンターオシレーターを作るために使用されます。ダイナミッククランプの左下。一番左には、動的クランプ変数の5計算値があります: 私はポンプ=ポンプ 電流注入。Ih = h-current が注入された (ここでは使用されません);IP = P 電流が注入されました。NaI = 計算された内部 Na+ 濃度;ENa = 計算されたナトリウム逆転電位。ダイナミッククランプの左下。計算変数の右側には、6ユーザーが決定したパラメータボックスがあります:GNa =アクション電位に関連するNa+ フラックスを計算するために、想定された内因性高速ナトリウム最大伝導率の使用。PumpMaxL = 動的クランプによって注入される最大ポンプ電流;ナイは方程式(2)を参照してください。H = ダイナミッククランプによって注入されるh電流を決定する最大コンダクタンス;Gp = 想定内因性 P 電流最大コンダクタンス使用で、内因性 P 電流に関連する Na+ フラックスを計算します。GpinHNLive = ダイナミッククランプによって注入されるP電流を決定する最大コンダクタンス。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:独立HN(7)バーストの動的クランプ解析(A)4.0nSから(B)9.0nSのアップレギュレーションは、独立したHNバーストリズムを遅くする。実験的なトレースは、動的クランプを有する孤立したHN(7)ニューロンにおけるリズミカルな破裂を示す。[Na+]iと Vm の振動の範囲は、アップレギュレートと共に増加 します。トレース上から下へ:記録されたVm、注入されたIポンプ、計算[Na+]i、および注入されたIP.黒い破線はベースライン値を示します。略語: HN = 心臓インターニューロン;私はポンプ=外向き電流;IP =持続的な Na+電流;= 最大 Na+/K+ポンプ電流; = 持続Na+電流の最大コンダクタンス;Vm = 膜電位;[ナ+]i = Na+の内部濃度。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:独立HN(7)バーストの動的クランプ解析 のアップレギュレーション は減少する傾向が、続いてHNバースト期間が増加する。動的クランプを使用した個々の実験(線で接続されたポイント)では、 値を一定に保持しながら値 をスイープした。色は、異なる 実験で使用される追加された異なる定数レベルを表します。略語: HN = 心臓インターニューロン; = 最大 Na+/K+ ポンプ電流; = 持続Na+ 電流の最大コンダクタンス。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
モデリング、動的クランプ、およびそれらが可能になる結果の分析は、個々およびイオン伝導度/電流のグループがニューロンの電気的活動にどのように寄与するかを探索するのに有用な技術である(図1、図2、図4、および図5)。これらの技術の使用は、Na+/K+ポンプ電流(Iポンプ) が電圧ゲート電流、特に持続性Na+電流(IP)と相互作用して、リーチハートビートパターンジェネレータのコアHNにおける堅牢な破裂を促進する方法を示しています。動的クランプ実験とモデリングを組み合わせることで、通常の電圧記録や電流クランプ技術で可能な限り直接的にモデルをテストすることが可能です。ダイナミッククランプ実験から得られた結果(図5)を用い、HNモデルをさらに改良します。ここで示す動的クランプの基本的な方法は、ニューロン電流の数学的モデルを電圧クランプ実験で決定できる場合、研究中のニューロンの特性を反映するようにカスタマイズすることができます。
ここで示すタイプの実験を成功させるには、鋭利な微小電極を用いた場合にHNまたは他のニューロンの入念な不形成が必要であり、電極浸透1によって強い破裂が抑制されるためである。(全細胞パッチ記録技術は、導入されたリークを最小限に抑え、他のニューロンにも適用可能ですが、リーチニューロンではうまく機能しません。HNニューロンの障害がニューロンへの損傷を最小限に(追加リーク)させ、入力抵抗を監視し、実験を成功させるためには60-100MOhmsの範囲になければならないことが重要である。
動的クランプは強力な技術であるが、人工的なコンダクタンスは記録電極の部位で実施されるため、ニューロン幾何学によって課される限界がある。リーチHNニューロンでは、細胞体は、ほとんどの活性電流が局在するニューロンの統合ゾーン(主神経突起)に電気的に近く、スパイクが開始される。
Disclosures
何一つ
Acknowledgments
我々は、その破裂能力を実証したHN(7)ニューロンの予備的な動的クランプ実験のためのクリスチャン・エルクスレーベンに感謝する。アンジェラ・ウェニングは専門家のアドバイスで実験を支援しました。我々は、グラント1 R21 NS111355を通じてGSCおよびRLCに資金を提供したNIHを認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANIMALS | |||
| Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
| CHEMICALS | |||
| ARTIFICIAL POND WATER | |||
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
| glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
| Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
| NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
| MICROELECTRODES | |||
| K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
| SALINE | |||
| EQUIPMENT | |||
| #5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
| AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
| Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
| Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
| Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
| Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
| Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
| Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
| Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
| Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
| Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
| Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
| Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
| Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
| Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
| Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
| Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
| pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
| Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
| Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
| Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
| Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |
References
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生物学,課題171,リーチ,変調,無脊椎動物中央パターンジェネレータCPG,Na+/K+ポンプ,h電流,持続Na+電流Erratum
Formal Correction: Erratum: Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses
Posted by JoVE Editors on 07/28/2021.
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An erratum was issued for: Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses. An author name was updated.
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Ricardo Javier Erazo Toscano
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Ricardo Javier Erazo-Toscano
