Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Immunohistokemi tekniker för att analysera cellulär proliferation och neurogenes hos råttor med hjälp av tymidinanalogen BrdU

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61483
Automatic Translation
*1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, *1
1Laboratorio de Neurociencias, Departamento de Psicología, Universidad Iberoamericana Ciudad de México, 2Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma del Estado de México
* These authors contributed equally

Summary

Denna artikel presenterar fyra av de vanligaste teknikerna för att visualisera BrdU-positiva celler för att mäta vuxen neurogenes hos råttor. Detta arbete inkluderar instruktioner för reagensberedning, tymidinanalog administrering, transkardiell perfusion, vävnadsberedning, peroxidasimmunhistokemisk reaktion, immunofluorescens, signalförstärkning, motfärgning, mikroskopiavbildning och cellanalys.

Abstract

En av de viktigaste sakerna inom vuxen hippocampus neurogenes (AHN) är identifieringen av de nygenererade cellerna. Immunodetektion av tymidinanaloger (såsom 5-Bromo-2'-deoxiuridin (BrdU)) är en standardteknik som används för att visualisera dessa nygenererade celler. Därför injiceras BrdU vanligtvis i små djur intraperitonealt, så tymidinanalogen införlivas i delande celler under DNA-syntesen. Detektion utförs genom immunohistokemisk analys av hjärnskivor. Varje forskargrupp som har använt denna teknik kan uppskatta att den kräver särskild uppmärksamhet på små detaljer för att uppnå en framgångsrik fläck. Till exempel är ett viktigt steg DNA-denaturering med HCl, vilket gör att den kan nå cellkärnan för att fläcka den. De befintliga vetenskapliga rapporterna beskriver dock mycket få av sådana steg i detalj. Därför är det utmanande för nya laboratorier att standardisera tekniken eftersom det kan ta flera månader att ge positiva och framgångsrika resultat. Syftet med detta arbete är att beskriva och utarbeta stegen för att få positiva och framgångsrika resultat av immunfärgningstekniken i detalj när man arbetar med tymidinanalogen BrdU. Protokollet innefattar reagensberedning och installation, administrering av tymidinanalog i en gnagare, transkardiell perfusion, vävnadsberedning, peroxidasimmunohistokemisk reaktion, användning av avidin-biotinkomplex, immunofluorescens, motfärgning, mikroskopiavbildning och cellanalys.

Introduction

Tanken att nya neuroner genereras i den vuxna mänskliga hjärnan under hela livslängden har fascinerat det vetenskapliga samfundet i årtionden. Kunskapen om att hjärnan genererar nya nervceller under hela sin livslängd uppnåddes genom detektion av celler under division 1,2. Detektion av nygenererade nervceller i den vuxna hjärnan identifierades först genom intrakraniellt injicering av tritierat tymidin (tymidin-H3) hos råttor och detektion av celler i cellcykeln med autoradiogram 1,2. Celldelning av glia och närvaron av neuroblaster rapporterades, vilket var de första lovande uppgifterna om postnatal neurogenes1. Ändå innebar användningen och detekteringen av tymidin-H3 användningen av radioaktivitet, vilket kan vara skadligt för de människor som hanterar det. Den första ansträngningen som undersökte lämpligheten av BrdU-immunhistokemi i studien av spridning, migration och ursprung för celler i nervsystemet uppträdde 1988 av Miller och Nowakowski3. År 1998 visade en artikel publicerad av Eriksson och kollegor att nya neuroner visualiserades postmortem i den mänskliga vuxna hjärnan hos patienter injicerade med 5-Bromo-2′-deoxiuridin (BrdU)4. Dessa patienter fick BrdU-injektionen (250 mg intravenöst) för att märka tillväxten av tumörer4. Denna teknik antogs i djurmodeller. Införandet av dessa metoder markerade en milstolpe för fältet eftersom detta möjliggjorde detektion av nygenererade celler utan användning av radioaktiva föreningar. Denna procedur blev guldstandarden för att mäta cellproliferation i vuxna hjärnnischer för att främja ytterligare forskning inom området.

Begränsningen av tymidinanalogtekniken är att den inte tillåter bestämning av cellulär identitet för de nygenererade cellerna. Immunohistokemi tillåter oss emellertid att utföra dubbel- eller trippelmärkningsteknik för samma cell, vilket validerar de nygenererade cellernas cellulära öde och till och med deras mognadsstadier, vilket leder till ytterligare utveckling av fältet. Denna metod karakteriserades för att differentiera nygenererade celler till glia, odifferentierade neuroner eller en helt mogen granulär cell, och till och med för att avgöra om de deltar aktivt i kretsarna. Ett annat genombrott inom området var användningen av transgena modeller för att identifiera odifferentierade celler under domänen nestin. De nestin-GFP-transgena mössen uttrycker ett förbättrat grönt fluorescerande protein (GFP), som är under kontroll av nestinpromotorn. Nestin är ett mellanliggande filament som kännetecknas av stamceller5. De nestin-GFP-transgena mössen fick etablera tidiga utvecklingssteg involverade i neurogenes6. En betydande begränsning är dock att kunna upprätthålla en nestin-GFP-transgen mösskoloni under speciella förhållanden i en laboratorieanläggning som blir kostnadseffektiv för vissa vetenskapliga grupper, särskilt de från utvecklingsländer.

De tekniker som nämns ovan har fördelar och nackdelar. Identifiering av prolifererande celler genom immunohistokemi (IHC) och möjligheten att utföra dubbel- eller trippelmärkningsteknik genom immunofluorescens för att identifiera cellmognadsstadium eller cellöde representerar dock det mest genomförbara sättet att mäta vuxen neurogenes, hittills. Identifieringsprocessen med immunhistokemi består av märkning av proteiner, proteindomän eller nukleotider med en specifik antikropp som möjliggör deras erkännande som kallas primär antikropp. Den senare känns igen av den sekundära antikroppen, som är märkt med en kromogen (t.ex. pepparrotsperoxidas) eller en fluorokrom (t.ex. FITC) i kombination med den sekundära antikroppen. Mikroskop kan detektera både kromogener och fluorokromsignaler. Med hjälp av IHC är det möjligt att identifiera membranproteiner, cytoskelettproteiner eller kärnkomponenter såsom BrdU. Å andra sidan kan BrdU hittas i cellkärnan eftersom den införlivas i DNA under S-fas genom konkurrens. Därför är ett avgörande steg DNA-denatureringen med HCl, som öppnar DNA-bindningar för att ge BrdU-antikroppen tillgång till BrdU i DNA. Det är viktigt att veta att BrdU finns i en mättad koncentration i möss och råttserum i 15 respektive 60 minuter, efter intraperitoneal administrering, och sjunker sedan snabbt till omätbara nivåer vid 60 respektive 120 min7.

Här beskriver vi fyra olika men närbesläktade IHC-tekniker: kromogen indirekt detektion med pepparrotsperoxidas (HRP) reaktion med DAB (3,3'-diaminobenzidin) sans signalförstärkning (steg 4.1), avidin-biotinkomplex (ABC) förstärkning (steg 4.1), indirekt immunofluorescensdetektering utan signalförstärkning (steg 4.4) och märkt streptavidin-biotin (LSAB) förstärkning (steg 4.3). Varje metod har för- och nackdelar och kan vara användbar för specifika vävnadskrav (se tabell 1). Vi bestämde oss för att följa indirekta ICH-metoder på grund av deras överkomliga priser och enkelhet att göra förändringar från kromogena till fluorescerande detektionsmetoder vid användning av okonjugerade primära antikroppar. HRP-metoden är en vanligt förekommande IHC-metod på grund av dess överkomliga priser, höga stabilitet, höga omsättningshastighet och substratens fulla tillgänglighet. Ändå rekommenderar vi att du använder en positiv kontroll för att bekräfta att färgningsmetoden fungerar korrekt och användningen av negativ kontroll för att testa antikroppsfunktionen effektivt. Flera immunfärgningar eller multiplex IHC-metoder (se steg 6) är potenta verktyg för att förvärva stora mängder data från vävnadssektionen i ett enda experiment. Denna teknik är särskilt viktig när tillgången på prover är begränsad. En annan fördel är möjligheten att samtidigt identifiera specifika proteiner som uttrycks i samma cellulära utrymme samtidigt som vävnadens integritet bevaras. Multiplex gör det möjligt att färga olika markörer uttryckta under specifika proliferativa stadier (t.ex. nestin, GFAP, DCX, Ki-67), vilket gör att vi kan nå en mer detaljerad spridnings- och differentieringsforskning8. Det är viktigt att välja antikroppar som är kompatibla med den fixeringsteknik som används för att undvika korsreaktivitet. Vi rekommenderar att du testar varje ny antikropp (inklusive BrdU) individuellt för att justera och förfina metoden. Introducera sedan den dubbla sekventiella färgningen och slutligen starta den samtidiga immunfärgningsprocessen när den sekventiella metoden är helt dominerad. Det är viktigt att välja lämpliga sekundära antikroppar för denna metod.

Metod Specifik metod Fördelar Nackdelar
Indirekt detektionsmetod Peroxidasreaktion med DAB 1. Högre känslighet än metoden för direkt detektion och indirekt fluorescens.
2. Högre motståndskraft mot fotoblekning än fluorokromer.
3. Lägre kostnad än fluorescensdetekteringsmetod		 1. Svårt för multiplexering med färre färgfärger.
2. Komplicerat för samuttryckta mål i samma cellulära utrymme.
3. Reducerat dynamiskt omfång för samtidiga knappa och höga rikliga mål på samma vävnad.
Fluorescens 1. Bäst och enklast för multiplexering med fler färgfärger.
2. Bäst för samuttryckta mål i samma cellulära utrymme.
3. Bättre dynamiskt omfång för samtidiga knappa och höga rikliga mål på samma vävnad.
4. Inga ytterligare steg.		 1. Lägre känslighet än den indirekta peroxidasreaktionen med DAB-metoden.
2. Svagt motstånd mot fotoblekning över tid.
3. Dyrare.
Metod för signalförstärkning Avidin-Biotin-komplexet (ABC) 1. Högre känslighet än den direkta och indirekta detektionsmetoden.
2. Minska bakgrunden		 1. Ytterligare steg.
2. Dyrare än inte förstärkning.
Märkt Streptavidin-Biotin (LSAB) 1. Högre känslighet än den direkta och indirekta detektionsmetoden.
2. Mer omfattande vävnadspenetration än ABC-metoden.
3. Minska bakgrunden		 1. Ytterligare steg.
2. Dyrare än ABC-metoden.
Inte ytterligare förstärkningsmetod 1. Lägre kostnad.
2. Inga ytterligare steg.
3. Perfekt för höga rikliga mål.		 1. Lägre känslighet: problematisk utan rikliga mål.

Tabell 1: För- och nackdelar med IHC-tekniker. Denna tabell visar fördelarna/nackdelarna med indirekta detektionsmetoder: Peroxidasreaktion med (3,3'-diaminobenzidin) DAB och fluorescens; och signalförstärkningsmetoder: avidin-biotinkomplex (ABC), märkt streptavidin-biotin (LSAB), och inte ytterligare förstärkningsmetod.

En högupplöst bild är grundläggande för att utföra korrekt analys och presentera resultaten. Det finns två metoder för att förbättra upplösningen: 1) användning av en bättre mikroskopdesign (t.ex. konfokal, multifoton) eller 2) numeriskt invertera suddighetsprocessen för att förbättra bilder med dekonvolution9. Tyvärr är konfokalmikroskopi inte överkomligt på grund av de höga kostnaderna för utrustning och dess service10. Ett bredfältsepifluorescensmikroskop och den efterföljande dekonvolutionen av z-stackbilderna ger ett lämpligt, billigt alternativ till konfokalmikroskopi 8,9. Som nämnts ovan är dekonvolutionsmålet att återställa den ursprungliga signalen som försämrades av förvärvssystemet9, genom att minska oskärpa, out-of-focus dis och distorsion som visas i bilden erhållen av ett epifluorescens eller konfokalmikroskop med hjälp av matematiska borttagningsalgoritmer10. Den förvärvade suddiga bilden kan matematiskt modelleras som ett resultat av att de observerade objekten konvolveras med en 3D-punktspridningsfunktion (PSF). PSF är ett teoretiskt diffraktionsmönster av de ljuspunkter som avges av vävnadsprovet och samlas in av mikroskopet. PSF-filen skapas med de specifika förhållandena för varje bild, såsom kamerans CCD-cellavstånd, brytningsindex för det använda mediet, objektivlinsens numeriska bländare, fluoroforens emissionsvåglängd, bildstorlekar, antal bilder i z-stack-bearbetningsmetoden och utrymmet mellan dem (se teknisk specifikation i tabell 2). Med andra ord sammanfattar PSF-filen effekterna av bildinställningen på mikroskopobservationerna9. Vi använder dock diffraktionen PSF 3D Plugin (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) för att skapa vår egen specifika PSF-fil för varje z-stack-bild. Z-stack-bilder är en serie digitaliserade optiska sektioner från definierade djup (z-axel) på samma XY-plats för bilden. En dator sammanställer den information som erhålls från fokusplanet genom att omtilldela signaler som har sitt ursprung från objekt som befinner sig i andra fokalplan. För att skapa z-stack-bilder är det nödvändigt att ta bilder från olika fokuserade lager av bilderna (t.ex. tio olika bilder av samma XY-område var 1 μm djup). Sedan använder vi mikroskopiprogramvara som tillhandahålls av tillverkaren eller Fiji för att skapa en z-stack eller 3D-bild. Resultatet blir en enda stapelbildfil (t.ex. tio bilder med olika fokus). Det finns flera kundspecifika verktyg och mjukvarulösningar, till exempel programvara med öppen källkod för dekonvolutionsmikroskopi. Vi kommer att visa utgångarna från dekonvolutionsprocessen med DeconvolutionLab29 som är ett Fiji11-plugin (distribution av ImageJ12). Dekonvolution hjälper till att förbättra upplösningen av slutliga mikrografer (se figur 1B, C ). För ytterligare information och instruktioner rekommenderar vi starkt att du läser referens13.

Figure 1
Bild 1: Representativ bild av 3D-dekonvolution för flera färgkanaler. A) GD med låg förstoring. (B) De ursprungliga z-stackbilderna för varje kanal och den sammanslagna bilden. (C) 3D-dekonvoluterade z-stack-bilder för varje kanal och den sammanslagna bilden. Denna hjärna var från råttan som var en del av fysisk aktivitetsgrupp. Märkt streptavidin-biotin (LSAB) förstärkningsmetod användes. Den visade Cy3 streptavidinkonjugerad antikropp för att indikera BrdU (röd), DAPI som en motfärgning (blå) och glialfibrillärt surt protein (GFAP) som en astroglial markör (grön). ML = molekylärt skikt; GCL = granulärt cellskikt; SGZ = subgranulär zon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Syftet med detta arbete är att ge en detaljerad beskrivning av stegen för att uppnå positiva och framgångsrika resultat med immunfärgning och att lista vanliga steg i BrdU-baserade studier, utan användning av ett konfokalmikroskop. BrdU-färgning är en teknik som kräver flera steg som måste följas noggrant för att uppnå en framgångsrik fläck. Att standardisera dessa färgningstekniker tar vanligtvis månader och är tids- och resurskrävande. Vi förväntade oss att den här artikeln skulle kunna ge information till de grupper som börjar inom detta område genom att minska tid och fel.

Protocol

Alla procedurer följer National Institutes of Health guide för vård och användning av laboratoriedjur (NIH Publications Nr 8023, reviderad 1978) och lokala mexikanska lagar för att minimera antalet djur som används och deras lidande. Etikkommittén vid Universidad Iberoamericana godkände försöksprotokollen för användning av djur i denna studie.

1. Reagensberedning och installation

OBS: De flesta lösningarna kan beredas dagar före användning om inte annat anges.

  1. BrdU-lösning
    1. Hämta BrdU-lösningen från frysen -20 °C och låt den balansera vid rumstemperatur (RT).
    2. Beräkna massan av BrdU som behövs för en dos på 50 mg/kg beroende på råttans kroppsvikt. Beräkna volymen av 0,9% saltlösning (0,9 g NaCl i 100 ml steriltH2O) som behövs för en arbetslösning på 20 mg / ml. Förbered ett överskott för att ge minst 0,5 ml per råtta per injektion.
      OBS: Dosen som administreras till försöksdjur ska vara säker, med minimala biverkningar och effektiv. Det har rapporterats att färgningstiden med 100 mg/kg BrdU inte uppväger den potentiellt högre toxiciteten jämfört med dosen50 mg/kg 7. Inga signifikanta skillnader hittades i antalet BrdU-märkta celler/mm3 för 50 och 100 mg/kg i.p. hos råttor7. Det är att föredra att injicera en liten dos för att minimera djurens lidande.
    3. Väg upp BrdU-lösningen och tillsätt den till saltlösningen i ett koniskt rör och virvel.
      OBS: Förvärm saltlösningen vid 45\u201250 °C i ett vattenbad för volymer större än 1 ml.
    4. Placera röret i ett vattenbad vid 50 °C i 10\u201215 min och virvla var 2\u20123 min tills det är helt upplöst. Filtrera lösningen med ett sprutfilter för steril injektion. Täck röret med tennfolie, kyl ner det vid rumstemperatur och använd omedelbart.
      VARNING: BrdU-lösningen är giftig och potentiellt cancerframkallande. Förbered den i dragskåpet. BrdU-lösningen måste hanteras med korrekt skyddsutrustning (PPE). Det rekommenderas att förbereda lösningen omedelbart före användning. Lösningen är dock stabil i 24 timmar under RT. Skydda den från ljus.
  2. För att bereda 1 liter 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid pH 7,4, tillsätt 240 mg kaliumfosfatmonobasiskt (KH2PO4), 1,44 g natriumfosfatdibasiskt (Na2HPO4), 200 mg kaliumklorid (KCl) och 8 g natriumklorid (NaCl) till 800 ml dubbeldestillerat vatten (ddH2O) under konstant omrörning. Justera pH-värdet till 7,4 och tillsätt dubbeldestilleratH2O-värdeupp till den totala volymen på 1 liter. Förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka.
  3. För 100 ml PBS+, tillsätt 3% (3 ml) normalt hästserum och 0,3% (300 μL) Triton X-100 till 0,1 M PBS (pH 7,4). Förvaras i 20\u201250 ml alikvoter vid -20 °C i upp till 3 månader.
    Alternativt kan TBS användas istället för PBS. Alla andra serum som skiljer sig från värdens antikroppar och experimentella vävnad är lämpliga.
  4. För 100 ml PBS++, tillsätt 10% (10 ml) normalt hästserum och 0,3% (300 μL) Triton X-100 till 0,1 M PBS pH 7,4. Förvaras i 20\u201250 ml alikvoter vid -20 °C i upp till 3 månader.
  5. För 1 liter kryoskyddande lösning, blanda 250 ml etylenglykol och 250 ml glycerol, rör om hela tiden tills det blandas. Ta långsamt till 1 L med PBS. Filtrera med filterpapper av klass 4 (20\u201225 μm). Förvaras vid 4 °C eller RT i upp till 1 år.
  6. Bered 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS (PFA-lösning) enligt följande. För 1 liter lösning, tillsätt långsamt 40 g paraformaldehydpulver till 800 ml 60\u201265 °C 0,1 M PBS under konstant omrörning. Rör om tills paraformaldehyd är helt upplöst under kontroll av temperaturen (60\u201265 °C). Tillsätt vid behov några droppar 1 M NaOH för att klargöra lösningen. När lösningen når rumstemperatur, filtrera med filterpapper av klass 4 (20-25 μm).
    VARNING: Paraformaldehyd är giftigt och misstänks vara cancerframkallande, förbered dig i dragskåpet. Förvaras vid 4 °C och använd helst inom 2 dagar. PFA-färdig lösning är kommersiellt tillgänglig.
  7. För 1 liter 10 mM natriumcitratbuffert (SCB) vid pH 6, tillsätt 1,204 g natriumcitrat (dihydrat) och 1,134 g citronsyra till 800 ml dubbeldestilleratH2O-värdeunder konstant omrörning. Justera pH-värdet till 6,0 och tillsätt ddH2Oupp till 1 L. Förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader.
  8. Bered 50 ml 2 N HCl genom att långsamt tillsätta 8,25 ml 12 N HCl (koncentrerad stamlösning) till 41,75 ml ddH2Ounder konstant omrörning.
    VARNING: Förbered dig i dragskåpet. Lösningen måste beredas omedelbart före användning.
    OBS: 2 N HCl kommer att användas för DNA-denaturering, ett avgörande steg. Eftersom BrdU införlivas i DNA används HCl för att öppna DNA-bindningarna så att BrdU-antikroppar får tillgång till BrdU i DNA.
  9. Förbered endogen peroxidasblockerande lösning enligt följande. Bered 100 ml 0,6% väteperoxid genom att blanda 2 ml 30% väteperoxid med 98 ml ddH2O under konstant omrörning.
    OBS: Lösningen måste beredas omedelbart före användning. Håll den i mörkret eftersomH2O2är ljuskänslig. PBS eller TBS kan användas istället för vatten.
  10. Förbered avidin-biotinkomplex (ABC) lösning enligt instruktionerna från tillverkaren. För 5 ml ABC i 0,1 M PBS, tillsätt 2 droppar (≈100 μL) reagens A och blanda och tillsätt sedan 2 droppar (≈100 μL) reagens B och blanda.
    OBS: Lösningen måste beredas och får tumla-rulla i 20\u201230 min före användning.
  11. Förbered DAB (Diaminobenzidine) peroxidas (HRP) substrat med hjälp av satsen genom att följa tillverkarens instruktioner. Till 5 ml ddH 2 O, tillsätt 2 droppar (≈ 84 μL) reagens 1 och blanda, tillsätt 4 droppar (≈ 100 μL) reagens 2 och blanda, tillsätt sedan2droppar (≈ 80 μL) reagens 3 och blanda. Slutligen, om så önskas, tillsätt 2 droppar (≈ 80 μl) reagens 4 (nickel) och blanda.
    OBS: Lösningen måste beredas omedelbart före användning.
    VARNING: DAB är giftigt och potentiellt cancerframkallande. Det måste hanteras med försiktighet och kasseras enligt förordningen om farligt avfall vid varje institution. För att inaktivera DAB, tillsätt flera droppar blekmedel (natriumhypoklorit); Lösningen blir svart.
  12. Bered 100 ml kresylviolett lösning genom att tillsätta 100 mg kresylviolettacetat och 250 μl ättiksyra till 80 mlddH2OOvid 55\u201260 °C. Justera volymen till 100 ml, filtrera och förvara vid 4 °C i ett mörkfärgat kärl.
    OBS: Användaren uppmuntras att testa olika koncentrationer av den cresylvioletta lösningen innan den används på värdefulla vävnadsprover. Resultatet kan vara mörkare för motfärgning med vissa vävnadsprover, vilket kan minska förmågan att räkna BrdU-positiva celler exakt.

2. Tymidin analog BrdU-administrering

  1. Håll tillbaka försöksdjuret (t.ex. 90 dagar gammal Wistar-råtta som väger 350 g) genom att immobilisera den nedre bukhålan.
  2. Administrera BrdU-lösningen (50 mg/kg) intraperitonealt (i.p.) med en 23 G nål och 1 ml spruta.
    OBS: Justera injektionsvolymen enligt djurets vikt. Använd en 23\u201227 G nål och en 1\u20125 ml spruta för vuxna råttor. Den maximala tolerabla intraperitoneala injektionsvolymen hos den vuxna råttan är 10 ml. Olika vägar kan användas för att administrera BrdU-lösningen14. Till exempel intraperitoneal injektion eller oral administrering genom dricksvatten.

3. Vävnadsberedning

OBS: Tre månader gamla råttor fick ad libitum tillgång till fysisk aktivitet (oändligt hjul) i sju dagar. På dag 6 injicerades råttor med BrdU (steg 2) 3 gånger med intervaller om 12 timmar. Utför steg i avsnitt 3 efter 8 timmar efter den sista BrdU-injektionen.

  1. Injicera pentobarbital (50 mg/kg i.p.) och vänta några minuter tills djuret är djupt bedövat.
    OBS: Se till att djuret är helt sövt innan du fortsätter. Nyp försiktigt ett av benen eller svansen. Om djuret reagerar på stimulansen, vänta några minuter till. Om djuret inte reagerar på nypan, gå till nästa steg.
  2. Exponera hjärtat genom att skära bukhålans hud under bröstbenet, ta isär revbenen och skära membranet.
  3. Transkardiell perfusionsfixering
    1. Sätt in en nål i vänster kammare och gör ett litet snitt i höger atrium. Använd en pump eller gravitation, perfuse (flödeshastighet 5\u20127 ml/min.) 0,1 M PBS tills hela blodet dräneras ut och lösningen blir klar.
    2. Använd en pump eller gravitation, utför kall perfusion (flödeshastighet 5\u20127 ml/min) med PFA-lösning för att fixera vävnaden tills svansen blir stel.
      OBS: Vanligtvis kräver en 300 g råtta cirka 100 \ u2012150 ml av PFA-lösningen. Vävnadsfixeringen är valfri. Därmed kan hjärnan extraheras för användning i olika processer för att minimera djuranvändningen i experimenten.
  4. Dissektion och postfixering
    1. Halshugga djuret och extrahera försiktigt hjärnan från skallen. Sänk ner hjärnan i ett koniskt rör som innehåller PFA-lösning (~40 ml för en råtta på 250 mg) i 1\u20122 dagar vid 4 °C.
      OBS: Överfixera inte (mer än 48 timmar), eftersom detta kan tömma vävnadsfärgningen på grund av att antigener inte är tillgängliga.
    2. Förbered 100 ml 30% sackaroslösning, tillsätt 30 g sackaros till 70 ml 0,1 M PBS-lösning under konstant omrörning. Tillsätt 0,1 M PBS-lösning till 100 ml. Sänk ner hjärnan i ett koniskt rör med en 30% sackaroslösning (35 ml) i cirka 1\u20122 dagar vid 4 °C tills hjärnan sjunker till botten av röret.
  5. Skär koronala hjärnsektioner
    OBS: Att använda en kryostat-mikrotom kräver vägledning och utbildning. För detaljerade instruktioner, se referens15.
    1. Sänk ner hela hjärnan i isopentan vid -80 °C och håll den vid -80 °C i 10 minuter. Placera hjärnan i en inbäddningsmatris på en kryostat-mikrotomplatta.
      OBS: Under vissa förhållanden kan snabb frysning av hjärnan vid -80 ° C orsaka fraktur eller skada på vävnaden. Användaren bör vara medveten om detta problem. Om så är fallet, använd -20 °C iso-pentan för att frysa hjärnan.
    2. Använd en kryostat-mikrotom (temperatur vid -25 till -20 ° C) skurna koronasektioner med en tjocklek på 40 μm. Överför sekventiellt sektioner till en 24-brunns cellodlingsplatta med kryoskyddslösning enligt guiden i figur 2. Förvaras vid -20 °C tills det används, i upp till några månader.
      OBS: Bearbeta därefter all vävnad i fritt flytande seriella sektioner på 40 μm i 12-brunnsplattor med nätinsatser i mild och kontinuerlig omrörning (10 rpm). Det är möjligt att lagra hjärnsektioner i flera år under rätt förhållanden.

Figure 2
Figur 2: Schematisk illustration av sekventiellt överföring av sektioner från kryostat-mikrotom till en 24-brunns cellodlingsplatta med kryoskyddslösning. Börja vid A1-brunnen och placera nästa skivor i rad A; efter A6-brunn flytta till nästa rad B, så vidare. När du anländer D6, gå tillbaka till A1 och fortsätt. Detta arrangemang tillåter Nth (t.ex. sjätte för neurogenes, motsvarande innehållet i en kolumn) sektionskvantifiering av en hel hjärnregion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. Immunfärgning

OBS: Se tabell 1 för en sammanfattning av fördelarna och nackdelarna med varje teknik.

  1. Detektion av BrdU med användning av peroxidasreaktion med DAB
    OBS: Utför steg 4.1.1 till 4.1.5 dag 1.
    1. Överför skivor från kryoskyddslösningen till 0,1 M PBS vid rumstemperatur. Skölj tre gånger i 10 min vardera, med 0,1 M PBS.
    2. Inkubera skivor i 30 minuter i endogen peroxidasblockerande lösning för att inaktivera endogent peroxidas. Skölj 3 gånger, 10 min vardera, med 0,1 M PBS. Alternativt kan du utföra antigenhämtning (se avsnitt 5). Inkubera skivor i 20 minuter med 2 N HCl vid 37 °C. Skölj i 0,1 M boratbuffert (8,5 pH) i 10 min. Skölj 3 gånger i 10 min vardera, med iskall 0,1 M PBS.
    3. Inkubera skivor i 2 timmar vid rumstemperatur med PBS ++ (blockerande lösning). Inkubera med anti-BrdU primär antikropp (musvärd) i koncentration av 1:250 i PBS+ över natten vid 4 °C.
    4. På dag 2, skölj skivorna 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS.
    5. Inkubera med 1:250 HRP-konjugerad sekundär antikropp (antimus) i PBS+ i 2\u20124 h vid rumstemperatur. Skölj 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS.
    6. Överför skivor till DAB-peroxidas (HRP) substratlösning och inkubera i 2\u201210 min. När skivorna blir mörkgrå, visualisera vävnaden med ett förstoringsglas eller ett mikroskop. Om positiva celler är närvarande, skölj 3 gånger (i 15 min vardera) med kranvatten (för att minska bakgrunden). Tvätta 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS.
    7. Montera försiktigt skivor på gelatiniserade bilder med en mjuk borste, lufttorka över natten vid rumstemperatur. Motfärgning (se avsnitt 7.1), lägg till permanent monteringsmedium och placera täckblad. Förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader.
  2. Detektion av BrdU med användning av peroxidasreaktion med avidin-biotin-peroxidaskomplexet
    OBS: Utför steg 4.2.1 till 4.2.5 på dag 1.
    1. Överför skivor från kryoskyddslösningen till 0,1 M PBS för att få till rumstemperatur. Skölj 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS.
    2. Inkubera i 30 minuter med endogen peroxidasblockerande lösning för att inaktivera endogent peroxidas. Skölj 3 gånger i 10 min vardera i 0,1 M PBS. Alternativt kan du utföra antigenhämtning (se avsnitt 5).
    3. Inkubera i 20 minuter med 2 N HCl vid 37 °C. Skölj i 0,1 M boratbuffert (pH 8,5) i 10 min. Tvätta 3 gånger i 10 min vardera med iskalla 0,1 M PBS.
    4. Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur i PBS++ (blockerande lösning).
    5. Inkubera med anti-BrdU primär antikropp (musvärd) 1:250 i PBS+ över natten vid 4 °C.
    6. På dag 2, skölj 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS.
    7. Inkubera med 1:250 biotinylerad sekundär antikropp (antimus) i PBS+ i 2\u20124 timmar vid rumstemperatur. Skölj 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS.
    8. Inkubera i ABC-lösningen i 1 h vid rumstemperatur. Skölj 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS.
    9. Överför skivor till DAB-peroxidas (HRP) substratlösning och inkubera i 2\u201210 min. När skivorna blir mörkgrå, visualisera vävnaden med ett förstoringsglas eller ett mikroskop. Om positiva celler är närvarande, skölj 3 gånger (15 min vardera) med kranvatten (för att minska bakgrunden) följt av 3 gånger med 0,1 M PBS-tvätt i 10 minuter vardera.
      OBS: Lösningen måste beredas omedelbart före användning. Försiktighet bör vidtas för att undvika att hjärnskivor klibbar fast vid varandra på grund av oregelbundna mörka fläckar i vävnaden.
    10. Montera försiktigt skivor på gelatiniserade bilder med en mjuk borste och lufttorka sedan över natten vid rumstemperatur.
    11. Motfläcka vid behov (se steg 7.1), lägg till permanent monteringsmedium och placera täckglas. Förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader.
  3. Detektion av BrdU genom immunofluorescens med märkt Streptavidin-Biotin (LSAB) förstärkning
    OBS: Utför steg 4.3.1 till 4.3.4 dag 1.
    1. Överför skivor från kryoskyddslösningen till 0,1 M PBS vid rumstemperatur. Skölj 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS. Alternativt kan du utföra antigenhämtning (se avsnitt 5).
    2. Inkubera i 20 minuter i 2 N HCl vid 37 °C. Skölj i 0,1 M boratbuffert (8,5 pH) i 10 min. Skölj 3 gånger i 10 min vardera i iskalla 0,1 M PBS.
    3. Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur i PBS++ (blockerande lösning). Inkubera med 1:250 anti-BrdU primär antikropp (musvärd) i PBS+ över natten vid 4 °C.
    4. På dag 2, skölj 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS.
    5. Inkubera med 1:250 biotinylerad sekundär antikropp (antimus) i PBS+ i 2\u20124 timmar vid rumstemperatur. Skölj 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS. Inkubera med 1:250 fluorokromkonjugerat streptavidin (Cy3) i PBS (använd inte serum) i 1\u20122 h vid rumstemperatur. Skölj 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS.
      OBS: Serum kan innehålla biotin och bör inte tillsättas till spädningsvätskor. Använd istället PBS som innehåller 0,3% av Triton X-100.
    6. Montera försiktigt skivor på gelatiniserade bilder med en mjuk borste, lufttorka över natten vid rumstemperatur eller montera omedelbart med ett lämpligt monteringsmedium. Motfläck (se steg 7.2), lägg till permanent monteringsmedium och placera täckblad. Förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader.
  4. Detektion av BrdU genom indirekt immunofluorescens
    OBS: Utför steg 4.4.1 till 4.4.4 dag 1.
    1. Överför skivor från kryoskyddslösningen till 0,1 M PBS tills den når rumstemperatur. Skölj 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS. Utför antigenhämtning vid behov (valfritt, se avsnitt 5).
    2. Inkubera i 20 minuter i 2 N HCl vid 37 °C. Skölj i 0,1 M boratbuffert (8,5 pH) i 10 min. Skölj 3 gånger i 10 min vardera med iskalla 0,1 M PBS. Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur med PBS++ (blockeringslösning). Inkubera med 1:250 anti-BrdU primär antikropp (musvärd) i PBS+ över natten vid 4 °C.
    3. På dag 2, skölj 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS.
    4. Inkubera med 1:250 fluorokromkonjugerad sekundär antikropp (antimus) i PBS+ i 2\u20124 timmar vid rumstemperatur. Skölj 3 gånger i 10 min vardera med 0,1 M PBS.
    5. Montera försiktigt skivor på gelatiniserade bilder med en mjuk borste, lufttorka över natten vid rumstemperatur eller montera omedelbart med ett lämpligt monteringsmedium. Motfläck (se steg 7.2), lägg till permanent monteringsmedium och placera täckblad. Förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader.

5. Antigenhämtning (valfritt)

OBS: Antigenhämtning är ett valfritt steg som är avsett att korrigera förlusten av antigenicitet orsakad av fixering som modifierar den tertiära och kvartära strukturen hos många antigener, vilket gör dem omöjliga att upptäcka av antikroppar. Detta steg kan läggas till i det ursprungliga protokollet.

  1. Förvärm 10 mM natriumcitratbuffert (SCB) pH 6-lösning i mikrovågsugn eller vattenbad till 90\u201295 °C (beroende på höjd börjar lösningen koka runt denna temperatur). Fyll 80% av ett 50 ml koniskt rör (40 ml) med förvärmd SCB. Överför skivor till nätinsatser i det koniska röret med SCB. Täck röret med ett skruvlock med hål gjorda med en 18\u201220 G nål.
  2. Håll skivorna i 30 minuter i SCB vid 80\u201285 °C alternerande uppvärmningscykler i mikrovågsugnen vid lägsta effektnivå. Fyll vid behov på det koniska röret med SCB. Överför skivor omedelbart efter tillsammans med nätinsatserna till iskall 0,1 M PBS och skölj 3 gånger i 10 min vardera.

6. Flera immunfärgningar (valfritt)

OBS: Se introduktionsavsnittet för motiveringen bakom detta steg.

  1. Samtidiga multipla immunfärgningar
    1. Förbered en cocktail med de primära antikropparna mot målet (t.ex. mus anti-BrdU och kanin anti -GFAP) i PBS +. Använd olika värdar för varje primär antikropp som används. Inkubera över natten vid 4 °C. Fortsätt med samma nästa steg för varje protokoll.
    2. Bered en cocktail med motsvarande sekundära antikroppar för varje primär antikropp som används (t.ex. get-antimus-FITC, get-anti-kanin-TRITC) i samma spädningslösning för varje protokoll. Fortsätt med samma nästa steg för varje protokoll. Använd helst sekundära antikroppar som kommer från samma värdar för att undvika korsreaktion.
  2. Sekventiella multipla immunfärgningar.
    1. Följ protokollet för det första antikroppsmålet (t.ex. musens anti-BrdU) och stoppa innan skivorna monteras. Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur med PBS++ (blockeringslösning).
    2. Inkubera den andra primära antikroppen (t.ex. kanin anti -GFAP) i PBS+ över natten vid 4 °C. Följ nästa steg för varje protokoll, inklusive inkubation av den andra sekundära antikroppen (t.ex. get-anti-kanin TRITC). Fortsätt med nästa steg för varje protokoll till slutet.

7. Motfärgning (valfritt)

  1. För protokoll som använder peroxidasreaktion, förvärm den cresylvioletta lösningen till 60 °C. Hydrera bilderna med ddH2O i 1 min. Inkubera objektglasen i den heta kresylvioletta lösningen i 5\u201220 min.
    1. Skölj bilderna med ddH2O i 1 min. Skölj bilderna med 70%, 80%, 90% och 100% etylalkohol i 1\u20123 min vardera. Skölj bilderna med xylen i 1\u20123 min.
    2. Lägg till permanent hydrofobt monteringsmedium och placera täckblad.
      OBS: Förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader. Självtillverkat monteringsmedium som innehåller PVA (polyvinylalkohol) - DABCO kan användas.
  2. För protokoll som använder immunofluorescens, tillsätt en liten volym (25\u201250 μL) hydrofilt monteringsmedium med DAPI, propidiumjodid eller liknande. Försegla runt omkretsen med nagellack eller ett plasttätningsmedel. Förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader.

8. Bildbehandling och analys

OBS: Se tabell 2 för specifikationer för mikroskopinställning. Vanligtvis görs räkning av de färgade nya cellerna med hjälp av peroxidasreaktionsfärgade skivor (billigare metod), men det kan också utföras med immunofluorescens.

  1. För att kvantifiera celler, identifiera först dentate gyrus ordentligt med 4x förstoringslinsen (för ytterligare instruktioner om DG anatomiska detaljer, se Amaral et al.16).
    1. Sök i det granulära cellskiktet i dentate gyrus för kärnor märkta med BrdU (med 40x förstoringslinsen). Utför cellsökning uttömmande längs z-axeln eftersom nya celler kan distribueras i olika lager (se Video 1).
    2. Välj en intervallsektion för cellsökning över hela dentate gyrus (t.ex. var 6: e sektion av vävnad, motsvarande varje 240 μm).
    3. Räkna alla BrdU-positiva celler. Morfologin för den märkta kärnan kan förändras beroende på hur mycket BrdU cellen införlivade (se figur 3 som vägledning). Rör dig långsamt över z-axeln för att kvantifiera alla flera kärnor som integrerar ett kluster (se Video 2).
    4. Multiplicera det totala antalet räknade celler med intervallsektionen markerad (t.ex. 6) för att uppskatta det totala antalet BrdU-märkta nya celler.
    5. Helst, i ett regelbundet experiment, räkna minst tio sektioner per djur och minst fem djur per grupp.
  2. Bilddekonvolution (valfritt)
    OBS: Se introduktionsavsnittet för viktig information om detta steg. Denna procedur behöver monokromatiska bilder (gråskala). Omforma färgbilder till gråskala. Om bilderna är sammansatta av RGB delar du först kanalerna och sammanfogar dem som en enda bild (inte sammansatt) och omformar sedan till 8-bitars gråskala.
    1. Skapa en z-stack-fil från mikrografer.
    2. Skapa en PSF-fil (Point Spread Function) som öppnar Diffraction PSF 3D-plugin (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) från alternativet Plugins-menyn . Fyll i alla nödvändiga uppgifter (se tabell 2). Tryck på OK och spara filen.
    3. Öppna plugin-programmet DeconvolutionLab29 från menyn Plugins (http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/). Dra den matchade z-stack-bilden och PDF-filen till motsvarande fönsterplats.
    4. Välj dekonvolutionsalgoritmen (t.ex. Richardson-Lucy) och antalet iterationer (t.ex. 20). Tryck på RUN.
    5. Kombinera de invecklade bilderna till en enda z-stackbild genom att välja Staplar från menyn Bild högst upp. Klicka sedan på Z Project. Välj Maxintensitet i rullgardinsmenyn Projektionstyp , tryck på OK och spara filen.
    6. Skapa en RGB-bild med den enda z-stack-bildfilen som skapades i steget ovan med önskad pseudofärg som väljer Färg från bildmenyn högst upp. Klicka sedan på Slå samman kanaler. Ställ in motsvarande bild till önskad färgkanal från rullgardinsmenyn. Avmarkera rutan Skapa komposit, tryck på OK och spara filen (se bild 4).
    7. Om det finns mer än en kanalbild upprepar du stegen 8.2.1\u20128.2.5. Skapa en RGB-bildfil enligt steg 8.2.6, öppna minst två bildfiler och välj olika färgkanaler för varje bildfil (se bild 4).

Representative Results

Metoderna som beskrivs ovan tillämpades för att kvantifiera nyfödda celler i vuxen råtta hippocampus efter frivillig fysisk aktivitet, i motsats till en kontrollgrupp utan någon extra fysisk aktivitet. Vi använde postnatal råtta hippocampus som en positiv kontroll. Hanråttor 3 månaders ålder var under ett frivilligt fysiskt aktivitetsprotokoll (oändligt hjul) i sju dagar. På dag 6 injicerades råttor med BrdU (avsnitt 2) och var 12:e timme efter tre fullständiga injektioner. För att slutföra tre cellcykeldelningar perfuserades djuren transkardiellt (avsnitt 3) 8 timmar efter den sista BrdU-injektionen. Samma förfarande användes på tre månader gamla råttor som inte genomgick fysisk aktivitet för att användas som en jämförande kontroll. Som en positiv kontroll injicerades en dag gamla råttungar (postnatal dag 1) med BrdU en gång, enligt beskrivningen i avsnitt 2 ovan. En dag efter injektionen (postnatal dag 2) avlivades ungarna och deras huvuden nedsänktes i PFA-lösning, enligt beskrivningen i steg 3.4. Vuxna råttor var djupt sövda (steg 3.1), transkardiellt perfuserade, enligt beskrivningen i steg 3.2. Hjärnor dissekerades och postfixerades (steg 3.4). Hjärnorna skars i 40 μm koronasektioner (steg 3.5). Avsnitt behandlades för BrdU-immunhistokemi, enligt beskrivningen i steg 4.

Vi använde pepparrotsperoxidasreaktion med DAB IHC för färgning (steg 4.1) och räkning av BrdU-positiva celler i DG. Figur 5 visar ett GD-avsnitt med BrdU-märkta celler. Figur 5C,D visar en representativ del av generaldirektoratets sektion med högre förstoring. Märkta celler visade intensiv mörk färgning, som var markerade med pilar. Insatsen visar det genomsnittliga antalet märkta celler i experiment- och kontrollgrupperna (räknade positiva celler multiplicerade med sex enligt beskrivningen i steg 8.1). En students t-test avslöjade signifikansskillnader mellan antalet BrdU-positiva celler (t (10) = 2,704, p = 0,0222). Kontrollgruppen som inte genomgick fysisk aktivitet visade 2 040 ± 314 celler (n = 6 råttor). Som jämförelse visade gruppen fysisk aktivitet i genomsnitt 3 606 ± 486 (n = 6 råttor) BrdU-positiva celler. Som observerats ökar exponeringen för fysisk aktivitet BrdU-positiva celler. Därför överensstämmer dessa resultat med andra rapporterade resultat som visar att fysisk aktivitet ökade cellproliferationen hos den vuxna dentate gyrus17.

Figure 3
Figur 3: Exempel på olika morfologi hos BrdU-märkt cellkärna. BrdU är en DNA-syntesmarkör som märker kärnan. I hippocampusregionen hade de BrdU-positiva kärnorna en halv oval form belägen i dentate gyrus sub-granulär zon. Eftersom BrdU införlivas av konkurrens kommer mängden som införlivas för varje cell att ha en variation som senare kommer att återspeglas i hur kärnan kommer att visualiseras. (A) Immunofluorescensbild. (B) En bild med peroxidasreaktion utan ytterligare förstärkningsmetod presenteras. Gula pilar visar artefakter och icke-specifika signaler. Svarta eller vita pilar visar BrdU+-celler. 1 - Helt arkiverad kärna, halvovala kärnor mycket färgade. 2 - Kärnor med prickar, kärnans kant är markerad och har inuti flera prickar. 3 - Kärnor med få prickar, kärnans kant är markerad och har ett litet antal prickar inuti. 4 - Liten kärna är möjliga celler i ett annat differentieringsstadium men fortfarande en del av nischen. 5 - Kluster är prekursorceller under delning, därför kan flera celler tillsammans i kondenserade grupper observeras. Inom dessa grupper måste räkningen göras särskilt noggrant för att undvika felmärkning av positiva celler. Röda pilar visar kärnan under delning som kan förväxlas för att vara en enda cell. Varje cell är innesluten i en låda och kan särskiljas i ett Z-axelplan i realtid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Bild 4: Representativ RGB-bild för enskilda och sammanslagna kanaler. Den övre bilden visar den ursprungliga z-stackbilden och den nedre bilden visar den 3D-dekonvoluterade z-stackbilden. A) Låg förstoring av generaldirektoratet. (B) RGB-bild för varje kanal och (C) sammanfogad RGB-bild. Detta var en hjärna från kontrollgruppen. Immunofluorescens användes utan en ytterligare förstärkningsmetod. BrdU (röd), DAPI som motfärgning (blå) och GFAP (glialfibrillär surt protein) som en astroglial markör (grön). ML = molekylärt skikt; GCL = granulärt cellskikt; SGZ = subgranulär zon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Representativt GD-avsnitt med BrdU-märkta celler (intensivt mörkt) för varje experimentgrupp. Peroxidasreaktionen användes med avidin-biotin-peroxidaskomplexförstärkningsmetoden. (A, B) Visa en låg förstoring av GD och (C, D) visa rutområdet med högre förstoring. Panelerna A och C är vävnader från gruppen fysisk aktivitet, panelerna B och D är från kontrollgruppen. Insatsen visar det genomsnittliga antalet märkta celler i grupperna för fysisk aktivitet och kontroll (räknade positiva celler multiplicerade med sex enligt beskrivningen i steg 8.1). ML = molekylärt skikt; GCL = granulärt cellskikt; SGZ = subgranulär zon; pilar indikerar BrdU+-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1: Video som visar ett annat fokus för positiva celler längs z-axeln fördelade i olika lager. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 2: Video som visar ett annat fokus för positiva cellkluster längs z-axeln fördelade i olika lager. Rör dig långsamt över z-axeln för att kvantifiera alla flera kärnor som integrerar ett kluster. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Typ av mikroskop: Epifluorescens mikroskop Olympus BX53
Ljuskälla: Högtrycks 130 W kvicksilverbågslampa (U-HGLGPS)
Programvara för förvärv: CellSens Standard
Filteruppsättningar: Katalognummer Excitation intervall Dikromatisk spegel Undertryckande intervall
U-FUW 340 - 490 nm 410 nm 420 nm
U-FBW 460 - 495 nm 505 nm 510 nm
U-FGW 530 - 550 nm 570 nm 575 nm
Kamera: Modell: CCD-kamera UC50
Spektralområde: 290 – 1000 nm
CCD-chip storlek: 2/3 tum, 2588 (bredd *7) x 1960 (höjd *8) pixlar
Pixelstorlek: 3,4 x 3,4 μm
Fluorokrom: Namn Excitation våglängd (nm) Emission *3 Våglängd (nm) Utsläpp Färg
4, 6-diamidino-2-fenyl-indol HCI (DAPI) 345 455 Blå
Tetrametylrhodamin-isotyocyanat (TRITC) 541 572 Röd
Fluorescein-isotiocyanat (FITC) 494 519 Grön
Cy3 552 565 Röd
Montering Medium och nedsänkningsolja: Namn Index för medias brytning *1
Luft (inget mellan bilden och linsen) 1.00029
Antifade monteringsmedium med DAPI 1.45
Permount monteringsmedium 1.519
Olja med låg autofluorescens nedsänkning (MOIL-30 typ F) 1.518
Förstoringslins (Plan fluorit) Förstoring Numerisk bländare (NA) *2 Upplösning (μm) Bildpixelavstånd (nm) *5 Segmentavstånd Z-axel (nm) *6
4X 0.13 2.12 850 3000
10X 0.3 0.92 340 3000
20X 0.5 0.55 27S 2000
40X 0.75 0.37 85 1000
100X 1.3 0.21 34 1000

Tabell 2: Specifikationer för mikroskopinställning och krav på att skapa punktspridningsfunktioner (PSF). Det finns 11 platser i diffraktionsfönstret PSF 3D-plugin för att skapa PSF-filen. Varje kortplats beskrivs enligt följande: *1 - Brytningsindex för mediet: brytningsindex för mediet mellan bilden och linsen (t.ex. luft = 1,00029). *2 - Numerisk bländare: NA för lins som används (det måste korrigeras när ett annat nedsänkningsmedium används och linsen tilldelades). *3 - Våglängd: Fluorokrom maximal emissionsvåglängd (nm). *4 - Längsgående sfärisk avvikelse: 0,00. *5 - Bildpixelavstånd: CCD-pixelstorlek (nm)/Förstoring (t.ex. 3,4 μm och 100X-objektiv, 3400/100 = 34 nm). *6 - Avstånd mellan bilder Z-axel. *7 - Bredd: Ange bredden på bilden som ska avbildas i pixlar. *8 - Höjd: Ange höjden på bilden som ska avbildas i pixlar. *9 - Djup, segment: antalet bilder i z-stacken. *10 - Normalisering: Summan av pixelvärden = 1. *11 - Titel: Önskat namn för PSF-filen. Filen ska matcha den unika givna z-stack-bilden.

Discussion

Vuxen neurogenes är en process som förekommer oftast i nischer av vuxna neurala prekursorceller som har potential att generera nya nervceller under hela deras livslängd. Bromodeoxyuridin (BrdU) märkning används ofta i immunologi för att karakterisera antalet nygenererade celler i en vuxen hjärna. BrdU kommer huvudsakligen att införlivas i celler i diskreta hjärnregioner (neurogena zoner). Dessa celler är belägna i den subventrikulära zonen (SVZ), hippocampus dentate gyrus - mellan hilus och granulära celler som kallas subgranulär zon (SGZ)1,2,18. Dessutom finns det olika hjärnregioner som kännetecknas av en lägre proliferativ kapacitet i vuxen ålder, inklusive hypotalamus, striatum, neocortex och amygdala19. Som nämnts tidigare är BrdU-färgning den vanliga metoden för forskning om vuxen neurogenes för att upptäcka cellproliferation. Användningen av BrdU som markör har dock begränsningar och fallgropar. Den första är att BrdU är en cellcykelmarkör. Därför måste dubbel eller trippelfärgning utföras för att identifiera cellens öde och inkludera cellmarkörer för att detektera det specifika utvecklingsstadiet hos de celler som är märkta. Ytterligare en oro för BrdU är att det är en giftig och mutagen lösning som modifierar DNA-stabilitet kan förändra cellulär funktion och cellcykler. Hänsyn bör tas till tidigare information när man beslutar att följa ett administreringsprotokoll och administreringsdoser (50\u2012600 mg/kg). En annan avgörande egenskap är att BrdU är en DNA-syntesmarkör, inte en cellproliferationsmarkör14. Därför är det relevant att skilja cellproliferation från andra händelser såsom en DNA-reparation, abortiv cellcykelåterinträde och genduplicering. Forskare måste följa lämpliga kontroller för att säkerställa lämplig användning av BrdU. För en mer detaljerad diskussion om dessa problem och begränsningar rekommenderar vi att du granskar Taupins arbete14. Standardiseringsprocessen för ett immunhistokemiprotokoll kan vara långsam och utmanande. I detta arbete har vi presenterat alla allmänna steg för att hantera ett framgångsrikt IHC-protokoll. Vi rekommenderar dock att varje forskargrupp testar och utvärderar vävnad, antikroppar och tillstånd i förväg. Tester och utvärderingar måste utföras med minst tre olika nivåer av inkubationer, tvättsteg och styrkor för varje testad antikropp och vävnad. Vi rekommenderar också att forskare granskar ytterligare protokoll för att kunna välja det bästa som uppfyller specifika behov och krav 20,21,22,23,24,25.

Som tidigare nämnts innefattar förfarandet flera steg och metodologiska överväganden som vanligtvis används och nämns i vetenskapliga artiklar, som senare kommer att diskuteras. Vi rekommenderar att forskare väljer antikropparna noggrant och korrekt när det gäller teknik, budget, utrustning, installation och huvudforskningsmål. Antikroppar måste testas med samma typ av vävnad som senare kommer att testas i experimentet. Vi rekommenderar också användning av en antikropp som testades för samma ändamål (IHC) (dvs. inte bara i western blot- eller flödescytometritekniker) för att testa dess kompatibilitet med fixeringstekniken. Olika vägar kan användas för att administrera BrdU-färgningen, såsom intraperitoneal injektion, intraperitoneal infusion, oralt intag eller intraventrikulär infusion (för en mer detaljerad beskrivning av varje teknik, se referens26). Om den intraperitoneala injektionen väljs, se till att BrdU administreras i bukhålan och undvik tarmområdet. Eftersom tarmen har flera celler i duplicering som kan uttömma BrdU innan den kommer till hjärnan vilket kommer att påverka antalet märkta celler. Det är viktigt att få tunna sektioner eftersom de möjliggör en bättre penetration av lösningar. Koronala skivor på 40 μm tjocka skars rostro-caudally och överfördes till en 24-brunns cellodlingsplatta, enligt det stereologiska förfarandet som föreslagits av Kempermann et al.27. Immunohistokemin kan utföras med vävnad monterad på glidbanor eller som fritt flytande sektioner. Eftersom BrdU ligger djupt i cellkärnor möjliggör det penetrering av lösningar i fritt flytande sektioner vilket ger bättre resultat och bättre tillgång till intresseområdet. Det är viktigt att öppna DNA-bindningar (DNA-denaturering) för att möjliggöra den primära anti-BrdU-antikroppsåtkomsten. I detta arbete utförde vi dessa specifika procedurer med användning av HCI-inkubation. Å andra sidan möjliggjorde processen att blockera ospecifika epitoper en mer exakt identifiering av cellsignalen.

Den goda membranpermeabiliseringen gör att antikropparna kan tränga in i intresseområdet ordentligt. Att lägga till en permeabilizer som Triton X-100 till PBS ++ och PBS + -lösningar förbättrar membranpermeabiliseringen. Både PBS- och Tris-buffrade saltlösningsreagenser (TBS) kan användas i detta protokoll. När det gäller budget kan TBS vara relativitet billigare än PBS. PBS kan dock störa antifosfatantikroppar och hämma alkaliska fosfataskonjugerade antikroppar, så undvik användning av PBS om målet är posttranslationellt modifierat genom fosforylering (dvs. fosforylerat). Vi använde PBS för detta arbete, och vi fick reda på att vävnadstvättsteg gav en mer specifik signal. Vi rekommenderar också forskare att utföra minst tre tvättcykler med antingen TBS o PBS. Lösningarna måste vara nyberedda. Antigenhämtning (AR) är en metod som är avsedd att minska förlusten av antigenicitet orsakad av fixeringen som modifierar strukturen hos tertiära och kvartära antigener. Denna reduktion gör antigener omöjliga att upptäcka med antikroppar28,29. Den värmeinducerade epitophämtningen (HIER) som används i detta protokoll försökte vända de kemiska reaktionerna mellan formaldehyd och proteiner genom hög temperatur eller stark alkalisk hydrolys (med andra buffertlösningar som EDTA pH 8,5 eller Tris pH 9,5). Det är viktigt att testa nya antikroppar med olika AR-protokoll för att jämföra resultat och välja det bästa för protokollet. Det sista steget kan vara valfritt i ett vanligt protokoll. Vi behandlade dock vävnader med ett antigenhämtningsprotokoll för att ge bättre resultat för detta protokoll.

Det är viktigt att välja rätt slutlig kontrastfärg och motfärgningstekniken med hänsyn till den primära färgningsfärgen och metoden som används för att synliggöra en icke-färgningsstruktur och undvika att maskera den primära färgningsfärgen från immunreaktionen. För fluorescensmikroskopin är DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) en mycket populär kärn- och kromosommotstatning som avger blå fluorescens (absorption: 360 nm, utsläpp: 460 nm) vid bindning till AT-regioner av DNA. DAPI-innehållande monteringsmedium finns tillgängligt och är lätt att använda; Detta ger utmärkt signalretention för bildförvärv. För peroxidreaktionen var IHC tillgängligt i olika alternativ såsom cresylviolett, hematoxylin, neutralröd eller metylgrön färgning. För flera immunfärgningstekniker är det viktigt att välja en kompatibel antikropp med den fixeringsteknik som används för att undvika korsreaktivitet30. När problem och komplikationer med enstaka färgning löses, administrera en annan färgfärgning som anses nödvändig. Det är viktigt att kontrollera den ospecifika bindningen mellan de sekundära antikropparna. Detta kan göras genom att mätta de primära antikropparna innan man använder en sekundär antikropp som produceras i samma värdart av de primära antikropparna. Till exempel, när man använder antimus som produceras i kanin och anti-kanin som produceras i get-sekundära antikroppar, måste antikaninen som produceras i getantikropp användas före antimusen som produceras i kaninantikropp. När den sekventiella metoden domineras helt, kan den samtidiga immunfärgningsprocessen initieras. I denna metod är det viktigt att välja sekundära antikroppar på lämpligt sätt. Helst måste alla dessa antikroppar komma från samma värddjur för att undvika korsreaktivitet. Vi rekommenderar att du kör en positiv kontroll för att bekräfta att färgningsmetoden fungerar korrekt i postnatal hippocampusvävnad (riklig neurogenes runt denna ålder). Om den positiva kontrollvävnaden visar färgningsproblem, granska och gå igenom proceduren, gör korrigeringar och justeringar och upprepa tills en bra färgning produceras. Kör sedan en negativ kontroll för att testa att antikroppen fungerar korrekt genom att utelämna eller ersätta en viss primär antikropp med normalt serum (samma art som den primära antikroppen). Som nämnts i inledningen är bilddekonvolution ett kraftfullt verktyg och ger ett alternativ när ett konfokalmikroskop inte är tillgängligt. Den kan tillämpa bilddekonvolutionen på alla bilder som erhållits med hjälp av överfört ljusfält, bredfältfluorescens och konfokal fluorescensmikroskopi. Det yttersta syftet med bilddekonvolution är att rekonstruera den ursprungliga signalen att förvärvssystemet försämras10.

Sammanfattningsvis är identifieringen av de nygenererade cellerna visualiserade genom immunodetektion av tymidinanalog BrdU en komplicerad men kraftfull teknik. Detta arbete är ett försök att hjälpa forskare, särskilt inom området vuxen hippocampus neurogenes, att kvantifiera nya celler mer exakt. Vi hoppas att denna insats har varit till hjälp för det vetenskapliga samfundet och gör det lättare att finjustera studien av cellproliferation med immunhistokemitekniken.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Miguel Burgos och Gustavo Lago för att de tillhandahåller tekniskt bistånd. Vi vill också tacka Dr. Clorinda Arias, Dr. Karla Hernandez och Dr. Oscar Galicia för deras vänliga stöd för att tillhandahålla reagenser och material. Vi tackar också División de Investigación y Posgrado vid Universidad Iberoamericana Ciudad de México för att ha tillhandahållit finansiering för utförandet av detta arbete och för att täcka videoproduktionskostnader.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENT PREPARATION AND SETUP
Donor Horse Serum BioWest S0900 Blocking and incubation solutions in PBS
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma-Aldrich P6148 toxic, flammable
Potassium Chloride Sigma-Aldrich 746436-500G
Potassium Phosphate, monobasic J.T Bker 3246-01
Sacarose J.T Baker 4072-01
Sodium Chloride Meyer 2365-500G
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G Corrisive, to calibrate pH
Sodium Phophate Dibasic Sigma-Aldrich S9763-5KG
Triton-x 100 Sigma-Aldrich T8787
THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
23–27G hypodermic needle BD PrecisionGlide
Saline solution PiSA 30130032
Syringes 1 mL NIPRO
TISSUE PREPARATION
15-ml polypropylene conical tube Thermo Scientific 339650
50-ml polypropylene conical tube Thermo Scientific 339652
Dissecting tools
Guillotine Stoelting
Microtome Cryostat MICROM HM525
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3477 pre-loaded in 12-well culture plates
Netwell plastic 12-well carrier kit Corning 3520 for 15 mm polyester mesh membrane inserts
Netwell plastic 6-well carrier kit Corning 3521
Perfusion pump Cole-Parmer 7553-70
Shaker IKA ROKCER 3D Digital
IMMUNOSTAINING
Cresyl violet Sigma-Aldrich C5042 1%, Light sensitive
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 carcinogenic, light sensitive
Hydochloric Acid J.T.Baker 9535-05 Corrosive, to calibrate pH
Hydrogen Peroxide, 50% Meyer 5375-1L Toxic, oxidative
Permount Mounting Medium Fisher Chemical SP15-500
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Light sensitive
VECTASTAIN® Elite® ABC Kit Peroxidase (HRP) Vector Laboratories PK-6100 enzymatic, avidin/biotin based amplification system
Primary antibodies
Anti-GFAP antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich HPA056030 1:500
Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse Sigma-Aldrich B2531 1:250
Secondary antibodies
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-065-151 1:250
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP Invitrogen G-21040 1:1000
Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC Sigma-Aldrich T5393 1:250
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC Invitrogen F-2765 1:250
Streptavidin, Cy3 Vector Laboratories SA-1300 1:250
IMAGING AND ANALYSIS
Computer Dell Computer Company T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB For controlling and monitoring protocols’ processes
CCD-camera Olympus UC50
CellSens Standard software Olympus cellSens Standard Edition Acquisition Software
Epifluorescent microscope Olympus BX53
High-pressure 130 W mercury arc lamp Olympus U-HGLGPS
low autofluorescence immersion oil Olympus MOIL-30 Type F
Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24  60 mm)
Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76  26 mm)
U-FBW filter cube Olympus U-FBW excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm
U-FGW filter cube Olympus U-FGW excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm
U-FUW filter cube Olympus U-FUW excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altman, J. Are new neurons formed in the brains of adult mammals. Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
  3. Miller, M. W., Nowakowski, R. S. Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system. Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).
  4. Eriksson, P. S., et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).
  5. Filippov, V., et al. Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes. Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).
  6. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).
  7. Matiašová, A., et al. Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice. Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).
  8. Von Bohlen Und Halbach, O. Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus. Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).
  9. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  10. Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue. Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with imageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).
  13. Giannini, A., Giannini, J. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual. , Available from: https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p (2016).
  14. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  15. Revilla, V., Jones, A. Cryostat sectioning of brains. International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).
  16. Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).
  17. Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density. Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).
  18. Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodríguez-Serrano, L. M., Buenrostro-Jáuregui, M. Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update. Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).
  19. Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).
  20. Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).
  21. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
  22. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. Journal of Visualized Experiments. (46), e2166 (2010).
  23. Tischler, A. S. Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).
  24. Taupin, P. Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments. Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).
  25. Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive. Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).
  26. Magavi, S. S., MacKlis, J. D. Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo. Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).
  27. Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. , 391-399 (2003).
  28. Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).
  29. Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  30. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).

Tags

Biologi Utgåva 163 BrdU hippocampus dentate gyrus neurogenes antigenhämtning detektionsmetoder fixering immunohistokemi immunofluorescens standardisering felsökning bildavtfaltning
Immunohistokemi tekniker för att analysera cellulär proliferation och neurogenes hos råttor med hjälp av tymidinanalogen BrdU
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buenrostro-Jauregui, M.,… More

Buenrostro-Jauregui, M., Tapia-de-Jesús, A., Mata, J., Rodríguez-Serrano, L. M., Chávez-Hernández, M. E., Mata, F., Monroy-Plasencia, M., Alonso-Flores, A. C., Leal-Galicia, P. Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU. J. Vis. Exp. (163), e61483, doi:10.3791/61483 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter