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Biology

थाइमिडीन एनालॉग बीआरडीयू का उपयोग करके चूहों में सेलुलर प्रसार और न्यूरोजेनेसिस का विश्लेषण करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री तकनीक

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61483
Automatic Translation
*1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, *1
1Laboratorio de Neurociencias, Departamento de Psicología, Universidad Iberoamericana Ciudad de México, 2Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma del Estado de México
* These authors contributed equally

Summary

यह पेपर चूहों में वयस्क न्यूरोजेनेसिस को मापने के लिए बीआरडीयू सकारात्मक कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए सबसे आम तकनीकों में से चार प्रस्तुत करता है। इस काम में अभिकर्मक तैयारी, थाइमिडीन एनालॉग प्रशासन, ट्रांसकार्डियल छिड़काव, ऊतक तैयारी, पेरोक्सीडेज इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रतिक्रिया, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, सिग्नल प्रवर्धन, काउंटरस्टेनिंग, माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और सेल विश्लेषण के निर्देश शामिल हैं।

Abstract

वयस्क हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनेसिस (एएचएन) के क्षेत्र में सबसे महत्वपूर्ण चीजों में से एक नई उत्पन्न कोशिकाओं की पहचान है। थाइमिडीन एनालॉग्स (जैसे 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडिन (बीआरडीयू)) का इम्यूनोडिटेक्शन एक मानक तकनीक है जिसका उपयोग इन नई उत्पन्न कोशिकाओं की कल्पना के लिए किया जाता है। इसलिए, बीआरडीयू को आमतौर पर छोटे जानवरों में इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया जाता है, इसलिए थाइमिडीन एनालॉग डीएनए संश्लेषण के दौरान विभाजित कोशिकाओं में शामिल हो जाता है। मस्तिष्क स्लाइस के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण द्वारा पता लगाया जाता है। इस तकनीक का उपयोग करने वाले प्रत्येक शोध समूह इस बात की सराहना कर सकते हैं कि एक सफल दाग प्राप्त करने के लिए मिनट विवरणों पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, एक महत्वपूर्ण कदम एचसीएल के साथ डीएनए विकृतीकरण है, जो इसे दागने के लिए सेल नाभिक तक पहुंचने की अनुमति देता है। हालांकि, मौजूदा वैज्ञानिक रिपोर्टों में ऐसे बहुत कम चरणों का विस्तार से वर्णन किया गया है। इसलिए, तकनीक को मानकीकृत करना नई प्रयोगशालाओं के लिए चुनौतीपूर्ण है क्योंकि सकारात्मक और सफल परिणाम देने में कई महीने लग सकते हैं। इस काम का उद्देश्य थाइमिडीन एनालॉग बीआरडीयू के साथ काम करते समय विस्तार से इम्यूनोस्टेनिंग तकनीक के सकारात्मक और सफल परिणामों को प्राप्त करने के लिए चरणों का वर्णन और विस्तृत करना है। प्रोटोकॉल में अभिकर्मक तैयारी और सेटअप, कृंतक में थाइमिडीन एनालॉग का प्रशासन, ट्रांसकार्डियल छिड़काव, ऊतक तैयारी, पेरोक्सीडेज इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रतिक्रिया, एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स का उपयोग, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, काउंटरस्टेनिंग, माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और सेल विश्लेषण शामिल हैं।

Introduction

यह विचार कि पूरे जीवनकाल में वयस्क मानव मस्तिष्क में नए न्यूरॉन्स उत्पन्न होते हैं, दशकों से वैज्ञानिक समुदाय को मोहित किया है। यह ज्ञान कि मस्तिष्क अपने पूरे जीवनकाल में नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करता है, विभाजन 1,2 के तहत कोशिकाओं का पता लगाने के माध्यम से प्राप्त किया गया था। वयस्क मस्तिष्क में नए उत्पन्न न्यूरॉन्स का पता लगाने की पहचान पहली बार चूहों में इंट्राक्रैनियल रूप से ट्राइटाइज्ड थाइमिडीन (थाइमिडाइन-एच 3) को इंजेक्ट करके और ऑटोरेडियोग्राम 1,2 द्वारा सेल चक्र में कोशिकाओं का पता लगाकर की गई थी। ग्लिया के कोशिका विभाजन और न्यूरोब्लास्ट्स की उपस्थिति की सूचना दी गई थी, जो प्रसवोत्तर न्यूरोजेनेसिस1 पर पहला आशाजनक डेटा था। फिर भी, थाइमिडीन-एच 3 के उपयोग और पता लगाने से रेडियोधर्मिता का उपयोग निहित होता है, जो इसे प्रबंधित करने वाले लोगों के लिए हानिकारक हो सकता है। तंत्रिका तंत्र में कोशिकाओं के प्रसार, प्रवासन और उत्पत्ति के अध्ययन में बीआरडीयू इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की उपयुक्तता की जांच करने वाला पहला प्रयास 1988 में मिलर और नोवाकोव्स्की3 द्वारा दिखाई दिया। 1998 में, एरिक्सन और सहयोगियों द्वारा प्रकाशित एक पेपर से पता चला कि 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (बीआरडीयू)4 के साथ इंजेक्ट किए गए रोगियों के मानव वयस्क मस्तिष्क में नए न्यूरॉन्स पोस्टमॉर्टम की कल्पना की गई थी। इन रोगियों को ट्यूमर4 के विकास को लेबल करने के लिए बीआरडीयू इंजेक्शन (250 मिलीग्राम अंतःशिरा) प्राप्त हुआ। इस तकनीक को पशु मॉडल में अपनाया गया था। इन विधियों की शुरूआत ने क्षेत्र के लिए एक मील का पत्थर चिह्नित किया क्योंकि इसने रेडियोधर्मी यौगिकों के उपयोग के बिना नई उत्पन्न कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति दी। यह प्रक्रिया क्षेत्र में आगे के शोध को बढ़ावा देने के लिए वयस्क मस्तिष्क niches में सेल प्रसार को मापने के लिए स्वर्ण मानक बन गई।

थाइमिडीन एनालॉग तकनीक की सीमा यह है कि यह नई उत्पन्न कोशिकाओं के लिए सेलुलर पहचान के निर्धारण की अनुमति नहीं देता है। हालांकि, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री हमें एक ही सेल की डबल- या ट्रिपल-लेबलिंग तकनीक करने की अनुमति देता है, जो नई उत्पन्न कोशिकाओं के सेलुलर भाग्य और यहां तक कि परिपक्वता के उनके चरणों को मान्य करता है, जिससे क्षेत्र का और विकास होता है। इस विधि को नई उत्पन्न कोशिकाओं को ग्लिया, अविभाजित न्यूरॉन्स, या पूरी तरह से परिपक्व दानेदार कोशिका में अलग करने की विशेषता थी, और यहां तक कि यह निर्धारित करने के लिए कि क्या वे सर्किटरी में सक्रिय रूप से भाग ले रहे हैं। क्षेत्र में एक और सफलता नेस्टिन के डोमेन के तहत उदासीन कोशिकाओं की पहचान करने के लिए ट्रांसजेनिक मॉडल का उपयोग था। नेस्टिन-जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहे एक उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करते हैं, जो नेस्टिन प्रमोटर के नियंत्रण में है। नेस्टिन एक मध्यवर्ती फिलामेंट है जो पूर्वज कोशिकाओं5 की विशेषता है। नेस्टिन-जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों ने न्यूरोजेनेसिस 6 में शामिल प्रारंभिक विकासचरणों को स्थापित करने की अनुमति दी। हालांकि, एक महत्वपूर्ण सीमा एक प्रयोगशाला सुविधा में विशेष परिस्थितियों में नेस्टिन-जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों की कॉलोनी को बनाए रखने में सक्षम होना है जो कुछ वैज्ञानिक समूहों, विशेष रूप से विकासशील देशों के लिए लागत प्रभावी हो जाता है।

ऊपर बताई गई तकनीकों के फायदे और नुकसान हैं। हालांकि, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा प्रसार कोशिकाओं की पहचान और सेल परिपक्वता चरण या सेल भाग्य की पहचान करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा डबल- या ट्रिपल-लेबलिंग तकनीक करने की संभावना वयस्क न्यूरोजेनेसिस को मापने का अब तक का सबसे व्यवहार्य तरीका है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके पहचान प्रक्रिया में प्रोटीन, प्रोटीन डोमेन या न्यूक्लियोटाइड को एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल करना शामिल है जो प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में जाना जाता है। उत्तरार्द्ध को द्वितीयक एंटीबॉडी द्वारा पहचाना जाता है, जिसे द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ युग्मित क्रोमोजेन (जैसे, हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज) या फ्लोरोक्रोम (जैसे, एफआईटीसी) के साथ चिह्नित किया जाता है। माइक्रोस्कोप क्रोमोजेन्स और फ्लोरोक्रोम सिग्नल दोनों का पता लगा सकते हैं। आईएचसी का उपयोग करके, झिल्ली प्रोटीन, साइटोस्केलेटन प्रोटीन, या बीआरडीयू जैसे परमाणु घटकों की पहचान करना संभव है। दूसरी ओर, बीआरडीयू सेलुलर नाभिक में पाया जा सकता है क्योंकि यह प्रतिस्पर्धा द्वारा एस-चरण के दौरान डीएनए में शामिल होता है। इसलिए, एक महत्वपूर्ण कदम एचसीएल के साथ डीएनए विकृतीकरण है, जो डीएनए के भीतर बीआरडीयू एंटीबॉडी को बीआरडीयू तक पहुंच की अनुमति देने के लिए डीएनए बॉन्ड खोलता है। यह जानना आवश्यक है कि बीआरडीयू चूहों और चूहे के सीरम में क्रमशः 15 और 60 मिनट के लिए संतृप्त एकाग्रता में मौजूद है, इंट्रापरिटोनियल प्रशासन के बाद, फिर क्रमशः 60 और 120 मिनट पर अज्ञात स्तर तक तेजी सेगिरता है।

यहां, हम चार अलग-अलग लेकिन निकटता से संबंधित आईएचसी तकनीकों का वर्णन करते हैं: सिग्नल प्रवर्धन (चरण 4.1), एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (एबीसी) प्रवर्धन (चरण 4.1), सिग्नल प्रवर्धन के बिना अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन (चरण 4.4) और लेबल स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन (एलएसएबी) प्रवर्धन (चरण 4.3) के साथ हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) प्रतिक्रिया का उपयोग करके क्रोमोजेनिक अप्रत्यक्ष पहचान। प्रत्येक विधि के फायदे और नुकसान हैं और विशिष्ट ऊतक आवश्यकताओं के लिए उपयोगी हो सकते हैं ( तालिका 1 देखें)। हमने असंगत प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय क्रोमोजेनिक से फ्लोरोसेंट डिटेक्शन विधियों में बदलाव करने के लिए उनकी सामर्थ्य और सादगी के कारण अप्रत्यक्ष आईसीएच विधियों का पालन करने का फैसला किया। एचआरपी दृष्टिकोण इसकी सामर्थ्य, उच्च स्थिरता, उच्च टर्नओवर दर और सब्सट्रेट्स की पूर्ण उपलब्धता के कारण आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली आईएचसी विधि है। फिर भी, हम यह पुष्टि करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करने की सलाह देते हैं कि धुंधला विधि सटीक रूप से काम करती है और एंटीबॉडी फ़ंक्शन का प्रभावी ढंग से परीक्षण करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करती है। मल्टीपल इम्यूनोस्टेनिंग या मल्टीप्लेक्स आईएचसी विधियां (चरण 6 देखें) एक ही प्रयोग में ऊतक अनुभाग से बड़ी मात्रा में डेटा प्राप्त करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। यह तकनीक विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब नमूने की उपलब्धता सीमित है। एक और लाभ ऊतक अखंडता को संरक्षित करते हुए एक ही सेलुलर स्थान में सह-व्यक्त विशिष्ट प्रोटीन की एक साथ पहचान करने की संभावना है। मल्टीप्लेक्स विशिष्ट प्रोलिफेरेटिव चरणों (जैसे, नेस्टिन, जीएफएपी, डीसीएक्स, केआई -67) के दौरान व्यक्त विभिन्न मार्करों को दागने की अनुमति देता है, जिससे हमें अधिक विस्तृत प्रसार और भेदभाव अनुसंधान तक पहुंचने में मददमिलती है। क्रॉस-रिएक्टिविटी से बचने के लिए उपयोग की जाने वाली निर्धारण तकनीक के साथ संगत एंटीबॉडी चुनना महत्वपूर्ण है। हम विधि को समायोजित और परिष्कृत करने के लिए प्रत्येक नए एंटीबॉडी (बीआरडीयू सहित) का व्यक्तिगत रूप से परीक्षण करने की सलाह देते हैं। फिर, डबल अनुक्रमिक धुंधलापन पेश करें और अंत में, एक साथ इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया शुरू करें जब अनुक्रमिक विधि पूरी तरह से हावी हो। इस विधि के लिए उपयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी चुनना महत्वपूर्ण है।

पद्धति विशिष्ट विधि लाभ नुकसान
अप्रत्यक्ष पहचान विधि डीएबी के साथ पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया 1. प्रत्यक्ष पहचान और अप्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति विधि की तुलना में उच्च संवेदनशीलता।
2. फ्लोरोक्रोम की तुलना में फोटोब्लीचिंग के लिए उच्च प्रतिरोध।
3. फ्लोरेसेंस डिटेक्शन विधि की तुलना में कम लागत		 1. कम रंग रंगों के साथ मल्टीप्लेक्सिंग के लिए मुश्किल।
2. एक ही सेलुलर स्पेस में सह-व्यक्त लक्ष्यों के लिए जटिल।
3. एक ही ऊतक पर एक साथ दुर्लभ और उच्च प्रचुर मात्रा में लक्ष्यों के लिए कम गतिशील रेंज।
प्रतिदीप्ति 1. अधिक रंग रंगों के साथ मल्टीप्लेक्सिंग के लिए सबसे अच्छा और आसान।
2. एक ही सेलुलर स्पेस में सह-व्यक्त लक्ष्यों के लिए सबसे अच्छा।
3. एक ही ऊतक पर एक साथ दुर्लभ और उच्च प्रचुर मात्रा में लक्ष्यों के लिए बेहतर गतिशील रेंज।
4. कोई अतिरिक्त कदम नहीं।		 1. डीएबी विधि के साथ अप्रत्यक्ष पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया की तुलना में कम संवेदनशीलता।
2. समय के साथ फोटोब्लीचिंग के लिए कमजोर प्रतिरोध।
3. अधिक महंगा।
सिग्नल प्रवर्धन विधि एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (एबीसी) 1. प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष पहचान विधि की तुलना में उच्च संवेदनशीलता।
2. पृष्ठभूमि कम करें		 1. अतिरिक्त कदम।
2. प्रवर्धन नहीं होने की तुलना में अधिक महंगा।
लेबल स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन (LSAB) 1. प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष पहचान विधि की तुलना में उच्च संवेदनशीलता।
2. एबीसी विधि की तुलना में अधिक पर्याप्त ऊतक प्रवेश।
3. पृष्ठभूमि कम करें		 1. अतिरिक्त कदम।
2. एबीसी विधि की तुलना में अधिक महंगा।
अतिरिक्त प्रवर्धन विधि नहीं 1. कम लागत।
2. कोई अतिरिक्त कदम नहीं।
3. उच्च प्रचुर लक्ष्यों के लिए आदर्श।		 1. कम संवेदनशीलता: बिना किसी प्रचुर लक्ष्य के समस्याग्रस्त।

तालिका 1: आईएचसी तकनीकों के फायदे / यह तालिका अप्रत्यक्ष पहचान विधियों के लिए फायदे / नुकसान दिखाती है: (3,3'-डायमिनोबेंज़िडाइन) डीएबी और प्रतिदीप्ति के साथ पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया; और सिग्नल प्रवर्धन विधियां: एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (एबीसी), लेबल स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन (एलएसएबी), और अतिरिक्त प्रवर्धन विधि नहीं।

उचित विश्लेषण करने और परिणामों को प्रस्तुत करने के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि मौलिक है। रिज़ॉल्यूशन को बेहतर बनाने के लिए दो दृष्टिकोण हैं: 1) एक बेहतर माइक्रोस्कोप डिज़ाइन का उपयोग (जैसे, कॉन्फोकल, मल्टीफोटॉन) या 2) संख्यात्मक रूप से डीकॉन्वोल्यूशन9 का उपयोग करके छवियों को बढ़ाने के लिए धुंधली प्रक्रिया को उलटना। दुर्भाग्य से, उपकरणों की उच्च लागत और इसकी सर्विसिंग10 के कारण कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सस्ती नहीं है। एक वाइड-फील्ड एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और जेड-स्टैक छवियों के बाद के डीकन्वोल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 8,9 के लिए एक उपयुक्त, कम लागत वाला विकल्प प्रदान करते हैं। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, डीकॉन्वोल्यूशन लक्ष्य गणितीय निष्कासन एल्गोरिदम10 का उपयोग करके एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा प्राप्त छवि में दिखाए गए धुंध, आउट-ऑफ-फोकस धुंध और विकृति को कम करके अधिग्रहण प्रणाली9 द्वारा अवक्रमित मूल संकेत को बहाल करना है। अधिग्रहित धुंधली छवि को गणितीय रूप से 3 डी पॉइंट-स्प्रेड फ़ंक्शन (पीएसएफ) के साथ देखी गई वस्तुओं को संयोजित करने के परिणामस्वरूप मॉडलिंग की जा सकती है। पीएसएफ ऊतक के नमूने द्वारा उत्सर्जित प्रकाश के बिंदुओं का एक सैद्धांतिक विवर्तन पैटर्न है और माइक्रोस्कोप द्वारा एकत्र किया जाता है। पीएसएफ फ़ाइल प्रत्येक छवि की विशिष्ट स्थितियों के साथ बनाई गई है, जैसे कि कैमरे की सीसीडी सेल स्पेसिंग, उपयोग किए गए मीडिया का अपवर्तक सूचकांक, उद्देश्य लेंस का संख्यात्मक एपर्चर, फ्लोरोफोरे की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, छवि आकार, जेड-स्टैक प्रोसेसिंग विधि में छवियों की संख्या और उनके बीच का स्थान (तालिका 2 में तकनीकी विनिर्देश देखें)। दूसरे शब्दों में, पीएसएफ फ़ाइल माइक्रोस्कोप अवलोकन 9 पर इमेजिंग सेटअप के प्रभावों को सारांशित करतीहै। हालांकि, हम प्रत्येक जेड-स्टैक छवि के लिए अपनी विशिष्ट पीएसएफ फ़ाइल बनाने के लिए विवर्तन पीएसएफ 3 डी प्लगइन (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) का उपयोग करते हैं। जेड-स्टैक छवियां स्लाइड के एक ही एक्सवाई स्थान पर परिभाषित गहराई (जेड-अक्ष) से डिजिटाइज्ड ऑप्टिकल वर्गों की एक श्रृंखला हैं। एक कंप्यूटर फोकस प्लेन से प्राप्त जानकारी को उन संकेतों को फिर से असाइन करके संकलित करता है जो अन्य फोकल विमानों में स्थित वस्तुओं से उत्पन्न हुए हैं। जेड-स्टैक छवियां बनाने के लिए, स्लाइड की विभिन्न केंद्रित परतों से छवियां लेना आवश्यक है (उदाहरण के लिए, हर 1 μm गहराई पर एक ही XY क्षेत्र की दस अलग-अलग छवियां)। फिर, हम जेड-स्टैक या 3 डी छवि बनाने के लिए निर्माता या फिजी द्वारा प्रदान किए गए माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हैं। परिणाम एक एकल स्टैक छवि फ़ाइल होगी (उदाहरण के लिए, विभिन्न फोकस के साथ दस छवियां)। कई ग्राहक-विशिष्ट उपकरण और सॉफ्टवेयर समाधान हैं, जैसे कि डीकॉन्वोल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर। हम डीकन्वोल्यूशनलैब 29 का उपयोग करके डीकॉन्वोल्यूशन प्रक्रिया के आउटपुट दिखाएंगे जो एक फिजी11 प्लगइन (इमेजजे12 का वितरण) है। डीकॉन्वोल्यूशन अंतिम माइक्रोग्राफ के संकल्प को बेहतर बनाने में मदद करेगा (चित्रा 1बी, सी देखें)। अधिक जानकारी और निर्देश के लिए, हम दृढ़ता से संदर्भ13 पढ़ने की सलाह देते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: कई रंग चैनलों के लिए 3 डी डीकन्वोल्यूशन की प्रतिनिधि छवि। (ए) कम आवर्धन पर डीजी। (बी) प्रत्येक चैनल और विलय की गई छवि के लिए मूल जेड-स्टैक छवियां। (सी) प्रत्येक चैनल और विलय की गई छवि के लिए 3 डी जटिल जेड-स्टैक छवियां। यह मस्तिष्क चूहे से था जो शारीरिक गतिविधि समूह का हिस्सा था। लेबल स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन (एलएसएबी) प्रवर्धन विधि का उपयोग किया गया था। इसमें बीआरडीयू (लाल), डीएपीआई को काउंटरस्टेनिंग (नीला) और ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) को एस्ट्रोग्लियाल मार्कर (हरे) के रूप में इंगित करने के लिए साइ3 स्ट्रेप्टाविडिन संयुग्मित एंटीबॉडी दिखाया गया है। एमएल = आणविक परत; जीसीएल = दानेदार कोशिका परत; एसजीजेड = उप-समूह क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस काम का उद्देश्य इम्यूनोस्टेनिंग के साथ सकारात्मक और सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए चरणों का विस्तृत विवरण प्रदान करना है और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के बिना बीआरडीयू-आधारित अध्ययनों में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले चरणों को सूचीबद्ध करना है। बीआरडीयू धुंधला एक ऐसी तकनीक है जिसके लिए कई चरणों की आवश्यकता होती है जिन्हें एक सफल दाग प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक पालन किया जाना चाहिए। इन धुंधला तकनीकों को मानकीकृत करने में आमतौर पर महीनों लगते हैं और यह समय और संसाधन गहन है। हमने अनुमान लगाया कि यह आलेख समय और त्रुटियों को कम करके इस फ़ील्ड के भीतर शुरू होने वाले समूहों को जानकारी प्रदान कर सकता है।

Protocol

सभी प्रक्रियाएं प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान गाइड (एनआईएच प्रकाशन एन ° 8023, 1978 में संशोधित) और स्थानीय मैक्सिकन कानूनों का पालन करती हैं ताकि उपयोग किए गए जानवरों की संख्या और उनकी पीड़ा को कम किया जा सके। Universidad इबेरोअमेरिकाना की आचार समिति ने इस अध्ययन में जानवरों का उपयोग करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को मंजूरी दी।

1. अभिकर्मक तैयारी और सेटअप

नोट: अधिकांश समाधान उपयोग से कुछ दिन पहले तैयार किए जा सकते हैं जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न किया जाए।

  1. BrdU समाधान
    1. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बीआरडीयू समाधान को पुनः प्राप्त करें और इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर बराबर करने की अनुमति दें।
    2. चूहे के शरीर के वजन के अनुसार 50 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक के लिए आवश्यक बीआरडीयू के द्रव्यमान की गणना करें। 20मिलीग्राम /एमएल के कामकाजी समाधान के लिए आवश्यक 0.9% खारा घोल (बाँझ एच 2 ओ के 100 एमएल में 0.9 ग्राम एनएसीएल) की मात्रा की गणना करें। प्रति इंजेक्शन कम से कम 0.5 एमएल प्रति चूहा प्रदान करने के लिए एक अतिरिक्त तैयार करें।
      नोट: प्रयोगात्मक जानवरों को दी जाने वाली खुराक सुरक्षित होनी चाहिए, न्यूनतम दुष्प्रभावों के साथ, और प्रभावी। यह बताया गया है कि 100 मिलीग्राम / किग्रा बीआरडीयू के साथ धुंधला होने की अवधि 50 मिलीग्राम / किग्रा खुराक7 की तुलना में संभावित उच्च विषाक्तता से अधिक नहीं है। चूहों में 50 और 100 मिलीग्राम / किग्रा के लिए बीआरडीयू-लेबल कोशिकाओं / मिमी3 की संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पायागया। जानवरों की पीड़ा को कम करने के लिए एक छोटी खुराक इंजेक्ट करना बेहतर है।
    3. बीआरडीयू समाधान का वजन करें और इसे शंक्वाकार ट्यूब और भंवर में खारा घोल में जोड़ें।
      नोट: खारे घोल को 45\u201250 °C पर 1 mL से बड़े वॉल्यूम के लिए पानी के स्नान में पूर्व-गर्म करें।
    4. ट्यूब को 10\u201215 मिनट के लिए 50 °C पर पानी के स्नान में रखें और हर 2\u20123 मिनट में भंवर को पूरी तरह से घुलने तक रखें। बाँझ इंजेक्शन के लिए एक सिरिंज फ़िल्टर के साथ समाधान को फ़िल्टर करें। ट्यूब को टिन पन्नी के साथ कवर करें, इसे कमरे के तापमान पर ठंडा करें और तुरंत उपयोग करें।
      सावधानी: बीआरडीयू समाधान विषाक्त और संभावित रूप से कार्सिनोजेनिक है। इसे फ्यूम हुड में तैयार करें। बीआरडीयू समाधान को उचित सुरक्षा उपकरण (पीपीई) के साथ संभाला जाना चाहिए। उपयोग से तुरंत पहले समाधान तैयार करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, समाधान आरटी के तहत 24 घंटे के लिए स्थिर है। कृपया इसे प्रकाश से बचाएं।
  2. पीएच 7.4 पर 0.1 एम फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) का 1 लीटर तैयार करने के लिए, 240 मिलीग्राम पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक (केएच2पीओ4), 1.44 ग्राम सोडियम फॉस्फेट डिबासिक (एनए2एचपीओ4), 200 मिलीग्राम पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल), और 8 ग्राम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) को 800 मिलीलीटर डबल डिस्टिल्ड पानी (डीडीएच2ओ) में लगातार हलचल के तहत जोड़ें। पीएच को 7.4 में समायोजित करें और 1 एल की कुल मात्रा तक डबल डिस्टिल्ड एच2ओ जोड़ें।
  3. पीबीएस + के 100 एमएल के लिए, सामान्य घोड़े के सीरम का 3% (3 एमएल) और ट्राइटन एक्स -100 का 0.3% (300 μL) 0.1 एम पीबीएस (पीएच 7.4) जोड़ें। 3 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर 20\u201250 mL एलिकोट में स्टोर करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, पीबीएस के बजाय टीबीएस का उपयोग किया जा सकता है। मेजबान के एंटीबॉडी और प्रयोगात्मक ऊतक से अलग कोई अन्य सीरम उपयुक्त है।
  4. पीबीएस ++ के 100 एमएल के लिए, सामान्य घोड़े के सीरम का 10% (10 एमएल) और ट्राइटन एक्स -100 का 0.3% (300 μL) 0.1 एम पीबीएस पीएच 7.4 जोड़ें। 3 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर 20\u201250 mL एलिकोट में स्टोर करें।
  5. 1 एल क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान के लिए, 250 एमएल एथिलीन ग्लाइकोल और 250 एमएल ग्लिसरॉल मिलाएं, मिश्रण होने तक लगातार हिलाएं। धीरे-धीरे पीबीएस के साथ 1 एल तक लाएं। ग्रेड 4 (20\u201225 μm) फ़िल्टर पेपर के साथ फ़िल्टर करें. 1 वर्ष तक 4 डिग्री सेल्सियस या आरटी पर स्टोर करें।
  6. निम्नानुसार 0.1 एम पीबीएस (पीएफए समाधान) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड तैयार करें। 1 लीटर घोल के लिए, 40 ग्राम पैराफॉर्मलडिहाइड पाउडर को धीरे-धीरे 60\u201265 °C 0.1 M PBS के 800 mL में निरंतर सरगर्मी के तहत जोड़ें। तापमान को नियंत्रित करते हुए पैराफॉर्मलडिहाइड पूरी तरह से घुल ने तक हिलाएं (60\u201265 °C)। यदि आवश्यक हो, तो समाधान को स्पष्ट करने के लिए 1 एम एनएओएच की कुछ बूंदें जोड़ें। जब समाधान कमरे के तापमान तक पहुंच जाता है, तो ग्रेड 4 (20-25 μm) फ़िल्टर पेपर के साथ फ़िल्टर करें।
    चेतावनी: पैराफॉर्मलडिहाइड विषाक्त है और एक कार्सिनोजेन होने का संदेह है, जो फ्यूम हुड में तैयार होता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और अधिमानतः 2 दिनों के भीतर उपयोग करें। पीएफए रेडी-टू-यूज़ समाधान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है।
  7. पीएच 6 पर 10 एमएम सोडियम साइट्रेट बफर (एससीबी) के 1 एल के लिए, निरंतर हिलाने के तहत डबल डिस्टिल्ड एच 2 ओ के 800 एमएल में1.204ग्राम सोडियम साइट्रेट (डाइहाइड्रेट), और 1.134 ग्राम साइट्रिक एसिड जोड़ें। पीएच को 6.0 में समायोजित करें और 1 एल तक डीडीएच2ओ जोड़ें।
  8. निरंतर हिलाहट के तहत 41.75 एमएल डीडीएच 2 ओ में धीरे-धीरे 12 एन एचसीएल (केंद्रित स्टॉक समाधान) के8.25एमएल जोड़कर 2 एन एचसीएल का 50 एमएल तैयार करें।
    सावधानी: फ्यूम हुड में तैयारी करें। उपयोग से पहले समाधान तुरंत तैयार किया जाना चाहिए।
    नोट: 2 एन एचसीएल का उपयोग डीएनए विकृतीकरण के लिए किया जाएगा, एक महत्वपूर्ण कदम। जैसा कि बीआरडीयू को डीएनए में शामिल किया जाता है, एचसीएल का उपयोग डीएनए बॉन्ड खोलने के लिए किया जाता है जिससे बीआरडीयू एंटीबॉडी डीएनए के भीतर बीआरडीयू तक पहुंच सकता है।
  9. अंतर्जात पेरोक्सीडेज ब्लॉकिंग समाधान निम्नानुसार तैयार करें। निरंतर सरगर्मी के तहत 98 एमएलडीडीएच 2ओ के साथ 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 2 एमएल को मिलाकर 0.6% हाइड्रोजन पेरोक्साइड का 100 एमएल तैयार करें।
    नोट: समाधान उपयोग से तुरंत पहले तैयार किया जाना चाहिए। इसे अंधेरे में रखें क्योंकि एच2ओ2 हल्का संवेदनशील है। पानी के बजाय पीबीएस या टीबीएस का उपयोग किया जा सकता है।
  10. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (एबीसी) समाधान तैयार करें। 0.1 M PBS में ABC के 5 mL के लिए, अभिकर्मक A की 2 बूंदें (≈100 μL) जोड़ें और मिलाएं, और फिर अभिकर्मक B की 2 बूंदें (≈100 μL) जोड़ें और मिलाएं।
    नोट: समाधान तैयार किया जाना चाहिए और उपयोग से पहले 20\u201230 मिनट के लिए Tumbl-roll करने की अनुमति दी जानी चाहिए।
  11. निर्माता के निर्देशों का पालन करके किट का उपयोग करके डीएबी (डायमिनोबेंज़िडाइन) पेरोक्सीडेज (एचआरपी) सब्सट्रेट तैयार करें। ddH2O के 5 mL में, अभिकर्मक 1 की 2 बूंदें (≈ 84 μL) डालें और मिलाएं, अभिकर्मक 2 की 4 बूंदें (≈ 100 μL) जोड़ें और मिलाएं, फिर अभिकर्मक 3 की 2 बूंदें (≈ 80 μL) जोड़ें और मिलाएं। अंत में, यदि वांछित हो, तो अभिकर्मक 4 (निकल) की 2 बूंदें (≈ 80 μL) जोड़ें और मिलाएं।
    नोट: उपयोग से पहले समाधान तुरंत तैयार किया जाना चाहिए।
    चेतावनी: डीएबी विषाक्त और संभावित कार्सिनोजेनिक है। इसे देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए और प्रत्येक संस्थान में खतरनाक अपशिष्ट विनियमन के अनुसार छोड़ दिया जाना चाहिए। डीएबी को निष्क्रिय करने के लिए, ब्लीच (सोडियम हाइपोक्लोराइट) की कई बूंदें जोड़ें; समाधान काला हो जाएगा।
  12. 55\u201260 डिग्री सेल्सियस पर 80 एमएल ddH 2 O में 100 मिलीग्राम क्रेसिल वायलेट एसीटेट और250μL एसिटिक एसिड जोड़कर 100 मिलीलीटर क्रेसिल वायलेट घोल तैयार करें। वॉल्यूम को 100 एमएल में समायोजित करें, फ़िल्टर करें, और गहरे रंग के बर्तन में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: उपयोगकर्ता को मूल्यवान ऊतक नमूनों पर उपयोग करने से पहले क्रेसिल वायलेट समाधान की विभिन्न सांद्रता का परीक्षण करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। परिणाम कुछ ऊतक नमूनों के साथ काउंटरस्टेनिंग के लिए गहरा हो सकता है, जो बीआरडीयू सकारात्मक कोशिकाओं को सटीक रूप से गिनने की क्षमता को कम कर सकता है।

2. थाइमिडीन एनालॉग बीआरडीयू प्रशासन

  1. निचले पेट की गुहा को स्थिर करके प्रयोगात्मक जानवर (उदाहरण के लिए, 350 ग्राम वजन वाले 90 दिन के नर विस्टार चूहे) को रोकें।
  2. 23 ग्राम सुई और 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके बीआरडीयू समाधान (50 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्रापरिटोनियल (यानी) का प्रबंधन करें।
    नोट: जानवर के वजन के अनुसार इंजेक्शन की मात्रा समायोजित करें। वयस्क चूहों के लिए 23\u201227 G सुई और 1\u20125 mL सिरिंज का उपयोग करें। वयस्क चूहे में अधिकतम सहनीय इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन की मात्रा 10 एमएल है। बीआरडीयू समाधान14 को प्रशासित करने के लिए विभिन्न मार्गों का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पीने के पानी के माध्यम से इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन या मौखिक प्रशासन।

3. ऊतक तैयारी

नोट: तीन महीने के चूहों को सात दिनों के लिए शारीरिक गतिविधि (अंतहीन पहिया) तक पहुंच की अनुमति दी गई थी। 6 वें दिन, चूहों को 12 घंटे के अंतराल पर 3 बार बीआरडीयू (चरण 2) के साथ इंजेक्ट किया गया था। अंतिम बीआरडीयू इंजेक्शन से 8 घंटे के बाद अनुभाग 3 में चरणों का प्रदर्शन करें।

  1. पेंटोबार्बिटल (50 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्ट करें और जानवर को गहराई से एनेस्थेटाइज्ड होने तक कुछ मिनट प्रतीक्षा करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि जारी रखने से पहले जानवर पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है। सावधानी से पैरों या पूंछ में से एक को चुटकी लें। यदि जानवर उत्तेजना पर प्रतिक्रिया करता है, तो कुछ और मिनट प्रतीक्षा करें। यदि जानवर चुटकी पर प्रतिक्रिया नहीं करता है, तो अगले चरण पर जाएं।
  2. स्तन की हड्डी के नीचे पेट की गुहा त्वचा को काटकर, पसलियों को अलग करके और डायाफ्राम को काटकर दिल को उजागर करें।
  3. ट्रांसकार्डियल छिड़काव निर्धारण
    1. बाएं वेंट्रिकल में एक सुई डालें और दाएं आलिंद में एक छोटा सा चीरा लगाएं। पंप या गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करके, प्रवाह (प्रवाह दर 5\u20127 mL/min.) 0.1 M PBS तब तक जारी रखें जब तक कि पूरा रक्त बाहर न निकल जाए, और समाधान स्पष्ट न हो जाए।
    2. पंप या गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करके, पूंछ कठोर होने तक ऊतक को ठीक करने के लिए पीएफए समाधान के साथ ठंडा छिड़काव (प्रवाह दर 5\u20127 mL/min) करें।
      नोट: आमतौर पर, एक 300 ग्राम चूहे को पीएफए समाधान के लगभग 100 \ u2012150 एमएल की आवश्यकता होती है। ऊतक निर्धारण वैकल्पिक है। इस प्रकार, प्रयोगों में जानवरों के उपयोग को कम करने के लिए मस्तिष्क को विभिन्न प्रक्रियाओं में उपयोग के लिए निकाला जा सकता है।
  4. विच्छेदन और पोस्ट-फिक्सेशन
    1. जानवर का सिर काट दें, और धीरे से खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें। मस्तिष्क को पीएफए समाधान (250 मिलीग्राम चूहे के लिए ~ 40 एमएल) युक्त शंक्वाकार ट्यूब में 1 \ u20122 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर डुबोएं।
      नोट: ओवर-फिक्सेट (48 घंटे से अधिक) न करें, क्योंकि यह एंटीजन की अनुपलब्धता के कारण ऊतक धुंधला हो सकता है।
    2. 30% सुक्रोज समाधान का 100 एमएल तैयार करें, निरंतर हिलाने के तहत 0.1 एम पीबीएस समाधान के 70 एमएल में 30 ग्राम सुक्रोज जोड़ें। 100 एमएल में 0.1 एम पीबीएस समाधान जोड़ें। मस्तिष्क को 30% सुक्रोज समाधान (35 एमएल) के साथ एक शंक्वाकार ट्यूब में लगभग 1 \u20122 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर डुबोएं जब तक कि मस्तिष्क ट्यूब के तल तक डूब न जाए।
  5. कोरोनल मस्तिष्क वर्गों में कटौती
    नोट: क्रायोस्टेट-माइक्रोटोम का उपयोग करने के लिए मार्गदर्शन और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। विस्तृत निर्देशों के लिए, संदर्भ15 देखें।
    1. पूरे मस्तिष्क को -80 डिग्री सेल्सियस पर आइसो-पेंटेन में डुबोएं और इसे 10 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। मस्तिष्क को क्रायोस्टेट-माइक्रोटोम प्लेट पर एक एम्बेडिंग मैट्रिक्स में रखें।
      नोट: कुछ शर्तों के तहत, -80 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क के तेजी से जमने से ऊतक को फ्रैक्चर या नुकसान हो सकता है। उपयोगकर्ता को इस समस्या के बारे में पता होना चाहिए। यदि यह मामला है, तो मस्तिष्क को फ्रीज करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस आइसो-पेंटेन का उपयोग करें।
    2. क्रायोस्टेट-माइक्रोटोम (-25 से -20 डिग्री सेल्सियस पर तापमान) का उपयोग करके 40 μm मोटाई के कोरोनल खंडों को काटता है। क्रमिक रूप से चित्रा 2 में गाइड के बाद क्रायोप्रोटेक्शन समाधान के साथ 24-वेल सेल कल्चर प्लेट में वर्गों को स्थानांतरित करें। उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, कुछ महीनों तक।
      नोट: इसके बाद, कोमल और निरंतर आंदोलन (10 आरपीएम) में जाल डालने के साथ 12-वेल प्लेटों में 40 μm के मुक्त-फ्लोटिंग सीरियल वर्गों में सभी ऊतकों को संसाधित करें। मस्तिष्क वर्गों को सही परिस्थितियों में वर्षों तक संग्रहीत करना संभव है।

Figure 2
चित्रा 2: क्रायोस्टेट-माइक्रोटोम से क्रायोप्रोटेक्शन समाधान के साथ 24-वेल सेल कल्चर प्लेट में क्रमिक रूप से वर्गों को स्थानांतरित करने का योजनाबद्ध चित्रण। ए 1-वेल से शुरू करें और अगले स्लाइस को पंक्ति ए में रखें; A6 के बाद अगली पंक्ति B में चले जाते हैं, इसी तरह। डी 6 पर पहुंचने पर, ए 1 पर वापस जाएं और जारी रखें। यह व्यवस्था एनटीएच (उदाहरण के लिए, न्यूरोजेनेसिस के लिए छठा, एक कॉलम की सामग्री के बराबर) खंड परिमाणीकरण को पूरे मस्तिष्क क्षेत्र की मात्रा का निर्धारण करने की अनुमति देती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. इम्यूनोस्टेनिंग

नोट: प्रत्येक तकनीक के फायदे और नुकसान के सारांश के लिए तालिका 1 देखें।

  1. डीएबी के साथ पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया का उपयोग करके बीआरडीयू का पता लगाना
    नोट: पहले दिन चरण 4.1.1 से 4.1.5 तक निष्पादित करें।
    1. कमरे के तापमान पर क्रायोप्रोटेक्शन समाधान से स्लाइस को 0.1 एम पीबीएस में स्थानांतरित करें। 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
    2. अंतर्जात पेरोक्सीडेज को निष्क्रिय करने के लिए अंतर्जात पेरोक्सीडेज ब्लॉकिंग समाधान में 30 मिनट के लिए स्लाइस इनक्यूबेट करें। 0.1 एम पीबीएस के साथ 3 बार, 10 मिनट धोएं। वैकल्पिक रूप से, एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें (अनुभाग 5 देखें)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एन एचसीएल के साथ 20 मिनट के लिए स्लाइस इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए 0.1 एम बोरेट बफर (8.5 पीएच) में कुल्ला करें। बर्फ-ठंडा 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला करें।
    3. पीबीएस ++ (ब्लॉकिंग समाधान) के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए स्लाइस इनक्यूबेट करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस + में 1:250 की एकाग्रता पर एंटी-बीआरडीयू प्राथमिक एंटीबॉडी (माउस होस्ट) के साथ इनक्यूबेट करें।
    4. दिन 2 पर, स्लाइस को 0.1 एम पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
    5. कमरे के तापमान पर 2\u20124 घंटे के लिए पीबीएस + में 1: 250 एचआरपी-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (एंटी-माउस) के साथ इनक्यूबेट करें। 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
    6. डीएबी पेरोक्सीडेज (एचआरपी) सब्सट्रेट समाधान में स्लाइस स्थानांतरित करें और 2 \ u201210 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। जब स्लाइस गहरे भूरे रंग के हो जाते हैं, तो ऊतक को मैग्निफाइंग ग्लास या माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना करें। यदि सकारात्मक कोशिकाएं मौजूद हैं, तो नल के पानी (पृष्ठभूमि को कम करने के लिए) के साथ 3 बार (प्रत्येक 15 मिनट के लिए) कुल्ला करें। 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
    7. एक नरम ब्रश का उपयोग करके जिलेटिनयुक्त स्लाइडों पर सावधानीपूर्वक स्लाइस माउंट करें, कमरे के तापमान पर रात भर हवा में सूखें। काउंटरस्टेन (अनुभाग 7.1 देखें), स्थायी माउंटिंग माध्यम जोड़ें और कवरलिप रखें। 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एविडिन-बायोटिन-पेरोक्सीडेज कॉम्प्लेक्स के साथ पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया का उपयोग करके बीआरडीयू का पता लगाना
    नोट: पहले दिन 4.2.1 से 4.2.5 चरणों का पालन करें।
    1. कमरे के तापमान पर लाने के लिए क्रायोप्रोटेक्शन समाधान से स्लाइस को 0.1 एम पीबीएस में स्थानांतरित करें। 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
    2. अंतर्जात पेरोक्सीडेज को निष्क्रिय करने के लिए अंतर्जात पेरोक्सीडेज ब्लॉकिंग समाधान के साथ 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 0.1 एम पीबीएस में प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं। वैकल्पिक रूप से, एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें (अनुभाग 5 देखें)।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एन एचसीएल के साथ 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए 0.1 एम बोरेट बफर (पीएच 8.5) में कुल्ला करें। बर्फ-ठंडा 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
    4. पीबीएस ++ (ब्लॉकिंग समाधान) में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. एंटी-बीआरडीयू प्राथमिक एंटीबॉडी (माउस होस्ट) 1:250 के साथ पीबीएस + में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    6. दिन 2 पर, 0.1 एम पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला करें।
    7. कमरे के तापमान पर 2\u20124 घंटे के लिए पीबीएस + में 1: 250 बायोटिनिलेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी (एंटी-माउस) के साथ इनक्यूबेट करें। 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
    8. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एबीसी समाधान में इनक्यूबेट करें। 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
    9. स्लाइस को डीएबी पेरोक्सीडेज (एचआरपी) सब्सट्रेट समाधान में स्थानांतरित करें और 2 \ u201210 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। जब स्लाइस गहरे भूरे रंग के हो जाते हैं, तो ऊतक को मैग्निफाइंग ग्लास या माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना करें। यदि सकारात्मक कोशिकाएं मौजूद हैं, तो नल के पानी (पृष्ठभूमि को कम करने के लिए) के साथ 3 बार (प्रत्येक 15 मिनट) कुल्ला करें, इसके बाद 10 मिनट के लिए 0.1 एम पीबीएस धोने के साथ 3 बार धोएं।
      नोट: उपयोग से पहले समाधान तुरंत तैयार किया जाना चाहिए। ऊतक में अनियमित काले धब्बे के कारण मस्तिष्क स्लाइस को एक दूसरे से चिपकने से बचने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए।
    10. एक नरम ब्रश का उपयोग करके जिलेटिनयुक्त स्लाइड पर स्लाइस को सावधानीपूर्वक माउंट करें और फिर कमरे के तापमान पर रात भर हवा में सुखाएं।
    11. यदि आवश्यक हो तो काउंटरस्टेन (चरण 7.1 देखें), स्थायी माउंटिंग माध्यम जोड़ें और कवरलिप रखें। 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. लेबल स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन (एलएसएबी) प्रवर्धन का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा बीआरडीयू का पता लगाना
    नोट: पहले दिन 4.3.1 से 4.3.4 तक चरण ों का प्रदर्शन करें।
    1. कमरे के तापमान पर क्रायोप्रोटेक्शन समाधान से स्लाइस को 0.1 एम पीबीएस में स्थानांतरित करें। 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं। वैकल्पिक रूप से, एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें (अनुभाग 5 देखें)।
    2. 2 N HCl में 37 °C पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए 0.1 एम बोरेट बफर (8.5 पीएच) में कुल्ला करें। बर्फ-ठंडा 0.1 एम पीबीएस में प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला करें।
    3. पीबीएस ++ (ब्लॉकिंग समाधान) में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस + में 1: 250 एंटी-बीआरडीयू प्राथमिक एंटीबॉडी (माउस होस्ट) के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. दिन 2 पर, 0.1 एम पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला करें।
    5. कमरे के तापमान पर 2\u20124 घंटे के लिए पीबीएस + में 1: 250 बायोटिनिलेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी (एंटी-माउस) के साथ इनक्यूबेट करें। 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं। कमरे के तापमान पर 1\u20122 घंटे के लिए पीबीएस में 1:250 फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन (Cy3) के साथ इनक्यूबेट करें (सीरम का उपयोग न करें)। 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
      नोट: सीरम में बायोटिन हो सकता है और इसे डिल्यूएंट्स में नहीं जोड़ा जाना चाहिए। इसके बजाय, ट्राइटन एक्स -100 के 0.3% वाले पीबीएस का उपयोग करें।
    6. एक नरम ब्रश का उपयोग करके जिलेटिनयुक्त स्लाइडों पर सावधानीपूर्वक स्लाइस माउंट करें, कमरे के तापमान पर रात भर हवा में सुखाएं, या तुरंत एक उपयुक्त माउंटिंग माध्यम के साथ माउंट करें। काउंटरस्टेन (चरण 7.2 देखें), स्थायी माउंटिंग माध्यम जोड़ें और कवरलिप रखें। 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा बीआरडीयू का पता लगाना
    नोट: पहले दिन चरण 4.4.1 से 4.4.4 तक प्रदर्शन करें।
    1. क्रायोप्रोटेक्शन समाधान से स्लाइस को 0.1 एम पीबीएस में स्थानांतरित करें जब तक कि यह कमरे के तापमान तक नहीं पहुंच जाता। 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं। यदि आवश्यक हो तो एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें (वैकल्पिक, अनुभाग 5 देखें)।
    2. 2 N HCl में 37 °C पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए 0.1 एम बोरेट बफर (8.5 पीएच) में कुल्ला करें। बर्फ-ठंडा 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला करें। पीबीएस ++ (ब्लॉकिंग समाधान) के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस + में 1: 250 एंटी-बीआरडीयू प्राथमिक एंटीबॉडी (माउस होस्ट) के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. दिन 2 पर, 0.1 एम पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला करें।
    4. कमरे के तापमान पर 2\u20124 घंटे के लिए पीबीएस + में 1: 250 फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (एंटी-माउस) के साथ इनक्यूबेट करें। 0.1 एम पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
    5. एक नरम ब्रश का उपयोग करके जिलेटिनयुक्त स्लाइडों पर सावधानीपूर्वक स्लाइस माउंट करें, कमरे के तापमान पर रात भर हवा में सुखाएं, या तुरंत एक उपयुक्त माउंटिंग माध्यम के साथ माउंट करें। काउंटरस्टेन (चरण 7.2 देखें), स्थायी माउंटिंग माध्यम जोड़ें और कवरलिप रखें। 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. एंटीजन पुनर्प्राप्ति (वैकल्पिक)

नोट: एंटीजन पुनर्प्राप्ति एक वैकल्पिक कदम है जिसका उद्देश्य निर्धारण के कारण एंटीजेनिसिटी के नुकसान को ठीक करना है जो कई एंटीजन की तृतीयक और चतुर्धातुक संरचना को संशोधित करता है, जिससे उन्हें एंटीबॉडी द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है। यह चरण मूल प्रोटोकॉल में जोड़ा जा सकता है।

  1. माइक्रोवेव या पानी के स्नान में, 10 mM सोडियम साइट्रेट बफर (SCB) pH 6 घोल को 90\u201295 °C तक गर्म करें (ऊंचाई के आधार पर, समाधान इस तापमान के आसपास उबलना शुरू हो जाता है)। पूर्व-गर्म एससीबी के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब (40 एमएल) का 80% भरें। एससीबी के साथ शंक्वाकार ट्यूब में जाल डालने के लिए स्लाइस स्थानांतरित करें। ट्यूब को स्क्रू कैप के साथ कवर करें जिसमें 18 \u201220 G सुई से बने छेद हों।
  2. न्यूनतम बिजली स्तर पर माइक्रोवेव में 80\u201285 °C पर SCB में 30 मिनट के लिए स्लाइस रखें। यदि आवश्यक हो, तो शंक्वाकार ट्यूब को एससीबी के साथ फिर से भरें। जाल के साथ तुरंत स्लाइस को बर्फ-ठंडा 0.1 एम पीबीएस में डालें और प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला करें।

6. मल्टीपल इम्यूनोस्टेनिंग (वैकल्पिक)

नोट: इस कदम के पीछे तर्क के लिए परिचय अनुभाग देखें।

  1. एक साथ कई इम्यूनोस्टेनिंग
    1. पीबीएस + में लक्ष्य (जैसे, माउस एंटी-बीआरडीयू, और खरगोश एंटी-जीएफएपी) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक कॉकटेल तैयार करें। उपयोग किए गए प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए अलग-अलग मेजबानों का उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए समान अगले चरणों के साथ जारी रखें।
    2. उपयोग किए गए प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, बकरी एंटी-माउस एफआईटीसी, बकरी विरोधी खरगोश टीआरआईटीसी) के लिए संबंधित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ एक कॉकटेल तैयार करें। प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए समान अगले चरणों के साथ जारी रखें। आदर्श रूप से, क्रॉस-रिएक्शन से बचने के लिए एक ही मेजबान से आने वाले द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करें।
  2. अनुक्रमिक एकाधिक इम्यूनोस्टेनिंग।
    1. पहले एंटीबॉडी लक्ष्य (जैसे, माउस एंटी-बीआरडीयू) के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें और स्लाइस को माउंट करने से पहले रोकें। पीबीएस ++ (ब्लॉकिंग समाधान) के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. पीबीएस + में दूसरे प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, खरगोश विरोधी -जीएफएपी) को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए अगले चरणों का पालन करें, जिसमें दूसरे माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे, बकरी विरोधी खरगोश टीआरआईटीसी) की इनक्यूबेशन शामिल है। अंत तक प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए अगले चरणों के साथ जारी रखें।

7. काउंटरस्टेनिंग (वैकल्पिक)

  1. पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल के लिए, क्रेसिल वायलेट समाधान को 60 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म करें। 1 मिनट के लिए डीडीएच2ओ के साथ स्लाइड्स को हाइड्रेट करें। 5\u201220 मिनट के लिए गर्म क्रेसिल वायलेट समाधान में स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें।
    1. स्लाइड्स को 1 मिनट के लिए ddH2O से धो लें। स्लाइड्स को 70%, 80%, 90% और 100% एथिल अल्कोहल के साथ 1\u20123 मिनट के लिए धोएं। 1\u20123 मिनट के लिए जाइलीन के साथ स्लाइड्स को धो लें।
    2. स्थायी हाइड्रोफोबिक माउंटिंग माध्यम जोड़ें और कवरलिप रखें।
      नोट: 6 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। पीवीए (पॉलीविनाइल अल्कोहल) -डीएबीसीओ युक्त स्व-निर्मित माउंटिंग माध्यम को नियोजित किया जा सकता है।
  2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल के लिए, डीएपीआई, प्रोपिडियम आयोडाइड या इसी तरह के हाइड्रोफिलिक माउंटिंग माध्यम की एक छोटी मात्रा (25\u201250 μL) जोड़ें। नेल पॉलिश या प्लास्टिक सीलेंट के साथ परिधि के चारों ओर सील करें। 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

8. इमेजिंग और विश्लेषण

नोट: माइक्रोस्कोप सेटअप विनिर्देशों के लिए तालिका 2 देखें। आमतौर पर, दाग वाली नई कोशिकाओं की गिनती पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया दाग वाले स्लाइस (सस्ती विधि) का उपयोग करके की जाती है, लेकिन इसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके भी किया जा सकता है।

  1. कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए, सबसे पहले, 4x आवर्धन लेंस के साथ डेंटेट गाइरस को ठीक से पहचानें (डीजी शारीरिक विवरण पर आगे के निर्देशों के लिए, अमरल एट अल .16 देखें)।
    1. बीआरडीयू (40 एक्स आवर्धन लेंस का उपयोग करके) के साथ लेबल किए गए नाभिक के लिए डेंटेट गाइरस की दानेदार कोशिका परत खोजें। जेड-अक्ष के साथ पूरी तरह से सेल खोज करें क्योंकि नई कोशिकाओं को विभिन्न परतों में वितरित किया जा सकता है ( वीडियो 1 देखें)।
    2. डेंटेट गाइरस पर सेल खोज के लिए एक अंतराल अनुभाग का चयन करें (उदाहरण के लिए, ऊतक का हर 6 वां खंड, हर 240 μm के बराबर)।
    3. सभी बीआरडीयू पॉजिटिव कोशिकाओं की गणना करें। लेबल किए गए नाभिक की आकृति विज्ञान इस बात पर निर्भर करता है कि सेल में कितना बीआरडीयू शामिल है (एक गाइड के रूप में चित्रा 3 देखें)। एक क्लस्टर को एकीकृत करने वाले सभी कई नाभिकों को निर्धारित करने के लिए जेड-अक्ष पर धीरे-धीरे आगे बढ़ें ( वीडियो 2 देखें)।
    4. बीआरडीयू-लेबल वाली नई कोशिकाओं की कुल संख्या का अनुमान लगाने के लिए चयनित अंतराल अनुभाग (जैसे, 6) के साथ गिने गए कोशिकाओं की कुल संख्या को गुणा करें।
    5. आदर्श रूप से, एक नियमित प्रयोग में, प्रति पशु कम से कम दस खंड और प्रति समूह कम से कम पांच जानवरों की गणना करें।
  2. Image deconvolution (वैकल्पिक)
    नोट: इस चरण के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी के लिए परिचय अनुभाग देखें। इस प्रक्रिया को मोनोक्रोमैटिक छवियों (ग्रेस्केल) की आवश्यकता होती है। रंग छवियों को ग्रेस्केल में बदलें। यदि छवियां एक आरजीबी कम्पोजिट हैं, तो पहले चैनलों को विभाजित करें और उन्हें एकल छवि (समग्र नहीं) के रूप में विलय करें, फिर 8-बिट ग्रेस्केल में बदल जाएं।
    1. माइक्रोग्राफ से एक जेड-स्टैक फ़ाइल बनाएँ।
    2. विकल्प प्लगइन्स मेनू से विवर्तन पीएसएफ 3 डी प्लगइन (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) खोलने वाली एक बिंदु स्प्रेड फ़ंक्शन (पीएसएफ) फ़ाइल बनाएं। सभी आवश्यक डेटा भरें ( तालिका 2 देखें)। ठीक दबाएँ और फ़ाइल सहेजें.
    3. विकल्प प्लगइन्स मेनू (http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/) से डीकन्वोल्यूशनलैब 29 प्लगइन खोलें। मिलान किए गए जेड-स्टैक छवि और पीडीएफ फ़ाइल को संबंधित विंडो स्लॉट पर खींचें।
    4. डीकॉन्वोल्यूशन एल्गोरिदम (जैसे, रिचर्डसन-लुसी) और पुनरावृत्तियों की संख्या (जैसे, 20) का चयन करें। चलाएँ दबाएँ.
    5. शीर्ष पर छवि मेनू से स्टैक का चयन करने वाली एकल जेड-स्टैक छवि में विकृत छवियों को मिलाएं। फिर Z Project क्लिक करें। प्रोजेक्शन प्रकार ड्रॉपडाउन मेनू से अधिकतम तीव्रता का चयन करें, OK दबाएँ और फ़ाइल सहेजें।
    6. ऊपर दिए गए चरण में बनाई गई एकल जेड-स्टैक छवि फ़ाइल का उपयोग करके एक आरजीबी छवि बनाएं, जिसमें शीर्ष पर छवि मेनू से रंग का चयन करने वाले वांछित स्यूडोकलर हों। फिर मर्ज चैनल्स पर क्लिक करें। ड्रॉपडाउन मेनू से इच्छा रंग चैनल के लिए संबंधित छवि सेट करें। कम्पोजिट बनाएं बॉक्स को अनचेक करें, ओके दबाएं और फ़ाइल सहेजें (चित्रा 4 देखें)।
    7. यदि एक से अधिक चैनल छवि है, तो चरण 8.2.1\u20128.2.5 दोहराएँ। चरण 8.2.6 के बाद एक RGB छवि फ़ाइल बनाएँ, कम से कम दो छवि फ़ाइलें खोलें और प्रत्येक छवि फ़ाइल के लिए अलग-अलग रंग चैनल चुनें ( चित्रा 4 देखें)।

Representative Results

ऊपर वर्णित विधियों को स्वैच्छिक शारीरिक गतिविधि के बाद वयस्क चूहे हिप्पोकैम्पस में नवजात कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए लागू किया गया था, बिना किसी अतिरिक्त शारीरिक गतिविधि के एक नियंत्रण समूह के विपरीत। हमने प्रसवोत्तर चूहे हिप्पोकैम्पस को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया। 3 महीने की उम्र के नर चूहे सात दिनों के लिए स्वैच्छिक शारीरिक गतिविधि प्रोटोकॉल (अंतहीन पहिया) के तहत थे। दिन 6 पर, चूहों को बीआरडीयू (खंड 2) के साथ इंजेक्शन दिया गया था, और हर 12 घंटे बाद तीन पूर्ण इंजेक्शन तक। तीन कोशिका चक्र विभाजनों को पूरा करने के लिए, जानवरों को अंतिम बीआरडीयू इंजेक्शन के 8 घंटे बाद ट्रांसकार्डियल रूप से संक्रमित (धारा 3) किया गया था। इसी प्रक्रिया का उपयोग तीन महीने के चूहों पर किया गया था जो तुलनात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए शारीरिक गतिविधि से नहीं गुजरते थे। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक दिन के चूहे पिल्ले (प्रसवोत्तर दिन 1) को एक बार बीआरडीयू के साथ इंजेक्ट किया गया था, जैसा कि ऊपर अनुभाग 2 में वर्णित है। इंजेक्शन (प्रसवोत्तर दिन 2) के एक दिन बाद, पिल्ले को इच्छामृत्यु दी गई थी, और उनके सिर को पीएफए समाधान में डुबोया गया था, जैसा कि चरण 3.4 में वर्णित है। वयस्क चूहों को गहराई से एनेस्थेटाइज्ड (चरण 3.1), ट्रांसकार्डियल रूप से संक्रमित किया गया था, जैसा कि चरण 3.2 में वर्णित है। दिमाग को विच्छेदित और पोस्ट-फिक्स्ड किया गया था (चरण 3.4)। मस्तिष्क को 40 μm कोरोनल वर्गों (चरण 3.5) में काट दिया गया था। चरण 4 में वर्णित बीआरडीयू इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए अनुभागों को संसाधित किया गया था।

हमने डीएबी आईएचसी के साथ हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया का उपयोग धुंधला (चरण 4.1) और डीजी में बीआरडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं की गिनती के लिए किया। चित्रा 5 बीआरडीयू-लेबल कोशिकाओं के साथ एक डीजी अनुभाग दिखाता है। चित्रा 5सी, डी उच्च आवर्धन पर डीजी अनुभाग का एक प्रतिनिधि हिस्सा दिखाता है। लेबल वाली कोशिकाओं ने तीव्र गहरे धब्बे दिखाए, जिन्हें तीरों से चिह्नित किया गया था। इनसेट प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों में लेबल कोशिकाओं की औसत संख्या दिखाता है (चरण 8.1 में वर्णित सकारात्मक कोशिकाओं को छह से गुणा किया गया है)। एक छात्र के टी-टेस्ट ने बीआरडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं (टी (10) = 2.704 , पी = 0.0222) की संख्या के बीच महत्वपूर्ण अंतर का खुलासा किया। नियंत्रण समूह जो शारीरिक गतिविधि से नहीं गुजरता था, उसने 2,040 ± 314 कोशिकाओं (एन = 6 चूहे) को दिखाया। इसकी तुलना में, शारीरिक गतिविधि समूह ने औसतन, 3,606 ± 486 (एन = 6 चूहे) बीआरडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं को दिखाया। जैसा कि देखा गया है, शारीरिक गतिविधि जोखिम बीआरडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं को बढ़ाता है। इसलिए, ये परिणाम अन्य रिपोर्ट किए गए परिणामों के अनुरूप हैं जो दिखाते हैं कि शारीरिक गतिविधि ने वयस्क डेंटेट गाइरस17 में सेलुलर प्रसार में वृद्धि की है।

Figure 3
चित्रा 3: बीआरडीयू-लेबल सेल न्यूक्लियस के विभिन्न आकृति विज्ञान के उदाहरण। बीआरडीयू एक डीएनए संश्लेषण मार्कर है जो नाभिक को लेबल करता है। हिप्पोकैम्पस क्षेत्र में, बीआरडीयू-पॉजिटिव नाभिक में एक अर्ध-अंडाकार आकार था जो डेंटेट गाइरस उप-दानेदार क्षेत्र में स्थित था। चूंकि बीआरडीयू को प्रतिस्पर्धा द्वारा शामिल किया गया है, इसलिए प्रत्येक कोशिका के लिए शामिल राशि में एक भिन्नता होगी जो बाद में प्रतिबिंबित होगी कि नाभिक की कल्पना कैसे की जाएगी। (ए) इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि। (बी) एक अतिरिक्त प्रवर्धन विधि के बिना पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया का उपयोग करके एक छवि प्रस्तुत की जाती है। पीले तीर कलाकृतियों और गैर-विशिष्ट संकेतों को दिखाते हैं। काले या सफेद तीर बीआरडीयू + कोशिकाओं को दिखाते हैं। 1 – पूरी तरह से दायर नाभिक, अर्ध-अंडाकार नाभिक अत्यधिक रंगीन। 2 – बिंदुओं के साथ नाभिक, नाभिक की सीमा चिह्नित होती है और कई बिंदुओं के अंदर होती है। 3 – कुछ बिंदुओं वाले नाभिक, नाभिक की सीमा चिह्नित होती है और अंदर कम संख्या में बिंदु होते हैं। 4 – छोटे नाभिक एक अलग भेदभाव चरण में संभव कोशिकाएं हैं लेकिन फिर भी आला का हिस्सा हैं। 5 – क्लस्टर विभाजन के तहत अग्रदूत कोशिकाएं हैं, इसलिए संघनित समूहों में एक साथ कई कोशिकाओं को देखा जा सकता है। इन समूहों के भीतर, सकारात्मक कोशिकाओं को गलत लेबल करने से बचने के लिए गिनती विशेष रूप से सावधानी से की जानी चाहिए। लाल तीर विभाजन के तहत नाभिक दिखाते हैं जिसे एकल कोशिका के रूप में भ्रमित किया जा सकता है। प्रत्येक सेल एक बॉक्स में संलग्न है और वास्तविक समय में जेड-अक्ष विमान में प्रतिष्ठित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एकल और विलय किए गए चैनलों के लिए प्रतिनिधि आरजीबी छवि। शीर्ष छवि मूल जेड-स्टैक छवि दिखाती है, और निचली छवि 3 डी डी जटिल जेड-स्टैक छवि दिखाती है। (ए) डीजी का कम आवर्धन। (बी) प्रत्येक चैनल के लिए आरजीबी छवि, और (सी) आरजीबी मर्ज छवि। यह नियंत्रण समूह से एक मस्तिष्क था। इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग एक अतिरिक्त प्रवर्धन विधि के बिना किया गया था। बीआरडीयू (लाल), डीएपीआई एक काउंटरस्टेनिंग (नीला) के रूप में, और जीएफएपी (ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन) एक एस्ट्रोग्लियाल मार्कर (हरा) के रूप में। एमएल = आणविक परत; जीसीएल = दानेदार कोशिका परत; एसजीजेड = उप-समूह क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए बीआरडीयू लेबल कोशिकाओं (तीव्र अंधेरे) के साथ प्रतिनिधि डीजी अनुभाग। पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया का उपयोग एविडिन-बायोटिन-पेरोक्सीडेज जटिल प्रवर्धन विधि के साथ किया गया था। (ए, बी) DG का कम आवर्धन दिखाएँ, और (C, D) बॉक्स क्षेत्र को उच्च आवर्धन पर दिखाएँ। पैनल ए और सी शारीरिक गतिविधि समूह से ऊतक हैं, पैनल बी और डी नियंत्रण समूह से हैं। इनसेट शारीरिक गतिविधि और नियंत्रण समूहों में लेबल कोशिकाओं की औसत संख्या दिखाता है (चरण 8.1 में वर्णित सकारात्मक कोशिकाओं को छह से गुणा किया गया है)। एमएल = आणविक परत; जीसीएल = दानेदार कोशिका परत; एसजीजेड = सबग्रेनुलर ज़ोन; तीर बीआरडीयू + कोशिकाओं को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1: विभिन्न परतों में वितरित जेड-अक्ष के साथ सकारात्मक कोशिकाओं का एक अलग फोकस दिखाने वाला वीडियो। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: विभिन्न परतों में वितरित जेड-अक्ष के साथ सकारात्मक सेल क्लस्टर का एक अलग फोकस दिखाने वाला वीडियो। एक क्लस्टर को एकीकृत करने वाले सभी कई नाभिकों को निर्धारित करने के लिए जेड-अक्ष पर धीरे-धीरे आगे बढ़ें। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

माइक्रोस्कोप प्रकार: एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप ओलंपस बीएक्स 53
प्रकाश स्रोत: उच्च दबाव 130 डब्ल्यू पारा चाप लैंप (यू-एचजीएलजीपीएस)
अधिग्रहण सॉफ्टवेयर: CellSens Standard
फ़िल्टर सेट: कैटलॉग नंबर उत्तेजना रेंज डाइक्रोमैटिक दर्पण दमन रेंज
U-FUW 340 - 490 एनएम 410 एनएम 420 एनएम
U-FBW 460 - 495 एनएम 505 एनएम 510 एनएम
U-FGW 530 - 550 एनएम 570 एनएम 575 एनएम
कैमरा: नमूना: CCD-कैमरा UC50
वर्णक्रमीय सीमा: 290 - 1000 एनएम
सीसीडी चिप का आकार: 2/3 इंच, 2588 (चौड़ाई * 7) X 1960 (ऊंचाई * 8) पिक्सेल
पिक्सेल आकार: 3.4 X 3.4 μm
फ्लोरोक्रोम: नाम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (एनएम) उत्सर्जन * 3 तरंग दैर्ध्य (एनएम) उत्सर्जन रंग
4, 6-डायमिडिनो-2-फिनाइल-इंडोल एचसीआई (DAPI) 345 455 नीला
टेट्रामिथाइलरोडामाइन-आइसोथियोसाइनेट (TRITC) 541 572 लाल
फ्लोरेसिन-आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) 494 519 हरा
Cy3 552 565 लाल
माउंटिंग मध्यम और विसर्जन तेल: नाम मीडिया के अपवर्तन का सूचकांक *1
हवा (स्लाइड और लेंस के बीच कुछ भी नहीं) 1.00029
DAPI के साथ एंटीफैड माउंटिंग माध्यम 1.45
परमाउंट माउंटिंग मीडियम 1.519
कम ऑटोफ्लोरेसेंस विसर्जन तेल (एमओआईएल -30 टाइप एफ) 1.518
आवर्धन लेंस (प्लान फ्लोराइट) आवर्धन न्यूमेरिकल एपर्चर (एनए) *2 Resolution (μm) छवि पिक्सेल रिक्ति (एनएम) * 5 स्लाइस स्पेसिंग जेड-अक्ष (एनएम) * 6
4X 0.13 2.12 850 3000
10X 0.3 0.92 340 3000
20X 0.5 0.55 170 2000
40X 0.75 0.37 85 1000
100X 1.3 0.21 34 1000

तालिका 2: माइक्रोस्कोप सेटअप विनिर्देश और बिंदु प्रसार फ़ंक्शन (पीएसएफ) फ़ाइल निर्माण आवश्यकताएं। पीएसएफ फ़ाइल बनाने के लिए विवर्तन पीएसएफ 3 डी प्लगइन विंडो में 11 स्लॉट हैं। प्रत्येक स्लॉट को निम्नानुसार वर्णित किया गया है: *1 - मीडिया के अपवर्तन का सूचकांक: स्लाइड और लेंस के बीच माध्यम के लिए अपवर्तन का सूचकांक (उदाहरण के लिए, वायु = 1.00029)। * 2 - न्यूमेरिकल एपर्चर: लेंस का एनए उपयोग किया जाता है (इसे ठीक किया जाना चाहिए जब एक अलग विसर्जन मीडिया का उपयोग किया जाता है और लेंस को सौंपा गया था)। * 3 - तरंग दैर्ध्य: फ्लोरोक्रोम अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य (एनएम)। * 4 - अनुदैर्ध्य गोलाकार विपथन: 0.00. * 5 - छवि पिक्सेल रिक्ति: सीसीडी पिक्सेल आकार (एनएम)/आवर्धन (उदाहरण के लिए, 3.4 μm और 100X लेंस, 3400/100 = 34 nm)। * 6 - छवियों जेड-अक्ष के बीच की दूरी। * 7 - चौड़ाई: पिक्सेल में विभाजित होने के लिए छवि की चौड़ाई दर्ज करें। * 8 - ऊंचाई: पिक्सेल में विभाजित होने के लिए छवि की ऊंचाई दर्ज करें। * 9 - गहराई, स्लाइस: जेड-स्टैक में छवियों की संख्या। * 10 - सामान्यीकरण: पिक्सेल मानों का योग = 1. * 11 - शीर्षक: पीएसएफ फ़ाइल के लिए वांछित नाम। फ़ाइल को अद्वितीय दिए गए जेड-स्टैक छवि के साथ मेल खाना चाहिए।

Discussion

वयस्क न्यूरोजेनेसिस एक ऐसी प्रक्रिया है जो वयस्क तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं के आला में सबसे अधिक बार होती है जिसमें उनके जीवनकाल में नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करने की क्षमता होती है। ब्रोमोडॉक्स्यूरिडिन (बीआरडीयू) लेबलिंग का व्यापक रूप से इम्यूनोलॉजी में वयस्क मस्तिष्क में नई उत्पन्न कोशिकाओं की संख्या को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है। बीआरडीयू को मुख्य रूप से असतत मस्तिष्क क्षेत्रों (न्यूरोजेनिक क्षेत्रों) की कोशिकाओं में शामिल किया जाएगा। ये कोशिकाएं उप-वेंट्रिकुलर ज़ोन (एसवीजेड) में स्थित होती हैं, हिप्पोकैम्पस के डेंटेट गाइरस- हिलस और दानेदार कोशिकाओं के बीच जिन्हें उप-दानेदार क्षेत्र (एसजीजेड) 1,2,18 के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, वयस्कता में कम प्रोलिफेरेटिव क्षमता की विशेषता वाले विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्र हैं, जिनमें हाइपोथैलेमस, स्ट्रेटम, नियोकॉर्टेक्स और एमिग्डाला19 शामिल हैं। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, बीआरडीयू धुंधलापन सेल प्रसार का पता लगाने के लिए वयस्क न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है। हालांकि, मार्कर के रूप में बीआरडीयू के उपयोग की सीमाएं और नुकसान हैं। पहला यह है कि बीआरडीयू एक सेल चक्र मार्कर है। इसलिए, सेल भाग्य की पहचान करने के लिए डबल या ट्रिपल स्टेनिंग किया जाना चाहिए और लेबल की गई कोशिकाओं के विशिष्ट विकास चरण का पता लगाने के लिए सेल मार्करों को शामिल करना चाहिए। बीआरडीयू के बारे में एक और चिंता यह है कि यह एक विषाक्त और म्यूटाजेनिक समाधान है जो डीएनए स्थिरता को संशोधित करता है जो सेलुलर फ़ंक्शन और सेल चक्रों को बदल सकता है। प्रशासन प्रोटोकॉल और प्रशासन खुराक (50 \u2012600 mg / kg) का पालन करने का निर्णय लेते समय पिछली जानकारी पर विचार किया जाना चाहिए। एक और महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि बीआरडीयू एक डीएनए संश्लेषण मार्कर है, न कि सेल प्रसार मार्कर14। इसलिए, सेल प्रसार को अन्य घटनाओं जैसे डीएनए की मरम्मत, गर्भपात सेल चक्र पुन: प्रवेश और जीन दोहराव से अलग करना प्रासंगिक है। शोधकर्ताओं को बीआरडीयू के उचित उपयोग को सुनिश्चित करने के लिए उचित नियंत्रणों का पालन करना चाहिए। इन समस्याओं और सीमाओं के बारे में अधिक विस्तृत चर्चा के लिए, हम ताउपिन के काम14 की समीक्षा करने की सलाह देते हैं। एक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल की मानकीकरण प्रक्रिया धीमी और चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इस काम में, हमने एक सफल आईएचसी प्रोटोकॉल का प्रबंधन करने के लिए सभी सामान्य चरण प्रस्तुत किए हैं। हालांकि, हम अनुशंसा करते हैं कि प्रत्येक शोध समूह पहले से ऊतक, एंटीबॉडी और स्थितियों का परीक्षण और मूल्यांकन करता है। परीक्षण और मूल्यांकन प्रत्येक एंटीबॉडी और ऊतक परीक्षण के लिए ऊष्मायन, धोने के चरणों और शक्तियों के कम से कम तीन अलग-अलग स्तरों के साथ किया जाना चाहिए। हम यह भी अनुशंसा करते हैं कि शोधकर्ता 20,21,22,23,24,25 विशिष्ट आवश्यकताओं और आवश्यकताओं को पूरा करने वाले सर्वोत्तम को चुनने में सक्षम होने के लिए अतिरिक्त प्रोटोकॉल की समीक्षा करें।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, प्रक्रिया में कई चरण और पद्धतिगत विचार शामिल हैं जो आमतौर पर वैज्ञानिक लेखों में उपयोग और उल्लेख किए जाते हैं, जिन पर बाद में चर्चा की जाएगी। हम अनुशंसा करते हैं कि शोधकर्ता तकनीक, बजट, उपकरण, सेटअप और मुख्य अनुसंधान लक्ष्य के संदर्भ में एंटीबॉडी को सावधानीपूर्वक और सही ढंग से चुनें। एंटीबॉडी को उसी प्रकार के ऊतक के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए जिसे बाद में प्रयोग में परीक्षण किया जाएगा। हम एक एंटीबॉडी के उपयोग की भी सलाह देते हैं जिसे एक ही उद्देश्य (आईएचसी) के लिए परीक्षण किया गया था (यानी, न केवल पश्चिमी धब्बा या प्रवाह साइटोमेट्री तकनीकों में) निर्धारण तकनीक के साथ इसकी संगतता का परीक्षण करने के लिए। बीआरडीयू धुंधला करने के लिए विभिन्न मार्गों का उपयोग किया जा सकता है जैसे कि इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन, इंट्रापरिटोनियल इन्फ्यूजन, मौखिक अंतर्ग्रहण, या इंट्रावेंट्रिकुलर इन्फ्यूजन (प्रत्येक तकनीक के अधिक विस्तृत विवरण के लिए, संदर्भ26 देखें)। यदि इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन का चयन किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि बीआरडीयू आंत क्षेत्र से बचने के लिए पेरिटोनियल गुहा में प्रशासित है। चूंकि आंत में दोहराव में कई कोशिकाएं होती हैं जो मस्तिष्क तक पहुंचने से पहले बीआरडीयू को समाप्त कर सकती हैं जो लेबल कोशिकाओं की संख्या को प्रभावित करेगी। पतले वर्गों को प्राप्त करना महत्वपूर्ण है क्योंकि वे समाधानों के बेहतर प्रवेश की अनुमति देते हैं। केम्परमैन एट अल.27 द्वारा प्रस्तावित स्टीरियोलॉजिकल प्रक्रिया का पालन करते हुए, 40 μm मोटी कोरोनल स्लाइस को रोस्ट्रो-पुच्छल रूप से काटा गया था और 24-वेल सेल कल्चर प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को स्लाइड पर लगाए गए ऊतक के साथ या फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन के रूप में किया जा सकता है। चूंकि बीआरडीयू कोशिका नाभिक में गहराई से स्थित है, इसलिए यह मुक्त-फ्लोटिंग वर्गों में समाधानों के प्रवेश की अनुमति देता है जो रुचि के क्षेत्र में बेहतर परिणाम और बेहतर पहुंच प्रदान करता है। प्राथमिक एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी पहुंच की अनुमति देने के लिए डीएनए बॉन्ड (डीएनए विकृतीकरण) खोलना महत्वपूर्ण है। इस काम में, हमने एचसीआई इनक्यूबेशन के उपयोग के साथ इन विशिष्ट प्रक्रियाओं को अंजाम दिया। दूसरी ओर, अस्पष्ट एपिटोप्स को अवरुद्ध करने की प्रक्रिया ने सेल सिग्नल की अधिक सटीक पहचान की अनुमति दी।

अच्छी झिल्ली परमेबिलाइजेशन एंटीबॉडी को हित क्षेत्र में ठीक से प्रवेश करने की अनुमति देता है। पीबीएस ++ और पीबीएस + समाधानों में ट्राइटन एक्स -100 जैसे परमेबिलाइज़र को जोड़ने से झिल्ली परमेबिलाइजेशन में सुधार होता है। इस प्रोटोकॉल में पीबीएस और ट्राइस-बफर्ड सेलाइन (टीबीएस) अभिकर्मकों दोनों का उपयोग किया जा सकता है। बजट के संदर्भ में, टीबीएस पीबीएस की तुलना में सापेक्षता सस्ता हो सकता है। हालांकि, पीबीएस एंटी-फॉस्फेट एंटीबॉडी के साथ हस्तक्षेप कर सकता है और क्षारीय फॉस्फेट-संयुग्मित एंटीबॉडी को रोक सकता है, इसलिए पीबीएस के उपयोग से बचें यदि लक्ष्य फॉस्फोराइलेशन (यानी, फॉस्फोराइलेटेड) द्वारा पोस्ट ट्रांसलेशनल रूप से संशोधित है। हमने इस काम के लिए पीबीएस का उपयोग किया, और हमें पता चला कि ऊतक धोने के कदमों ने अधिक विशिष्ट संकेत दिया। हम शोधकर्ताओं को टीबीएस ओ पीबीएस का उपयोग करके कम से कम तीन धोने के चक्र करने की भी सलाह देते हैं। समाधान ताजा तैयार किया जाना चाहिए। एंटीजन पुनर्प्राप्ति (एआर) एक विधि है जिसका उद्देश्य निर्धारण के कारण एंटीजेनिसिटी के नुकसान को कम करना है जो तृतीयक और चतुर्धातुक एंटीजन की संरचना को संशोधित करता है। यह कमी एंटीजन को एंटीबॉडी28,29 द्वारा पता लगाने योग्य बनाती है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले गर्मी-प्रेरित एपिटोप पुनर्प्राप्ति (HIER) ने उच्च तापमान या मजबूत क्षारीय हाइड्रोलिसिस (ईडीटीए पीएच 8.5 या ट्रिस पीएच 9.5 के रूप में अन्य बफर समाधानों के साथ) द्वारा फॉर्मलाडेहाइड और प्रोटीन के बीच रासायनिक प्रतिक्रियाओं को उलटने का प्रयास किया। परिणामों की तुलना करने और प्रोटोकॉल के लिए सबसे अच्छा चुनने के लिए विभिन्न एआर प्रोटोकॉल के साथ नए एंटीबॉडी का परीक्षण करना आवश्यक है। यह अंतिम चरण एक नियमित प्रोटोकॉल में वैकल्पिक हो सकता है; हालांकि, हमने इस प्रोटोकॉल के लिए बेहतर परिणाम प्रदान करने के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल के साथ ऊतकों का इलाज किया।

गैर-धुंधला संरचना को दृश्यमान बनाने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से प्राथमिक धुंधला रंग को ढंकने से बचने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक धुंधला रंग और विधि को ध्यान में रखते हुए सही अंतिम विपरीत रंग और काउंटरस्टेन तकनीक का चयन करना महत्वपूर्ण है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए, DAPI (4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल) एक बहुत लोकप्रिय परमाणु और क्रोमोसोम काउंटरस्टेन है जो डीएनए के एटी क्षेत्रों से जुड़ने पर नीले प्रतिदीप्ति (अवशोषण: 360 एनएम, उत्सर्जन: 460 एनएम) का उत्सर्जन करता है। DAPI युक्त माउंटिंग माध्यम उपलब्ध है और उपयोग करना आसान है; यह छवि अधिग्रहण के लिए उत्कृष्ट संकेत प्रतिधारण प्रदान करता है। पेरोक्साइड प्रतिक्रिया के लिए, आईएचसी विभिन्न विकल्पों में उपलब्ध था जैसे कि क्रेसिल वायलेट, हेमेटॉक्सिलिन, तटस्थ लाल, या मिथाइल ग्रीन स्टेनिंग। कई इम्यूनोस्टेनिंग तकनीकों के लिए, क्रॉस-रिएक्टिविटी30 से बचने के लिए उपयोग की जाने वाली निर्धारण तकनीक के साथ एक संगत एंटीबॉडी चुनना महत्वपूर्ण है। जब एकल धुंधलापन के साथ मुद्दों और जटिलताओं को हल किया जाता है, तो आवश्यक समझे जाने पर एक और रंग धुंधला करें। द्वितीयक एंटीबॉडी के बीच गैर-विशिष्ट बंधन को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है। यह प्राथमिक एंटीबॉडी की एक ही मेजबान प्रजाति में उत्पादित द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करने से पहले प्राथमिक एंटीबॉडी को संतृप्त करके किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, बकरी द्वितीयक एंटीबॉडी में उत्पादित खरगोश और एंटी-खरगोश में उत्पादित एंटी-माउस का उपयोग करते समय, बकरी एंटीबॉडी में उत्पादित एंटी-खरगोश का उपयोग खरगोश एंटीबॉडी में उत्पादित एंटी-माउस से पहले किया जाना चाहिए। जब अनुक्रमिक विधि पूरी तरह से हावी हो जाती है, तो एक साथ इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया शुरू की जा सकती है। इस विधि में, माध्यमिक एंटीबॉडी को उचित रूप से चुनना आवश्यक है। आदर्श रूप से, क्रॉस-रिएक्टिविटी से बचने के लिए उन सभी एंटीबॉडी को एक ही मेजबान जानवर से आना चाहिए। हम यह पुष्टि करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण चलाने की सलाह देते हैं कि धुंधला विधि प्रसवोत्तर हिप्पोकैम्पस ऊतक (इस उम्र के आसपास प्रचुर मात्रा में न्यूरोजेनेसिस) में सटीक रूप से काम करती है। यदि सकारात्मक नियंत्रण ऊतक धुंधला समस्याएं दिखाता है, तो प्रक्रिया की समीक्षा करें और उस पर जाएं, सुधार और समायोजन करें, और तब तक दोहराएं जब तक कि एक अच्छा धुंधलापन उत्पन्न न हो। फिर, यह परीक्षण करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण चलाएं कि एंटीबॉडी सामान्य सीरम (प्राथमिक एंटीबॉडी के समान प्रजाति) के साथ एक विशेष प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़कर या प्रतिस्थापित करके सही ढंग से काम करता है। जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, छवि डीकन्वोल्यूशन एक शक्तिशाली उपकरण है और एक विकल्प प्रदान करता है जब एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप उपलब्ध नहीं होता है। यह प्रेषित प्रकाश उज्ज्वल-क्षेत्र, वाइड-फील्ड फ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त सभी छवियों पर छवि डीकन्वोल्यूशन को लागू कर सकता है। छवि डीकॉन्वोल्यूशन का अंतिम उद्देश्य मूल संकेत का पुनर्निर्माण करना है कि अधिग्रहण प्रणाली10 खराब हो जाती है।

सारांश में, थाइमिडीन एनालॉग बीआरडीयू के इम्यूनोडिटेक्शन द्वारा कल्पना की गई नई उत्पन्न कोशिकाओं की पहचान एक जटिल लेकिन शक्तिशाली तकनीक है। यह काम वैज्ञानिकों की मदद करने का एक प्रयास है, विशेष रूप से वयस्क हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनेसिस के क्षेत्र में, नई कोशिकाओं को अधिक सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए। हमें उम्मीद है कि यह प्रयास वैज्ञानिक समुदाय के लिए सहायक रहा है और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री तकनीक द्वारा सेल प्रसार के अध्ययन को ठीक करना आसान बनाता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए श्री मिगुएल बर्गोस और गुस्तावो लागो को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम अभिकर्मकों और सामग्री प्रदान करने में उनके समर्थन के लिए डॉ. क्लोरिंडा एरियस, डॉ. कार्ला हर्नांडेज़ और डॉ. ऑस्कर गैलिसिया को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। हम इस काम के प्रदर्शन के लिए धन प्रदान करने और वीडियो उत्पादन खर्चों को कवर करने के लिए यूनिवर्सिड इबेरोअमेरिकाना सियुदाद डी मेक्सिको के डिविज़ियन डी इन्वेस्टिगासियोन वाई पोस्ग्राडो को भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENT PREPARATION AND SETUP
Donor Horse Serum BioWest S0900 Blocking and incubation solutions in PBS
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma-Aldrich P6148 toxic, flammable
Potassium Chloride Sigma-Aldrich 746436-500G
Potassium Phosphate, monobasic J.T Bker 3246-01
Sacarose J.T Baker 4072-01
Sodium Chloride Meyer 2365-500G
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G Corrisive, to calibrate pH
Sodium Phophate Dibasic Sigma-Aldrich S9763-5KG
Triton-x 100 Sigma-Aldrich T8787
THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
23–27G hypodermic needle BD PrecisionGlide
Saline solution PiSA 30130032
Syringes 1 mL NIPRO
TISSUE PREPARATION
15-ml polypropylene conical tube Thermo Scientific 339650
50-ml polypropylene conical tube Thermo Scientific 339652
Dissecting tools
Guillotine Stoelting
Microtome Cryostat MICROM HM525
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3477 pre-loaded in 12-well culture plates
Netwell plastic 12-well carrier kit Corning 3520 for 15 mm polyester mesh membrane inserts
Netwell plastic 6-well carrier kit Corning 3521
Perfusion pump Cole-Parmer 7553-70
Shaker IKA ROKCER 3D Digital
IMMUNOSTAINING
Cresyl violet Sigma-Aldrich C5042 1%, Light sensitive
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 carcinogenic, light sensitive
Hydochloric Acid J.T.Baker 9535-05 Corrosive, to calibrate pH
Hydrogen Peroxide, 50% Meyer 5375-1L Toxic, oxidative
Permount Mounting Medium Fisher Chemical SP15-500
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Light sensitive
VECTASTAIN® Elite® ABC Kit Peroxidase (HRP) Vector Laboratories PK-6100 enzymatic, avidin/biotin based amplification system
Primary antibodies
Anti-GFAP antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich HPA056030 1:500
Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse Sigma-Aldrich B2531 1:250
Secondary antibodies
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-065-151 1:250
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP Invitrogen G-21040 1:1000
Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC Sigma-Aldrich T5393 1:250
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC Invitrogen F-2765 1:250
Streptavidin, Cy3 Vector Laboratories SA-1300 1:250
IMAGING AND ANALYSIS
Computer Dell Computer Company T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB For controlling and monitoring protocols’ processes
CCD-camera Olympus UC50
CellSens Standard software Olympus cellSens Standard Edition Acquisition Software
Epifluorescent microscope Olympus BX53
High-pressure 130 W mercury arc lamp Olympus U-HGLGPS
low autofluorescence immersion oil Olympus MOIL-30 Type F
Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24  60 mm)
Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76  26 mm)
U-FBW filter cube Olympus U-FBW excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm
U-FGW filter cube Olympus U-FGW excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm
U-FUW filter cube Olympus U-FUW excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm

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References

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जीव विज्ञान अंक 163 बीआरडीयू हिप्पोकैम्पस डेंटेट गाइरस न्यूरोजेनेसिस एंटीजन पुनर्प्राप्ति पहचान के तरीके निर्धारण इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री इम्यूनोफ्लोरेसेंस मानकीकरण समस्या निवारण छवि डीकन्वोल्यूशन
थाइमिडीन एनालॉग बीआरडीयू का उपयोग करके चूहों में सेलुलर प्रसार और न्यूरोजेनेसिस का विश्लेषण करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री तकनीक
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Buenrostro-Jauregui, M., Tapia-de-Jesús, A., Mata, J., Rodríguez-Serrano, L. M., Chávez-Hernández, M. E., Mata, F., Monroy-Plasencia, M., Alonso-Flores, A. C., Leal-Galicia, P. Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU. J. Vis. Exp. (163), e61483, doi:10.3791/61483 (2020).

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