Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generering Transposon Indsættelse Biblioteker i Gram-negative bakterier til høj-throughput sekventering

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

Vi beskriver en metode til at generere mætte transposon mutant biblioteker i Gram-negative bakterier og efterfølgende forberedelse af DNA amplicon biblioteker for høj-throughput sekventering. Som et eksempel, vi fokuserer på ESKAPE patogen, Acinetobacter baumannii, men denne protokol er modtagelig for en bred vifte af Gram-negative organismer.

Abstract

Transposon sekventering (Tn-seq) er en kraftfuld metode, der kombinerer transposon mutagenesis og massiv parallel sekventering for at identificere gener og veje, der bidrager til bakteriel fitness under en bred vifte af miljømæssige forhold. Tn-seq applikationer er omfattende og har ikke kun gjort det muligt undersøgelse af genotype-fænotype relationer på et organismeniveau, men også på befolkningen, samfund og systemer niveauer. Gram-negative bakterier er stærkt forbundet med antimikrobiel resistens fænotyper, som har øget tilfælde af antibiotikabehandling fiasko. Antimikrobiel resistens defineres som bakterievækst ved tilstedeværelse af ellers dødelige antibiotika. Den "sidste-line" antimikrobiel colistin anvendes til behandling af Gram-negative bakterielle infektioner. Men flere Gram-negative patogener, herunder Acinetobacter baumannii kan udvikle colistin resistens gennem en række molekylære mekanismer, hvoraf nogle var karakteriseret ved hjælp af Tn-seq. Desuden, signal transduktion veje, der regulerer colistin resistens varierer inden for Gram-negative bakterier. Her foreslår vi en effektiv metode til transposon mutagenesis i A. baumannii, der strømliner generation af en mættende transposon indsættelse bibliotek og amplicon bibliotek konstruktion ved at fjerne behovet for begrænsning enzymer, adapter ligation, og gel rensning. De metoder, der er beskrevet heri, vil muliggøre dybdegående analyse af molekylære determinanter, der bidrager til A. baumannii fitness, når udfordret med colistin. Protokollen gælder også for andre Gram-negative ESKAPE patogener, som primært er forbundet med resistente hospitalserhvervedeinfektioner.

Introduction

Opdagelsen af antibiotika er uden tvivl en af de mest virkningsfulde sundhedsrelaterede begivenheder i det20. Ikke alene antibiotika hurtigt løse alvorlige bakterielle infektioner, de spiller også en central rolle i moderne medicin. Større operationer, transplantationer og fremskridt inden for neonatal medicin og kemoterapi efterlader patienter modtagelige for livstruende infektioner, og disse behandlinger ville ikke være mulige uden antibiotika1,,2. Men, hurtig udvikling og spredning af antibiotikaresistens blandt humane patogener har reduceret effekten af alle klinisk vigtige klasser af antibiotika3. Mange bakterielle infektioner, der engang var let ryddet med antibiotika behandling, ikke længere reagere på klassiske behandling protokoller, forårsager en alvorlig trussel mod den globale folkesundhed1. Antimikrobiel resistens (AMR) er stedet, hvor bakterieceller vokser i ellers dødelige koncentrationer af antibiotika, uanset behandlingsvarigheden4,5. Der er et presserende behov for at forstå molekylære og biokemiske faktorer, der regulerer AMR, hvilket vil hjælpe med at styre alternativ antimikrobiel udvikling. Specifikt, ESKAPE patogener er problematisk i kliniske omgivelser og forbundet med omfattende AMR. Disse omfatter Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa og Enterobacter spp. Mens flere mekanismer bidrager til AMR i ESKAPE patogener, er de fire sidstnævnte organismer Gram-negative.

Gram-negative bakterier samle en definerende ydre membran, der beskytter dem mod ugunstige miljøforhold. Den ydre membran fungerer som en permeabilitet barriere for at begrænse indrejse af giftige molekyler, såsom antibiotika, i cellen. I modsætning til andre biologiske membraner er den ydre membran asymmetrisk. Den ydre folder er beriget med overflade-eksponeret lipopolysaccharid, mens den indre folder er en blanding af fosfolipider6. Lipopolysaccharid molekyler er forankret til den ydre membran af en bevaret lipid En moiety indlejret i lipid tolags7. Den kanoniske lipid Et domæne af Escherichia coli lipopolysaccharid er nødvendig for væksten af de fleste Gram-negative bakterier og er syntetiseret af en ni-trins enzymatisk vej, der er en af de mest grundlæggende og bevarede veje i Gram-negative organismer6,7,8.

Polymyxiner er kationiske antimikrobielle peptider, der er målrettet lipid Et domæne af lipopolysaccharid at forstyrre den ydre membran og lyse cellen. Den elektrostatiske interaktion mellem positivt ladede rester af polymyxiner og de negativt ladede lipid A fosfatgrupper forstyrrer bakteriecellemembranen, der i sidste ende fører til celledød9,10,11,12,13. Colistin (polymyxin E) er en sidste udvej antimikrobielle anvendes til behandling af infektioner forårsaget af multidrug resistente Gram-negative nosokomielle patogener, såsom Acinetobacter baumannii14,15,16. Først opdaget i 1947, polymyxiner produceres af jorden bakterier, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Polymyxiner blev ordineret til behandling af Gram-negative infektioner iårevis,før deres kliniske anvendelse var begrænset på grund af rapporter om signifikant nefrokro- og neurotoksicitet20,21.

A. baumannii er en nosokomiel Gram-negative patogen, der har dramatisk øget sygelighed og dødelighed af patientens resultater i de senesteårtier 22. Hvad der engang blev betragtet som en lav-trussel patogen, nu udgør en betydelig risiko for hospitalserhvervet infektion i hele verden på grund af sin utrolige evne til at erhverve AMR og høj risiko for epidemi23,24. A. baumannii tegner sig for mere end 10% af nosokomielle infektioner i USA. Sygdom manifesterer sig som lungebetændelse, bakteriæmi, urinvejsinfektioner, hud og blødt væv infektioner, meningitis, og endocarditis25. Behandlingsmuligheder for A. baumannii infektioner er svundet ind på grund af resistens over for næsten alle antibiotika klasser, herunder β-lactams, fluoroquinoloner, tetracyclin, og aminoglycosider23,24. Forekomsten af multiresistente, omfattende resistente og pan-resistente A. baumannii isolater har ført til en genopblussen i colistin behandling, som blev anset for at være en af de få resterende terapeutiske muligheder stadig effektiv mod multidrug resistente A. baumannii. Men øget colistin resistens blandt A. baumannii isolater har yderligere forstærket sin trussel mod den globale folkesundhed10,11,12,13,27,30,31.

De seneste fremskridt inden for høj-throughput sekventering teknologier, såsom transposon sekventering (Tn-seq), har givet vigtige værktøjer til at fremme vores forståelse af bakteriel fitness in vitro og in vivo. Tn-seq er et kraftfuldt værktøj, der kan udnyttes til at studere genotype-fænotype interaktioner i bakterier. Tn-seq er bredt anvendelig på tværs af bakterielle patogener, hvor det kombinerer traditionel transposon mutagenese med massiv parallel sekventering til hurtigt kort indsættelse steder, som kan bruges til at forbinde DNA-mutationer til fænomypiske varianter på et genom-dækkendeskala 32,33,34,35. Mens transposon mutagenese metoder er tidligere blevet beskrevet, de generelle trin er de samme33. For det første genereres et indsætningsbibliotek ved hjælp af transposon mutagenese, hvor hver bakteriecelle i en population er begrænset til en enkelt transpononindføring i det genomiske DNA (gDNA). Efter mutagenese er individuelle mutanter samlet. gDNA udvindes fra indførings mutant-puljen, og transponeringskrydsene forstærkes og udsættes for sekvensering med høj gennemløb. Læserne repræsenterer indsætningssteder, som kan knyttes til genomet. Transposon indsættelser, der reducerer fitness hurtigt falder ud af befolkningen, mens gavnlige indsættelser er beriget. Tn-seq har været medvirkende til at fremme vores forståelse af, hvordan gener påvirker bakteriel fitness i stress33.

Himar1-systemet for søfarende, der er kodet i pJNW684, er specielt konstrueret og optimeret med henblik på transposon mutagenese. Det omfatter en mariner-familietransposon flankerende kanamycin resistens genet, som bruges til udvælgelse af transposon indsættelse mutanter i A. baumannii. Det koder også en A. baumannii specifik promotor, der driver udtryk for transposase kodning gen36. Den marinermariner-baserede transposon indeholder også to translationelle terminatorer neden for kanamycin resistens genet, som forhindrer gennemlæselse nedstrøms forindsættelsen 37. pJNW684 har også en RP4/oriT/oriR6K-betinget oprindelse af replikation, som kræver λpir-genet, som donorstammen har bidraget medtil at replikere 38. I mangel af λpir-genet vil pJNW684-vektoren, der bærer gennemførelsesmaskineriet, ikke kunne replikere i A. baumannii-recipientstammen 10,36,38. Derfor indsættes der under bakteriel bøjning kun transponeringen i recipientgenomet uden baggrundsindføring af plasmid, som bærer transposase-genet. Dette er vigtigt, fordi tabet af transposase aktivitet sammen med plasmid resulterer i en enkelt, stabil gennemførelse begivenhed, der forhindrer transposon fra at flytte til forskellige steder, når den indsætter i modtagerens genom.

pJNW648 er også blevet testet for aktivitet i en anden Gram-negativ organisme, E. coli. Vellykket samling af et mættende Tn-seq bibliotek i E. coli stamme W3110 angivet systemet er modtagelige for at udføre mutagenese i en bred vifte af patogener, herunder Enterobakterier. Desuden kan den a. baumannii specifikke promotor, der driver transposase udtryk hurtigt udveksles med en artsspecifik promotor. Endelig kan kanamycinresistensgen udskiftes med andre resistenskassetter, afhængigt af AMR-fænotypen af den organisme, der undersøges.

En faktor, der bidrager til colistin resistens i A. baumannii er administration af utilstrækkelige doser, hvor bakterier udsættes for selektivt tryk på ikke-dødelige niveauer39. Flere rapporter viste, at subinhibitory antimikrobielle koncentrationer kan fremkalde regulerede reaktioner , der ændrer cellefysiologi for at reducere følsomheden af hele bakteriepopulationen11,12,30,31. Ved hjælp af Tn-seq opdagede vi faktorer, der regulerer colistinresistens i A. baumannii stamme ATCC 17978 efter udsættelse for hæmmende10 og subinhibitory koncentrationer af colistin. I dette eksempel beskrives en Tn-seq-metode , der strømliner konstruktionen og berigelsen af et mættet transposon-mutant bibliotek ved hjælp af den mariner-baseredefamilie af transposons40,41. Mens flere Tn-seq protokoller generere 20.000 - 100.000 mutanter35,42,43,4444,45,46, protokollen beskrevet heri kan hurtigt generere en transposon bibliotek på 400.000 + mutanter, hvilket nogenlunde svarer til en transponering for hvert 10-basepar i A. baumannii10. Desuden kan bibliotekets størrelse skaleres op uden en betydelig ekstra indsats. Denne metode eliminerer også kravet om begrænsning endonucleaser, adapter ligation og gel rensning, som kan reducere det endelige bibliotek mangfoldighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af bakteriel stamme

  1. Streak "donor" stamme (E. coli MFD DAP-/ pJNW684, Tabel af materialer) for isolerede kolonier på Luria-Bertani agar suppleret med 600 μM diaminopimelic syre (DAP), 100 mg / l af ampicillin og 25 mg / l af kanamycin. Inkuber natten over ved 37 °C. Ved hjælp af en enkelt isoleret koloni, inokulere 50 ml Luria bouillon (LB) suppleret med 600 μM DAP, 100 mg / l af ampicillin og 25 mg / l af kanamycin i en 250 ml Erlenmeyer kolbe og mærke det som "donor".
  2. Streak "recipient" stamme (A. baumannii stamme ATCC 17978, Tabel af Materialer) for isolerede kolonier på Luria-Bertani agar. Inkuber natten over ved 37 °C. Ved hjælp af en enkelt isoleret koloni, inokulere 50 ml LB i en 250 ml Erlenmeyer kolbe og mærke det som "modtager".
  3. Inkuber begge kulturer ("donor" og "modtager") natten over ved 37 °C med omrystning.

2. Bakteriel parring

  1. Overfør natten kulturer til 50 ml koniske rør.
  2. Pellet både recipient- og donorkulturer ved centrifugering ved 5.000 x g i 7 min.
  3. Kassér supernatant og resuspend den "donor" stamme pellet i 35 ml LB suppleret med DAP at vaske væk resterende antibiotika.
  4. Pellet "donor" stamme celler ved hjælp af centrifugering på 5.000 x g i 7 min.
  5. Kassér supernatanten og opslæmp "donor"-stammepillen i 4,5 ml LB suppleret med DAP. Brug en 10 ml serologisk pipette.
  6. Overfør den resuspenderede "donor" stamme i "modtager" stamme rør, som indeholder pellets "recipient" celler. Brug den samme 10 ml serologisk pipette fra trin 2.5 til at blande kulturerne. Gå straks videre til næste trin.
    BEMÆRK: Det samlede volumen af den endelige suspension skal være 5 ml.
  7. Parringssuspensionen fordeles som individuelle 100 μL dråber på LB agarplader suppleret med DAP (5-7 dråber pr. plade) (Figur 1A).
  8. Inkuber plader ved stuetemperatur i 30 min.
  9. Uden at forstyrre dråberne overføres pladerne forsigtigt til en 37 °C-inkubator, og der kan parre sig kulturer i 1 time.
    BEMÆRK: Inkubationsperioder på over 1 time risikerer generering af søster mutanter.
  10. Efter inkubation tilsættes 1,5 ml LB på hver plade og høstes ved at opslæme bakterier fra pladerne. Brug en 1 ml mikropipette til resuspension. Slutvolumen skal være ca. 12 - 15 ml.
  11. Kombiner høstede celler i et 50 ml konisk rør.
  12. Pellet de parrede celler ved hjælp af centrifugering ved 5.000 x g i 7 min.
  13. Kassér supernatanten og de opslæmrede cellerne i 50 ml LB for at fjerne resterende DAP.
  14. Pellet parringen ved centrifugering ved 5.000 x g i 7 min.
  15. Vasketrinnet gentages (trin 2.13 og 2.14).
  16. Ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette, resuspend pellet i 10 ml LB suppleret med 25% glycerol.
  17. Brug vaskede celler, gøre fem serielle fortyndinger i LB bouillon (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Spred 100 μL af hver fortynding på 4 forskellige plader ved hjælp af sterile glasperler: Luria-Bertani agar suppleret med kanamycin, agar suppleret med ampicillin, agar suppleret med DAP og agar alene.
  19. Inkuber plader ved 37 °C natten over.
  20. Den resterende parring er aliquot i 1 ml aliquots og opbevares ved -80 °C.

3. Bestemme en passende udvanding af transposon bibliotek

  1. Optag kolonidannende enheder (CFU) fra natten plader.
  2. Billede en plade med tællelige kolonier for hver anden plade tilstand (Figur 2A).
    BEMÆRK: Både "donor" og "modtager" stammer bør vokse på agar plader suppleret med DAP, så de fleste belagte fortyndinger vil give en græsplæne. Kun "modtageren" stamme kan vokse på agar plader. Hverken "donor" eller "modtager" stamme kan vokse på agar plader suppleret med ampicillin, så der bør være ingen / minimal vækst. Kun mål stamme celler kodning transposon indsættelse kan vokse på agar plader suppleret med kanamycin. Kolonier bør variere i størrelse, hvilket indikerer transposon indsættelser i gener, der bidrager til fitness på agar suppleret med kanamycin.
  3. Antallet af transposon mutanter i den frosne parring beregnes ved at tælle antallet af kolonier på LB agarplader suppleret med kanamycin.
    BEMÆRK: For A. baumannii-genomet (ca. 4 Mbps) var målet at opnå ca. 400.000 kolonier for at generere et mutant bibliotek med høj opløsning (ca. én transpononindsættelse/10 basispar). Dette tal bør dog optimeres på grundlag af målartens genomstørrelse).

4. Generation af endelig bakteriel mutant bibliotek

  1. Tø en aliquot af den frosne parring på is.
  2. Plade parring på 150 mm Luria-Bertani agar plader suppleret med kanamycin baseret på CFUs beregnet i trin 3.1. Volumenet justeres med LB for at give 13.333 kolonier pr. 150 μL før plettering.
    BEMÆRK: CFU-tallet her blev bestemt til at være ca. 105 CFU/ml, så parringsvolumenet blev justeret for at opnå 13.333 kolonier pr. plade, da dette ville give et optimalt antal kolonier på 30 plader til et højopløsnings mutantbibliotek uden at overbebyrde pladerne.
  3. Brug sterile glasperler til at sprede 150 μL af fortyndingen pr. plade på 30 x 150 mm Luria-Bertani agarplader suppleret med kanamycin for at opnå 400.000 kolonier (Figur 1C).
    BEMÆRK: Sterile stænger eller enhver form for sterilt sprederværktøj (dvs. glasperler) kan anvendes til at sprede bakterierne på pladerne.
  4. Det brugte rør, der indeholder overskydende parring, bortskaffes.
    BEMÆRK: Frys/tø cyklusser tilføjer selektivt pres på bakteriekulturen, hvilket kan skævvride Tn-seq-eksperimentresultaterne. Brug en frisk aliquot hver gang.
  5. Inkuber plader ved 37 °C i 14 timer.
    BEMÆRK: Inkubationstiden er optimeret til at forhindre overvækst (kolonier rører). Minimering af væksten ved at reducere inkubationstiden foreslås.

5. Estimering af bibliotekstæthed og pooling til opbevaring

  1. Tæl CFUs på hver plade for at anslå de samlede mutanter i transponeringsbiblioteket. 20 % af mindst 3 plader skal tælles for hele pladegruppen (figur 2A). Sørg for, at kolonierne ikke rører en anden koloni.
  2. Efter beregning af den anslåede koloni udbytte, tilsættes 3-5 ml LB (eller mere, hvis det er nødvendigt) til hver plade og skrabe bakterierne ved hjælp af en steril skrabe værktøj.
    BEMÆRK: Sterile inokulerende sløjfer blev brugt til effektivt at skrabe plader.
  3. Pool bakterielle suspensioner fra alle plader i 50 ml koniske rør (Figur 1D). Dette vil kræve flere 50 ml koniske rør, mindst 3.
  4. Pellet poolet bakteriel suspension ved hjælp af centrifugering på 5.000 x g i 7 min.
  5. Kassér supernatant og resuspend pellet i 5 ml LB suppleret med 30% glycerol.
  6. Aliquot 1 ml af transposon biblioteket i kryovials og opbevares ved -80 °C.

6. Identifikation af faktorer, der regulerer colistinresistens i A. baumannii

  1. Der tilberedes 4 x 250 mL Erlenmeyerkolber med hver indeholdende 50 ml LB bouillon og etiket som (figur 2B)
    1. A. baumannii stamme ATCC 17978 Tn-seq bibliotek; (-) colistin_1
    2. A. baumannii stamme ATCC 17978 Tn-seq bibliotek; (-) colistin_2
    3. A. baumannii stamme ATCC 17978 Tn-seq bibliotek; (+) colistin_1
    4. A. baumannii stamme ATCC 17978 Tn-seq bibliotek; (+) colistin_2
      BEMÆRK: I den udfordringsvækst, der er beskrevet her, testes hver betingelse, (-) colistinkontrol og (+) colistin-udfordring, i to eksemplarer. Derfor kræver opsætningen 4 x 250 ml Erlenmeyerkolber, to pr. betingelse.
  2. Der tilsættes 50 μL på 0,5 mg/L colistin til (+) colistinkolber (6.1.3 og 6.1.4) og 50 μL vand til (-) colistinkolber (6.1.1 og 6.1.2).
  3. Tø en frossen Tn-seq bibliotek aliquot fra trin 5 på is.
  4. Pipette 1 μL af det optøede bibliotek til 1 ml PBS.
  5. Den optiske massetæthed måles ved 600 nm (OD600), og multipliceres med 1.000.
    BEMÆRK: Dette bestemmer OD600 af 1 μL af Tn-biblioteket.
  6. På grundlag af beregningen i trin 6.5 skal hver kolbe, der indeholder 50 ml LB, inokuleres til en endelig OD600 0,001.
  7. Dyrk kulturer i en rystende inkubator ved 37 °Ctil OD 600 0,5.
    BEMÆRK: Det er vigtigt, at kulturer forbliver i logaritmisk vækstfase, så hvis din stamme er på en anden OD600 under eksponentiel vækst, skal OD600 justeres for at sikre, at kulturen replikerer så mange gange som muligt inden for logaritmisk vækstfase. Hvis kulturen kun replikerer 3 gange, er kraften til at detektere fitnessdefekter hos mutanter i teorien begrænset til 3-fold forskelle. Da forskellige bakterier har forskellige fordoblingstider, er det vigtigt at frø kulturerne på en fast OD600 for at normalisere startinoculum. Dette sikrer en ensartet repræsentation af hele biblioteket i alle kulturer.
  8. Høstkulturer ved centrifugering ved 5.000 x g ved 4 °C i 7 min.
  9. Fjern supernatanten og vask med 50 ml PBS.
  10. Pellet ved centrifugering ved 5.000 x g ved 4 °C i 7 min.
  11. Fjern supernatanten, og opslæm pelletpen pellet i 1 ml PBS. Aliquot ~ 200 μL i 5 mikrocentrifuge rør.
  12. Pellet ved centrifugering ved 5.000 x g ved 4 °C i 5 min. Fjern al supernatanten ved hjælp af en pipettespids.
  13. Pellets opbevares ved -20 °C, eller gDNA-ekstraktion fortsættes.

7. gDNA-ekstraktion

  1. Tø en cellepille op på is.
  2. Tilføj 0,6 ml lysis buffer (Tabel over Materialer) og vortex til helt resuspend pellet.
  3. Inkuberes ved 37 °C i 1 time.
  4. Der tilsættes 0,6 ml phenol/chloroform/isoamylalkohol til prøven og vortex kraftigt.
  5. Separate faser ved hjælp af centrifugering i en mikrocentrifuge ved maksimal hastighed ved rumtemperatur i 5 min.
  6. Overfør den øvre vandige fase til et nyt rør. Undgå at forstyrre fasegrænsefladen under overførslen.
  7. Der tilsættes et tilsvarende volumen af chloroform til den vandige fase, der er opnået ovenfor, og vortex kraftigt.
  8. Separate faser ved hjælp af centrifugering i mikrocentrifuge ved maksimal hastighed ved rumtemperatur i 5 min.
  9. Overfør den øvre vandige fase til et nyt rør.
    BEMÆRK: Sørg for at undgå at forstyrre grænsefladen under overførslen.
  10. Der tilsættes 2,5 x vandigt fasevolumen af kold 100 % ethanol og blandes forsigtigt. Udfældet DNA vil være synlig.
  11. Rørret ved -80 °C i mindst 1 time.
  12. Pellet DNA ved centrifugering ved maksimal hastighed ved 4 °C i 30 min.
  13. Supernatanten fjernes forsigtigt uden at forstyrre DNA-pellet og vaskes med 150 μL ethanol på 70 % ved pipettering.
  14. Pellet-DNA ved centrifugering ved maksimal hastighed ved 4 °C i 2 min.
  15. Fjern forsigtigt supernatanten.
  16. Gentag trin 7.14 én gang. Fjern forsigtigt al resterende ethanol.
  17. Tør DNA ved inkubering på værelse temp i 5-10 min.
  18. Opslæmret DNA-pellet i 100 μL TE-buffer ved pipettering.

8. DNA-klipning (Figur 3A)

  1. GDNA fortyndes med TE-buffer til en koncentration på 250 ng/ml i et samlet volumen på 200 μL.
  2. Placer rør i et vandbad sonicator.
  3. Sonikere DNA til at give fragmenter af ca. 300 nukleotider. Effekt: 60 %, Samlet tid: 20 min, Cyklusser: 10 s ON og 10 s OFF ved 4 °C (Figur 3A).
  4. Bekræft, at DNA er skåret korrekt ved at adskille 10 μL uhørte DNA og 10 μL skåret DNA på en 1% agarosegel. Gentag sonikering eller optimer efter behov (Figur 3B).

9. Poly-C hale tilføjelse til 3 'ende (Figur 3A)

  1. Opsætter poly-C-reaktion i henhold til tabel 1.
  2. Inkuber reaktion ved 37 °C i 1 time.
  3. Rengør poly-C-reaktionen med 40 μL paramagnetiske perler (Figur 3A) ved at følge nedenstående trin.
    1. Der tilsættes 40 μL paramagnetiske perler til hver prøve. Vortex ~ 5 s eller pipette op og ned.
    2. Inkuber prøver ved stuetemperatur i 5 min.
    3. Kortvarigt centrifugerør til at indsamle væske i bunden af røret (~ 2 s).
    4. Overfør rør til en magnetisk rack og inkubere ved stuetemperatur i ~ 2 min, indtil opløsningen er klar.
    5. Med rør på magnetisk rack, forsigtigt fjerne supernatant.
    6. Med rør på magnetisk rack, tilsæt 200 μL frisklavet 80% ethanol (forstyr ikke perler).
    7. Inkuber prøver i mindst 30 s, indtil opløsningen er klar.
    8. Med rør på magnetisk rack, forsigtigt fjerne supernatant.
    9. Vasketrinnet gentages (trin 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Opsaml væske i bunden af røret ved hjælp af et kort centrifugeringstrin (~ 2 s).
    11. Overfør rør til den magnetiske rack og fjern eventuel resterende væske.
    12. Inkuberes ved stuetemperatur i 2-5 min. til tørre prøver. Må ikke tørres over.
    13. Fjern rør fra magnetisk rack og tilsæt 25 μL vand til hver. Vortex for ~ 5 s eller pipette op og ned.
    14. Kortvarigt centrifugerør til at indsamle væske i bunden af røret (~ 2 s).
    15. Overfør rør til den magnetiske rack og lad det sidde i ~ 2 min, indtil opløsningen er klar.
    16. Med rør på den magnetiske rist fjernes væsken uden at forstyrre perlerne og overføres til et nyt rør (~ 23 μL DNA).

10. Transposon junction forstærkning (Figur 3A)

  1. Opsætning af PCR 1 som beskrevet i tabel 1 for den første indlejrede PCR (tabel 2).
  2. Udfør PCR 1 ved hjælp af de betingelser, der er beskrevet i tabel 1.
  3. Rens PCR-produkter med 40 μL paramagnetiske perler med størrelsesvalg (trin 9.3.1 – 9.3-12). Elute i 50 μL vand (trin 9.3.13 – 9.3.16). På dette tidspunkt kan prøverne opbevares ved -20 °C.
  4. Forbered Streptavidin-koblede paramagnetiske perler:
    1. Resuspend Streptavidin perler ved at ryste kraftigt.
    2. Der tilsættes 32 μL perler pr. prøve til et frisk mikrocentrifugerør.
      BEMÆRK: Perler til 6 + prøver kan fremstilles i et enkelt rør.
    3. Overfør røret til et magnetisk stativ. Inkubere i ~ 2 min indtil opløsningen er klar.
    4. Med rør på magnetisk rack, fjerne supernatant.
    5. Fjern røret fra magnetisk rack. Vask perler ved resuspending i 1 ml 1x B & W buffer ved pipettering op og ned.
    6. Overfør røret til magnetisk rack. Inkubere i ~ 2 min indtil opløsningen er klar.
    7. Med røret på magnetisk rack fjernes supernatanten.
    8. Gentag vasketrinnet med 1 ml 1x B&W buffer (trin 10.4.5 – 10.4.7) to gange mere for i alt 3 vaske.
    9. Fjern røret fra magnetisk rack og resuspendperler i 52 μL 2x B&W buffer pr. prøve.
  5. Kombiner 50 μL af de forberedte perler med 50 μL renset PCR1 (fra trin 10.3). Pipette til at blande.
  6. Drej ved stuetemperatur i 30 min.
  7. Vask ubundet DNA væk:
    1. Kortvarigt centrifuger for at opsaml væske i bunden af røret (~ 2 s).
    2. Overfør røret til magnetisk rack. Inkuber i ~ 2 min, indtil opløsningen er klar.
    3. Med røret på magnetisk rack fjernes supernatanten.
    4. Fjern røret fra magnetisk rack, vask perler ved resuspending i 100 μL 1x B & W buffer og pipettering op og ned.
    5. Overfør rør til magnetisk rack. Inkuber i ~ 2 min, indtil opløsningen er klar.
    6. Med rør på magnetisk rack, fjerne supernatant.
    7. Gentag vasketrin med 100 μL LoTE (trin 10.7.4 – 10.7.6) to gange mere for i alt 3 vaske.
  8. Opsætning af PCR 2 som beskrevet i tabel 1 for at forstærke transponeringssamlinger og tilføje en enkelt stregkode til hver prøve (tabel 2 og tabel 3).
  9. Udfør PCR 2 ved hjælp af de betingelser, der er beskrevet i tabel 1.
  10. Rengør med 40 μL størrelsesudvælgelse paramagnetiske perler (trin 9.3.1 – 9.3.12). Elute i 17 μL vand (trin 9.3.13 – 9.3.16), opsaml ~ 15 μL.
  11. Kvantificere DNA-koncentration ved hjælp af et fluorometer. De endelige koncentrationer skal være ~ 50 til 250 ng/μl.
  12. Vurder DNA-kvalitet ved hjælp af chip-baseret kapillær elektroforese (Figur 4A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De skitserede metoder beskriver genereringen af et transponeringsbibliotek med høj densitet i A. baumannii-stammen ATCC 17978 gennem bakteriel bøjning ved hjælp af E. coli MFD DAP-som replikerer plasmid pJNW684 (Figur 4B). Den detaljerede protokol anvender bi-forældre bakteriel bøjning til overførsel af pJNW684 fra E. coli λpir+ donor stamme til A. baumannii modtager stamme. Dette er en effektiv og billig metode til at generere tætte transposon mutant biblioteker. Bakterier blev blandet ved optimerede nøgletal og parringer blev spottet på Luria-Bertani agar plader i 1 h (Figur 1A). Under parringen blev transponen overført fra donoren til recipientstammen, hvor den blev indsat i gDNA (figur 1B). Parringer blev indsamlet, ca. 105 CFU/ml blev beregnet og belagt på 150 mm x 15 mm agarplader suppleret med kanamycin. Efter 14 timers vækst ved 37 °C indeholdt pladerne tusindvis af kolonier af varierende størrelse (Figur 1C), hvilket indikerer en vellykket generering af et transposon mutant-bibliotek. Transposon-indsætningsmutanterne blev samlet (figur 1D) og frosset i aliquots for at forhindre gentagne fryseoptøninger, hvilket kunne tilføje selektivt tryk på indføringsbiblioteket.

Det samlede A. baumannii transposon mutant bibliotek blev brugt til at identificere fitnessfaktorer, der er vigtige for colistinresistens under subinhibitory koncentrationer af antimikrobielle (Figur 2B). Det mutante bibliotek blev dyrket til logaritmisk fase i fravær/tilstedeværelse af 0,5 mg/L colistin i to eksemplarer for at nedbryde mutante celler, der kodning af indsættelser i gener, der bidrager til colistinresistens. Den samlede gDNA for den resterende bibliotekspulje blev isoleret fra kontrol- og forsøgskulturer og forarbejdet til fremstilling af DNA til sekvensering (figur 3A).

Isoleret gDNA var fragmenteret ved hjælp af mekanisk klipning, og der blev tilsat en poly-C hale på DNA-fragmenterne (figur 3A). Efter tilsætning af poly-C hale, DNA blev renset og transposon-genom kryds blev beriget ved hjælp af poly-C specifikke primer efterfulgt af en anden runde af PCR ved hjælp af en anden poly-C specifik primer, der indførte P7 sekventering site, som er nødvendig for bindende Illumina flow celle og klynge generation, og en seks-base stregkode, der bruges til demultiplex biblioteker postncing37,47. DNA-koncentrationer blev beregnet, og prøverne blev analyseret ved hjælp af chip-baseret kapillær elektroforese for at bekræfte vellykket bibliotek bygger (Figur 4A), som er klar til høj-throughput sekventering.

DNA-biblioteker blev sekventeret af næste generation sekventering. En enkelt-end, 50 cyklus løb blev udført, hvilket gav 30 millioner høj kvalitet læser / prøve giver 62,5-fold dækning af Transposon biblioteket. Transposon vejkryds (læser) blev kortlagt til reference genom48, ved hjælp af kommercielt tilgængelige bioinformatik analyse software. Antallet af læsninger på hvert indsætningssted i inputprøverne (-) colistinkontroltilstand blev sammenlignet med antallet af aflæsninger i outputprøverne, (+) colistin eksperimentel tilstand, og der blev beregnet fitnessscore for hvert indsætningssted. Fitnessscoren blev derefter grupperet efter gen. Gener, der viste reducerede scorer, når biblioteket blev dyrket i nærvær af colistin i forhold til inputprøverne, blev anset for at være egnethedsdeterminanter for A. baumannii overlevelse ved subinhibitory koncentrationer af colistin. For eksempel var transponeringer i PmrAB-systemet for to komponenter til stede i inputprøven, men blev ikke fundet i outputprøven. PmrAB regulerer direkte udtrykket pmrC, som overfører fosforethanolamin til lipid A for at neutralisere ladningen på celleoverfladen12,31. Neutralisering af bakteriel overfladeladning menes at reducere det elektrostatiske potentiale, der kræves for colistin-medieret drab. Identifikation af forarmede gener, der vides at bidrage til resistensfenotype valideret metoden.

Figure 1
Figur 1: Skematisk af transposon mutant bibliotek konstruktion. (A) Bakteriel bøjning. "Donor"-stammen, som koder for gennemførelsesmaskineriet, blev blandet med "recipient"-stammen. Blandingen blev spottet på LB agar plader og lov til at parre sig i 1 h.(B)Generation af Transposon bibliotek. Den plasmid, der transporterede gennemførelsesmaskineriet, blev overført fra "donorstammen" til "recipient"-stammen, og transponen blev tilfældigt indsat i hele genomet af "recipient"-stammen. cC) Valg. Resulterende celler blev belagt på agar plader suppleret med kanamycin at vælge for transposon indsættelse mutanter. DD) Poolet bibliotek. Kolonier blev skrabet fra plader, resuspended i LB og samlet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative bakterielle bøjningsresultater og et skematisk colistin Tn-seq-eksperiment. aA) Repræsentativ kanamycin-markeringsplade. Pladen er opdelt i fem lige store sektioner. Blå prikker repræsenterer kolonitælling til estimering af A. baumannii transposon indsættelsese mutanter. Mindst tre separate plader blev optalt til beregning af det endelige skøn. b) Identifikation af egnethedsfaktorer ved koncentrationerne af subinhibitory colistin. Det samlede transponeringsbibliotek blev dyrket til logaritmisk vækstfase enten i fravær (kontrol) eller i tilstedeværelse (eksperimentel) af colistin. Når kulturerne nåede passende optisk tæthed, cellerne blev pelleteret og gDNA blev udvundet fra hver prøve. Hver betingelse blev testet i to eksemplarer for i alt fire prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Rutediagram over DNA-ampliconbiblioteket bygger for massiv parallel sekvensering og repræsentativ skåret gDNA. (A) Tn-seq DNA bibliotek bygge skematisk. Efter ekstraktionen var gDNA fragmenteret via mekanisk klipning. Terminal deoxynucleotidyl transferase blev brugt til at tilføje en poly-C hale til 3 'enden af fragmenteret DNA før PCR forstærkning af transposon-genom kryds og stregkode tilføjelse. (B) 1% agarose gel af uhørt og skåret A. baumannii mutant biblioteker efter gDNA klipning trin. 1 Kb stigen blev brugt som dna-markør. Sheared gDNA smøre primært spænder mellem ~ 100 og 500 base par. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Resultater af repræsentativ kvalitetskontrol (QC) og kort over den plasmid, der bærer gennemførelsesgenerene. (A) QC spor for en DNA-bibliotek bygge. Der er et højdepunkt på ~ 350 base par, hvilket indikerer en vellykket bibliotek bygge. Hvis der blev fundet noget større DNA i QC-resultaterne, kan prøverne renses yderligere for at fjerne store DNA-fragmenter. b) Plasmid pJNW684 består af en Himar1 mariner transposon (grøn) med en kanamycin modstand kassette (lilla) for mutant udvælgelse, en genkodning af den hyperaktive mariner Himar1 C9 transposase (rød) under kontrol af en A. baumannii 17978 specifik promotor (blå), et ampicillinresistensgen (bla, orange) og en RP4/oriT/oriR6K-betinget oprindelse af replikation (gul). Klik her for at se en større version af dette tal.

Reaktion Installationsprogrammet Betingelser
Poly-C reaktion 30 μL skåret gDNA
2,5 μL på 9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP
10 μL 5X Terminal deoxynucleotidyl transferase (Tdt) reaktionsbuffer
1,25 μL rTdt
6,25 μL vand til 50 μL		 Inkuber ved 37ºC i 1 time
PCR 1 23 μL 3'-poly-C renset DNA (hele prøven fra tidligere trin)
10 μL 10x high-fidelity DNA polymerase reaktion mix
2 μL 10 mM dNTPs
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 510 biotin
3 μL 30 μM olj 376
0,5 μL high-fidelity DNA polymerase
8,5 μL rent vand til 50 μL i alt		 1 cyklus: 2 min 94 ºC
15 cyklusser: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 min 68 ºC
1 cyklus: 4 min 68 ºC
Hold: ∞ 4 ºC
PCR 2 DNA-bundet perler fra tidligere trin
10 μL 10x high-fidelity DNA polymerase reaktion mix
2 μL 10 mM dNTP
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 511
1 μL 30 μM stregkodeprimer (tabel 2)
0,5 μL high-fidelity DNA polymerase
33,5 μL rent vand til 50 μL		 1 cyklus: 2 min 94 ºC
15 cyklusser: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 min 68 ºC
1 cyklus: 4 min 68 ºC
Hold: ∞ 4 ºC

Tabel 1: Opstilling af reaktion. Opsætning og betingelser for poly-C-, PCR 1- og PCR 2-reaktioner.

Formål Navn Sekvens
Glødeblade til transposon olj510-Biotin Biotin-GATGGCCTTTTTGCGTTTCTACCTGCAGGGCG
Glødeblade til poly-C hale olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGG
GGGGGGGGGGGG
Indlejret til Transposon + P5-adapter:
P5 capture site - P5 sekventering site- N5-Tn		 olj511 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTT
CCCTACACGACCCTCTTCCGATCTNNNNGGGGACTTA
TCATCCAACCTGTTAG
Indlejret til olj376: P7-sekventeringssted
– stregkode XXXXXX - P7 fange site)		 Bc ## CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxXXGTGA
CTGGAGTTCAGACGTGTG
se tabel 2 for specifikke stregkoder***

Tabel 2: PCR-forstærkningsprimere. PCR forstærkning primere, der anvendes i protokollen til at forstærke transposon vejkryds. Formålet med hver er angivet i den første kolonne.

Primer Læse Stregkode Sekvens
KR1 ATCACG CGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGT
GATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
kr. CGATGT ACATCG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAC
ATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
kr. TTAGGC GCCTAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCC
TAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. TGACCA TGGTCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
GGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. ACAGTG CACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. GCCAAT ATTGGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
TTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
kr. CAGATC GATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
kr. ACTTGA TCAAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
kr. GATCAG CTGATC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. TAGCTT AAGCTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
AAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. GGCTAC GtagCC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. CTTGTA TACAAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
ACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. AGTCAA TTGACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. AGTTCC GGAACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. ATGTCA TGACAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. CCGTCC GGACGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. GTAGAG CTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. GTCCGC GCGGAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. GTGAAA TTTCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. GTGGCC GGCCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. GTTTCG CGAAAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. CGTACG CGTACG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. K GAGTGG CCACTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
CACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. GGTAGC GCTACC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. ACTGAT ATCAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. ATGAGC GCTCAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. ATTCCT AGGAAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
GGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. CAAAAG CTTTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. CAACTA TAGTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
Kr. 30 CACCGG CCGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CCGGTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
Kr. 39 CTATAC GTATAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTATAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. CTCAGA TCTGAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTGAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. TAATCG CGATTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
GATTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. TACAGC GCTGTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTGTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. TATAAT ATTATA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATTATAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. TCATTC GAATGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GAATGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. TCCCGA TCGGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCGGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. TCGAAG CTTCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
KR. TCGGCA TGCCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TGCCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG

Tabel 3: Stregkodeprimere. Stregkodeprimere bruges i det andet PCR-trin til at forstærke transpononkrydsene, mens du tilføjer et P7-sekventeringssted og stregkoder til ampliconen. Ikke alle stregkodeprimere er nødvendige for at generere et bibliotek. Kun stregkodeprimere til antallet af prøver er påkrævet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A. baumannii er en ny trussel mod den globale folkesundhed på grund af den hurtige erhvervelse af AMR mod "last-line" terapi, såsom colistin10,11,12,23,24,30,31. I de seneste årtier har Tn-seq spillet en afgørende rolle i at belyse genotype-fænotype interaktioner på tværs af mange bakteriearter og udvide vores forståelse af bakteriel genetik34,,35,42,43. Tn-seq protokoller har været medvirkende til at identificere væsentlige gener i forskellige bakteriearter såsom Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, det parodontale patogen Porphyromonas gingivalis, og selv Mycobacterium tuberkulose37,49,50,51. Ud over identifikation af væsentlige gener, Tn-seq er blevet brugt til at identificere antibiotikaresistens gener i Pseudomonas aeruginosa, flere betinget væsentlige gener i Salmonella typhimurium, og talrige genotype-fænotype relationer i Streptococcus pneumoniae52,53,54. For nylig, transposon sekventering af Vibrio kolerae blev ansat i spædbarn kanin model af Kolera til at identificere gener, der er vigtige for in vivo fitness under infektion47. Disse undersøgelser viser alsidigheden af Tn-seq, da det kan udnyttes til både in vitro og in vivo undersøgelser.

Den største fordel ved Tn-seq i forhold til andre metoder, såsom microarray teknologier, 2D gel elektroforese, og qPCR, er, at det ikke kræver forudgående kendskab til genomet eller genomiske oplysninger55. Transposon mutagenese kombineret med massiv parallel sekvensering gør det derfor muligt at studere kendte gener og genomer samt opdagelsen af nye genetiske interaktioner. Her har vi præsenteret en omfattende metode til at generere en meget tæt transposon mutant bibliotek i A. baumannii at identificere faktorer, der er afgørende for bakteriel fitness, når de udsættes for subinhibitory koncentrationer af colistin. Den beskrevne metode er også blevet anvendt med succes i E. coli (ikke-offentliggjorte data), hvilket viser, at systemet er modtageligt for at udføre Tn-seq-analyse i andre Gram-negative patogener, herunder Enterobakterier.

Brug mariner transposons for insertional mutagenesis har flere fordele. Transposon familien stammer fra eukaryote værter og har været meget brugt til at generere mættende mutant biblioteker i forskellige bakteriepopulationer. Søfarende transposons er værtsafhængige , hvilket betyder , at der kan opnås stabile tilfældige indsættelser uden specifikke værtsfaktorer40,41. Derudover har søfarende transposons et defineret antal indsætningshændelser, fordi de fortrinsvis indsætter i thymin-adenin ("TA") motiver, hvilket reducerer indskærning bias og fører til en mere robust statistiskanalyse 37,56,57,58.

Flere mariner-baseredeTn-seq metoder bruger MmeI begrænsning fordøjelsen til gDNA fragmentering32,42,43. Mens enzymatisk DNA fragmentering er en populær og vellykket metode, det tilføjer unødvendige skridt til proceduren og øger potentielle bias37. Disse teknikker kræver ikke blot store mængder råvarer, de kan også potentielt føre til ulige repræsentation af indføringssekvenser idownstream-analyser 37,59. Ligesom nogle andre metoder, der ikke er afhængige af MmeI nukleaseaktivitet 52,60,61, metoden skitseret heri er afhængig af mekanisk klipning til fragment gDNA, og TdT at tilføje en poly-C hale til 3 'ende af DNA fragmenter. Sammenlignet med enzymatiske DNA-fragmenterings- og adapterfugeringsmetoder kræver denne fremgangsmåde betydeligt mindre mængder start-DNA, samtidig med at den giver mere ensartede resultater, sænker også risikoen for DNA-krydskontaminering og reducerer prøvetab på grund af indespærring i etforseglet rør 37,59,62. Desuden giver denne metode længere sekventering af høj kvalitet af 50 nukleotider , som understøtter en mere effektiv og præcis kortlægning af sekvenser og en mere robustdownstream-analyse 37,59. Tilsætning af en syntetisk poly-C-hale ser bort fra potentielle udhæng, der kan opstå som følge af fragmentering, da denne metode er baseret på den eksogent tilsat poly-C-hale som genkendelsessted for den omvendte primer, som indeholder 16 dG-nukleotider i 3'ende,og en sekvens, der er specifik for næste generations sekvensering (f.eks. Illumina-sekvensering) ved 5' ende, til syntese47,59. Brugen af en syntetisk nukleotid hale udvider anvendelsen af denne metode til mange forskellige genomer uafhængigt af deres oprindelige indhold59. Efterfølgende forstærkes transponon-genomkryds ved hjælp af den poly-C specifikke primer37. Dette alternativ forenkler proceduren ved at eliminere behovet for dyre restriktionsenzymer, adapter ligation, dannelse af adapter dimers og gel rensning trin. Vi har yderligere optimeret protokollen til effektivt at generere meget mættet transposon indsættelse biblioteker i flere Gram-negative ESKAPE patogener, herunder Acinetobacter baumannii og kan bruges til at studere genetiske interaktioner under forskellige in vitro og in vivo betingelser10.

En begrænsning af Tn mutagenesis er det bygger på antibiotikaresistens markører for udvælgelse. Men mange Gram-negative ESKAPE patogener er multidrug eller omfattende resistente over for lægemidler, hvilket betyder, at brugeren kan være nødvendigt at udveksle resistenskassetten i henhold til det specifikke patogen af interesse. Desuden kan nogle kliniske isolater ikke gennemføres ved hjælp af den mariner-baserede transposon.

Et kritisk trin i protokollen er at beregne antallet af Tn mutanter til plade. Plating for mange kolonier vil resultere i en græsplæne, der kan komplicere downstream analyse. Hvis kolonierne er for tæt på eller rører, kan de tilføje uønsket selektivt pres på biblioteket, der kan resultere i artefakter. Ideelt set ville kolonier ikke være rørende og fordelt jævnt over pladen, som vist (Figur 2A). Omvendt, hvis for få kolonier er belagt, vil det være vanskeligt at isolere flere Tn indsættelser i hvert gen.

Det er også vigtigt at udføre de kontrolelementer, der er angivet i trin 2.18. Som anført i notatet i afsnit 3. 2, hverken "donor" eller "modtager" stamme bør vokse på plader suppleret med Ampicillin. Da eksogen DAP er nødvendig for vækst af "donor" stamme, enhver vækst vil indikere "modtager" stamme replikater pJNW684. Dette er et betydeligt problem, fordi hvis transposon ikke integreres i gDNA, sekventering læser vil kun kort til plasmid, ikke en integration site. I dette tilfælde vil eksperimentet sandsynligvis ikke give brugbare data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af finansiering fra National Institute of Health (Grant AI146829 til J.M.B.) og er taknemmeligt anerkendt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, I. M., Bal, A. M. New antibiotic agents in the pipeline and how they can help overcome microbial resistance. Virulence. 4 (2), 185-191 (2013).
  2. Holzheimer, R. G. Antibiotic induced endotoxin release and clinical sepsis: a review. Journal of Chemotherapy. 13 (1), Florence, Italy. Spec No 1 159-172 (2001).
  3. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). , (2019).
  4. Scholar, E. M., Pratt, W. B. The antimicrobial drugs. , Oxford University Press. New York. (2000).
  5. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  6. Henderson, J. C., et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annual Review of Microbiology. 70, 255-278 (2016).
  7. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  8. Raetz, C. R. H., Whitfield, C. Lipopolysaccharide Endotoxins. Annual Review of Biochemistry. 71 (1), 635-700 (2002).
  9. Kang, K. N., et al. Colistin heteroresistance in Enterobacter cloacae is regulated by PhoPQ-dependent 4-amino-4-deoxy- L -arabinose addition to lipid A. Molecular Microbiology. 111 (6), 1604-1616 (2019).
  10. Boll, J. M., et al. A penicillin-binding protein inhibits selection of colistin-resistant, lipooligosaccharide-deficient Acinetobacter baumannii. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (41), 6228-6237 (2016).
  11. Boll, J. M., et al. Reinforcing Lipid A Acylation on the Cell Surface of Acinetobacter baumannii Promotes Cationic Antimicrobial Peptide Resistance and Desiccation Survival. mBio. 6 (3), 00478 (2015).
  12. Arroyo, L. A., et al. The pmrCAB operon mediates polymyxin resistance in Acinetobacter baumannii ATCC 17978 and clinical isolates through phosphoethanolamine modification of lipid A. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (8), 3743-3751 (2011).
  13. Harris, T. L., et al. Small molecule downregulation of PmrAB reverses lipid A modification and breaks colistin resistance. ACS Chemical Biology. 9 (1), 122-127 (2014).
  14. Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiological Reviews. 56 (3), 395-411 (1992).
  15. Vaara, M. Polymyxins and their novel derivatives. Current Opinion in Microbiology. 13 (5), 574-581 (2010).
  16. Kassamali, Z., Rotschafer, J. C., Jones, R. N., Prince, R. A., Danziger, L. H. Polymyxins: wisdom does not always come with age. Clinical Infectious Diseases: An Official publication of the Infectious Diseases Society of America. 57 (6), 877-883 (2013).
  17. Ainsworth, G. C., Brown, A. M., Brownlee, G. Aerosporin, an antibiotic produced by Bacillus aerosporus Greer. Nature. 159 (4060), 263 (1947).
  18. Benedict, R. G., Langlykke, A. F. Antibiotic activity of Bacillus polymyxa. Journal of Bacteriology. 54 (1), 24 (1947).
  19. Stansly, P. G., Shepherd, R. G., White, H. J. Polymyxin: a new chemotherapeutic agent. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital. 81 (1), 43-54 (1947).
  20. Hermsen, E. D., Sullivan, C. J., Rotschafer, J. C. Polymyxins: pharmacology, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical applications. Infectious Disease Clinics of North America. 17 (3), 545-562 (2003).
  21. Pedersen, M. F., Pedersen, J. F., Adsen, P. O. A clinical and experimental comparative study of sodium colistimethate and polymyxin B sulfate. Investigative Urology. 9 (3), 234-237 (1971).
  22. Falagas, M. E., Bliziotis, I. A. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era. International Journal of Antimicrobial Agents. 29 (6), 630-636 (2007).
  23. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 21 (3), 538-582 (2008).
  24. Beceiro, A., Tomás, M., Bou, G. Antimicrobial resistance and virulence: a successful or deleterious association in the bacterial world. Clinical Microbiology Reviews. 26 (2), 185-230 (2013).
  25. Eliopoulos, G. M., Maragakis, L. L., Perl, T. M. Acinetobacter baumannii: Epidemiology, Antimicrobial Resistance, and Treatment Options. Clinical Infectious Diseases. 46 (8), 1254-1263 (2008).
  26. Lee, A., Nolan, A., Watson, J., Tristem, M. Identification of an ancient endogenous retrovirus, predating the divergence of the placental mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1626), 20120503 (2013).
  27. Moffatt, J. H., et al. Colistin Resistance in Acinetobacter baumannii Is Mediated by Complete Loss of Lipopolysaccharide Production. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 4971-4977 (2010).
  28. Cai, Y., Chai, D., Wang, R., Liang, B., Bai, N. Colistin resistance of Acinetobacter baumannii: clinical reports, mechanisms and antimicrobial strategies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (7), 1607-1615 (2012).
  29. Da Silva, G., Domingues, S. Interplay between Colistin Resistance, Virulence and Fitness in Acinetobacter baumannii. Antibiotics. 6 (4), 28 (2017).
  30. Chin, C. -Y., Gregg, K. A., Napier, B. A., Ernst, R. K., Weiss, D. S. A PmrB-Regulated Deacetylase Required for Lipid A Modification and Polymyxin Resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7911-7914 (2015).
  31. Beceiro, A., et al. Phosphoethanolamine modification of lipid A in colistin-resistant variants of Acinetobacter baumannii mediated by the pmrAB two-component regulatory system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3370-3379 (2011).
  32. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-Wide Fitness and Genetic Interactions Determined by Tn-seq, a High-Throughput Massively Parallel Sequencing Method for Microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36, 1-24 (2015).
  33. Kwon, Y. M., Ricke, S. C., Mandal, R. K. Transposon sequencing: methods and expanding applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (1), 31-43 (2016).
  34. Yamaichi, Y., Dörr, T. Transposon Insertion Site Sequencing for Synthetic Lethal Screening. Methods in Molecular Biology. 1624, Clifton, N.J. 39-49 (2017).
  35. Goodman, A. L., et al. Identifying Genetic Determinants Needed to Establish a Human Gut Symbiont in Its Habitat. Cell Host & Microbe. 6 (3), 279-289 (2009).
  36. Wang, N., Ozer, E. A., Mandel, M. J., Hauser, A. R. Genome-Wide Identification of Acinetobacter baumannii Genes Necessary for Persistence in the Lung. mBio. 5 (3), 01163 (2014).
  37. Klein, B. A., et al. Identification of essential genes of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. BMC Genomics. 13 (1), 578 (2012).
  38. Ferrieres, L., et al. Silent Mischief: Bacteriophage Mu Insertions Contaminate Products of Escherichia coli Random Mutagenesis Performed Using Suicidal Transposon Delivery Plasmids Mobilized by Broad-Host-Range RP4 Conjugative Machinery. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6418-6427 (2010).
  39. Lim, L. M., et al. Resurgence of Colistin: A Review of Resistance, Toxicity, Pharmacodynamics, and Dosing. Pharmacotherapy. 30 (12), 1279-1291 (2010).
  40. Lampe, D. J., Churchill, M. E., Robertson, H. M. A purified mariner transposase is sufficient to mediate transposition in vitro. The EMBO Journal. 15 (19), 5470-5479 (1996).
  41. Mazurkiewicz, P., Tang, C. M., Boone, C., Holden, D. W. Signature-tagged mutagenesis: barcoding mutants for genome-wide screens. Nature Reviews. Genetics. 7 (12), 929-939 (2006).
  42. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nature Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  43. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews. Microbiology. 11 (7), 3033 (2013).
  44. Liu, H., Bouillaut, L., Sonenshein, A. L., Melville, S. B. Use of a Mariner-Based Transposon Mutagenesis System To Isolate Clostridium perfringens Mutants Deficient in Gliding Motility. Journal of Bacteriology. 195 (3), 629-636 (2013).
  45. Singer, J. T., Finnerty, W. R. Insertional specificity of transposon Tn5 in Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 157 (2), 607-611 (1984).
  46. Subashchandrabose, S., et al. Acinetobacter baumannii Genes Required for Bacterial Survival during Bloodstream Infection. mSphere. 1 (1), 13-15 (2015).
  47. Shull, L. M., Camilli, A. Transposon Sequencing of Vibrio cholerae in the Infant Rabbit Model of Cholera. Vibrio Cholerae. 1839, 103-116 (2018).
  48. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes & Development. 21 (5), 601-614 (2007).
  49. Stahl, M., Stintzi, A. Identification of essential genes in C. jejuni genome highlights hyper-variable plasticity regions. Functional & Integrative Genomics. 11 (2), 241-257 (2011).
  50. Chaudhuri, R. R., et al. Comprehensive identification of essential Staphylococcus aureus genes using Transposon-Mediated Differential Hybridisation (TMDH). BMC Genomics. 10 (1), 291 (2009).
  51. Griffin, J. E., et al. High-resolution phenotypic profiling defines genes essential for mycobacterial growth and cholesterol catabolism. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002251 (2011).
  52. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. mBio. 2 (1), 00315 (2011).
  53. Khatiwara, A., et al. Genome scanning for conditionally essential genes in Salmonella enterica Serotype Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology. 78 (9), 3098-3107 (2012).
  54. van Opijnen, T., Camilli, A. A fine scale phenotype-genotype virulence map of a bacterial pathogen. Genome Research. 22 (12), 2541-2551 (2012).
  55. Hurd, P. J., Nelson, C. J. Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (3), 174-183 (2009).
  56. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  57. Perry, B. J., Yost, C. K. Construction of a mariner-based transposon vector for use in insertion sequence mutagenesis in selected members of the Rhizobiaceae. BMC Microbiology. 14 (1), 298 (2014).
  58. Plasterk, R. H. A., Izsvák, Z., Ivics, Z. Resident aliens: the Tc1/ mariner superfamily of transposable elements. Trends in Genetics. 15 (8), 326-332 (1999).
  59. Lazinski, D. W., Camilli, A. Homopolymer tail-mediated ligation PCR: a streamlined and highly efficient method for DNA cloning and library construction. BioTechniques. 54 (1), (2013).
  60. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  61. Langridge, G. C., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  62. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved Protocols for the Illumina Genome Analyzer Sequencing System. Current Protocols in Human Genetics. 62 (1), (2009).

Tags

Biologi Transposon høj-throughput sekventering Gram-negativ Acinetobacter baumannii colistin ESKAPE
Generering Transposon Indsættelse Biblioteker i Gram-negative bakterier til høj-throughput sekventering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll,… More

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter