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Biology

Generazione di librerie di inserimento transposon in batteri Gram-Negativi per il sequenziamento ad alta velocità effettiva

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

Descriviamo un metodo per generare librerie mutanti trasposoni saturanti nei batteri Gram-negativi e la successiva preparazione di librerie di amplicone di DNA per il sequenziamento ad alto rendimento. Ad esempio, ci concentriamo sull'agente patogeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ma questo protocollo è summostico per una vasta gamma di organismi Gram-negativi.

Abstract

Il sequenziamento transposon (Tn-seq) è un metodo potente che combina la mutagenesi trasposone e il sequenziamento parallelo massiccio per identificare geni e percorsi che contribuiscono alla forma fisica batterica in una vasta gamma di condizioni ambientali. Le applicazioni Tn-seq sono estese e hanno anche permesso l'esame delle relazioni genotipo-fenotipo a livello di organismo, ma anche a livello di popolazione, comunità e sistemi. I batteri Gram-negativi sono altamente associati ai fenotipi di resistenza agli antimicrobici, che ha aumentato gli incidenti di insufficienza di trattamento antibiotico. La resistenza agli antimicrobici è definita come crescita batterica in presenza di antibiotici altrimenti letali. La colistina antimicrobica "ultima linea" viene utilizzata per trattare le infezioni batteriche Gram-negative. Tuttavia, diversi patogeni Gram-negativi, tra cui Acinetobacter baumannii possono sviluppare resistenza alla colistina attraverso una serie di meccanismi molecolari, alcuni dei quali sono stati caratterizzati utilizzando Tn-seq. Inoltre, le vie di trasduzione del segnale che regolano la resistenza alla colistina variano all'interno dei batteri Gram-negativi. Qui proponiamo un metodo efficiente di mutagenesi trasposone in A. baumannii che semplifica la generazione di una libreria di inserimento trasposone e la costruzione di librerie amplicon saturando eliminando la necessità di enzimi di restrizione, ligazione dell'adattatore e purificazione del gel. I metodi qui descritti consentiranno un'analisi approfondita dei determinanti molecolari che contribuiscono alla forma fisica di A. baumannii quando sono stati sfidati con la colistina. Il protocollo è applicabile anche ad altri patogeni ESKAPE Gram-negativi, che sono principalmente associati a infezioni ospedaliere farmacoresistenti.

Introduction

La scoperta di antibiotici è senza dubbio uno degli eventi più impattanti legati alla salute delXX secolo. Non solo gli antibiotici risolvono rapidamente le infezioni batteriche gravi, ma svolgono anche un ruolo fondamentale nella medicina moderna. Grandi interventi chirurgici, trapianti e progressi nella medicina neonatale e nella chemioterapia lasciano i pazienti suscettibili a infezioni potenzialmente letali e queste terapie non sarebbero possibili senza antibiotici1,2. Tuttavia, il rapido sviluppo e la diffusione della resistenza agli antibiotici tra i patogeni umani ha ridotto significativamente l'efficacia di tutte le classi clinicamente importanti di antibiotici3. Molte infezioni batteriche che una volta erano facilmente cancellate con il trattamento antibiotico, non rispondono più ai protocolli di trattamento classici, causando una grave minaccia per la salute pubblicaglobale 1. La resistenza agli antimicrobici (AMR) è il luogo in cui le cellule batteriche crescono in concentrazioni altrimenti letali di antibiotici, indipendentemente dalla duratadel trattamento 4,5. È urgente comprendere i fattori molecolari e biochimici che regolano la resistenza antimicrobica, che aiuteranno a guidare lo sviluppo antimicrobico alternativo. In particolare, gli agenti patogeni ESKAPE sono problematici in ambienti clinici e associati a un'estesa AMR. Questi includono Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp. Mentre diversi meccanismi contribuiscono alla AMR negli agenti patogeni ESKAPE, questi ultimi quattro organismi sono Gram-negativi.

I batteri Gram-negativi assemblano una membrana esterna che li protegge da condizioni ambientali avverse. La membrana esterna serve come barriera permeabile per limitare l'ingresso di molecole tossiche, come gli antibiotici, nella cellula. A differenza di altre membrane biologiche, la membrana esterna è asimmetrica. Il foglietto illustrativo esterno è arricchito con lipopolysaccharide esposto in superficie, mentre il volantino interno è una miscela di fosfopididi6. Le molecole di lipopolysaccharide sono ancorate alla membrana esterna da un lipidico conservato A moiety incorporato all'interno del bistratolipidico 7. Il lipide canonico Un dominio di Escherichia coli lipopolysaccharide è necessario per la crescita della maggior parte dei batteri Gram-negativi ed è sintetizzato da un percorso ezimatico in nove passaggi che è uno dei percorsi più fondamentali e conservati negli organismi Gram-negativi6,7,8.

Le polimixine sono peptidi antimicrobici cationici che prendono di mira il lipidico Un dominio di lipopolysaccharide per perturbare la membrana esterna e lyse la cellula. L'interazione elettrostatica tra residui caricati positivamente di polimixine e i gruppi di lipidi A caricati negativamente interrompe la membrana cellulare batterica portando infine alla mortecellulare 9,10,11,12,13. La colistina (polimixine E) è un antimicrobico di ultima istanza utilizzato per trattare le infezioni causate da patogeni nosocomiali Gram-negativi multifarmaci, come Acinetobacter baumannii14,15,16. Scoperte per la prima volta nel 1947, le polimixine sono prodotte dai batteri del suolo, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Polimixine sono stati prescritti per trattare le infezioni Gram-negative per anni prima che il loro uso clinico è stato limitato a causa di segnalazioni di nefrro- e neurotossicitàsignificativa 20,21.

A. baumannii è un patogeno nosocomiale Gram-negativo che ha aumentato drasticamente la morbilità e la mortalità degli esiti dei pazienti negli ultimidecenni 22. Quello che una volta era considerato un agente patogeno a bassa minaccia, ora rappresenta un rischio significativo per l'infezione ospedaliera in tutto il mondo a causa della sua incredibile capacità di acquisire la RSI edell'alto rischio di epidemia 23,24. A. baumannii rappresenta più del 10% delle infezioni nosocomiali negli Stati Uniti. La malattia si manifesta come polmonite, batteriemia, infezioni delle vie urinarie, infezioni della pelle e dei tessuti molli, meningite ed endocardite25. Le opzioni di trattamento per le infezioni da A. baumannii sono diminuite a causa della resistenza contro quasi tutte le classi antibiotiche, tra cui β-lactams, fluoroquinolones, tetracycline e aminoglicosides23,24. La prevalenza di isolati A. baumannii, resistenti alla droga e antifarmacorta, ha portato a una rinascita del trattamento della colistina, che si è ritenuto essere una delle poche opzioni terapeutiche rimaste ancora efficaci contro la resistenza multifarmaco A. baumannii. Tuttavia, una maggiore resistenza alla colistina tra gli isolati di A. baumannii ha ulteriormente amplificato la sua minaccia per la salute pubblica globale10,11,12,13,27,30,31.

I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, come il sequenziamento dei traspositori (Tn-seq), hanno fornito importanti strumenti per far progredire la nostra comprensione della forma fisica batterica in vitro e in vivo. Tn-seq è un potente strumento che può essere sfruttato per studiare le interazioni genotipo-fenotipo nei batteri. Tn-seq è ampiamente applicabile tra i patogeni batterici, dove combina la mutagenesi tradizionale trasposone con il sequenziamento parallelo massiccio per mappare rapidamente i siti di inserimento, che possono essere utilizzati per collegare le mutazioni del DNA alle varianti fenotipico su una scalagenomica 32,33,34,35. Mentre i metodi di mutagenesi trasposone sono stati descritti in precedenza, i passaggi generali sono simili33. In primo luogo, viene generata una libreria di inserimento utilizzando la mutagenesi trasposone, in cui ogni cellula batterica all'interno di una popolazione è limitata a un singolo inserimento di trasposone all'interno del DNA genomico (gDNA). Dopo la mutagenesi, i singoli mutanti sono in comune. gDNA viene estratto dal pool mutante di inserimento e le giunzioni trasposone vengono amplificate e sottoposte a sequenziamento ad alta velocità effettiva. Le letture rappresentano siti di inserimento, che possono essere mappati al genoma. Gli inserimenti di transposon che riducono la forma fisica cadono rapidamente dalla popolazione, mentre gli inserimenti benefici sono arricchiti. Tn-seq è stato strumentale per far progredire la nostra comprensione di come i geni influiscono sulla forma fisica batterica nello stress33.

Il sistema di transposon di mariner Himar1 codificato in pJNW684 è stato specificamente costruito e ottimizzato ai fini della mutagenesi trasposone. Esso comprende marinerun transposon marinaio-famiglia che affianca il gene della resistenza kanamycin, che viene utilizzato per la selezione di mutanti di inserimento transposon in A. baumannii. Codifica anche un promotore specifico di A. baumannii che guida l'espressione del gene di codifica trasposizione36. Il transposon a base di marinaiocontiene anche due terminatori trasmizionali a valle del gene di resistenza kanamycin, che impedisce la lettura a valle dell'inserimento37. pJNW684 porta anche un'origine RP4/oriT/oriR6K-condizionale della replica che richiede che il gene λpir contribuito dal ceppo donatore si replica38. In assenza del gene λpir, il vettore pJNW684 che trasporta il macchinario di trasposizione non sarà in grado di replicare nel ceppo del destinatario A. baumannii 10,36,38. Pertanto, durante la coniugazione batterica, solo il trasposone viene inserito nel genoma ricevente senza inserimento in background del plasmide, che trasporta il gene trasposizione. Questo è significativo perché la perdita di attività di trasposizione insieme al plasmide si traduce in un singolo evento di trasposizione stabile che impedisce al trasposone di spostarsi in luoghi diversi una volta che si inserisce nel genoma del destinatario.

pJNW648 è stato anche testato per l'attività in un altro organismo Gram-negativo, E. coli. Il successo dell'assemblaggio di una libreria Tn-seq saturante nel ceppo E. coli W3110 ha indicato che il sistema è suscettibile di eseguire la mutagenesi in un'ampia gamma di agenti patogeni, tra cui Enterobacteriaceae. Inoltre, il promotore specifico di A. baumannii che guida l'espressione trasposizione può essere rapidamente scambiato con un promotore specifico della specie. Infine, il gene di resistenza al kanamycin può essere scambiato con altre cassette di resistenza, a seconda del fenotipo AMR dell'organismo in fase di studio.

Un fattore che contribuisce alla resistenza alla colistina in A. baumannii è la somministrazione di dosi insufficienti, dove i batteri sono esposti a pressioni selettive a livelli nonletali 39. Diversi rapporti hanno mostrato che le concentrazioni di antimicrobici subinibito possono indurre risposte regolamentate che alterano la fisiologia cellulare per ridurre la suscettibilità dell'intera popolazionebatterica 11,12,30,31. Utilizzando Tn-seq, abbiamo scoperto fattori che regolano la resistenza alla colistina nel ceppo A. baumannii ATCC 17978 dopo l'esposizione a concentrazioni inibitorie10 e subinibitory di colistina. In questo esempio viene illustrato come utilizzare un metodo Tn-seq che semplifica la costruzione e l'arricchimento di una libreria mutante trasposone satura utilizzando lafamiglia di trasposoni40,41. Mentre diversi protocolli Tn-seq generano 20.000 - 100.000 mutanti35,42,43,44,45,46, il protocollo descritto qui può generare rapidamente una libreria transposon di 400.000 mutanti, che equivale approssimativamente a un transposon ogni inserimento di coppie di 10 basi in A. baumanni10., Inoltre, le dimensioni della libreria possono essere scalate senza uno sforzo aggiuntivo significativo. Questo metodo elimina anche la necessità di endonucleasi di restrizione, legatura dell'adattatore e purificazione del gel, che può ridurre la diversità finale della libreria.

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Protocol

1. Preparazione del ceppo batterico

  1. Streak il ceppo"donatore" ( E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabella dei Materiali) per colonie isolate sull'agar Luria-Bertani integrato con acido diaminopimelico 600 M (DAP), 100 mg/L di ampicillina e 25 mg/L di kanamycin. Incubate durante la notte a 37 gradi centigradi. Utilizzando una singola colonia isolata, inoculare 50 mL di brodo di Luria (LB) integrato con 600 DAP, 100 mg/L di ampicillina e 25 mg/L di kanamycin in una fiaschetta Erlenmeyer da 250 mL ed etichettarlo come "donatore".
  2. Streak il ceppo "destinatario" (A. baumannii ceppo ATCC 17978, Tabella dei Materiali) per colonie isolate su Luria-Bertani agar. Incubate durante la notte a 37 gradi centigradi. Utilizzando una singola colonia isolata, inoculare 50 mL di LB in una fiaschetta Erlenmeyer da 250 mL ed etichettarla come "destinatario".
  3. Incubare entrambe le colture ("donatore" e "destinatario") durante la notte a 37 gradi centigradi con agitazione.

2. Accoppiamento batterico

  1. Trasferire le colture notturne a tubi conici da 50 mL.
  2. Pellet sia le colture ricevente che il donatore utilizzando la centrifugazione a 5.000 x g per 7 min.
  3. Scartare il supernatante e risundere il pellet di ceppo "donatore" in 35 mL di LB integrato con DAP per lavare via gli antibiotici residui.
  4. Pellet le cellule di ceppo "donatore" utilizzando centrifugazione a 5.000 x g per 7 min.
  5. Scartare il supernatant e risuspendere il pellet di ceppo "donatore" in 4,5 mL di LB integrato con DAP. Utilizzare una pipetta sierologica da 10 mL.
  6. Trasferire il ceppo "donatore" rispeso nel tubo di deformazione "destinatario", che contiene le cellule "destinatarie" pellet. Utilizzare la stessa pipetta sierologica da 10 mL del passaggio 2.5 per mescolare le culture. Passare immediatamente al passaggio successivo.
    NOTA: Il volume totale della sospensione finale deve essere di 5 mL.
  7. Distribuire la sospensione di accoppiamento come singole goccioline da 100 L su piastre di agar L integrate con DAP (5-7 goccioline per piastra)(Figura 1A).
  8. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 min.
  9. Senza disturbare le goccioline, trasferire con cura le piastre in un'incubatrice di 37 gradi centigradi e consentire alle colture di accoppiarsi per 1 h.
    NOTA: periodi di incubazione superiori a 1 h rischiano la generazione di mutanti sorella.
  10. Dopo l'incubazione, aggiungere 1,5 mL di LB su ogni piatto e raccogliere riempendo i batteri dalle piastre. Utilizzare una micropipetta da 1 mL per la resussione. Il volume finale dovrebbe essere di circa 12 - 15 mL.
  11. Unire le cellule raccolte in un tubo conico da 50 mL.
  12. Pellet le cellule accoppiate utilizzando la centrifugazione a 5.000 x g per 7 min.
  13. Scartare le cellule supernata e di riespetta in 50 mL di LB per rimuovere il DAP residuo.
  14. Pellet l'accoppiamento con centrifugazione a 5.000 x g per 7 min.
  15. Ripetere il passo di lavaggio (passaggi 2.13 e 2.14).
  16. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, risundere il pellet in 10 mL di LB integrato con 25% glicerolo.
  17. Utilizzando le cellule lavate, effettuare cinque diluizioni seriali in brodo LB (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Stendere 100 L di ogni diluizione su 4 piastre diverse utilizzando perline di vetro sterili: agar Luria-Bertani integrato con kanamycin, agar integrato con ampicillina, agar integrato con DAP e agar solo.
  19. Piastre incubate a 37 gradi centigradi durante la notte.
  20. Aliquot l'accoppiamento rimanente in 1 mL aliquots e conservare a -80 gradi centigradi.

3. Determinare l'appropriata diluizione della libreria di trasposizioni

  1. Registrare le unità di formazione delle colonie (CFU) dalle piastre notturne.
  2. Immagine di una piastra con colonie countable per ogni diversa condizione di piastra (Figura 2A).
    NOTA: entrambi i ceppi "donatore" e "destinatario" dovrebbero crescere su piastre di agar integrate con DAP, quindi la maggior parte delle diluizioni placcate produrrà un prato. Solo il ceppo "destinatario" può crescere su piastre di agar. Né il ceppo "donatore" né il ceppo "destinatario" possono crescere su piastre di agar integrate con ampicillina, quindi non dovrebbe esserci una crescita minima. Solo le cellule di deformazione bersaglio che codificano l'inserimento del trasposone possono crescere su piastre di agar integrate con kanamycin. Le colonie dovrebbero variare di dimensioni, indicando inserimenti di traspositori nei geni che contribuiscono alla forma fisica sull'agar integrato con kanamycin.
  3. Calcolare il numero di mutanti transposon nell'accoppiamento congelato contando il numero di colonie su piastre di agar LB integrate con kanamycin.
    NOTA: Per il genoma di A. baumannii (circa 4 Mbps), l'obiettivo era quello di ottenere circa 400.000 colonie al fine di generare una libreria mutante ad alta risoluzione (circa un inserimento trasposone/10 coppie di basi). Tuttavia, questo numero dovrebbe essere ottimizzato in base alle dimensioni del genoma della specie bersaglio).

4. Generazione di ultima libreria di mutanti batterici

  1. Scongelare un aliquot dell'accoppiamento congelato sul ghiaccio.
  2. Accoppiamento della piastra su piastre Agar Luria-Bertani da 150 mm integrate con kanamycin sulla base di CDU calcolate al punto 3.1. Regolare il volume con LB per produrre 13.333 colonie per 150 L prima della placcatura.
    NOTA: Il conteggio CFU qui è stato determinato per essere circa 105 CFU / mL, quindi il volume di accoppiamento è stato regolato per ottenere 13.333 colonie per piastra in quanto questo fornirebbe un numero ottimale di colonie su 30 piastre per una libreria mutante ad alta risoluzione senza sovraffollare le piastre.
  3. Utilizzare perline di vetro sterili per spalmare 150 L della diluizione per piastra su piastre di agar Luria-Bertani da 150 mm integrate con kanamycin per ottenere 400.000 colonie(Figura 1C).
    NOTA: Le aste sterili o qualsiasi tipo di strumento sterile (ad esempio, perline di vetro) possono essere utilizzate per diffondere i batteri sulle piastre.
  4. Smaltire il tubo usato contenente l'accoppiamento in eccesso.
    NOTA: i cicli di congelamento/disgelo aggiungono pressioni selettive sulla coltura batterica, che possono inclinare i risultati dell'esperimento Tn-seq. Utilizzare un aliquot fresco ogni volta.
  5. Piastre incubate a 37 gradi centigradi per 14 h.
    NOTA: Il tempo di incubazione è ottimizzato per prevenire la crescita esremina (colonie che toccano). Si consiglia di ridurre al minimo la crescita riducendo i tempi di incubazione.

5. Stima della densità della libreria e del pooling per lo storage

  1. Contare CFUs su ogni piastra per stimare i mutanti totali nella libreria transposon. Contare il 20% di almeno 3 piastre per determinare la stima del conteggio delle colonie per l'intero gruppo di piastre(Figura 2A). Assicurati che le colonie non tocchino un'altra colonia.
  2. Dopo aver calcolato la resa stimata della colonia, aggiungere 3-5 mL di LB (o più se necessario) a ogni piastra e raschiare i batteri utilizzando uno strumento sterile di raschiare.
    NOTA: Per raschiare in modo efficiente le piastre sono stati utilizzati anelli sterili.
  3. Piscina sospensioni batteriche da tutte le piastre in tubi conici da 50 mL(Figura 1D). Questo richiederà più tubi conici da 50 mL, almeno 3.
  4. Pellet ha in poolato le sospensioni batteriche utilizzando la centrifugazione a 5.000 x g per 7 min.
  5. Scartare il pellet supernatant e resuspend in 5 mL di LB integrato con 30% glicerolo.
  6. Aliquot 1 mL della biblioteca dei traspositori in criovials e conservare a -80 gradi centigradi.

6. Identificazione dei fattori che regolano la resistenza alla colistina in A. baumannii

  1. Preparare flaconi Erlenmeyer da 4 x 250 mL con ciascuno contenente brodo l'LB da 50 mL ed etichetta come (Figura 2B)
    1. A. baumannii ceppo ATCC 17978 libreria Tn-seq; (-) colistin_1
    2. A. baumannii ceppo ATCC 17978 libreria Tn-seq; (-) colistin_2
    3. A. baumannii ceppo ATCC 17978 libreria Tn-seq; (e) colistin_1
    4. A. baumannii ceppo ATCC 17978 libreria Tn-seq; (e) colistin_2
      NOTA: nella crescita della sfida descritta di seguito, ogni condizione, (-) il controllo della colistina e la sfida della colistina (-) vengono testate in duplicato. Pertanto, l'installazione richiede 4 x 250 mL flaconi Erlenmeyer, due per condizione.
  2. Aggiungere 50 L di 0,5 mg/L di colistina a flaconi di colistina (6.1.3 e 6.1.4) e 50 lL acqua a (-) flaconi di colistina (6.1.1 e 6.1.2).
  3. Scongelare una libreria Tn-seq congelata al passo 5 sul ghiaccio.
  4. Pipette 1 L della libreria scongelata in 1 mL di PBS.
  5. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600)e moltiplicare per 1.000.
    NOTA: questo determina OD600 di 1 L della libreria Tn.
  6. Sulla base del calcolo al punto 6.5, inoculare ogni fiaschetta contenente 50 mL LB ad un ODfinale 600 0.001.
  7. Coltivare le colture in un'incubatrice tremante a 37 gradi centigradi aOD 600 0,5.
    NOTA: È importante che le culture rimangano in fase di crescita logaritmica, quindi se il tuo ceppo si trova in un OD600 diverso durante la crescita esponenziale, l'OD600 deve essere regolato per garantire che la coltura si replica il maggior numero di volte possibile all'interno della fase di crescita logaritmica. Se la coltura si replica solo 3 volte, il potere di rilevare i difetti di fitness nei mutanti è limitato a differenze di 3 volte, in teoria. Poiché diversi batteri hanno tempi di raddoppio diversi, è importante seminare le colture a un ODfisso 600 per normalizzare l'inoculum iniziale. Ciò garantisce una rappresentazione coerente dell'intera libreria in tutte le impostazioni cultura.
  8. Raccogliere le colture utilizzando la centrifugazione a 5.000 x g a 4 gradi centigradi per 7 min.
  9. Rimuovere il supernatant e lavare con 50 mL di PBS.
  10. Pellet con centrifugazione a 5.000 x g a 4 gradi centigradi per 7 min.
  11. Rimuovere il supernante e risuspendere il pellet in 1 mL di PBS. Aliquot - 200 l in 5 tubi microcentrifuge.
  12. Pellet con centrifugazione a 5.000 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Rimuovere tutto il supernatant utilizzando una punta pipette.
  13. Conservare i pellet a -20 gradi centigradi o procedere con l'estrazione gDNA.

7. estrazione gDNA

  1. Scongelare un pellet cellulare sul ghiaccio.
  2. Aggiungere il buffer lysis da 0,6 mL (Tabella deimateriali ) e il vortice per risundere completamente il pellet.
  3. Incubate a 37 gradi centigradi per 1 h.
  4. Aggiungere 0,6 mL di alcole fenolo/cloroformio/isoatile al campione e vortice vigorosamente.
  5. Fasi separate utilizzando la centrifugazione in un microcentrifuge alla velocità massima a temperatura ambiente per 5 min.
  6. Trasferire la fase aques superiore in un nuovo tubo. Evitare di disturbare l'interfaccia di fase durante il trasferimento.
  7. Aggiungere un volume uguale di cloroformio alla fase aques ottenuta sopra e vortice vigorosamente.
  8. Fasi separate utilizzando la centrifugazione in microcentrifuge alla velocità massima a temperatura ambiente per 5 min.
  9. Trasferire la fase aques superiore in un nuovo tubo.
    NOTA: Assicurarsi di evitare di disturbare l'interfaccia durante il trasferimento.
  10. Aggiungere 2,5 volte il volume di fase aque di freddo 100 % di etanolo e mescolare delicatamente. Il DNA precipitato sarà visibile.
  11. Posizionare il tubo a -80 gradi centigradi per almeno 1 h.
  12. Pellet DNA utilizzando centrifugazione a velocità massima a 4 gradi centigradi per 30 min.
  13. Rimuovere con cura il supernatant senza disturbare il pellet del DNA e lavare con 150 L del 70 % di etanolo mediante pipettaggio.
  14. Pellet DNA utilizzando centrifugazione a velocità massima a 4 gradi centigradi per 2 min.
  15. Rimuovere con attenzione il supernatant.
  16. Ripetere il passaggio 7.14 una volta. Rimuovere con attenzione tutto l'etanolo rimanente.
  17. DNA secco incubando a temperatura ambiente stanza per 5-10 min.
  18. Riespettire il pellet di DNA in un buffer TE da 100 L tramite pipettatura.

8. taglio del DNA (Figura 3A)

  1. Diluire il gDNA con cuscinetto TE ad una concentrazione di 250 ng/mL in un volume totale di 200 L.
  2. Mettere i tubi in un sonicatore bagno d'acqua.
  3. DNA sonicato per produrre frammenti di circa 300 nucleotidi. Potenza: 60 %, Tempo totale: 20 min, Cicli: 10 s ON e 10 s OFF a 4 gradicentigradi (Figura 3A).
  4. Verificare che il DNA sia stato tosato in modo appropriato separando 10 L di DNA non sereno e 10 L di DNA tosato su un gel di agarose dell'1%. Ripetere l'ottimizzazione o ottimizzarlo in base alle esigenze (Figura 3B).

9. Aggiunta della coda poli-C alla fine 3'(Figura 3A)

  1. Impostare la reazione poli-C secondo la tabella 1.
  2. Reazione incubante a 37 gradi centigradi per 1 h.
  3. Purificare la reazione poli-C con 40 L di perline paramagnetiche di selezione delle dimensioni (Figura 3A) seguendo la procedura riportata di seguito.
    1. Aggiungere 40 L di perline paramagnetiche di selezione delle dimensioni a ciascun campione. Vortex - 5 s o pipette su e giù.
    2. Incubare campioni a temperatura ambiente per 5 min.
    3. In breve, i tubi di centrifuga per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo (2 s).
    4. Trasferire i tubi su un rack magnetico e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti fino a quando la soluzione è chiara.
    5. Con i tubi su rack magnetico, rimuovere con attenzione il supernatant.
    6. Con i tubi su rack magnetico, aggiungere 200 L di etanolo appena preparato 80% (non disturbare perline).
    7. Incubare campioni per almeno 30 s fino a quando la soluzione è chiara.
    8. Con i tubi su rack magnetico, rimuovere con attenzione il supernatant.
    9. Ripetere il passaggio di lavaggio (passaggi da 9.3.6 a 9.3.8).
    10. Raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo utilizzando un breve passo di centrifugazione (2 s).
    11. Trasferire i tubi sul rack magnetico e rimuovere il liquido rimanente.
    12. Incubare a temperatura ambiente per 2-5 min per asciugare i campioni. Non asciugare troppo.
    13. Rimuovere i tubi dal rack magnetico e aggiungere 25 L di acqua a ciascuno. Vortice per 5 s o pipetta su e giù.
    14. In breve, i tubi di centrifuga per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo (2 s).
    15. Trasferire i tubi sul rack magnetico e lasciare riposare per 2 minuti fino a quando la soluzione non è chiara.
    16. Con i tubi sul rack magnetico, rimuovere il liquido senza disturbare le perline e il trasferimento in un nuovo tubo (23 dollari di DNA).

10. Amplificazione della giunzione transposon (Figura 3A)

  1. Configurare PCR 1 come descritto nella tabella 1 per la prima PCR nidificata (Tabella 2).
  2. Eseguire la PCR 1 utilizzando le condizioni descritte nella tabella 1.
  3. Purificare i prodotti PCR con 40 L di perline paramagnetiche a selezione delle dimensioni (passaggi 9.3.1 – 9.3-12). Elute in 50 L di acqua (punti 9.3.13 – 9.3.16). A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 gradi centigradi.
  4. Preparare perline paramagnetiche accoppiate a Streptavidin:
    1. Rispendere le perline Streptavidin agitando vigorosamente.
    2. Aggiungere 32 L di perline per campione a un tubo di microcentrifuge fresco.
      NOTA: Le perline per i campioni 6 possono essere preparate in un unico tubo.
    3. Trasferire il tubo su un rack magnetico. Incubare per 2 minuti fino a quando la soluzione è chiara.
    4. Con tubo su rack magnetico, rimuovere supernante.
    5. Rimuovere il tubo dal rack magnetico. Lavare le perline riempending in 1 mL 1x B&W buffer pipetting su e giù.
    6. Trasferire il tubo su rack magnetico. Incubare per 2 minuti fino a quando la soluzione è chiara.
    7. Con il tubo su rack magnetico, rimuovere il supernatant.
    8. Ripetere il passaggio di lavaggio con 1 mL 1x buffer B&W (passaggi 10.4.5 – 10.4.7) altre due volte per un totale di 3 lavaggi.
    9. Rimuovere il tubo dal rack magnetico e rissovespendere le perline in 52 L di buffer B&W 2x per campione.
  5. Unire 50 L delle perline preparate con 50 L di PCR1 purificato (dal punto 10.3). Pipetta da mescolare.
  6. Ruotare a temperatura ambiente per 30 min.
  7. Lavare via il DNA non legato:
    1. In breve, centrifuga per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo (2 s).
    2. Trasferire il tubo su rack magnetico. Incubare per 2 minuti fino a quando la soluzione è chiara.
    3. Con il tubo su rack magnetico, rimuovere il supernatant.
    4. Rimuovere il tubo dal rack magnetico, lavare le perline rievocando in buffer B&W 1x 100 e pipettando su e giù.
    5. Trasferire il tubo su rack magnetico. Incubare per 2 minuti fino a quando la soluzione è chiara.
    6. Con tubo su rack magnetico, rimuovere supernante.
    7. Ripetere i passaggi di lavaggio con 100 L LoTE (passaggi da 10.7.4 a 10.7.6) altre due volte per un totale di 3 lavaggi.
  8. Impostare PCR 2 come descritto nella tabella 1 per amplificare le giunzioni di trasposizione e aggiungere un singolo codice a barre a ciascun campione(tabella 2 e tabella 3).
  9. Eseguire la PCR 2 utilizzando le condizioni descritte nella tabella 1.
  10. Purificare con 40 L di perline paramagnetiche di selezione delle dimensioni (punti 9.3.1 – 9.3.12). Elute in 17 l di acqua (passi 9.3.13 – 9.3.16), raccogliere 15 L.
  11. Quantificare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorometro. Le concentrazioni finali devono essere da 50 a 250 ng/l.
  12. Valutare la qualità del DNA utilizzando l'elettroforesi capillare a base di chip (Figura 4A).

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Representative Results

I metodi descritti descrivono la generazione di una libreria di transposon ad alta densità nel ceppo A. baumannii ATCC 17978 attraverso la coniugazione batterica utilizzando E. coli MFD DAP-, che replica il plasmide pJNW684 (Figura 4B). Il protocollo dettagliato utilizza la coniugazione batterica bi-parentale per il trasferimento di pJNW684 dal ceppo del donatore E. coli λpir- donatore al ceppo del ricevente A. baumannii. Si tratta di un metodo efficiente ed economico per generare dense librerie mutanti traspososi. I batteri sono stati miscelati a rapporti ottimizzati e gli accoppiamenti sono stati avvistati sulle piastre di agar Luria-Bertani per 1 h (Figura 1A). Durante l'accoppiamento, il transposon è stato trasferito dal donatore al ceppo ricevente, dove è stato inserito nel gDNA (Figura 1B). Sono state raccolte accoppiate allevamenti, sono staticalcolati circa 10 5 CFU/mL e placcati su piastre di agar da 150 mm x 15 mm completate con kanamycin. Dopo 14 h di crescita a 37 gradi centigradi, le piastre contenevano migliaia di colonie di dimensioni variabili(Figura 1C) che indicavano una generazione di successo di una libreria mutante trasposone. I mutanti di inserimento traspososi sono stati in pool (Figura 1D) e congelati in aliquots per evitare ripetuti cicli di congelamento-disgelo, che potrebbero aggiungere pressione selettiva sulla libreria di inserimento.

La libreria mutante transposon A. baumannii in comune è stata utilizzata per identificare i fattori di forma fisica importanti per la resistenza alla colistina sotto le concentrazioni subinibite del antimicrobico (Figura 2B). La libreria mutante è stata coltivata in fase logaritmica in assenza/presenza di 0,5 mg/L colistina in duplicato per esaurire gli inserimenti di cellule mutanti nei geni che contribuiscono alla resistenza alla colistina. Il gDNA totale del pool di librerie rimanente è stato isolato dalle colture di controllo e sperimentali ed elaborato per preparare il DNA per il sequenziamento (Figura 3A).

GDNA isolato è stato frammentato utilizzando la cesoia meccanica ed è stata aggiunta una coda poli-C sui frammenti di DNA (Figura 3A). In seguito all'aggiunta della coda poli-C, il DNA è stato purificato e le giunzioni traspososale-genome sono state arricchite utilizzando il primer specifico poli-C seguito da un secondo ciclo di PCR utilizzando un altro primer specifico poli-C che ha introdotto il sito di sequenziamento P7 che è necessario per legare la cellula di flusso Illumina e la generazione di cluster, e un codice a barre a sei basi che viene utilizzato per demultiplex librerie post sequenziamento37,47. Sono state calcolate le concentrazioni di DNA e i campioni sono stati analizzati utilizzando l'elettroforesi capillare a base di chip per confermare le costruzioni di librerie di successo (Figura 4A), pronte per il sequenziamento ad alta velocità effettiva.

Le librerie di DNA sono state sequenziate dal sequenziamento di nuova generazione. È stata eseguita una corsa a ciclo di 50 cicli a fine singola, che ha prodotto 30 milioni di letture/campioni di alta qualità che forniscono una copertura di 62,5 volte della libreria dei trasposinti. Le giunzioni Transposon (letture) sono state mappate al genomadi riferimento 48, utilizzando un software di analisi bioinformatica disponibile in modo commerciale. Il numero di letture in ogni sito di inserimento nei campioni di input, (-) condizione di controllo colistina, sono state confrontate con il numero di letture nei campioni di output, la condizione sperimentale di colistina e sono stati calcolati i punteggi di idoneità per ogni sito di inserimento. I punteggi di fitness sono stati poi raggruppati per gene. I geni che dimostrano punteggi ridotti quando la biblioteca è stata coltivata in presenza di colistina rispetto ai campioni di input sono stati considerati determinanti di fitness per la sopravvivenza di A. baumannii a concentrazioni subinibitorie di colistina. Ad esempio, gli inserimenti di traspositori all'interno del sistema a due componenti PmrAB erano presenti nel campione di input, ma non sono stati trovati nell'esempio di output. PmrAB regola direttamente l'espressione di pmrC, che trasferisce la fosphoethanolamina sul lipodico A per neutralizzare la carica sulla superficiecellulare 12,31. Si ritiene che la neutralizzazione della carica di superficie batterica riduca il potenziale elettrostatico necessario per l'uccisione mediata dalla colistina. L'identificazione dei geni esauriti noti per contribuire al fenotipo di resistenza ha convalidato il metodo.

Figure 1
Figura 1: Schema della costruzione della libreria mutante trasposone. (A) Coniugazione batterica. Il ceppo "donatore", che codifica il macchinario di trasposizione, è stato mescolato con il ceppo "destinatario". La miscela è stata avvistata su piastre di agar LB e ha permesso di accoppiarsi per 1 h. (B) Generazione di libreria di trasposone. Il plasmide che trasportava il macchinario di trasposizione è stato trasferito dal ceppo "donatore" al ceppo "destinatario" e il transposon è stato inserito casualmente in tutto il genoma del ceppo "destinatario". (C) Selezione. Le cellule risultanti sono state placcate su piastre di agar completate con kanamycin per selezionare i mutanti di inserimento trasposone. (D) Libreria in pool. Le colonie sono state raschiate dalle tavole, risussunate in LB e in comune. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Risultati rappresentativi della coniugazione batterica e schema dell'esperimento Tn-seq della colistina. (A) Piatto di selezione kanamycin rappresentativo. La piastra è divisa in cinque sezioni uguali. I punti blu rappresentano il conteggio delle colonie per la stima dei mutanti di inserimento traspososi A. baumannii. Per calcolare la stima finale sono state conteggiate almeno tre piastre distinte. (B) Identificazione dei fattori di forma fisica alle concentrazioni di colistina subinibitale. La libreria di transposon in pool è stata coltivata in fase di crescita logaritmica sia in assenza (controllo) o in presenza (sperimentale) di colistina. Una volta che le colture hanno raggiunto un'adeguata densità ottica, le cellule sono state pelleted e gDNA è stato estratto da ogni campione. Ogni condizione è stata testata in duplicato per un totale di quattro campioni. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Diagramma di flusso della libreria amplicon del DNA per un massiccio sequenziamento parallelo e gDNA tosato rappresentativo. (A) Schema di compilazione della libreria DNA Tn-seq. Dopo l'estrazione, il gDNA è stato frammentato tramite taglio meccanico. Il transferase deossinucleotidyl terminale è stato utilizzato per aggiungere una coda poli-C all'estremità 3' del DNA frammentato prima dell'amplificazione PCR delle giunzioni trasposson-genome e dell'aggiunta del codice a barre. (B) 1% gel di agarose di librerie mutanti A. baumannii nonhed e tosate dopo il passo di taglio gDNA. La scala da 1 Kb è stata usata come marcatore del DNA. Lo striscio gDNA disaffezionato varia principalmente tra le coppie di basi da 100 a 500. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Risultati rappresentativi del controllo di qualità (QC) e mappa del plasmide che trasporta i geni di trasposizione. (A) Traccia QC per una compilazione libreria di DNA. C'è un picco a 350 coppie di base, che indica la riuscita della compilazione della libreria. Se nei risultati del QC è stato rilevato un DNA più grande, i campioni possono essere ulteriormente puliti per rimuovere grandi frammenti di DNA. (B) Plasmid pJNW684 è costituito da un trasposon di marinaio Himar1 (verde) con una cassetta di resistenza kanamycin (viola) per la selezione dei mutanti, un gene che codifica il mariner iperattivo Himar1 C9 transposase (rosso) sotto il controllo di un promotore specifico A. baumannii 17978 (blu), un gene di resistenza all'ampicillina(bla,arancione) e un'origine RP4/oriT/oriR6K-condizionale della replica (giallo). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Reazione Installazione Condizioni
Reazione Poly-C 30 L di gDNA tosato
2,5 L di 9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP
10 L di 5X Buffer di reazione di deossinucleotidyl (Tdt)
1,25 L di rTdt
Da 6,25 lL di acqua a 50 L		 Incubare a 37oC per 1 ora
PcR 1 23 DNA purificato al polipo-C (intero campione della fase precedente)
Miscela di reazione di polimerasi del DNA 10x 10x 10x
2 dNTP da 10 mM
2 MgSO4 da 50 mM
1 L 30 M olj 510 biotina
3 L 30 M olj 376
Polimerasi del DNA ad alta fedeltà da 0,5 L
8,5 L acqua pura a 50 L totale		 1 ciclo: 2 min 94 oC
15 cicli: 15 s 94 oC
30 s 60 oC
2 min 68 oC
1 ciclo: 4 min 68 oC
Attesa: ∞ 4 oC
PCR 2 Perline legate al DNA dal passo precedente
Miscela di reazione di polimerasi del DNA 10x 10x 10x
2 dNTP da 10 mM
2 MgSO4 da 50 mM
1 L 30 M olj 511
1 primer per codici a barre da 30 M (Tabella 2)
Polimerasi del DNA ad alta fedeltà da 0,5 L
33,5 L acqua pura a 50 L		 1 ciclo: 2 min 94 oC
15 cicli: 15 s 94 oC
30 s 60 oC
2 min 68 oC
1 ciclo: 4 min 68 oC
Attesa: ∞ 4 oC

Tabella 1: Impostazione della reazione. Configurazione e condizioni per le reazioni poli-C, PCR 1 e PCR 2.

Scopo Nome Sequenza
Anneals al trasposone olj510-Biotina Biotina-GATGGCTTTTTTGTTTCTCTCTGCAGGGCG
Anneals alla coda poli-C olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATTTGG
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
Nidificato al trasposone - Adattatore P5:
Sito di acquisizione P5 – sito di sequenziamento P5 – N5 –Tn		 olj511 AATGATACGGCGACCGAGATCTCTCTTT
CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNGGGGACTTA
TCATCCAACCTGTTAG
Nidificato in olj376: sito di sequenziamento P7
– codice a barre XXXXXX – sito di acquisizione P7)		 Bc ## CAAGCAGAAGACGGCATACGATxxxxXXGTGA
CTGGAGTTCAGACGTGTGTG
vedere la tabella 2 per i codici a barre specifici

Tabella 2: primer di amplificazione PCR. Primer di amplificazione PCR utilizzati nel protocollo per amplificare le giunzioni trasposson. Lo scopo di ciascuno è elencato nella prima colonna.

Primer Leggere Barcode Sequenza
BC1 ATCACG CGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGT
GATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC2 CGATGT ACATCG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAC
ATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC3 TTAGGC GCCTAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCC
TAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC4 TGACCA TGGTCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
GGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTG
BC5 ACAGTG CACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTG
BC6 GCCAAT ATTGGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
TTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC7 CAGATC GATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC8 ACTTGA TCAAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC9 GATCAG CTGATC CAAGCAGAAGACGGCATACGA
TCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC10 TAGCTT AAGCTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
AAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC11 GGCTAC GTAGCC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC12 Funzione CTTGTA TACAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
ACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC13 AGTCAA TTGACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC14 AGTTCC GGAACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC15 ATGTCA TGACAT CAAGCAGAAGACGGCATACGA
TTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC16 CCGTCC GGACGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC17 A NUOVO DI NUOVO CTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC18 GTCCGC GCGGAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC19 GTGAAA TTTCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC20 GTGGCC GGCCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC21 GTTTCG CGAAAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC22 CGTACG CGTACG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC23 GAGTGG CCACTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
CACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC24 GGTAGC GCTACC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC25 ACTGAT ATCAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGGTG
BC26 ATGAGC GCTCAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC27 ATTCCT AGGAAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
GGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC28 CAAAAG Funzione CTTTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC29 CAACTA TAGTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC30 CACCGG CCGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CCGGTGGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC39 CTATAC GTATAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTATAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC40 CTCAGA TCTGAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTGAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC42 TAATCG CGATTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
GATTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC43 TACAGC GCTGTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC44 TATAAT ATTATA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATTATAGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC45 TCATTC GAATGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GAATGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC46 TCCCGA TCGGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCGGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC47 TCGAAG CTTCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC48 TCGGCA TGCCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TGCCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG

Tabella 3: primer con codice a barre. I primer a barre vengono utilizzati nel secondo passaggio PCR per amplificare le giunzioni trasposoni mentre si aggiungono un sito di sequenziamento P7 e codici a barre all'amplificatore. Non tutti i primer dei codici a barre sono necessari per generare una libreria. Sono necessari solo i primer a barre per il numero di campioni.

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Discussion

A. baumannii è una minaccia emergente per la salute pubblica globale a causa della rapida acquisizione di AMR contro terapie "di ultima linea", come colistina10,11,12,23,24,30,31. Negli ultimi decenni, Tn-seq ha svolto un ruolo fondamentale nel chiarire le interazioni genotipo-fenotipo attraverso numerose specie batteriche ed espandere la nostra comprensione della genetica batterica34,35,42,43. I protocolli Tn-seq sono stati fondamentali nell'identificare i geni essenziali in diverse specie batterichecome Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, il patogeno parodonte Porphyromonas gingivalise persino Mycobacterium tuberculosis37,49,50,51. Oltre all'identificazione dei geni essenziali, Tn-seq è stato utilizzato per identificare i geni di resistenza agli antibiotici in Pseudomonas aeruginosa, diversi geni condizionalmente essenziali in Salmonella typhimurium e numerose relazioni genotipo-fenotipo in Streptococcus pneumoniae52,53,54. Più recentemente, il sequenziamento transposon di Vibrio cholerae è stato impiegato nel modello di coniglio infantile del colera per identificare i geni che sono importanti per la forma fisica in vivo durante l'infezione47. Questi studi dimostrano la versatilità di Tn-seq in quanto può essere utilizzato sia per gli studi in vitro che in vivo.

Il vantaggio principale di Tn-seq rispetto ad altri metodi, come le tecnologie microarray, l'elettroforesi gel 2D e il qPCR, è che non richiede una conoscenza preventiva del genoma o delle informazioni genomiche55. Pertanto, la mutagenesi trasposone accoppiata con il sequenziamento massiccio parallelo consente lo studio di geni e genomi noti, nonché la scoperta di nuove interazioni genetiche. Qui abbiamo presentato un metodo completo per generare una libreria mutante trasposonica altamente densa in A. baumannii per identificare i fattori che sono essenziali per la forma fisica batterica quando esposti a concentrazioni subinibitorie di colistina. Il metodo descritto è stato utilizzato con successo anche in E. coli (dati inediti), dimostrando che il sistema è suscettibile di eseguire l'analisi Tn-seq in altri patogeni Gram-negativi, tra cui Enterobacteriaceae.

L'utilizzo di trasposoni mariner per la mutagenesi di inserimento presenta diversi vantaggi. La famiglia dei traspositori proveniva da ospiti eucarioti e sono stati ampiamente utilizzati per generare librerie mutanti saturanti in diverse popolazioni batteriche. I trasposoni Mariner sono indipendenti dall'host, il che significa che gli inserimenti casuali stabili possono essere raggiunti in assenza di fattori hostspecifici 40,41. Inoltre, i trasposoni mariner hanno un numero definito di eventi di inserimento perché inseriscono preferibilmente nei motivi timine-adenina ("TA", che riduce la distorsione dell'inserimento e porta a un'analisi statistica più robusta37,56,57,58.

Diversi metodiTn-seq basati su mariner utilizzano la digestione di restrizione MmeI per la frammentazione gDNA32,42,43. Mentre la frammentazione del DNA ezymatico è un metodo popolare e di successo, aggiunge passaggi inutili alla procedura e aumenta la potenziale distorsione37. Non solo queste tecniche richiedono grandi quantità di materiali di partenza, ma possono anche portare a una rappresentazione ineguale delle sequenze di inserimento nelle analisi a valle37,59. Come alcuni altri metodi che non si basano sull'attività nucleasiMmeI 52,60,61, il metodo qui delineato si basa sulla tosazione meccanica per frammentare gDNA, e TdT per aggiungere una coda poli-C alla fine 3' dei frammenti di DNA. Rispetto alla frammentazione ezimatica del DNA e ai metodi di legatura degli adattatori, questo approccio richiede quantità significativamente inferiori di DNA iniziale, fornendo anche risultati più coerenti, riduce anche il rischio di contaminazione incrociata del DNA e riduce la perdita di campioni dovuta al confinamento in un tubosigillato 37,59,62. Inoltre, questo metodo produce letture di sequenziamento più lunghe e di alta qualità di 50 nucleotidi che aiutano a una mappatura più efficace e precisa delle sequenze e ad un'analisi a vallepiù robusta 37,59. L'aggiunta di una coda poli-C sintetica ignora i potenziali sbalzi che possono derivare dalla frammentazione in quanto questo metodo si basa sulla coda poli-C aggiunta esogenamente come sito di riconoscimento per il primer inverso, che contiene 16 nucleotidi dG alla sua fine 3' e una sequenza specifica per il sequenziamento di generazione successiva (ad esempio, sequenziamento Illumina) alla fine 5', alla sintesi47,59. L'uso di una coda di nucleotide sintetica espande l'applicazione di questo metodo a molti genomi distinti indipendentemente dal loro contenuto nativo59. Successivamente, le giunzioni trasposone-genome vengono amplificate utilizzando il primer specifico poli-C37. Questa alternativa semplifica la procedura eliminando la necessità di costosi enzimi di restrizione, legatura dell'adattatore, formazione di dimeri dell'adattatore e fasi di purificazione del gel. Abbiamo ulteriormente ottimizzato il protocollo per generare in modo efficiente librerie di inserimento traspositori altamente saturi in diversi patogeni ESKAPE Gram-negativi, tra cui Acinetobacter baumannii e può essere utilizzato per studiare le interazioni genetiche in diverse condizioni in vitro e in vivo 10.

Una limitazione della mutagenesi Tn è che si basa sui marcatori di resistenza agli antibiotici per la selezione. Tuttavia, molti patogeni ESKAPE Gram-negativi sono multifarmaco o ampiamente resistenti ai farmaci, il che significa che l'utente potrebbe dover scambiare la cassetta di resistenza in base al patogeno specifico di interesse. Inoltre, alcuni isolati clinici non sono susbili alla mutagenesi trasposone utilizzando il trasposone a base di marinaio.

Una fase critica del protocollo è il calcolo del numero di mutanti Tn da placcare. Placcare troppe colonie si tradurrà in un prato che può complicare l'analisi a valle. Se le colonie sono troppo vicine o toccanti, possono aggiungere una pressione selettiva indesiderata sulla libreria che può causare artefatti. Idealmente, le colonie non sarebbero toccanti e distanziate uniformemente attraverso la piastra, come dimostrato (Figura 2A). Al contrario, se troppo poche colonie sono placcate, sarà difficile isolare più inserimenti di Tn in ogni gene.

È inoltre importante eseguire i controlli elencati nel passaggio 2.18. Come indicato nella nota della sezione 3. 2, né il ceppo "donatore" né "destinatario" dovrebbe crescere su piastre integrate con Ampicillina. Poiché il DAP esogeno è necessario per la crescita del ceppo "donatore", qualsiasi crescita indicherebbe che il ceppo "destinatario" replica pJNW684. Questo è un problema significativo perché se il transposon non si integra nel gDNA, le letture di sequenziamento verranno mappate solo al plasmide, non a un sito di integrazione. In questo caso l'esperimento probabilmente non produrrà dati utilizzabili.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del National Institute of Health (Grant AI146829 a J.M.B.) ed è riconosciuto con gratitudine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

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References

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Generazione di librerie di inserimento transposon in batteri Gram-Negativi per il sequenziamento ad alta velocità effettiva
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Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

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