Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Immunhistokjemi teknikker for å analysere cellulær proliferasjon og neurogenese hos rotter ved bruk av tymidinanalog BrdU

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61483
Automatic Translation
*1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, *1
1Laboratorio de Neurociencias, Departamento de Psicología, Universidad Iberoamericana Ciudad de México, 2Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma del Estado de México
* These authors contributed equally

Summary

Dette papiret presenterer fire av de vanligste teknikkene for å visualisere BrdU-positive celler for å måle voksen neurogenese hos rotter. Dette arbeidet inkluderer instruksjoner for reagensfremstilling, tymidinanalog administrering, transkardial perfusjon, vevspreparasjon, peroksidaseimmunhistokjemisk reaksjon, immunfluorescens, signalforsterkning, motfarging, mikroskopiavbildning og celleanalyse.

Abstract

En av de viktigste tingene innen voksen hippocampal neurogenese (AHN) er identifisering av de nylig genererte cellene. Immundeteksjon av tymidinanaloger (som 5-Bromo-2'-deoksyuridin (BrdU)) er en standardteknikk som brukes til å visualisere disse nylig genererte cellene. Derfor injiseres BrdU vanligvis i små dyr intraperitonealt, slik at tymidinanalogen blir innlemmet i delende celler under DNA-syntese. Deteksjon utføres ved immunhistokjemisk analyse av hjerneskiver. Hver forskningsgruppe som har brukt denne teknikken, kan forstå at det krever spesiell oppmerksomhet på små detaljer for å oppnå en vellykket flekk. For eksempel er et viktig skritt DNA-denaturering med HCl, som gjør det mulig å nå cellekjernen for å flekke den. De eksisterende vitenskapelige rapportene beskriver imidlertid svært få av slike trinn i detalj. Derfor er standardisering av teknikken utfordrende for nye laboratorier, da det kan ta flere måneder å gi positive og vellykkede resultater. Formålet med dette arbeidet er å beskrive og utdype trinnene for å oppnå positive og vellykkede resultater av immunostaining-teknikken i detalj når man arbeider med tymidinanalogen BrdU. Protokollen inkluderer reagensfremstilling og oppsett, administrering av tymidinanalog i en gnager, transkardial perfusjon, vevspreparasjon, peroksidaseimmunhistokjemisk reaksjon, bruk av avidin-biotinkompleks, immunfluorescens, motfarging, mikroskopiavbildning og celleanalyse.

Introduction

Ideen om at nye nevroner genereres i den voksne menneskelige hjerne gjennom hele levetiden har fascinert det vitenskapelige samfunn i flere tiår. Kunnskapen om at hjernen genererer nye nevroner gjennom hele levetiden ble oppnådd gjennom påvisning av celler under deling 1,2. Påvisning av nylig genererte nevroner i den voksne hjernen ble først identifisert ved intrakranialt injeksjon av tritiert tymidin (tymidin-H3) hos rotter og påvisning av celler i cellesyklusen ved autoradiogram 1,2. Celledeling av glia og tilstedeværelse av neuroblaster ble rapportert, som var de første lovende dataene om postnatal neurogenese1. Likevel innebar bruk og deteksjon av tymidin-H3 bruk av radioaktivitet, noe som kan være skadelig for de som klarer det. Den første innsatsen som undersøkte egnetheten til BrdU immunhistokjemi i studiet av spredning, migrasjon og opprinnelse av celler i nervesystemet dukket opp i 1988 av Miller og Nowakowski3. I 1998 viste et papir publisert av Eriksson og kolleger at nye nevroner ble visualisert postmortem i den menneskelige voksne hjernen til pasienter injisert med 5-Bromo-2′-deoksyuridin (BrdU)4. Disse pasientene fikk BrdU-injeksjonen (250 mg intravenøst) for å merke veksten av svulster4. Denne teknikken ble vedtatt i dyremodeller. Innføringen av disse metodene markerte en milepæl for feltet siden dette tillot påvisning av nylig genererte celler uten bruk av radioaktive forbindelser. Denne prosedyren ble gullstandarden for å måle celleproliferasjon i voksne hjernenisjer for å fremme videre forskning på feltet.

Begrensningen av tymidinanalogteknikken er at den ikke tillater bestemmelse av cellulær identitet for de nylig genererte cellene. Imidlertid tillater immunhistokjemi oss å utføre dobbelt- eller trippelmerkingsteknikk av samme celle, som validerer den cellulære skjebnen til de nylig genererte cellene og til og med deres modningsstadier, noe som fører til videre utvikling av feltet. Denne metoden ble karakterisert for å skille nylig genererte celler til glia, utifferentierte nevroner eller en fullt moden granulær celle, og til og med for å avgjøre om de deltar aktivt i kretsene. Et annet gjennombrudd i feltet var bruken av transgene modeller for å identifisere utifferentierte celler under domenet til nestin. Nestin-GFP-transgene mus uttrykker et forbedret grønt fluorescerende protein (GFP), som er under kontroll av nestinpromotoren. Nestin er et mellomliggende filament preget av stamceller5. De nestin-GFP transgene musene fikk lov til å etablere tidlige utviklingstrinn involvert i nevrogenese6. En betydelig begrensning er imidlertid å kunne opprettholde en nestin-GFP transgen muskoloni under spesielle forhold i et laboratorieanlegg som blir kostnadseffektivt for enkelte vitenskapelige grupper, spesielt de fra utviklingsland.

Teknikkene nevnt ovenfor har fordeler og ulemper. Imidlertid representerer identifisering av prolifererende celler ved immunhistokjemi (IHC) og muligheten til å utføre dobbelt- eller trippelmerkingsteknikk ved immunfluorescens for å identifisere cellemodningsstadium eller celleskjebne den mest gjennomførbare måten å måle voksen neurogenese på, så langt. Identifikasjonsprosessen ved bruk av immunhistokjemi består av merking av proteiner, proteindomene eller nukleotider med et spesifikt antistoff som gjør det mulig å gjenkjenne dem kjent som primært antistoff. Sistnevnte gjenkjennes av det sekundære antistoffet, som er merket med et kromogen (f.eks. Pepperrotperoksidase) eller et fluorokrom (f.eks. FITC) kombinert med det sekundære antistoffet. Mikroskoper kan oppdage både kromogener og fluorokromsignaler. Ved hjelp av IHC er det mulig å identifisere membranproteiner, cytoskelettproteiner eller kjernefysiske komponenter som BrdU. På den annen side kan BrdU finnes i den cellulære kjernen siden den er innlemmet i DNA under S-fase ved konkurranse. Derfor er et avgjørende skritt DNA-denatureringen med HCl, som åpner DNA-bindinger for å gi BrdU-antistoffet tilgang til BrdU i DNA. Det er viktig å vite at BrdU er tilstede i en mettet konsentrasjon i mus og rotteserum i henholdsvis 15 og 60 minutter, etter intraperitoneal administrering, og deretter faller raskt til uoppdagelige nivåer ved henholdsvis 60 og 120 minutter7.

Her beskriver vi fire forskjellige, men nært beslektede IHC-teknikker: kromogen indirekte deteksjon ved bruk av pepperrotperoksidase (HRP) reaksjon med DAB (3,3'-diaminobenzidin) uten signalforsterkning (trinn 4.1), avidin-biotinkompleks (ABC) forsterkning (trinn 4.1), indirekte immunfluorescensdeteksjon uten signalforsterkning (trinn 4.4) og merket streptavidin-biotin (LSAB) amplifisering (trinn 4.3). Hver metode har fordeler og ulemper og kan være nyttig for spesifikke vevskrav (se tabell 1). Vi bestemte oss for å følge indirekte ICH-metoder på grunn av deres overkommelige priser og enkelhet for å gjøre endringer fra kromogene til fluorescerende deteksjonsmetoder ved bruk av ukonjugerte primære antistoffer. HRP-tilnærmingen er en ofte brukt IHC-metode på grunn av overkommelig pris, høy stabilitet, høy omsetningshastighet og substratenes fulle tilgjengelighet. Likevel anbefaler vi å bruke en positiv kontroll for å bekrefte at fargemetoden fungerer nøyaktig og bruk av negativ kontroll for å teste antistoffet fungerer effektivt. Flere immunostainings eller multiplex IHC-metoder (se trinn 6) er potente verktøy for å skaffe store mengder data fra vevsseksjonen i et enkelt eksperiment. Denne teknikken er spesielt viktig når tilgjengeligheten av prøver er begrenset. En annen fordel er muligheten til samtidig å identifisere spesifikke proteiner som er uttrykt i samme cellulære rom, samtidig som vevets integritet bevares. Multiplex gjør det mulig å flekke forskjellige markører uttrykt under spesifikke proliferative stadier (f.eks. Nestin, GFAP, DCX, Ki-67), slik at vi kan nå en mer detaljert sprednings- og differensieringsforskning8. Det er avgjørende å velge antistoffer som er kompatible med fikseringsteknikken som brukes for å unngå kryssreaktivitet. Vi anbefaler å teste hvert nytt antistoff (inkludert BrdU) individuelt for å justere og avgrense metoden. Deretter introduserer du den doble sekvensielle fargingen, og til slutt starter du den samtidige immunostaining-prosessen når den sekvensielle metoden er helt dominert. Det er avgjørende å velge passende sekundære antistoffer for denne metoden.

Metode Spesifikk metode Fordeler Ulemper
Indirekte deteksjonsmetode Peroksidasereaksjon med DAB 1. Høyere følsomhet enn direkte deteksjon og indirekte fluorescensmetode.
2. Høyere motstand mot fotobleking enn fluorokromer.
3. Lavere kostnad enn fluorescensdeteksjonsmetode		 1. Vanskelig for multipleksing med færre fargestoffer.
2. Komplisert for Co-uttrykte mål i samme mobilrom.
3. Redusert dynamisk område for samtidig knappe og høye mål på samme vev.
Fluorescens 1. Best og enklest for multipleksing med flere fargestoffer.
2. Best for Co-uttrykte mål i samme mobilrom.
3. Bedre dynamisk område for samtidig knappe og høye mål på samme vev.
4. Ingen ekstra trinn.		 1. Lavere følsomhet enn den indirekte peroksidasereaksjonen med DAB-metoden.
2. Svak motstand mot fotobleking over tid.
3. Dyrere.
Metode for signalforsterkning Avidin-Biotin-komplekset (ABC) 1. Høyere følsomhet enn den direkte og indirekte deteksjonsmetoden.
2. Reduser bakgrunnen		 1. Ytterligere trinn.
2. Dyrere enn ikke forsterkning.
Merket streptavidin-biotin (LSAB) 1. Høyere følsomhet enn den direkte og indirekte deteksjonsmetoden.
2. Mer betydelig vevspenetrasjon enn ABC-metoden.
3. Reduser bakgrunnen		 1. Ytterligere trinn.
2. Dyrere enn ABC-metoden.
Ikke ytterligere forsterkningsmetode 1. Lavere kostnader.
2. Ingen ekstra trinn.
3. Ideell for høye tallrike mål.		 1. Lavere følsomhet: problematisk uten rikelig mål.

Tabell 1: Fordeler/ulemper ved IHC-teknikker. Denne tabellen viser fordeler/ulemper ved indirekte deteksjonsmetoder: Peroksidasereaksjon med (3,3'-diaminobenzidin) DAB og fluorescens; og signalforsterkningsmetoder: avidin-biotinkompleks (ABC), merket streptavidin-biotin (LSAB), og ikke ytterligere forsterkningsmetode.

Et høyoppløselig bilde er grunnleggende for å utføre riktig analyse og presentere resultatene. Det er to tilnærminger for å forbedre oppløsningen: 1) bruk av et bedre mikroskopdesign (f.eks. Konfokal, multifoton) eller 2) numerisk invertering av uskarphetsprosessen for å forbedre bilder ved hjelp av dekonvolusjon9. Dessverre er konfokalmikroskopi ikke rimelig på grunn av de høye kostnadene ved utstyr og service10. Et bredfelt epifluorescensmikroskop og påfølgende dekonvolusjon av z-stack-bildene gir et passende, rimelig alternativ til konfokalmikroskopi 8,9. Som nevnt ovenfor er dekonvolusjonsmålet å gjenopprette det opprinnelige signalet som ble degradert av oppkjøpssystemet9, ved å redusere uskarphet, ufokusert tåke og forvrengning vist i bildet oppnådd ved epifluorescens eller konfokalmikroskop ved hjelp av matematiske fjerningsalgoritmer10. Det ervervede uskarpe bildet kan modelleres matematisk som et resultat av å konvoldere de observerte objektene med en 3D-punktspredningsfunksjon (PSF). PSF er et teoretisk diffraksjonsmønster av lyspunktene som sendes ut av vevsprøven og samles inn av mikroskopet. PSF-filen er opprettet med de spesifikke forholdene til hvert bilde, for eksempel kameraets CCD-celleavstand, brytningsindeks for mediet som brukes, den numeriske blenderåpningen til objektivlinsen, fluoroforens emisjonsbølgelengde, bildestørrelser, antall bilder i z-stack-behandlingsmetoden og mellomrommet mellom dem (se teknisk spesifikasjon i tabell 2). Med andre ord oppsummerer PSF-filen effekten av bildeoppsettet på mikroskopobservasjonene9. Vi bruker imidlertid diffraksjon PSF 3D Plugin (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) for å lage vår egen spesifikke PSF-fil for hvert z-stack-bilde. Z-stack-bilder er en serie digitaliserte optiske seksjoner fra definerte dybder (z-aksen) på samme XY-plassering av lysbildet. En datamaskin samler informasjonen hentet fra fokusplanet ved å tilordne signaler som stammer fra objekter som befinner seg i andre fokalplan. For å lage z-stack-bilder er det nødvendig å ta bilder fra forskjellige fokuserte lag av lysbildene (f.eks. ti forskjellige bilder av det samme XY-området hver 1 μm dybde). Deretter bruker vi mikroskopi programvare levert av produsenten eller Fiji for å lage en z-stack eller 3D-bilde. Resultatet blir en enkelt stabelbildefil (f.eks. ti bilder med forskjellig fokus). Det finnes flere kundespesifikke verktøy og programvareløsninger, for eksempel åpen kildekode-programvare for dekonvolusjonsmikroskopi. Vi vil vise utgangene fra dekonvolusjonsprosessen ved hjelp av DeconvolutionLab29 som er et Fiji11-plugin (distribusjon av ImageJ12). Dekonvolusjon vil bidra til å forbedre oppløsningen til endelige mikrografer (se figur 1B, C ). For ytterligere informasjon og instruksjon anbefaler vi på det sterkeste å lese referanse13.

Figure 1
Figur 1: Representativt bilde av 3D-dekonvolusjon for flere fargekanaler. (A) DG ved lav forstørrelse. (B) De opprinnelige z-stack-bildene for hver kanal og det sammenslåtte bildet. (C) 3D-dekonvoluterte z-stack-bilder for hver kanal og det sammenslåtte bildet. Denne hjernen var fra rotta som var en del av fysisk aktivitetsgruppe. Merket streptavidin-biotin (LSAB) amplifikasjonsmetode ble brukt. Det viste Cy3 streptavidin konjugert antistoff for å indikere BrdU (rød), DAPI som en counterstaining (blå) og glial fibrillary acidic protein (GFAP) som en astroglial markør (grønn). ML = molekylært lag; GCL = granulært cellelag; SGZ = subgranulær sone. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Formålet med dette arbeidet er å gi en detaljert beskrivelse av trinnene for å oppnå positive og vellykkede resultater med immunostaining og å liste opp vanlige trinn i BrdU-baserte studier, uten bruk av et konfokalt mikroskop. BrdU-farging er en teknikk som krever flere trinn som må følges nøye for å oppnå en vellykket flekk. Standardisering av disse fargeteknikkene tar vanligvis måneder og er tids- og ressurskrevende. Vi forventet at denne artikkelen kunne gi informasjon til gruppene som starter innenfor dette feltet ved å redusere tid og feil.

Protocol

Alle prosedyrer følger National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (NIH Publications N °. 8023, revidert i 1978) og lokale meksikanske lover for å minimere antall dyr som brukes og deres lidelse. Den etiske komiteen ved Universidad Iberoamericana godkjente eksperimentelle protokoller for bruk av dyr i denne studien.

1. Reagensforberedelse og oppsett

MERK: De fleste løsningene kan tilberedes dager før bruk med mindre annet er spesifisert.

  1. BrdU-løsning
    1. Hent BrdU-løsningen fra -20 °C fryser og la den balansere ved romtemperatur (RT).
    2. Beregn massen av BrdU som trengs for en dose på 50 mg / kg i henhold til kroppsvekten til rotten. Beregn volum på 0,9% saltoppløsning (0,9 g NaCl i 100 ml steril H2O) som trengs for en arbeidsløsning på 20 mg / ml. Forbered et overskudd for å gi minst 0,5 ml per rotte per injeksjon.
      MERK: Dosen som administreres til forsøksdyr skal være trygg, med minimale bivirkninger og effektiv. Det er rapportert at varigheten av farging med 100 mg/kg BrdU ikke oppveier den potensielt høyere toksisiteten sammenlignet med dosen på 50 mg/kg7. Ingen signifikante forskjeller ble funnet i antall BrdU-merkede celler/mm3 for 50 og 100 mg/kg i.p. hos rotter7. Det er å foretrekke å injisere en liten dose for å minimere dyrets lidelse.
    3. Vei ut BrdU-løsningen og legg den til saltoppløsningen i et konisk rør og virvel.
      MERK: Forvarm saltoppløsningen ved 45\u201250 °C i et vannbad for volumer større enn 1 ml.
    4. Plasser slangen i et vannbad ved 50 °C i 10\u201215 min og virvel hver 2\u20123 min til den er helt oppløst. Filtrer oppløsningen med et sprøytefilter for steril injeksjon. Dekk røret med tinnfolie, avkjøl det ved romtemperatur og bruk umiddelbart.
      FORSIKTIG: BrdU-oppløsning er giftig og potensielt kreftfremkallende. Forbered den i avtrekkshetten. BrdU-løsningen må håndteres med riktig verneutstyr (PPE). Det anbefales å klargjøre løsningen umiddelbart før bruk. Løsningen er imidlertid stabil i 24 timer under RT. Vennligst beskytt den mot lys.
  2. For å fremstille 1 liter 0,1 M fosfatbufret saltvann (PBS) ved pH 7,4, tilsett 240 mg kaliumfosfat monobasisk (KH 2 PO 4), 1,44 g natriumfosfatdibasisk (Na 2 HPO4), 200 mg kaliumklorid (KCl) og 8 g natriumklorid (NaCl) til 800 ml dobbelt destillert vann (ddH2O) under konstant omrøring. Juster pH til 7,4 og tilsett dobbel destillert H2O opp til totalt volum på 1 L. Oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke.
  3. For 100 ml PBS+, tilsett 3 % (3 ml) normalt hesteserum og 0,3 % (300 μL) Triton X-100 til 0,1 M PBS (pH 7,4). Oppbevares i 20\u201250 ml aliquots ved -20 °C i opptil 3 måneder.
    MERK: Alternativt kan TBS brukes i stedet for PBS. Ethvert annet serum som er forskjellig fra vertens antistoffer og eksperimentelle vev er egnet.
  4. For 100 ml PBS++, tilsett 10 % (10 ml) normalt hesteserum og 0,3 % (300 μL) Triton X-100 til 0,1 M PBS pH 7,4. Oppbevares i 20\u201250 ml aliquots ved -20 °C i opptil 3 måneder.
  5. For 1 liter kryobeskyttende løsning, bland 250 ml etylenglykol og 250 ml glyserol, rør kontinuerlig til blandet. Sakte bringe til 1 L med PBS. Filtrer med filterpapir av klasse 4 (20\u201225 μm). Oppbevares ved 4 °C eller RT i opptil 1 år.
  6. Forbered 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS (PFA-løsning) som følger. For 1 liter oppløsning, tilsett 40 g paraformaldehydpulver sakte til 800 ml 60\u201265 °C 0,1 M PBS under konstant omrøring. Rør til paraformaldehyd er helt oppløst mens temperaturen kontrolleres (60\u201265 °C). Legg om nødvendig til noen dråper 1 M NaOH for å klargjøre løsningen. Når løsningen når romtemperatur, filtrer med filterpapir av klasse 4 (20-25 μm).
    FORSIKTIG: Paraformaldehyd er giftig og mistenkes for å være kreftfremkallende, tilberedes i avtrekkshetten. Oppbevares ved 4 °C og helst i løpet av 2 dager. PFA klar til bruk løsning er kommersielt tilgjengelig.
  7. For 1 liter 10 mM natriumsitratbuffer (SCB) ved pH 6, tilsett 1,204 g natriumsitrat (dihydrat) og 1,134 g sitronsyre til 800 ml dobbeltdestillert H2O under konstant omrøring. Juster pH til 6,0 og tilsett ddH2O opptil 1 L. Oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder.
  8. Forbered 50 ml 2 N HCl ved sakte å tilsette 8,25 ml 12 N HCl (konsentrert stamløsning) til 41,75 ml ddH2O under konstant omrøring.
    FORSIKTIG: Forbered deg i avtrekkshetten. Løsningen må tilberedes umiddelbart før bruk.
    MERK: 2 N HCl vil bli brukt til DNA-denaturering, et avgjørende skritt. Som BrdU er innlemmet i DNA, HCl brukes til å åpne DNA-bindinger slik at BrdU antistoff tilgang BrdU i DNA.
  9. Forbered endogen peroksidaseblokkerende løsning som følger. Forbered 100 ml 0,6% hydrogenperoksid ved å blande 2 ml 30% hydrogenperoksid med 98 ml ddH2O under konstant omrøring.
    MERK: Oppløsningen må tilberedes umiddelbart før bruk. Hold den i mørket da H 2 O2er lysfølsom. PBS eller TBS kan brukes i stedet for vann.
  10. Forbered avidin-biotinkompleks (ABC) løsning i henhold til instruksjonene fra produsenten. For 5 ml ABC i 0,1 M PBS, tilsett 2 dråper (≈100 μL) reagens A og bland, og tilsett deretter 2 dråper (≈100 μL) reagens B og bland.
    MERK: Oppløsningen må klargjøres og få lov til å rulle i 20\u201230 min før bruk.
  11. Forbered DAB (Diaminobenzidine) Peroxidase (HRP) substrat ved hjelp av settet ved å følge produsentens instruksjoner. Til 5 ml ddH 2 O, tilsett 2 dråper (≈ 84 μL) reagens 1 og bland, tilsett 4 dråper (≈ 100 μL) reagens 2 og bland, tilsett deretter2dråper (≈ 80 μL) reagens 3 og bland. Til slutt, hvis ønskelig, tilsett 2 dråper (≈ 80 μL) reagens 4 (nikkel) og bland.
    MERK: Oppløsningen må klargjøres umiddelbart før bruk.
    FORSIKTIG: DAB er giftig og potensielt kreftfremkallende. Det må håndteres med forsiktighet og kastes i henhold til forskrift om farlig avfall ved hver institusjon. For å inaktivere DAB, tilsett flere dråper blekemiddel (natriumhypokloritt); løsningen blir svart.
  12. Forbered 100 ml cresylfiolett løsning ved å tilsette 100 mg cresylfiolett acetat og 250 μL eddiksyre til 80 ml ddH2O ved 55\u201260 °C. Juster volumet til 100 ml, filtrer og oppbevar ved 4 ° C i en mørkfarget beholder.
    MERK: Brukeren oppfordres til å teste forskjellige konsentrasjoner av den cresylfiolette løsningen før du bruker den på verdifulle vevsprøver. Resultatet kan være mørkere for motfarging med noen vevsprøver, noe som kan redusere evnen til å telle BrdU-positive celler nøyaktig.

2. Tymidin analog BrdU administrasjon

  1. Hold tilbake forsøksdyret (f.eks. 90 dager gammel Wistar-hannrotte som veier 350 g) ved å immobilisere den nedre bukhulen.
  2. Administrer BrdU oppløsningen (50 mg/kg) intraperitonealt (i.p.) ved hjelp av en 23 G kanyle og 1 ml sprøyte.
    MERK: Juster injeksjonsvolumet i henhold til dyrets vekt. Bruk en 23\u201227 G nål og en 1\u20125 ml sprøyte for voksne rotter. Maksimalt tolerabelt intraperitonealt injeksjonsvolum hos voksne rotter er 10 ml. Ulike ruter kan brukes til å administrere BrdU-løsningen14. For eksempel intraperitoneal injeksjon eller oral administrering gjennom drikkevann.

3. Vevspreparasjon

MERK: Tre måneder gamle rotter fikk ad libitum tilgang til fysisk aktivitet (endeløst hjul) i syv dager. Dag 6 ble rotter injisert med BrdU (trinn 2) 3 ganger med intervaller på 12 timer. Utfør trinn i avsnitt 3 etter 8 timer fra siste BrdU-injeksjon.

  1. Injiser pentobarbital (50 mg/kg i.p.) og vent noen minutter til dyret er dypt bedøvet.
    MERK: Pass på at dyret er helt bedøvet før du fortsetter. Klyp forsiktig på et av bena eller halen. Hvis dyret reagerer på stimulansen, vent noen få minutter. Hvis dyret ikke reagerer på klemmen, gå til neste trinn.
  2. Utsett hjertet ved å kutte bukhulehuden under brystbenet, ta fra hverandre ribbeina og kutte membranen.
  3. Transkardial perfusjonsfiksering
    1. Sett en nål inn i venstre ventrikel og gjør et lite snitt i høyre atrium. Ved hjelp av en pumpe eller tyngdekraft, perfuse (strømningshastighet 5\u20127 ml / min.) 0,1 M PBS til hele blodet er drenert ut, og løsningen blir klar.
    2. Bruk en pumpe eller tyngdekraft, utfør kald perfusjon (strømningshastighet 5\u20127 ml / min) med PFA-løsning for å fikse vevet til halen blir stiv.
      MERK: Vanligvis krever en 300 g rotte rundt 100\u2012150 ml av PFA-løsningen. Vevfiksering er valgfritt. Dermed kan hjernen ekstraheres for bruk i ulike prosesser for å minimere dyrebruk i forsøkene.
  4. Disseksjon og postfiksering
    1. Halshugg dyret, og trekk forsiktig ut hjernen fra skallen. Senk hjernen ned i et konisk rør som inneholder PFA-oppløsning (~40 ml for en 250 mg rotte) i 1\u20122 dager ved 4 °C.
      MERK: Ikke overfikser (mer enn 48 timer), fordi dette kan tømme vevsfargingen på grunn av utilgjengelighet av antigener.
    2. Forbered 100 ml 30% sukroseoppløsning, tilsett 30 g sukrose til 70 ml 0,1 M PBS-løsning under konstant omrøring. Tilsett 0,1 M PBS-løsning til 100 ml. Senk hjernen ned i et konisk rør med en 30% sukroseoppløsning (35 ml) i ca. 1\u20122 dager ved 4 °C til hjernen synker til bunnen av røret.
  5. Kutting av koronale hjerneseksjoner
    MERK: Bruk av kryostat-mikrotom krever veiledning og opplæring. For detaljerte instruksjoner, se referanse15.
    1. Senk hele hjernen ned i iso-pentan ved -80 °C og hold den ved -80 °C i 10 minutter. Plasser hjernen i en innebygd matrise på en kryostat-mikrotomplate.
      MERK: Under visse forhold kan rask frysing av hjernen ved -80 °C forårsake brudd eller skade på vevet. Brukeren bør være klar over dette problemet. Hvis dette er tilfelle, bruk -20 ° C iso-pentan for å fryse hjernen.
    2. Ved hjelp av en kryostat-mikrotom (temperatur ved -25 til -20 °C) kuttes koronale seksjoner med 40 μm tykkelse. Overfør seksjoner sekvensielt til en 24-brønns cellekulturplate med kryobeskyttelsesløsning etter veiledningen i figur 2. Oppbevares ved -20 °C til bruk i opptil noen måneder.
      MERK: Deretter behandles alt vev i frittflytende serielle seksjoner på 40 μm i 12-brønnsplater med maskeinnsatser i forsiktig og kontinuerlig omrøring (10 o / min). Det er mulig å lagre hjerneseksjoner i årevis under de rette forholdene.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk illustrasjon av sekvensiell overføring av seksjoner fra kryostat-mikrotom til en 24-brønns cellekulturplate med kryobeskyttelsesløsning. Begynn på A1-brønnen og legg de neste skivene i rad A; etter A6-brønn flytte til neste rad B, så videre. Når du ankommer D6, går du tilbake til A1 og fortsetter. Dette arrangementet tillater Nth (f.eks. sjette for neurogenese, tilsvarende innholdet i en kolonne) seksjonskvantifisering av en hel hjernegruppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Immunostaining

MERK: Se tabell 1 for oppsummering av fordeler og ulemper ved hver teknikk.

  1. Påvisning av BrdU ved bruk av peroksidasereaksjon med DAB
    MERK: Utfør trinn 4.1.1 til 4.1.5 på dag 1.
    1. Overfør skiver fra kryobeskyttelsesløsningen til 0,1 M PBS ved romtemperatur. Skyll tre ganger i 10 minutter hver, med 0,1 M PBS.
    2. Inkuber skiver i 30 minutter i endogen peroksidaseblokkerende løsning for å inaktivere endogen peroksidase. Skyll 3 ganger, 10 min hver, med 0,1 M PBS. Du kan eventuelt utføre antigenuthenting (se avsnitt 5). Inkuber skiver i 20 minutter med 2 N HCl ved 37 °C. Skyll inn 0,1 M boratbuffer (8,5 pH) i 10 min. Skyll 3 ganger i 10 min hver, med iskalde 0,1 M PBS.
    3. Inkuber skiver i 2 timer ved romtemperatur med PBS ++ (blokkeringsløsning). Inkuber med anti-BrdU primært antistoff (musevert) ved konsentrasjon på 1:250 i PBS+ over natten ved 4 °C.
    4. På dag 2, skyll skivene 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS.
    5. Inkuber med 1:250 HRP-konjugert sekundært antistoff (antimus) i PBS+ i 2\u20124 timer ved romtemperatur. Skyll 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS.
    6. Overfør skiver til DAB Peroxidase (HRP) Substratløsning og inkuber i 2\u201210 min. Når skiver blir mørkegrå, visualiser vevet med et forstørrelsesglass eller et mikroskop. Hvis positive celler er til stede, skyll 3 ganger (i 15 minutter hver) med vann fra springen (for å redusere bakgrunnen). Vask 3 ganger i 10 min hver med 0,1 M PBS.
    7. Monter skiver forsiktig på gelatiniserte lysbilder med en myk børste, lufttørk over natten ved romtemperatur. Counterstain (se pkt. 7.1), legg til permanent monteringsmedium og plasser deksler. Oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder.
  2. Påvisning av BrdU ved bruk av peroksidasereaksjon med avidin-biotin-peroksidasekomplekset
    MERK: Utfør trinn 4.2.1 til 4.2.5 på dag 1.
    1. Overfør skiver fra kryobeskyttelsesløsningen til 0,1 M PBS for å oppnå romtemperatur. Skyll 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS.
    2. Inkuber i 30 minutter med endogen peroksidaseblokkerende løsning for å inaktivere endogen peroksidase. Skyll 3 ganger i 10 minutter hver på 0,1 M PBS. Du kan eventuelt utføre antigenuthenting (se avsnitt 5).
    3. Inkuber i 20 minutter med 2 N HCl ved 37 °C. Skyll i 0,1 M boratbuffer (pH 8,5) i 10 min. Vask 3 ganger i 10 minutter hver med iskalde 0,1 M PBS.
    4. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur i PBS ++ (blokkeringsløsning).
    5. Inkuber med anti-BrdU primært antistoff (musevert) 1:250 i PBS + over natten ved 4 ° C.
    6. På dag 2, skyll 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS.
    7. Inkuber med 1:250 biotinylert sekundært antistoff (antimus) i PBS+ i 2\u20124 timer ved romtemperatur. Skyll 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS.
    8. Inkuber i ABC-løsningen i 1 time ved romtemperatur. Skyll 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS.
    9. Overfør skiver til DAB peroksidase (HRP) substratløsning og inkuber i 2\u201210 min. Når skiver blir mørkegrå, visualiser vevet med et forstørrelsesglass eller et mikroskop. Hvis positive celler er til stede, skyll 3 ganger (15 min hver) med vann fra springen (for å redusere bakgrunnen) etterfulgt av 3 ganger med 0,1 M PBS vask i 10 minutter hver.
      MERK: Oppløsningen må klargjøres umiddelbart før bruk. Det må utvises forsiktighet for å unngå at hjerneskiver fester seg til hverandre på grunn av uregelmessige mørke flekker i vevet.
    10. Monter skiver forsiktig på gelatiniserte lysbilder med en myk børste og lufttørk deretter over natten ved romtemperatur.
    11. Motbeis om nødvendig (se trinn 7.1), legg til permanent monteringsmedium og plasser deksler. Oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder.
  3. Påvisning av BrdU ved immunfluorescens ved bruk av merket Streptavidin-Biotin (LSAB) amplifisering
    MERK: Utfør trinn 4.3.1 til 4.3.4 på dag 1.
    1. Overfør skiver fra kryobeskyttelsesløsningen til 0,1 M PBS ved romtemperatur. Skyll 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS. Du kan eventuelt utføre antigenuthenting (se avsnitt 5).
    2. Inkuber i 20 minutter i 2 N HCl ved 37 °C. Skyll inn 0,1 M boratbuffer (8,5 pH) i 10 min. Skyll 3 ganger i 10 minutter hver i iskalde 0,1 M PBS.
    3. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur i PBS ++ (blokkeringsløsning). Inkuber med 1:250 anti-BrdU primært antistoff (musevert) i PBS+ over natten ved 4 °C.
    4. På dag 2, skyll 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS.
    5. Inkuber med 1:250 biotinylert sekundært antistoff (antimus) i PBS+ i 2\u20124 timer ved romtemperatur. Skyll 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS. Inkuber med 1:250 fluorokromkonjugert streptavidin (Cy3) i PBS (ikke bruk serum) i 1\u20122 timer ved romtemperatur. Skyll 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS.
      MERK: Serum kan inneholde biotin og bør ikke tilsettes fortynningsmidler. Bruk i stedet PBS som inneholder 0,3% Triton X-100.
    6. Monter skiver forsiktig på gelatiniserte lysbilder med en myk børste, lufttørk over natten ved romtemperatur, eller monter umiddelbart med et passende monteringsmedium. Counterstain (se trinn 7.2), legg til permanent monteringsmedium og plasser deksler. Oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder.
  4. Påvisning av BrdU ved indirekte immunfluorescens
    MERK: Utfør trinn 4.4.1 til 4.4.4 på dag 1.
    1. Overfør skiver fra kryobeskyttelsesløsningen til 0,1 M PBS til den når romtemperatur. Skyll 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS. Utfør antigenuthenting om nødvendig (valgfritt, se avsnitt 5).
    2. Inkuber i 20 minutter i 2 N HCl ved 37 °C. Skyll inn 0,1 M boratbuffer (8,5 pH) i 10 min. Skyll 3 ganger i 10 minutter hver med iskald 0,1 M PBS. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur med PBS ++ (blokkeringsløsning). Inkuber med 1:250 anti-BrdU primært antistoff (musevert) i PBS+ over natten ved 4 °C.
    3. På dag 2, skyll 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS.
    4. Inkuber med 1:250 fluorokromkonjugert sekundært antistoff (antimus) i PBS+ i 2\u20124 timer ved romtemperatur. Skyll 3 ganger i 10 minutter hver med 0,1 M PBS.
    5. Monter skiver forsiktig på gelatiniserte lysbilder med en myk børste, lufttørk over natten ved romtemperatur, eller monter umiddelbart med et passende monteringsmedium. Counterstain (se trinn 7.2), legg til permanent monteringsmedium og plasser deksler. Oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder.

5. Antigenuthenting (valgfritt)

MERK: Antigen Retrieval er et valgfritt trinn beregnet på å korrigere tap av antigenitet forårsaket av fiksering som endrer tertiær og kvartær struktur av mange antigener, noe som gjør dem uoppdagelige av antistoffer. Dette trinnet kan legges til den opprinnelige protokollen.

  1. I et mikrobølge- eller vannbad forvarmer du 10 mM natriumcitratbuffer (SCB) pH 6-løsning til 90\u201295 °C (avhengig av høyde begynner løsningen å koke rundt denne temperaturen). Fyll 80% av et 50 ml konisk rør (40 ml) med forvarmet SCB. Overfør skiver til nettinginnsatser i det koniske røret med SCB. Dekk røret med en skruehett med hull laget med en 18\u201220 G nål.
  2. Oppbevar skiver i 30 minutter i SCB ved 80\u201285 °C vekslende oppvarmingssykluser i mikrobølgeovnen ved minimum effektnivå. Fyll om nødvendig det koniske røret med SCB. Overfør skiver umiddelbart etter sammen med nettinginnsatsene i iskalde 0,1 M PBS og skyll 3 ganger i 10 minutter hver.

6. Flere immunostainings (valgfritt)

MERK: Se introduksjonsdelen for begrunnelsen bak dette trinnet.

  1. Samtidig flere immunfarginger
    1. Forbered en cocktail med de primære antistoffene mot målet (f.eks. Mus anti-BrdU og kanin anti -GFAP) i PBS +. Bruk forskjellige verter for hvert primære antistoff som brukes. Rug over natten ved 4 °C. Fortsett med de samme neste trinnene for hver protokoll.
    2. Forbered en cocktail med de tilsvarende sekundære antistoffene for hvert primære antistoff som brukes (f.eks. geit anti-mus FITC, geit anti-kanin TRITC) i samme fortynningsløsning for hver protokoll. Fortsett med de samme neste trinnene for hver protokoll. Ideelt sett bør du bruke sekundære antistoffer som kommer fra de samme vertene for å unngå kryssreaksjon.
  2. Sekvensiell flere immunostainings.
    1. Følg protokollen for det første antistoffmålet (f.eks. Mus anti-BrdU) og stopp før montering av skivene. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur med PBS ++ (blokkeringsløsning).
    2. Inkuber det andre primære antistoffet (f.eks. kanin anti-GFAP) i PBS+ over natten ved 4 °C. Følg de neste trinnene for hver protokoll, inkludert inkubasjon av det andre sekundære antistoffet (f.eks. geit anti-kanin TRITC). Fortsett med de neste trinnene for hver protokoll til slutten.

7. Counterstaining (valgfritt)

  1. For protokoller som bruker peroksidasereaksjon, forvarm den cresylfiolette løsningen til 60 ° C. Hydrater lysbildene med ddH2O i 1 min. Inkuber lysbildene i den varme cresylfiolette løsningen i 5\u201220 min.
    1. Skyll lysbildene med ddH2O i 1 min. Skyll lysbildene med 70%, 80%, 90% og 100% etylalkohol i 1\u20123 min hver. Skyll lysbildene med xylen i 1\u20123 min.
    2. Legg til permanent hydrofobt monteringsmedium og plasser deksler.
      NOTAT: Oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder. Selvfremstillet monteringsmedium som inneholder PVA (polyvinylalkohol)-DABCO kan benyttes.
  2. For protokoller som bruker immunfluorescens, legg til et lite volum (25\u201250 μL) hydrofilt monteringsmedium med DAPI, propidiumjodid eller lignende. Forsegl rundt omkretsen med neglelakk eller et plastforseglingsmiddel. Oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder.

8. Bildebehandling og analyse

MERK: Se tabell 2 for spesifikasjoner for oppsett av mikroskop. Vanligvis telles de flekkete nye cellene ved hjelp av peroksidasereaksjonsfargede skiver (billigere metode), men det kan også utføres ved hjelp av immunfluorescens.

  1. For å kvantifisere celler, identifiser først dentate gyrus riktig med 4x forstørrelseslinsen (for ytterligere instruksjoner om DG anatomiske detaljer, se Amaral et al.16).
    1. Søk i det granulære cellelaget av dentate gyrus for kjerner merket med BrdU (ved hjelp av 40x forstørrelseslinsen). Utfør cellesøk uttømmende langs z-aksen siden nye celler kan distribueres i forskjellige lag (se Video 1).
    2. Velg en intervallseksjon for cellesøk over hele dentate gyrus (f.eks. hver 6. del av vevet, tilsvarende hver 240 μm).
    3. Tell alle BrdU positive celler. Morfologien til den merkede kjernen kan endres avhengig av hvor mye BrdU cellen innlemmet (se figur 3 som en veiledning). Beveg deg sakte over z-aksen for å kvantifisere alle flere kjerner som integrerer en klynge (se Video 2).
    4. Multipliser totalt antall talte celler med intervalldelen valgt (f.eks. 6) for å estimere det totale antallet BrdU-merkede nye celler.
    5. Ideelt sett, i et vanlig eksperiment, telle minst ti seksjoner per dyr og minst fem dyr per gruppe.
  2. Bildedekonvolusjon (valgfritt)
    MERK: Se introduksjonsdelen for viktig informasjon om dette trinnet. Denne prosedyren trenger monokromatiske bilder (gråtoner). Transformere fargebilder til gråtoner. Hvis bildene er en RGB-kompositt, må du først dele kanalene og slå dem sammen som ett enkelt bilde (ikke sammensatt), og deretter transformere til 8-biters gråtoner.
    1. Lag en z-stack-fil fra mikrografer.
    2. Opprett en PSF-fil (Point Spread Function) som åpner Diffraction PSF 3D-plugin (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) fra alternativet Plugins-menyen . Fyll ut alle nødvendige data (se tabell 2). Trykk OK og lagre filen.
    3. Åpne DeconvolutionLab29 plugin fra alternativet Plugins-menyen (http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/). Dra det samsvarende z-stackbildet og PDF-filen til det tilsvarende vindussporet.
    4. Velg dekonvolusjonsalgoritmen (f.eks. Richardson-Lucy) og antall iterasjoner (f.eks. 20). Trykk på KJØR.
    5. Kombiner de dekonvoluerte bildene til ett enkelt z-stack-bilde ved å velge Stabler fra Bilde-menyen øverst. Klikk deretter Z-prosjekt. Velg Maks intensitet fra rullegardinmenyen Projeksjonstype , trykk OK og lagre filen.
    6. Lag et RGB-bilde ved hjelp av den enkle z-stack-bildefilen som ble opprettet i trinnet ovenfor med ønsket pseudofarge, velg Farge fra Bilde-menyen øverst. Klikk deretter på Slå sammen kanaler. Sett det tilsvarende bildet til ønsket fargekanal fra rullegardinmenyen. Fjern merket i boksen Opprett kompositt, trykk OK og lagre filen (se figur 4).
    7. Hvis det er mer enn ett kanalbilde, gjentar du trinnene 8.2.1\u20128.2.5. Opprett en RGB-bildefil ved å følge trinn 8.2.6, åpne minst to bildefiler og velge forskjellige fargekanaler for hver bildefil (se figur 4).

Representative Results

Metodene beskrevet ovenfor ble brukt for å kvantifisere nyfødte celler i voksen rotte hippocampus etter frivillig fysisk aktivitet, i motsetning til en kontrollgruppe uten ekstra fysisk aktivitet. Vi brukte barselrotte hippocampus som en positiv kontroll. Hannrotter 3 måneder var under en frivillig fysisk aktivitetsprotokoll (endeløst hjul) i syv dager. På dag 6 ble rotter injisert med BrdU (avsnitt 2), og hver 12. time etter til tre komplette injeksjoner. For å fullføre tre cellesyklusdelinger ble dyrene transkardialt perfundert (avsnitt 3) 8 timer etter siste BrdU-injeksjon. Den samme prosedyren ble brukt på tre måneder gamle rotter som ikke gjennomgikk fysisk aktivitet for å bli brukt som en komparativ kontroll. Som positiv kontroll ble en dag gamle rottevalper (postnatal dag 1) injisert med BrdU én gang, som beskrevet i avsnitt 2 ovenfor. En dag etter injeksjonen (postnatal dag 2) ble avkom avlivet, og hodet ble nedsenket i PFA-oppløsning, som beskrevet i trinn 3.4. Voksne rotter ble dypt bedøvet (trinn 3.1), transkardialt perfundert, som beskrevet i trinn 3.2. Hjernene ble dissekert og postfiksert (trinn 3.4). Hjernen ble kuttet i 40 μm koronale seksjoner (trinn 3.5). Seksjoner ble behandlet for BrdU immunhistokjemi, som beskrevet i trinn 4.

Vi brukte pepperrotperoksidasereaksjon med DAB IHC for farging (trinn 4.1) og telling av BrdU-positive celler i DG. Figur 5 viser en DG-seksjon med BrdU-merkede celler. Figur 5C,D viser en representativ del av DG-delen ved høyere forstørrelse. Merkede celler viste intens mørk farging, som var merket med piler. Innfellingen viser gjennomsnittlig antall merkede celler i eksperiment- og kontrollgruppene (telles positive celler multiplisert med seks som beskrevet i trinn 8.1). Student t-test viste signifikansforskjeller mellom antall BrdU-positive celler (t(10) = 2,704, p = 0,0222). Kontrollgruppen som ikke gjennomgikk fysisk aktivitet viste 2 040 ± 314 celler (n = 6 rotter). Til sammenligning viste gruppen med fysisk aktivitet i gjennomsnitt 3 606 ± 486 (n = 6 rotter) BrdU-positive celler. Som observert øker eksponeringen for fysisk aktivitet BrdU-positive celler. Derfor er disse resultatene i samsvar med andre rapporterte resultater som viser at fysisk aktivitet økte cellulær proliferasjon i den voksne dentate gyrus17.

Figure 3
Figur 3: Eksempler på forskjellig morfologi av BrdU-merket cellekjerne. BrdU er en DNA-syntesemarkør som merker kjernen. I hippocampus-regionen hadde de BrdU-positive kjernene en semi-oval form plassert i dentate gyrus sub-granulær sone. Siden BrdU er inkorporert ved konkurranse, vil mengden innlemmet for hver celle ha en variasjon som senere vil bli reflektert i hvordan kjernen vil bli visualisert. (A) Immunfluorescensbilde. (B) Et bilde som bruker peroksidasereaksjon uten en ytterligere forsterkningsmetode presenteres. Gule piler viser artefakter og ikke-spesifikke signaler. Svarte eller hvite piler viser BrdU+-celler. 1 - Fullt arkivert kjerne, semi-ovale kjerner svært farget. 2 - Kjerner med prikker, grensen til kjernene er merket og har inne flere prikker. 3 – Kjerner med få prikker, grensen til kjernene er merket og har et lite antall prikker inni. 4 - Liten kjerne er mulige celler i et annet differensieringsstadium, men fortsatt en del av nisjen. 5 - Klynger er forløperceller under divisjon, derfor kan flere celler sammen i kondenserte grupper observeres. Innenfor disse gruppene må tellingen gjøres spesielt nøye for å unngå feilmerking av positive celler. Røde piler viser kjernen under deling som kan forveksles til å være en enkelt celle. Hver celle er innelukket i en boks og kan skilles i et Z-akseplan i sanntid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativt RGB-bilde for enkeltkanaler og sammenslåtte kanaler. Det øverste bildet viser det opprinnelige z-stack-bildet, og det nedre bildet viser det 3D-dekonvoluterte z-stack-bildet. (A) Lav forstørrelse av DG. (B) RGB-bilde for hver kanal, og (C) RGB-sammenslått bilde. Dette var en hjerne fra kontrollgruppen. Immunfluorescens ble brukt uten ytterligere amplifikasjonsmetode. BrdU (rød), DAPI som motvekt (blå) og GFAP (glial fibrillært surt protein) som astrogliamarkør (grønn). ML = molekylært lag; GCL = granulært cellelag; SGZ = subgranulær sone. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representativ DG-seksjon med BrdU-merkede celler (intens mørk) for hver eksperimentell gruppe. Peroksidasereaksjonen ble brukt med avidin-biotin-peroksidasekompleksforsterkningsmetoden. (A, B) Vis en lav forstørrelse av DG, og (C, D) viser boksområdet ved høyere forstørrelse. Panel A og C er vev fra den fysiske aktivitetsgruppen, panelene B og D er fra kontrollgruppen. Innfellingen viser gjennomsnittlig antall merkede celler i fysisk aktivitet og kontrollgrupper (telles positive celler multiplisert med seks som beskrevet i trinn 8.1). ML = molekylært lag; GCL = granulært cellelag; SGZ = subgranulær sone; pilene angir BrdU+-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Video som viser et annet fokus på positive celler langs z-aksen fordelt i forskjellige lag. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: Video som viser et annet fokus på positive celleklynger langs z-aksen fordelt i forskjellige lag. Beveg deg sakte over z-aksen for å kvantifisere alle flere kjerner som integrerer en klynge. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Mikroskop Type: Epifluorescens mikroskop Olympus BX53
Lyskilde: Høytrykks 130 W kvikksølvbuelampe (U-HGLGPS)
Oppkjøp Programvare: CellSens Standard
Filtre Sett: Katalog nummer Eksitasjonsområde Dikromatisk speil Undertrykkelse Range
U-FUW 340 - 490 nm 410 nm 420 nm
U-FBW 460 - 495 nm 505 nm 510 nm
U-FGW 530 - 550 nm 570 nm 575 nm
Kamera: Modell: CCD-kamera UC50
Spektral rekkevidde: 290 – 1000 nm
CCD chip størrelse: 2/3 tommer, 2588 piksler (bredde *7) X 1960 (høyde *8)
Pixel Størrelse: 3,4 X 3,4 μm
Fluorokrom: Navn Bølgelengde for eksitasjon (nm) Utslipp *3 Bølgelengde (nm) Utslipp Farge
4, 6-diamidino-2-fenyl-indol HCI (DAPI) 345 455 Blå
Tetrametylrhodamin-isotyocyanat (TRITC) 541 572 Rød
Fluorescein-isotiocyanat (FITC) 494 519 Grønn
Cy3 552 565 Rød
Montering Medium og nedsenkningsolje: Navn Indeks for brytning av media * 1
Luft (ingenting mellom lysbildet og linsen) 1.00029
Antifade monteringsmedium med DAPI 1.45
Permount monteringsmedium 1.519
Lav autofluorescens nedsenkningsolje (MOIL-30 Type F) 1.518
Forstørrelseslinse (Plan Fluorite) Forstørrelse Numerisk blenderåpning (NA) *2 Oppløsning (μm) Bildepikselavstand (nm) *5 Avstand mellom deler Z-aksen (nm) *6
4X 0.13 2.12 850 3000
10X 0.3 0.92 340 3000
20X 0.5 0.55 170 2000
40X 0.75 0.37 85 1000
100X 1.3 0.21 34 1000

Tabell 2: Spesifikasjoner for mikroskopoppsett og krav til oppretting av PSF-filer (Point Spread Function). Det er 11 spor i diffraksjon PSF 3D plugin-vinduet for å opprette PSF-filen. Hvert spor er beskrevet som følger: *1 - Brytningsindeks for mediet: brytningsindeks for mediet mellom lysbildet og objektivet (f.eks. luft = 1,00029). *2 - Numerisk blenderåpning: NA for objektivet som brukes (det må korrigeres når et annet nedsenkningsmedium brukes og objektivet ble tilordnet). *3 - Bølgelengde: Fluorokrom maksimal utslippsbølgelengde (nm). *4 - Langsgående sfærisk aberrasjon: 0,00. *5 – Bildepikselavstand: CCD-pikselstørrelse (nm)/forstørrelse (f.eks. 3,4 μm og 100X-objektiv, 3400/100 = 34 nm). *6 - Avstand mellom bilder Z-aksen. 7 - Bredde: Angi bredden på bildet som skal avvikles i piksler. *8 - Høyde: Angi høyden på bildet som skal dekonvolbles i piksler. 9 - Dybde, stykker: antall bilder i z-stacken. *10 – Normalisering: Summen av bildepunktverdier = 1. *11 – Tittel: Ønsket navn på PSF-filen. Filen skal samsvare med det unike gitte z-stack-bildet.

Discussion

Voksen neurogenese er en prosess som forekommer hyppigst i nisjer av voksne nevrale forløperceller som har potensial til å generere nye nevroner gjennom hele levetiden. Bromodeoxyuridine (BrdU) merking er mye brukt i immunologi for å karakterisere antall nylig genererte celler i en voksen hjerne. BrdU vil hovedsakelig bli innlemmet i celler i diskrete hjernegrupper (nevrogene soner). Disse cellene er lokalisert i sub-ventrikulær sone (SVZ), dentate gyrus av hippocampus - mellom hilus og granulære celler kjent som sub-granulær sone (SGZ) 1,2,18. Videre er det forskjellige hjernegrupper preget av lavere proliferativ kapasitet i voksen alder, inkludert hypothalamus, striatum, neocortex og amygdala19. Som nevnt tidligere er BrdU-farging den mest brukte metoden for nevrogeneseforskning hos voksne for å oppdage celleproliferasjon. Bruken av BrdU som markør har imidlertid begrensninger og fallgruver. Den første er at BrdU er en cellesyklusmarkør. Derfor må dobbel eller trippel farging utføres for å identifisere cellens skjebne og inkludere cellemarkører for å oppdage det spesifikke utviklingsstadiet av cellene som er merket. En annen bekymring om BrdU er at det er en giftig og mutagen løsning som endrer DNA-stabilitet, kan endre cellulær funksjon og cellesykluser. Det bør tas hensyn til tidligere informasjon når man bestemmer seg for å følge en administrasjonsprotokoll og administrasjonsdoser (50\u2012600 mg/kg). En annen viktig funksjon er at BrdU er en DNA-syntesemarkør, ikke en celleproliferasjonsmarkør14. Derfor er det relevant å skille celleproliferasjon fra andre hendelser som DNA-reparasjon, abortiv cellesyklus-re-entry og genduplisering. Forskeren må følge hensiktsmessige kontroller for å sikre riktig bruk av BrdU. For en mer detaljert diskusjon om disse problemene og begrensningene, anbefaler vi å gjennomgå Taupins arbeid14. Standardiseringsprosessen av en immunhistokjemiprotokoll kan være langsom og utfordrende. I dette arbeidet har vi presentert alle de generelle trinnene for å administrere en vellykket IHC-protokoll. Vi anbefaler imidlertid at hver forskningsgruppe tester og evaluerer vev, antistoffer og forhold på forhånd. Tester og evalueringer må utføres med minst tre forskjellige nivåer av inkubasjoner, vasketrinn og styrker for hvert antistoff og vev som testes. Vi anbefaler også at forskere gjennomgår tilleggsprotokoller for å kunne velge den beste som oppfyller spesifikke behov og krav 20,21,22,23,24,25.

Som nevnt tidligere innebærer prosedyren flere trinn og metodologiske hensyn som ofte brukes og nevnes i vitenskapelige artikler, som senere vil bli diskutert. Vi anbefaler at forskere velger antistoffene nøye og riktig når det gjelder teknikk, budsjett, utstyr, oppsett og hovedforskningsmål. Antistoffer må testes med samme type vev som senere skal testes i forsøket. Vi anbefaler også bruk av et antistoff som ble testet for samme formål (IHC) (dvs. ikke bare i western blot eller flowcytometri teknikker) for å teste kompatibiliteten med fikseringsteknikken. Ulike ruter kan brukes til å administrere BrdU-farging, som intraperitoneal injeksjon, intraperitoneal infusjon, oralt inntak eller intraventrikulær infusjon (for en mer detaljert beskrivelse av hver teknikk, se referanse26). Hvis den intraperitoneale injeksjonen er valgt, må du sørge for at BrdU administreres i bukhulen og unngår tarmområdet. Siden tarmen har flere celler i duplisering som kan utmatte BrdU før den kommer til hjernen som vil påvirke antall merkede celler. Det er avgjørende å få tynne seksjoner siden de tillater bedre penetrasjon av løsninger. Koronale skiver på 40 μm tykke ble kuttet rostro-kaudalt og ble overført til en 24-brønns cellekulturplate, etter den stereologiske prosedyren foreslått av Kempermann et al.27. Immunhistokjemien kan utføres med vev montert på lysbilder eller som frittflytende seksjoner. Siden BrdU ligger dypt i cellekjerner, tillater det penetrasjon av løsninger i frittflytende seksjoner som gir bedre resultater og bedre tilgang til interesseområdet. Det er viktig å åpne DNA-bindinger (DNA-denaturering) for å gi den primære anti-BrdU-antistofftilgangen. I dette arbeidet utførte vi disse spesifikke prosedyrene ved bruk av HCI-inkubasjon. På den annen side tillot prosessen med å blokkere uspesifikke epitoper en mer nøyaktig identifisering av cellesignal.

Den gode membranpermeabiliseringen gjør at antistoffene kan trenge ordentlig inn i interesseområdet. Tilsetning av en permeabilizer som Triton X-100 til PBS ++ og PBS + løsninger forbedrer membranpermeabilisering. Både PBS- og Tris-bufrede saltvannsreagenser (TBS) kan brukes i denne protokollen. Når det gjelder budsjett, kan TBS være relativitet billigere enn PBS. PBS kan imidlertid forstyrre antifosfatantistoffer og hemme alkaliske fosfatasekonjugerte antistoffer, så unngå bruk av PBS hvis målet er posttranslasjonelt modifisert ved fosforylering (dvs. fosforylert). Vi brukte PBS til dette arbeidet, og vi fant ut at vevsvasketrinn ga et mer spesifikt signal. Vi anbefaler også forskere å utføre minst tre vaskesykluser ved hjelp av enten TBS o PBS. Løsningene må være nyforberedt. Antigenuthenting (AR) er en metode som er ment å redusere tap av antigenitet forårsaket av fiksering som endrer strukturen til tertiære og kvartære antigener. Denne reduksjonen gjør antigener uoppdagelige av antistoffer28,29. Den varmeinduserte epitopinnhentingen (HIER) brukt i denne protokollen forsøkte å reversere de kjemiske reaksjonene mellom formaldehyd og proteiner ved høy temperatur eller sterk alkalisk hydrolyse (med andre bufferløsninger som EDTA pH 8,5 eller Tris pH 9,5). Det er viktig å teste nye antistoffer med forskjellige AR-protokoller for å sammenligne resultater og velge den beste for protokollen. Dette siste trinnet kan være valgfritt i en vanlig protokoll; Vi behandlet imidlertid vev med en antigeninnhentingsprotokoll for å gi bedre resultater for denne protokollen.

Det er avgjørende å velge riktig endelig kontrastfarge og motbesetningsteknikk med tanke på den primære fargefargen og metoden som brukes til å gjøre en ikke-fargingsstruktur synlig og unngå å maskere den primære fargefargen fra immunreaksjonen. For fluorescensmikroskopien er DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylidol) en veldig populær kjerne- og kromosommotvekt som avgir blå fluorescens (absorpsjon: 360 nm, utslipp: 460 nm) ved binding til AT-regioner av DNA. DAPI-holdig monteringsmedium er tilgjengelig og er enkelt å bruke; Dette gir utmerket signaloppbevaring for bildeopptak. For peroksidreaksjonen var IHC tilgjengelig i forskjellige alternativer som kresylfiolett, hematoksylin, nøytral rød eller metylgrønn farging. For flere immunostaining-teknikker er det avgjørende å velge et kompatibelt antistoff med fikseringsteknikken som brukes for å unngå kryssreaktivitet30. Når problemer og komplikasjoner med enkelt farging er løst, administrere en annen farge farging som anses nødvendig. Det er avgjørende å kontrollere den uspesifikke bindingen mellom de sekundære antistoffene. Dette kan gjøres ved å mette de primære antistoffene før du bruker et sekundært antistoff produsert i samme vertsart av de primære antistoffene. For eksempel, når du bruker anti-mus produsert i kanin og anti-kanin produsert i geit sekundære antistoffer, må anti-kanin produsert i geit antistoff brukes før anti-mus produsert i kanin antistoff. Når den sekvensielle metoden domineres helt, kan den samtidige immunostaining-prosessen startes. I denne metoden er det viktig å velge sekundære antistoffer på riktig måte. Ideelt sett må alle disse antistoffene komme fra samme vertsdyr for å unngå kryssreaktivitet. Vi anbefaler å kjøre en positiv kontroll for å bekrefte at fargemetoden fungerer nøyaktig i postnatal hippocampusvev (rikelig nevrogenese rundt denne alderen). Hvis det positive kontrollvevet viser fargeproblemer, gjennomgå og gå over prosedyren, gjør korreksjoner og justeringer, og gjenta til en god farging er produsert. Kjør deretter en negativ kontroll for å teste at antistoffet fungerer riktig ved å utelate eller erstatte et bestemt primært antistoff med normalt serum (samme art som det primære antistoffet). Som nevnt i innledningen er bildedekonvolusjon et kraftig verktøy og gir et alternativ når et konfokalt mikroskop ikke er tilgjengelig. Det kan bruke bildedekonvolusjonen på alle bilder som er oppnådd ved hjelp av overført lysfelt, bredfeltfluorescens og konfokal fluorescensmikroskopi. Det endelige formålet med bildedekonvolusjon er å rekonstruere det opprinnelige signalet om at innsamlingssystemet forverres10.

Oppsummert er identifiseringen av de nylig genererte cellene visualisert ved immundeteksjon av tymidinanalog BrdU en komplisert, men kraftig teknikk. Dette arbeidet er et forsøk på å hjelpe forskere, spesielt innen voksen hippocampal neurogenese, for å kvantifisere nye celler mer nøyaktig. Vi håper at denne innsatsen har vært nyttig for det vitenskapelige samfunnet og gjør det lettere å finjustere studiet av celleproliferasjon ved immunhistokjemi-teknikken.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Miguel Burgos og Gustavo Lago for å gi teknisk assistanse. Vi ønsker også å takke Dr. Clorinda Arias, Dr. Karla Hernandez og Dr. Oscar Galicia for deres vennlige støtte i å gi reagenser og materiale. Vi takker også División de Investigación y Posgrado fra Universidad Iberoamericana Ciudad de México for å gi finansiering til utførelsen av dette arbeidet og for å dekke videoproduksjonsutgifter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENT PREPARATION AND SETUP
Donor Horse Serum BioWest S0900 Blocking and incubation solutions in PBS
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma-Aldrich P6148 toxic, flammable
Potassium Chloride Sigma-Aldrich 746436-500G
Potassium Phosphate, monobasic J.T Bker 3246-01
Sacarose J.T Baker 4072-01
Sodium Chloride Meyer 2365-500G
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G Corrisive, to calibrate pH
Sodium Phophate Dibasic Sigma-Aldrich S9763-5KG
Triton-x 100 Sigma-Aldrich T8787
THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
23–27G hypodermic needle BD PrecisionGlide
Saline solution PiSA 30130032
Syringes 1 mL NIPRO
TISSUE PREPARATION
15-ml polypropylene conical tube Thermo Scientific 339650
50-ml polypropylene conical tube Thermo Scientific 339652
Dissecting tools
Guillotine Stoelting
Microtome Cryostat MICROM HM525
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3477 pre-loaded in 12-well culture plates
Netwell plastic 12-well carrier kit Corning 3520 for 15 mm polyester mesh membrane inserts
Netwell plastic 6-well carrier kit Corning 3521
Perfusion pump Cole-Parmer 7553-70
Shaker IKA ROKCER 3D Digital
IMMUNOSTAINING
Cresyl violet Sigma-Aldrich C5042 1%, Light sensitive
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 carcinogenic, light sensitive
Hydochloric Acid J.T.Baker 9535-05 Corrosive, to calibrate pH
Hydrogen Peroxide, 50% Meyer 5375-1L Toxic, oxidative
Permount Mounting Medium Fisher Chemical SP15-500
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Light sensitive
VECTASTAIN® Elite® ABC Kit Peroxidase (HRP) Vector Laboratories PK-6100 enzymatic, avidin/biotin based amplification system
Primary antibodies
Anti-GFAP antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich HPA056030 1:500
Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse Sigma-Aldrich B2531 1:250
Secondary antibodies
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-065-151 1:250
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP Invitrogen G-21040 1:1000
Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC Sigma-Aldrich T5393 1:250
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC Invitrogen F-2765 1:250
Streptavidin, Cy3 Vector Laboratories SA-1300 1:250
IMAGING AND ANALYSIS
Computer Dell Computer Company T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB For controlling and monitoring protocols’ processes
CCD-camera Olympus UC50
CellSens Standard software Olympus cellSens Standard Edition Acquisition Software
Epifluorescent microscope Olympus BX53
High-pressure 130 W mercury arc lamp Olympus U-HGLGPS
low autofluorescence immersion oil Olympus MOIL-30 Type F
Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24  60 mm)
Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76  26 mm)
U-FBW filter cube Olympus U-FBW excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm
U-FGW filter cube Olympus U-FGW excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm
U-FUW filter cube Olympus U-FUW excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altman, J. Are new neurons formed in the brains of adult mammals. Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
  3. Miller, M. W., Nowakowski, R. S. Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system. Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).
  4. Eriksson, P. S., et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).
  5. Filippov, V., et al. Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes. Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).
  6. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).
  7. Matiašová, A., et al. Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice. Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).
  8. Von Bohlen Und Halbach, O. Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus. Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).
  9. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  10. Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue. Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with imageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).
  13. Giannini, A., Giannini, J. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual. , Available from: https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p (2016).
  14. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  15. Revilla, V., Jones, A. Cryostat sectioning of brains. International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).
  16. Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).
  17. Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density. Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).
  18. Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodríguez-Serrano, L. M., Buenrostro-Jáuregui, M. Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update. Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).
  19. Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).
  20. Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).
  21. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
  22. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. Journal of Visualized Experiments. (46), e2166 (2010).
  23. Tischler, A. S. Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).
  24. Taupin, P. Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments. Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).
  25. Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive. Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).
  26. Magavi, S. S., MacKlis, J. D. Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo. Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).
  27. Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. , 391-399 (2003).
  28. Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).
  29. Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  30. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).

Tags

Biologi utgave 163 BrdU hippocampus dentate gyrus nevrogenese antigenuthenting deteksjonsmetoder fiksering immunhistokjemi immunfluorescens standardisering feilsøking bildedekonvolusjon
Immunhistokjemi teknikker for å analysere cellulær proliferasjon og neurogenese hos rotter ved bruk av tymidinanalog BrdU
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buenrostro-Jauregui, M.,… More

Buenrostro-Jauregui, M., Tapia-de-Jesús, A., Mata, J., Rodríguez-Serrano, L. M., Chávez-Hernández, M. E., Mata, F., Monroy-Plasencia, M., Alonso-Flores, A. C., Leal-Galicia, P. Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU. J. Vis. Exp. (163), e61483, doi:10.3791/61483 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter