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Biology

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.

Abstract

트랜스포슨 시퀀싱(Tn-seq)은 광범위한 환경 조건하에서 세균 적합성에 기여하는 유전자와 경로를 식별하기 위해 트랜스포슨 돌연변이 발생과 대규모 병렬 시퀀싱을 결합한 강력한 방법입니다. Tn-seq 응용 프로그램은 광범위하고 유기체 수준에서 뿐만 아니라 인구, 지역 사회 및 시스템 수준에서 유전자형 표현형 관계의 검사를 가능하게했다. 그람 음성 박테리아는 항균 저항 표현형과 매우 관련이 있으며, 이는 항생제 치료 실패의 인시던트를 증가시켰습니다. 항균 저항은 그렇지 않으면 치명적인 항생제의 존재에 세균성 성장으로 정의됩니다. "마지막 줄" 항균 colistin 그람 음성 세균 감염을 치료 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 아신토박터 baumannii를 포함한 몇몇 그람 음성 병원체는 Tn-seq를 사용하여 특징지어진 분자 기계장치의 범위를 통해 colistin 저항을 개발할 수 있습니다. 또한, colistin 저항을 조절 하는 신호 변환 경로 그람 부정적인 박테리아 내에서 변화. 여기서 는 제한 효소, 어댑터 리칭 및 젤 정화의 필요성을 제거하여 포화 트랜스포온 삽입 라이브러리 및 앰플리션 라이브러리 건설의 생성을 간소화하는 A. baumannii에서 트랜스포슨 돌연변이 발생의 효율적인 방법을 제안합니다. 본 원에 기재된 방법은 colistin에 도전할 때 A. baumannii 피트니스에 기여하는 분자 결정요인의 심층분석을 가능하게 할 것이다. 프로토콜은 또한 그밖 그람 음성 ESKAPE 병원체에 적용됩니다, 주로 약 저항하는 병원 취득한 감염과연관됩니다.

Introduction

항생제의 발견은 의심 할 여지없이 20세기의 가장 영향력있는 건강 관련 사건 중 하나입니다. 항생제는 심각한 세균 감염을 신속하게 해결할 뿐만 아니라 현대 의학에서도 중추적인 역할을 합니다. 신생아 의과 및 화학요법의 주요 수술, 이식 및 어드밴스는 생명을 위협하는 감염에 취약한 환자를 남겨두고 이러한 치료법은 항생제1,,2없이는 불가능할 것이다. 그러나, 인간 병원체 중 항생제 내성의 급속한 발달 및 확산은 항생제3의모든 임상적으로 중요한 클래스의 효능을 현저히 감소시켰습니다. 한 번 쉽게 항생제 치료로 삭제 된 많은 세균 성 감염, 더 이상 글로벌 공중 보건에 심각한 위협을 일으키는 고전적인 치료 프로토콜에 응답하지않습니다 1. 항균 성 내성 (AMR)은 치료 기간4,,5에관계없이 세균 세포가 항생제의 치명적인 농도에서 성장하는 곳입니다. AMR을 조절하는 분자 및 생화학적 요인을 이해해야 하는 긴급한 필요성이 있으며, 이는 대체 항균 발달을 안내하는 데 도움이 될 것입니다. 특히, ESKAPE 병원체는 임상 환경에서 문제가 있으며 광범위한 AMR과 관련이 있습니다. 여기에는 Enterococcus faecium, Staphylococcus 아우레우스, K렙시엘라 폐렴, 시네토박터바우마니, P수도모나스 아에루기노사 및 Enterobacter spp가 포함됩니다. 몇몇 기계장치는 ESKAPE 병원체에 있는 AMR에 기여하는 동안, 후자의 4개의 유기체는 그람 음성입니다.

그람 음성 박테리아는 불리한 환경 조건으로부터 그들을 보호하는 정의 외부 막을 조립합니다. 외부 막은 항생제와 같은 독성 분자의 진입을 세포로 제한하는 투과성 장벽역할을 합니다. 다른 생물학적 멤브레인과 달리 외부 막은 비대칭입니다. 외부 전단지는 표면에 노출된 리포폴리사카라이드로 풍부하고, 내부 전단지는 인지질6의혼합물이다. 지질성 당항 분자는 지질 이중층7내에 내장된 보존된 지질 A moiety에 의해 외부 막에 고정된다. 에세리치아 대장균 리포폴리사카라이드의 정식 지질 은 대부분의 그램 음성 박테리아의 성장에 필요하며 그람 음성 유기체에서 가장 근본적이고 보존된 통로 중 하나인 9단계 효소 경로에 의해 합성된다6,,7,,8.

다묘신은 외막을 교란시키고 세포를 분해하기 위해 지질 A 도메인을 표적으로 하는 양이온 항균 펩티드입니다. 폴리마이신의 양전하 잔류물과 음전하 지질 A 인산염 군 사이의 정전기 상호 작용은 궁극적으로 세포사멸9,,10,,11,,12,,13로이어지는 세균세포막을 방해한다. Colistin (polymyxin E)는 아신토박터 baumannii14,,15,,16과같은 다약물 내성 그람 음성 외유성 병원균으로 인한 감염을 치료하는 데 사용되는 최후의 수단 항균제이다. 1947년에 처음 발견된 폴리마이신은 토양 박테리아인 파니바실러스 폴리멕사17,,18,,19에의해 생산된다. 다각형은 중요한 신증후군 및 신경독성20,,21의보고 때문에 그들의 임상 사용이 제한되기 전에 년 동안 그람 음성 감염을 취급하기 위하여 처방되었습니다.

A. baumannii는 최근 수십 년 동안 환자 결과의 이환율과 사망률을 극적으로 증가시킨 nosocomial Gram 음성 병원체입니다22. 한 때 저위협 병원체로 여겨졌던 것은, 이제 AMR을 취득하는 놀라운 능력과 전염병23,,24의고위험 때문에 전 세계적으로 병원 취득한 감염에 대한 중요한 위험을 제기합니다. A. baumannii는 미국에서 nosocomial 감염의 10% 이상을 차지합니다. 질병은 폐렴, 세균, 요로 감염, 피부 및 연조직 감염, 뇌막염 및 내막염(25)으로나타납니다. A. baumannii 감염에 대한 치료 옵션은 β- lactams, 불소 퀴놀론, 테트라사이클린 및 아미노 글리코 사이드23,,24를포함하여 거의 모든 항생제 클래스에 대한 저항으로 인해 감소되었습니다. 다약물 내성, 광범위하게 약물 내성 및 범약 내성 A. baumannii 격리의 보급은 colistin 치료에 부활을 주도하고있다, 이는 여전히 다약물 내성 A. baumannii에대한 효과적인 몇 가지 남아있는 치료 옵션 중 하나가 될 것으로 생각되었다. 그러나, A. baumannii 격리 중 증가 된 colistin 저항은 글로벌 공중 보건,10,11,,12,13,27,,,,30,,31에대한 위협을 더욱 증폭시켰다.30

트랜스포슨 시퀀싱(Tn-seq)과 같은 고처리량 시퀀싱 기술의 최근 발전은 시험관 내 및 생체 내 세균 적합성에 대한 이해를 증진시키는 중요한 도구를 제공했습니다. Tn-seq는 박테리아에서 유전자형 표현형 상호 작용을 연구하기 위해 활용할 수 있는 강력한 도구입니다. Tn-seq는 기존의 트랜스포손 돌연변이 발생과 대규모 병렬 시퀀싱을 결합하여 삽입 부위를 빠르게 매핑하는 세균 병원체 전반에 광범위하게 적용되며, 이는 DNA 돌연변이를 게놈 전체 척도32,,33,,34,35에대한 페노티픽 변이체에 연결하는 데 사용될 수 있다., 트랜스포슨 돌연변이 발생 방법은 이전에 설명되었지만 일반적인 단계는33과유사합니다. 첫째, 삽입 라이브러리는 트랜스포슨 돌연변이 발생을 사용하여 생성되며, 인구 내의 각 세균 세포는 게놈 DNA(gDNA) 내의 단일 트랜스포슨 삽입으로 제한됩니다. 돌연변이 발생 에 따라 개별 돌연변이가 풀로 들어오게됩니다. gDNA는 삽입 돌연변이 풀에서 추출되고 트랜스포슨 접합은 증폭되고 고처리량 시퀀싱을 받습니다. 판독은 게놈에 매핑될 수 있는 삽입 부위를 나타냅니다. 체력을 감소시키는 트랜스포슨 삽입은 인구에서 빠르게 떨어지고 유익한 삽입은 풍부합니다. Tn-seq는 유전자가 스트레스33에서세균 성 피트니스에 미치는 영향에 대한 이해를 증진시키는 데 중요한 역할을해 왔습니다.

pJNW684에 인코딩된 히마1 마리너 트랜스포슨 시스템은 트랜스포슨 돌연변이 발생을 목적으로 특별히 제작및 최적화되었다. 그것은 A. baumannii에서 트랜스포슨 삽입 돌연변이의 선택에 사용되는 카나마이신 저항 유전자를 측면에 선원- 가족 트랜스 포슨을 포함한다. 또한 트랜스포사제 인코딩유전자(36)의발현을 구동하는 A. baumannii 특정 프로모터를 인코딩한다. 마리너기반 트랜스포슨은 또한 삽입37의판독 다운스트림을 방지하는 카나마이신 저항 유전자의 하류에 두 개의 번역 종기를 포함한다. pJNW684는 또한38을복제하기 위해 기증자 균주에 의해 기여된 λpir 유전자를 필요로 하는 복제의 RP4/oriT/oriR6K-조건부 기원을 전달한다. λpir 유전자가 없는 경우, 전치 기계를 운반하는 pJNW684 벡터는 A. baumannii 수신자 균주10,,36,,38에서복제할 수 없다. 따라서, 세균성 컨쥬게이션 도중, 트랜스포지온만이 트랜스포지아제 유전자를 운반하는 플라스미드의 배경 삽입 없이 수신자 게놈에 삽입된다. 이것은 플라스미드와 함께 트랜스포지아제 활동의 손실이 수신자 게놈에 삽입되면 트랜스포슨이 다른 위치로 이동하는 것을 방지하는 단일, 안정적인 전치 이벤트에서 결과하기 때문에 중요합니다.

pJNW648은 또 다른 그램 음성 유기체인 대장균에서의활성을 테스트하였다. 대장균 균주 W3110에서 포화 Tn-seq 라이브러리의 성공적인 조립은 시스템이 엔테로박테리아를 포함한 광범위한 병원균에서 돌연변이 발생을 수행할 수 있음을 나타냈다. 또한 트랜스포세아제 발현을 구동하는 A. baumannii 특정 프로모터는 종별 프로모터와 신속하게 교환할 수 있습니다. 마지막으로, 카나마이신 저항 유전자는 연구 중인 유기체의 AMR 표현형에 따라 다른 저항 카세트로 교환될 수 있다.

A. baumannii에서 colistin 저항에 기여하는 한 가지 요인은 박테리아가 비 치명적인 수준에서 선택적 압력에 노출되는 불충분한 복용량의 관리입니다39. 여러 보고서는 억제 항균 농도가,전체 세균,집단11,12,30,31의감수성을 감소시키기 위해 세포 생리학을 변화시키는 조절된 반응을 유도할 수 있음을 보여주었다., Tn-seq를 사용하여, 우리는 A. baumannii 균주 ATCC 17978에 있는 colistin 저항을 조절하는 요인을 발견10 및 colistin의 억제 농도에 노출 한 후.10 이 예제에서는 선원기반 트랜스포슨제품군(40,,41)을사용하여 포화 트랜스포손 돌연변이 라이브러리의 구성 및 농축을 간소화하는 Tn-seq 방법을 자세히 설명합니다. 여러 Tn-seq 프로토콜은 20,000 - 100,000 돌연변이35,,42,,43,,44,,45,,46을생성하는 반면, 본원에 설명된 프로토콜은 400,000+ 돌연변이의 트랜스포슨 라이브러리를 신속하게 생성할 수 있으며, 이는 대략10개의베이스 10쌍의 아포 스트랜톤 삽입과 동일합니다. A. baumannii 또한, 라이브러리 크기를 크게 추가없이 확장할 수 있습니다. 이 방법은 또한 최종 라이브러리 다양성을 줄일 수있는 제한 엔토넥션, 어댑터 결찰 및 젤 정화에 대한 요구 사항을 제거합니다.

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Protocol

1. 세균 균주 준비

  1. 루리아-베르타니 한천에 분리된 콜로니에 대한 "기증자" 균주(E.coli MFD DAP-/pJNW684, 재료 의 표)를600 μM 디아미노피멜산(DAP), 100 mg/L의 암피실린 및 가나마이신 25 mg/L로 보충하였다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 단일 고립 된 식민지를 사용 하 여, Inoculate 50 luria 국물의 mL (LB) 600 μM DAP, 100 암피실린의 mg/L 및 25 mg/L 에서 카나마이신의 25 mg/L 25 mL 에를렌마이어 플라스크와 라벨 "기증자"로 라벨.
  2. 루리아-베르타니 한천에 고립된 식민지를 위한 "수신자"균주(A. baumannii 균주 ATCC 17978, 재료 테이블)를줄입니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 단일 고립 된 식민지를 사용 하 여, 250 mL Erlenmeyer 플라스크에 LB의 50 mL을 접종 하 고 "받는 사람"으로 레이블.
  3. 두 문화 ("기증자"와 "수령인")를 37 °C에서 하룻밤 동안 흔들어 보배하십시오.

2. 세균 짝짓기

  1. 야간 문화를 50mL 원문 튜브로 옮기십시오.
  2. 7 분 동안 5,000 x g에서 원심 분리를 사용하는 수령인 과 기증자 문화.
  3. 상체를 버리고 잔류 항생제를 씻어 내기 위해 DAP로 보충 된 LB의 35 mL에서 "기증자"균주 펠릿을 다시 중단하십시오.
  4. 펠릿 "기증자" 변형 세포원심분리를 사용 하 여 5,000 x g에 대 한 7 분.
  5. 상체를 버리고 DAP로 보충 된 LB의 4.5 mL에서 "기증자"변형 펠릿을 다시 중단하십시오. 10mL 세로지피펫을 사용하십시오.
  6. "수령인" 균주 튜브로 재일시 중단된 "기증자" 균주를 전송하여 펠릿 "받는 사람" 세포를 포함합니다. 2.5단계에서 동일한 10mL 세로지피펫을 사용하여 배양을 혼합합니다. 즉시 다음 단계로 이동합니다.
    참고: 최종 서스펜션의 총 부피는 5mL여야 합니다.
  7. DAP(플레이트당 5-7방울)로 보충된 LB 천판에 개별 100 μL 방울로 결합 현탁액을 분배합니다(도1A).
  8. 30 분 동안 실온에서 접시를 배양하십시오.
  9. 물방울을 방해하지 않고 플레이트를 37 °C 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 문화가 1 h로 메이트 할 수있습니다.
    참고 : 1 h를 초과하는 잠복기는 자매 돌연변이의 생성을 위험합니다.
  10. 인큐베이션에 따라 각 접시에 1.5mL의 LB를 추가하고 접시에서 박테리아를 재연하여 수확하십시오. 1mL 마이크로피펫을 사용하여 리서스펜션을 사용할 수 있습니다. 최종 부피는 약 12 ~ 15mL여야 합니다.
  11. 수확된 세포를 50mL 원추형 튜브에 결합합니다.
  12. 7 분 동안 5,000 x g에서 원심 분리를 사용하여 메이트 된 세포를 펠렛.
  13. 잔류 DAP를 제거하기 위해 상체를 버리고 LB의 50mL에서 셀을 다시 중단합니다.
  14. 7 분 동안 5,000 x g에서 원심 분리를 사용하여 짝짓기를 펠렛.
  15. 세척 단계(2.13 및 2.14 단계)를 반복합니다.
  16. 10 mL 세로지 피펫을 사용하여 25 % 글리세롤로 보충 된 LB의 10 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
  17. 세척 된 세포를 사용하여, LB 국물에 5 개의 연속 희석을 합니다 (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000)
  18. 멸균 유리 구슬을 사용하여 4 개의 다른 접시에 각 희석의 100 μL을 확산 : 카나마이신으로 보충 루리아 - 베르타니 한천, 암피실린으로 보충 된 한천, DAP와 한천으로 보충 된 한천.
  19. 하룻밤 사이에 37 °C에서 플레이트를 배양하십시오.
  20. Aliquot는 나머지 짝짓기를 1 mL 알리쿼트에 쿼트하고 -80 °C에 저장합니다.

3. 트랜스포슨 라이브러리의 적절한 희석 을 결정

  1. 야간 플레이트에서 콜로니 형성 유닛(CFU)을 기록합니다.
  2. 각 상이한 플레이트 조건에 대해 카운트 가능한 콜로니가 있는 플레이트를이미지(그림 2A).
    참고: "기증자"와 "수령인" 균주는 DAP로 보충된 한천 접시에서 자라야 하므로 대부분의 도금 희석은 잔디밭을 생성합니다. 만 "받는 사람"변형은 천접시에서 성장할 수 있습니다. "기증자"도 "받는 사람"균주는 암피실린으로 보충 된 한천 접시에서 성장할 수 없으므로 성장이 최소화되지 않아야합니다. 트랜스포지 삽입을 인코딩하는 표적 스트레인 세포만이 카나마이신으로 보충된 한천 플레이트에서 자랄 수 있다. 식민지크기는 크기가 다양해야 하며, 이는 카나마이신으로 보충된 한천의 적합성에 기여하는 유전자의 트랜스포슨 삽입을 나타냅니다.
  3. 카나마이신으로 보충된 LB 한천 플레이트의 콜로니 수를 계산하여 냉동 결합에서 트랜스포슨 돌연변이의 수를 계산합니다.
    참고: A. baumannii 게놈(약 4Mbps)의 경우, 고해상도 돌연변이 라이브러리(약 1개의 트랜스포손 삽입/10 베이스 쌍)를 생성하기 위해 약 400,000개의 식민지를 획득하는 것이 목표였습니다. 그러나, 이 숫자는 표적 종의 게놈 크기에 기초하여 최적화되어야 한다).

4. 최종 세균 돌연변이 라이브러리의 세대

  1. 얼음 위에 얼어붙은 짝짓기의 알리쿼트를 해동합니다.
  2. 150mm 루리아-베르타니 식기 판의 플레이트 결합은 3.1단계에서 계산된 CFU를 기반으로 카나마이신으로 보충됩니다. 도금 전에 150 μL 당 13,333 개의 식민지를 산출하기 위해 LB로 부피를 조정합니다.
    참고: 여기서 CFU 카운트는 약105 CFU/mL로 결정되었기 때문에 플레이트당 13,333개의 콜로니를 획득하도록 조정되었기 때문에 플레이트를 과밀화하지 않고 고해상도 돌연변이 라이브러리를 위해 30플레이트에 최적의 콜로니 수를 제공할 수 있습니다.
  3. 멸균 유리 구슬을 사용하여 접시당 희석150 μL을 30 x 150mm 루리아-베르타니 식기 판에 30x 150mm루리아-베르타니 식기 판으로 분산하여 400,000개의식민지(그림 1C)를얻습니다.
    참고: 멸균 막대 또는 모든 종류의 멸균 스프레더 도구(즉, 유리 구슬)는 박테리아를 접시에 퍼뜨리는 데 사용될 수 있다.
  4. 초과 짝짓기가 포함된 중고 튜브를 폐기하십시오.
    참고: 동결/해동 주기는 박테리아 배양에 선택적 압력을 추가하여 Tn-seq 실험 결과를 왜곡할 수 있습니다. 매번 신선한 알리쿼트를 사용하십시오.
  5. 14 시간 동안 37 °C에서 플레이트를 배양합니다.
    참고: 인큐베이션 시간은 자라나는 것을 방지하기 위해 최적화되어 있습니다(식민지가 만지는). 인큐베이션 시간을 줄임으로써 성장을 최소화하는 것이 좋습니다.

5. 라이브러리 밀도 예측 및 스토리지풀

  1. 각 플레이트의 CfU를 계산하여 트랜스포슨 라이브러리의 총 돌연변이를 추정합니다. 플레이트의 전체 그룹에 대한 콜로니 카운트 추정을 결정하기 위해 최소 3 플레이트의 20%를 계산합니다(그림2A). 식민지가 다른 식민지를 건드리지 않도록 하십시오.
  2. 추정 된 식민지 수율을 계산 한 후, LB의 3-5 mL을 추가 (또는 필요한 경우 이상) 각 접시에 멸균 스크래핑 도구를 사용하여 박테리아를 긁어.
    참고: 멸균 접종 루프는 플레이트를 효율적으로 긁어내는 데 사용되었습니다.
  3. 모든 플레이트에서 50mL 원판 튜브(그림1D)로풀 세균 현탁액을 합니다. 이렇게 하려면 여러 50mL 원문 튜브가 필요하며, 적어도 3개이상이 필요합니다.
  4. 펠릿은 7 분 동안 5,000 x g에서 원심 분리를 사용하여 세균 현탁액을 풀었다.
  5. 상체를 버리고 30 % 글리세롤로 보충 된 LB5 mL에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
  6. Transposon 라이브러리의 Aliquot 1 mL은 극저온으로 저장하여 -80°C에 저장합니다.

6. A. 바우마니의 콜리신 저항을 조절하는 요인 식별

  1. 4 x 250 mL Erlenmeyer 플라스크를 각각 50 mL LB 국물 및 라벨로 준비(그림 2B)
    1. A. 바우마니 균주 ATCC 17978 Tn-seq 라이브러리; (-) colistin_1
    2. A. 바우마니 균주 ATCC 17978 Tn-seq 라이브러리; (-) colistin_2
    3. A. 바우마니 균주 ATCC 17978 Tn-seq 라이브러리; (+) colistin_1
    4. A. 바우마니 균주 ATCC 17978 Tn-seq 라이브러리; (+) colistin_2
      참고: 여기에 설명된 도전 성장에서 각 조건(-) colistin 제어 및 (+) colistin 챌린지가 중복으로 테스트되고 있습니다. 따라서 설정에는 4 x 250 mL Erlenmeyer 플라스크가 필요하며 조건당 2 개가 필요합니다.
  2. (+) 콜리스테인 플라스크(6.1.3 및 6.1.4)에 0.5 mg/L 콜리신의 50 μL과 50 μL 을 (-) 콜리스테인 플라스크(6.1.1 및 6.1.2)에 추가합니다.
  3. 얼음 에 5 단계에서 얼어 붙은 Tn-seq 라이브러리 알리쿼트해.
  4. 해동 된 라이브러리의 피펫 1 μL을 PBS의 1 mL로 넣습니다.
  5. 600nm(OD600)에서광학 밀도를 측정하고 1,000을 곱합니다.
    참고: Tn 라이브러리의 1 μL 중 OD600을 결정합니다.
  6. 6.5단계의 계산에 기초하여, 최종 OD600 0.001에 50mL LB를 포함하는 각 플라스크를 접종한다.
  7. 37°C에서 OD600 0.5로 흔들리는 인큐베이터에서 배양물을 성장시다.
    참고: 문화권은 로그자리트 성장 단계에 남아 있는 것이 중요하므로 기하급수적으로 증가하는 동안 변형이 다른 OD600에 있는 경우 OD600을 조정하여 문화가 로그리스믹 성장 단계에서 가능한 한 여러 번 복제되도록 조정해야 합니다. 문화가 3 번만 복제하는 경우, 돌연변이의 피트니스 결함을 감지하는 힘은 이론적으로 3 배 차이로 제한됩니다. 다른 박테리아는 서로 다른 두 배로 시간이 있기 때문에, 시작 접종을 정상화하기 위해 고정 OD600에서 배양을 종자하는 것이 중요하다. 이렇게 하면 모든 문화권에서 전체 라이브러리를 일관되게 표현할 수 있습니다.
  8. 원심분리기를 사용하여 4°C에서 5,000xg에서 7분 동안 수확배양.
  9. 상체를 제거하고 PBS의 50mL로 씻어.
  10. 4°C에서 5,000 x g에서 원심분리를 사용하여 7분 동안 펠릿.
  11. 상체를 제거하고 PBS의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 알리쿼트 ~ 200 μL을 5개의 미세원심분리기 튜브로 넣습니다.
  12. 4°C에서 5,000 x g에서 원심분리를 사용하여 5분 동안 펠릿. 파이펫 팁을 사용하여 모든 상체를 제거합니다.
  13. -20°C에 펠릿을 저장하거나 gDNA 추출을 진행합니다.

7. gDNA 추출

  1. 얼음 위에 한 개의 세포 펠릿을 해동하십시오.
  2. 0.6 mL 리시스버퍼(재료 표)와소용돌이를 추가하여 펠릿을 완전히 재연합니다.
  3. 1 h에 대한 37 °C에서 인큐베이션.
  4. 피놀/클로로폼/이소아밀 알코올을 0.6mL로 첨가하여 시료와 소용돌이에 적극적으로 넣습니다.
  5. 5 분 동안 방 온도에서 최대 속도로 미세 원심 분리기에서 원심 분리를 사용하여 별도의 단계.
  6. 상부 수성 단계를 새 튜브로 옮기습니다. 전송 하는 동안 위상 인터페이스를 방해 하지 마십시오.
  7. 위에서 얻은 수성 상에 동일한 부피의 클로로폼을 추가하고 적극적으로 소용돌이를 한다.
  8. 5 분 동안 방 온도에서 최대 속도로 미세 원심 분리기를 사용하여 별도의 단계.
  9. 상부 수성 단계를 새로운 튜브로 옮기.
    참고: 전송 하는 동안 인터페이스를 방해 하지 않도록 해야 합니다.
  10. 차가운 100 % 에탄올의 2.5 배 수성 상 부피를 넣고 부드럽게 섞습니다. 침전된 DNA가 보입니다.
  11. 튜브를 -80°C에서 1시간 이상 배치합니다.
  12. 펠릿 DNA는 최대 속도로 원심분리를 사용하여 4°C에서 30분 동안.
  13. DNA 펠릿을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 제거하고 파이펫팅하여 70 % 에탄올의 150 μL로 세척하십시오.
  14. 펠릿 DNA는 최대 속도에서 원심분리를 사용하여 4°C에서 2분 동안.
  15. 상체를 조심스럽게 제거합니다.
  16. 7.14 단계를 한 번 반복합니다. 나머지 에탄올을 모두 조심스럽게 제거합니다.
  17. 5-10 분 동안 방 온도에서 배양하여 DNA를 건조.
  18. 파이펫팅을 통해 100 μL TE 버퍼에서 DNA 펠릿을 다시 중단합니다.

8. DNA 전단(그림 3A)

  1. TE 버퍼로 gDNA를 총 200 μL의 농도로 희석합니다.
  2. 튜브를 수조 초음파 처리기에 놓습니다.
  3. 약 300개의 뉴클레오티드의 단편을 산출하기 위하여 DNA를 초음파 처리합니다. 전원 : 60 %, 총 시간 : 20 분, 사이클 : 10 s ON 과 10 s OFF 4 ° C(그림 3A).
  4. DNA가 1% 아가로즈 젤에 10 μL의 미광택 DNA 및 10 μL의 전염된 DNA를 분리하여 적절하게 전염된다는 것을 확인합니다. 초음파 처리를 반복하거나 필요에 따라 최적화하십시오(그림3B).

9. 3 엔드에 폴리-C 꼬리 추가(그림 3A)

  1. 표 1에 따라 폴리-C 반응을 설정합니다.
  2. 1 h에 대한 37 °C에서 반응을 배양.
  3. 아래 단계를 따라 크기 선택 파라자성 구슬(그림3A)의40 μL로 폴리-C 반응을 정화합니다.
    1. 각 샘플에 크기 선택 파라자성 구슬 40 μL을 추가합니다. 소용돌이 ~ 5 s 또는 파이펫 위아래로.
    2. 실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다.
    3. 간단히, 원심 분리관은 튜브의 바닥에 액체를 수집 (~ 2 s).
    4. 튜브를 자기 랙으로 옮기고 용액이 명확해질 때까지 ~ 2 분 동안 실온에서 배양하십시오.
    5. 마그네틱 랙에 튜브를 장착하면 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
    6. 마그네틱 랙에 튜브를 장착하면 새로 준비된 80% 에탄올 200 μL(구슬을 방해하지 않음)을 추가합니다.
    7. 용액이 명확해질 때까지 샘플을 30s 이상 배양합니다.
    8. 마그네틱 랙에 튜브를 장착하면 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
    9. 세척 단계 (단계 9.3.6 - 9.3.8)를 반복합니다.
    10. 간단한 원심분리 단계(~2s)를 사용하여 튜브 바닥에 액체를 수집합니다.
    11. 튜브를 마그네틱 랙으로 옮기고 남은 액체를 제거합니다.
    12. 실온에서 2-5분 동안 배양하여 시료를 건조시로 바립니다. 지나치게 건조하지 마십시오.
    13. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 각각 25 μL의 물을 추가합니다. ~ 5 s 또는 파이펫 위아래로 소용돌이.
    14. 간단히, 원심 분리관은 튜브의 바닥에 액체를 수집 (~ 2 s).
    15. 튜브를 자기 랙으로 옮기고 용액이 명확해질 때까지 ~ 2 분 동안 앉을 수 있습니다.
    16. 자기 랙에 튜브를 사용하면 구슬을 방해하지 않고 액체를 제거하고 새로운 튜브 (DNA의 23 μL)로 옮김하십시오.

10. 트랜스포슨 접합 증폭(그림 3A)

  1. 첫 번째 중첩 PCR(표 2)에대한 표 1에 설명 된 대로 설정 PCR 1.
  2. 표 1에 설명된 조건을 사용하여 PCR 1을 수행합니다.
  3. 크기 선택 파라자성 구슬40 μLPCR 제품을 정화합니다(9.3.1단계 – 9.3-12단계). 50 μL의 물(9.3.13 ~ 9.3.16)의 엘루트. 이 시점에서 샘플은 -20 °C에 저장될 수 있습니다.
  4. 스트렙타비딘 커플 파라자성 구슬 준비:
    1. 스트렙타비딘 구슬을 격렬하게 흔들어 재차 질한다.
    2. 샘플당 32μL의 비드를 신선한 미세센심분리기 튜브에 추가합니다.
      참고: 6 + 샘플에 대한 구슬은 하나의 튜브로 제조 할 수 있습니다.
    3. 튜브를 자기 랙으로 옮기습니다. 용액이 명확해질 때까지 ~ 2 분 동안 배양하십시오.
    4. 자기 랙에 튜브를 사용하면 상체를 제거하십시오.
    5. 자기 랙에서 튜브를 제거합니다. 1mL 1x B&W 버퍼에서 위아래로 파이프를 배싱하여 구슬을 세척합니다.
    6. 튜브를 자기 랙으로 옮기습니다. 용액이 명확해질 때까지 ~ 2 분 동안 배양하십시오.
    7. 자기 랙에 튜브를 사용하면 상체를 제거하십시오.
    8. 1mL 1x B&W 버퍼(10.4.5 ~ 10.4.7단계)로 반복 세척 단계는 총 3개의 세척을 위해 두 번 더 번 반복합니다.
    9. 자기 랙에서 튜브를 제거하고 샘플 당 2배 B&W 버퍼의 52 μL에서 구슬을 재축합니다.
  5. 준비된 구슬의 50 μL과 50 μL의 정제 된 PCR1 (10.3 단계에서)를 결합합니다. 파이펫을 섞어.
  6. 실온에서 30분 동안 회전합니다.
  7. 언바운드 DNA를 씻어내세요:
    1. 간단히, 원심 분리기는 튜브의 바닥에 액체를 수집 (~ 2 s).
    2. 튜브를 자기 랙으로 옮기습니다. 용액이 명확해질 때까지 ~ 2 분 동안 배양하십시오.
    3. 자기 랙에 튜브를 사용하면 상체를 제거하십시오.
    4. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고, 100 μL 1x B&W 버퍼로 재연하고 위아래로 파이프를 통해 구슬을 씻으십시오.
    5. 튜브를 자기 랙으로 옮기. 용액이 명확해질 때까지 ~ 2 분 동안 배양하십시오.
    6. 자기 랙에 튜브를 사용하면 상체를 제거하십시오.
    7. 100 μL LoTE (단계 10.7.4 - 10.7.6)로 반복 세척 단계는 총 3 개의 세척을 위해 두 번 더 번 번.
  8. 표 1에 설명된 대로 PCR 2를 설정하여 트랜스포슨 접합을 증폭하고 각 샘플(표2 및 표 3)에단일 바코드를 추가합니다.
  9. 표 1에설명된 조건을 사용하여 PCR 2를 수행합니다.
  10. 크기 선택 파라자성 구슬 40 μL로 정화 (단계 9.3.1 – 9.3.12). 17 μL의 물(단계 9.3.13 – 9.3.16)에서 엘루테는 15 μL을 수집합니다.
  11. 불소계를 사용하여 DNA 농도를 정량화합니다. 최종 농도는 ~ 50 ~ 250 ng /μl이어야합니다.
  12. 칩 기반 모세관 전기포진(도4A)을사용하여 DNA 품질을 평가합니다.

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Representative Results

설명된 방법은 플라스미드 pJNW684(도4B)를복제하는 대장균 MFD DAP를 이용한 세균융합을 통해- A. baumannii 균주 ATCC 17978에서 고밀도 트랜스포슨 라이브러리의 생성을 기술한다. 상세한 프로토콜은 대장균 λpir+ 기증자 균주에서 A. baumannii 받는 사람 균주로 pJNW684의 전송을 위한 이중 부모 세균 연상을 사용합니다. 이 방법은 조밀한 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하는 효율적이고 저렴한 방법입니다. 박테리아는 최적화된 비율로 혼합되었고 짝짓기는 루리아-베르타니 식기 플레이트에서 1h(그림1A)에발견되었다. 짝짓기 동안, 트랜스포슨은 기증자로부터 받는 사람 균주로 옮겨졌으며, 여기서 gDNA(도1B)에삽입되었다. 결합을 수집하였고, 약 105CFU/mL을 계산하여 카나마이신으로 보충한 150mm x 15mm 의 한천 판에5 도금되었다.. 37°C에서 14h의 성장 후, 플레이트에는 다양한 크기의 수천 개의식민지(도 1C)가포함되어 있어 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리의 성공적인 생성을 나타낸다. 트랜스포슨 삽입 돌연변이체(도1D)를풀링하고 알리쿼트에서 동결되어 반복되는 동결 해동 주기를 방지하여 삽입 라이브러리에 선택적 압력을 가할 수 있었다.

풀이 있는 A. 바우마니 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리는 항균의 억제 농도 하에서 colistin 저항에 중요한 피트니스 요소를 식별하는 데 사용되었다(도2B). 돌연변이 라이브러리는 콜리신 저항에 기여하는 유전자의 삽입을 코딩하는 돌연변이 세포를 고갈시키기 위해 중복으로 0.5 mg/L colistin의 부재/존재에서 로그산성 단계로 성장하였다. 나머지 라이브러리 풀의 총 gDNA는 제어 및 실험 배양으로부터 분리되고 시퀀싱을 위한 DNA를 준비하기 위해 처리되었다(그림3A).

분리된 gDNA는 기계적 전단을 사용하여 단편화되었고, 폴리-C 꼬리는 DNA단편(도 3A)에첨가되었다. 폴리-C 테일의 첨가에 따라, DNA는 폴리C 특이프라이머를 이용하여 정제되었고, 제2차 PCR은 일루미나 플로우나 플로우셀 및 클러스터 생성을 결합하는 데 필요한 P7 시퀀싱 부위를 도입하고,,47층의 라이브러리를 해독하는 데 사용되는 6개의37베이스 바코드가 있다. DNA 농도를 계산하고 샘플은 칩 기반 모세관 전기포아를 사용하여 분석하여 고처리량 시퀀싱을 위한 성공적인 라이브러리빌드(그림 4A)를확인하였다.

DNA 라이브러리는 차세대 시퀀싱에 의해 시퀀싱되었다. 단엔드, 50사이클 실행이 수행되어 3천만 개의 고품질 판독/샘플을 산출하여 트랜스포슨 라이브러리의 62.5배 커버리지를 제공했습니다. 트랜스포슨 접합부(reads)는 시판되는 생물정보학 분석 소프트웨어를 사용하여 기준게놈(48)에매핑되었다. 입력 샘플내각 삽입 부위의 판독 횟수(-(-) colistin 제어 조건은 출력 샘플의 판독 수, (+) 콜리신 실험 상태 및 각 삽입 부위에 대한 피트니스 스코어를 계산하였다. 피트 니스 점수 다음 유전자에 의해 그룹화 되었다. 입력 샘플에 비해 콜리신의 존재에서 라이브러리가 성장했을 때 감소 된 점수를 보여주는 유전자는 colistin의 억제 농도에서 A. baumannii 생존을위한 피트니스 결정요인으로 간주되었다. 예를 들어, PmrAB 2성분 시스템 내의 트랜스포슨 삽입은 입력 샘플에 존재했지만 출력 샘플에서 발견되지 않았다. PmrAB는 지질 A에 인포에탄올라민을 전달하여 세포표면(12,,31)의전하를 중화시키는 pmrC의발현을 직접 조절한다. 세균 표면 전하의 중화는 colistin 매개 살인에 필요한 정전기 전위를 감소시키는 것으로 생각된다. 저항 표현형에 기여하는 것으로 알려진 고갈된 유전자의 식별은 방법을 검증하였다.

Figure 1
그림 1: 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리 구성의 회로도. (A)세균성 연상. 전치 기계를 인코딩하는 "기증자"변형은 "받는 사람"변형과 혼합되었습니다. 혼합물은 LB 천 판에서 발견되었고 1 h.(B)트랜스포슨 라이브러리의 생성을 위해 짝짓기를 허용하였다. 전치 기계를 운반하는 플라스미드는 "기증자"변형에서 "받는 사람"균주로 옮겨졌고 트랜스포슨은 "받는 사람"균주의 게놈 전체에 무작위로 삽입되었다. (C)선택. 결과 세포는 트랜스포슨 삽입 돌연변이를 선택하기 위해 카나마이신으로 보충된 한천 판에 도금되었다. (D)풀 라이브러리. 식민지는 접시에서 긁어, LB에 다시 중단하고 풀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 대표적인 세균 발생 결과 및 colistin Tn-seq 실험의 회로도. (A)대표 카나마이신 선택 플레이트. 플레이트는 다섯 개의 동일한 섹션으로 나뉩니다. 파란색 점은 A. 바우마니 트랜스포슨 삽입 돌연변이의 추정을 위해 콜로니 카운트를 나타냅니다. 최종 추정을 계산하기 위해 적어도 세 개의 별도의 플레이트가 계산되었다. (B)억제 형 colistin 농도에서 피트니스 요인의 식별. 풀이 된 트랜스포슨 라이브러리는 코리스트신의 부재(control) 또는 존재(실험)에서 로그산스성장 단계로 성장하였다. 배양이 적절한 광학 밀도에 도달하면, 세포는 펠릿화되었고 gDNA는 각 샘플에서 추출되었다. 각 조건은 총 4개의 견본을 위해 복제로 시험되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: DNA 앰플리코 라이브러리의 플로크차트는 거대한 병렬 시퀀싱 및 대표적인 시어드 gDNA를 기반으로 합니다. (A)Tn-seq DNA 라이브러리는 회로도를 구축합니다. 추출 후 gDNA는 기계적 전단을 통해 단편화되었습니다. 말단 탈옥뉴클레오디딜 트랜스아제는 트랜스포슨-게놈 접합 및 바코드 첨가의 PCR 증폭 전에 단편화된 DNA의 3'끝에 폴리-C 꼬리를 추가하는 데 사용되었다. (B)gDNA 전단 단계에 따라 미세및 시어드 A. 바우만니 돌연변이 라이브러리의 1% 아가로즈 젤. 1 Kb 사다리는 DNA 마커로 사용되었다. 시어드 gDNA 얼룩은 주로 ~ 100 및 500 베이스 쌍 사이의 범위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 대표적인 품질 관리(QC) 결과 및 전치 유전자를 운반하는 플라스미드의 지도. (A)DNA 라이브러리 빌드에 대한 QC 추적. ~ 350개의 기본 쌍에서 피크가 있어 성공적인 라이브러리 빌드를 나타냅니다. QC 결과에서 더 큰 DNA가 검출되면 샘플은 더 이상 세척하여 큰 DNA 단편을 제거할 수 있습니다. (B)플라스미드 pJNW684는 돌연변이 선택을 위한 카나마이신 저항 카세트(보라색)가 있는 히마르1 마리너 트랜스포손(녹색)으로 구성되어 있으며, A. baumannii 17978 특정 프로모터(blue), 암피실린 저항 유전자(bla, orange)bla및 RP4/oriT/oriR6K-조건부 복제의 조건부 기원을 제어하던 중 활동적인 마리너 히마르1 C9 트랜스포사아제(red)를 코딩하는 유전자(yellow). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

반응 설치 조건
폴리-C 반응 전간 gDNA의 30 μL
9.5m dCTP/0.5mM ddCTP의 2.5 μL
5X 말기 탈옥뉴클레오디딜 트랜스퍼라제(Tdt) 반응 완충제의 10μL
1.25 μL 의 rTdt
6.25 μL에서 50 μL까지		 37ºC에서 1시간 동안 인큐베이션
PCR 1 23 μL 3'-폴리-C 정제 DNA(이전 단계의 전체 샘플)
10 μL 10x 고충실도 DNA 폴리머라제 반응 혼합
2 μL 10 mM dNTPs
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 510 비오틴
3 μL 30 μM olj 376
0.5 μL 고충실도 DNA 폴리머라제
8.5 μL 순수 수- 50 μL 합계		 1 주기: 2 분 94 ºC
15 사이클: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2분 68ºC
1 사이클: 4분 68 ºC
보류: ∞ 4 ºC
PCR 2 이전 단계에서 DNA 바인딩 구슬
10 μL 10x 고충실도 DNA 폴리머라제 반응 혼합
2 μL 10mMM dNTP
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 511
1 μL 30 μM 바코드 프라이머 (표 2)
0.5 μL 고충실도 DNA 폴리머라제
33.5 μL 순수 수- 50 μL		 1 주기: 2 분 94 ºC
15 사이클: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2분 68ºC
1 사이클: 4분 68 ºC
보류: ∞ 4 ºC

표 1: 반응 설정. 폴리-C, PCR 1 및 PCR 2 반응에 대한 설정 및 조건.

목적 이름 시퀀스
트랜포슨에 대한 음의 올j510-비오틴 비오틴-개트CCTTTTTGTTTCTACCTACCTGCAGGCGCG
폴리-C 꼬리에 대한 음막 olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGGTGTTCCTCCGATCTGGGG
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
트랜스포슨 + P5 어댑터에 중첩:
P5 캡처 사이트 – P5 시퀀싱 사이트 – N5 –Tn		 올j511 아가타그그지아크아크가타크택틱CTTT
CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGGACTTA
TCATCCAACCTGTTAGTAGTAGTAGTAG
olj376에 중첩: P7 시퀀싱 사이트
– 바코드 XXXXXX – P7 캡처 사이트)		 기원전 ## CAAGGAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG가타카가타카로타크트리플엑스XXXGTGA
CTGGAGTTCAGACGTGTG
특정 바코드의 표 2***

표 2: PCR 증폭 프라이머. 트랜스포슨 접합을 증폭하기 위해 프로토콜에 사용되는 PCR 증폭 프라이머. 각 의 목적은 첫 번째 열에 나열됩니다.

뇌관 읽기 바코드 시퀀스
BC1 ATCACG CGTGAT 카아가아가아가카타카타카가타카가타카가트CGT
개트그랙트가그가가가가CGGTGG
BC2 CGATGT ACATCG 카아가아가아가카타카가타카가타크
ATCGGTGACTGGAGTTCAGACGGTG
BC3 TTAGGC GCCTAA 카아가아가아가카타카가타카가타카가트가
타그게트가그가그GTG
BC4 TGACCA TGGTCA 카아가아가아가카타카가트
GGTCAGTGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC5 아카그그 선크GT 카아가아가아카타카타카가트
CACTGTGGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC6 GCCAAT ATTGGC 카아가아가아가카타카가타타
TTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGGTGG
BC7 CAGATC 개트CTG 카아가아가아카타카타카가트
가트트그게트가그가그가그GTG
BC8 액트가 TCAAGT 카아가아가아카타카타카가트
TCAAGTGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC9 가트카그 CTGATC 카아가아가아가카타카가가
TCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGGTGG
BC10 태그크트 AAGCTA 카아가아가아카타카타카가트
AAGCTAGGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC11 GGCTAC GTAGCC 카아가아가아카타카타카가트
그태그그GTGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC12 CTTGTA 타카그 카아가아가아가카타카가트
아카가그택트가그가가가그GTG
BC13 아그카아 TTGACT 카아가아가아카타카타카가트
TTGACTGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC14 AGTTCC GGAACT 카아가아가와카타카가타카가트가
개트GTGACTGGAGTTCAGACGGTG
BC15 ATGTCA TGACAT 카아가아가아가카타카가가
TTGACATGTGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTGG
BC16 CCGTCC GGACGG 카아가아가아카타카타카가트
GGACGGGGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC17 GTAGAG CTCTAC 카아가아가아카타카타카가트
CTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGGTG
BC18 GTCCGC GCGGAC 카아가아가아카타카타카가트
GCGGACGTGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTGG
BC19 GTGAAA TTTCAC 카아가아가아카타카타카가트
TTTCACGTGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC20 GTGGCC GGCCAC 카아가아가와카타카가타카가트가
GCCACGTGACTGGAGTTCAGACGGTGG
BC21 GTTTCG CGAAAC 카아가아가아카타카타카가트
CGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGGTG
BC22 CGTACG CGTACG 카아가아가아카타카타카가트
CGTACGGGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC23 개그 CCACTC 카아가아가아가카타카타카가타카가타카가트C
CACTCGGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC24 GGTAGC GCTACC 카아가아가아카타카타카가트
GCTACCGTGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC25 ACTGAT ATCAGT 카아가아가아카타카타카가트
ATCAGTGGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC26 ATGAGC GCTCAT 카아가아가아카타카타카가트
GCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGGTG
BC27 ATTCCT 아가트 (주) 카아가아가아가카타카가타타
GGAATGTGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTGG
BC28 CAAAAG CTTTTG 카아가아가아가카타카타카가타카가타카가트C
TTTTGGGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTGG
BC29 카액타 태그그 카아가아가아카타카타카가트
태그그택택트가그가그
BC30 CACCGG CCGGTG 카아가아가아카타카타카가트
CCGGGGACTGGAGTTCAGACGGTG
BC39 CTATAC GTATAG 카아가아가아카타카타카가트
GTATAGGTGACTGGAGTTCAGACGGTGG
BC40 CTCAGA TCTGAG 카아가아가아카타카타카가트
TCTGAGGTGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTG
BC42 타트CG CGATTA 카아가아가아가카타카타카가타카가타카가트C
개타그랙트가그가가가가그GTGG
BC43 타카GC GCTGTA 카아가아가아카타카타카가트
GCTGTAGGACTGGAGTTCAGACGGTGG
BC44 타타타트 아타타 주 카아가아가아카타카타카가트
ATTATAGTGACTGGAGGGAGTTCAGACGGTGG
BC45 TCATTC 가ATGA 카아가아가아카타카타카가트
가트가그택트가그게트카가CG
BC46 TCCCGA TCGGGA 카아가아가아카타카타카가트
TCGGGAGTGACTGGAGTTCAGACGGTG
BC47 TCGAAG CTTCGA 카아가아가아가카타카타카가타카가타카가트C
TTCGAGTGACTGGAGTTCAGACGGTGG
BC48 TCGGCA TGCCGA 카아가아가아카타카타카가트
TGCCGAGTGACTGGAGTTCAGACGGTG

표 3: 바코드 프라이머. 바코드 프라이머는 두 번째 PCR 단계에서 P7 시퀀싱 사이트와 바코드를 앰플리시온에 추가하는 동안 트랜스포슨 접합을 증폭시키는 데 사용됩니다. 라이브러리를 생성하기 위해 모든 바코드 프라이머가 필요한 것은 아닙니다. 샘플 수에 대한 바코드 프라이머만 필요합니다.

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Discussion

A. baumannii는 colistin,,,10,11,12, 23,,24,2330, 31과같은 "최후의 라인"치료에 대한 AMR의 급속한 인수로 인해 글로벌 공중 보건에 새로운 위협이되고30있습니다., 최근 수십 년 동안 Tn-seq는 수많은 세균 종에 걸쳐 유전자형 표현형 상호 작용을 해명하고 세균 유전학34,,35,,42,,43에대한 우리의 이해를 확장하는 데 중요한 역할을해 왔습니다. Tn-seq 프로토콜은 캄필로박터 제주니, 황색포도상구균, 치주병원균 포르피로모나스 치글리발리스,심지어 균균결핵37,,49,,50,,51등다양한 세균성 종에서 필수 유전자를 식별하는 데 중요한 역할을해왔다. 필수 유전자의 식별 을 넘어, Tn-seq는 슈도모나스 aeruginosa에서항생 저항 유전자를 식별하는 데 사용되었습니다, 살모넬라 타이피무리움에서 여러 조건부 필수 유전자, 및 연쇄상 구균 폐렴에수많은 유전자형 - 표현형 관계52,,53,,54. 최근에는 비브리오 콜레라의 트랜스포슨 염기서열분석이 콜레라의 유아 토끼 모델에서 감염 시 생체 내 체력에 중요한 유전자를 식별하기 위해사용되었다(47). 이러한 연구는 체외와 생체 내 연구 모두에 사용할 수 있기 때문에 Tn-seq의 다재다능함을 보여줍니다.

마이크로어레이 기술, 2D 겔 전기포고및 qPCR과 같은 다른 방법에 비해 Tn-seq의 주요 장점은 게놈 또는 게놈정보(55)에대한 사전 지식이 필요하지 않다는 것이다. 따라서, 대규모 병렬 시퀀싱과 결합된 트랜스포슨 돌연변이 발생은 알려진 유전자와 게놈의 연구뿐만 아니라 새로운 유전 적 상호 작용의 발견을 가능하게한다. 여기에서 우리는 Colistin의 억제 농도에 노출될 때 세균성 적합성에 필수적인 요인을 확인하기 위하여 A. baumannii에 있는 고밀도 트랜스포손 돌연변이 라이브러리를 생성하는 포괄적인 방법을 제시했습니다. 설명된 방법은 또한 대장균(미공개 데이터)에서 성공적으로 사용되었으며, Enterobacteriaceae를 포함한 다른 그램 음성 병원체에서 Tn-seq 분석을 수행할 수 있음을 입증하는 시스템이 가능하다는 것을 입증한다.

삽입 돌연변이 발생을 위해 마리너 트랜스포슨을 사용하는 데는 몇 가지 장점이 있습니다. 트랜스포손 가족은 진핵 호스트에서 유래했으며 다양한 세균 성 인구에서 돌연변이 라이브러리를 포화시키는 데 널리 사용되었습니다. 마리너 트랜스포슨은 호스트 독립적이며, 이는 특정 숙주요인(40,,41)이없는 상태에서 안정적인 무작위 삽입을 달성할 수 있음을 의미한다. 또한, 마리너 트랜스포슨은 삽입 편향을 줄이고 보다 견고한 통계 분석37,,56,,57,58로이어지는 티민 아데닌("TA") 모티프에 우선 삽입하기 때문에 삽입 이벤트의 정의된 수를 가지게 된다.,

몇몇 마리너기반 Tn-seq 방법은 gDNA 단편화32,,42,,43에대한 MmeI 제한 소화를 사용합니다. 효소 DNA 단편화는 인기 있고 성공적인 방법이지만 절차에 불필요한 단계를 추가하고 잠재적편향(37)을증가시킵니다. 이러한 기술은 다량의 시동 재를 필요로 할 뿐만 아니라, 다운스트림 분석37,,59에서삽입 서열의 불평등한 표현으로 이어질 수도 있다. MmeI 뉴클레아제 활성52,,60,,61에의존하지 않는 다른 방법과 마찬가지로, 본원에 설명된 방법은 gDNA 단편에 기계적 전단에 의존하고, TdT는 DNA 단편의 3'끝에 폴리-C 꼬리를 추가한다. 효소 DNA 단편화 및 어댑터 결찰 방법에 비해, 이 접근법은 보다 일관된 결과를 제공하면서 훨씬 적은 양의 시작 DNA를 필요로 하며, 또한 DNA 교차 오염의 위험을 낮추고 밀폐된튜브(37,,59,,62)에감금되어 시료 손실을 감소시킨다. 더욱이, 이 방법은 50개의 뉴클레오티드의 더 길고 고품질 시퀀싱 판독을 산출하여 서열의 보다 효과적이고 정밀한 매핑과 보다 견고한 다운스트림 분석37,,59를지원합니다. 합성 폴리-C 테일의 첨가는 이 방법이 3'엔드에 16dG 뉴클레오티드를 포함하는 역프라이머에 대한 인식 부위로서 외인성 첨가 폴리-C 꼬리에 의존하기 때문에 단편화로 인한 잠재적 오버행을 무시하고,,59일,59일,일루미나시퀀싱에 특이적인47서열이 있다. 합성 뉴클레오티드 테일의 사용은 본 방법의 적용을 네이티브함량(59)과무관하게 많은 뚜렷한 게놈으로 확장한다. 이어서, 트랜스포슨-게놈 접합은 폴리-C 특이적프라이머(37)를이용하여 증폭된다. 이 대안은 고가의 제한 효소, 어댑터 결찰, 어댑터 디머 형성 및 젤 정화 단계에 대한 필요성을 제거하여 절차를 단순화합니다. 아신토박터 바우만니를 포함한 여러 그램 음성 ESKAPE 병원체에서 고포화 트랜스포손 삽입 라이브러리를 효율적으로 생성하도록 프로토콜을 더욱 최적화했으며, 다양한 체외 및 생체 내조건(10)에서유전적 상호작용을 연구하는 데 사용할 수 있다.

Tn 돌연변이 발생의 한 가지 제한은 선택을 위한 항생 저항 마커에 의존합니다. 그러나, 많은 그램 음성 ESKAPE 병원체는 다약물 또는 광범위하게 약물 내성, 사용자가 관심의 특정 병원체에 따라 저항 카세트를 교환해야 할 수도 있음을 의미. 더욱이, 일부 임상 분리는 마리너 기반 트랜스포슨을 사용하여 트랜스포손 돌연변이 발생에 만만치 않다.

프로토콜의 중요한 단계는 Tn 돌연변이의 수를 플레이트로 계산하는 것입니다. 너무 많은 식민지를 도금하면 다운스트림 분석을 복잡하게 만들 수있는 잔디가 생길 수 있습니다. 식민지가 너무 가깝거나 만지는 경우 라이브러리에 원치 않는 선택적 압력을 추가하여 아티팩트를 초래할 수 있습니다. 이상적으로, 식민지는 건드리지 않고 판 전체에 고르게 간격을 두지 않을것입니다(그림 2A). 반대로, 너무 적은 식민지가 도금되는 경우에, 각 유전자에 있는 다중 Tn 삽입을 격리하는 것은 어려울 것입니다.

2.18 단계에 나열된 컨트롤을 수행하는 것도 중요합니다. 3의 참고 에 명시된 바와 같이. 2, 어느 "기증자" 또는 "받는 사람" 긴장 Ampicillin보충 접시에 성장 하지 않아야. 외인성 DAP는 "기증자" 긴장의 성장을 위해 요구되기 때문에, 어떤 성장든지 "수령인" 균주가 pJNW684를 복제한다는 것을 나타낼 것입니다. 이는 트랜스포슨이 gDNA에 통합되지 않으면 시퀀싱 읽기가 통합 사이트가 아닌 플라스미드에만 매핑되기 때문에 중요한 문제입니다. 이 경우 실험은 사용 가능한 데이터를 생성하지 않을 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 국립 보건 원 (그랜트 AI146829에서 J.M.B.에 대한 자금 지원)에 의해 지원되었으며 감사하게 인정받고 있습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

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생물학 문제 161 트랜스포슨 고처리량 시퀀싱 그람 네거티브 아시네토박터 바우마니,콜리신 ESKAPE
고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성
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Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll,… More

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

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