Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Создание транспосонных библиотек в грам-отрицательных бактериях для секвенирования высокой пропускной способности

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

Мы описываем метод генерации насыщенных библиотек транспосонных мутантов в грам-отрицательных бактериях и последующую подготовку библиотек ДНК-ампликона для секвенирования высокой пропускной способности. В качестве примера мы ориентируемся на патоген ESKAPE, Acinetobacter baumannii, но этот протокол подотменен широкому кругу грам-отрицательных организмов.

Abstract

Транспосон секвенирования (Tn-seq) является мощным методом, который сочетает в себе транспосон мутагенез и массивные параллельные секвенирования для выявления генов и путей, которые способствуют бактериальной пригодности в широком диапазоне условий окружающей среды. Приложения Tn-seq обширны и позволяют не только изутовить генотипно-фенотипные отношения на уровне организма, но и на уровне населения, сообщества и систем. Грам-отрицательные бактерии тесно связаны с фенотипами устойчивости к противомикробным препаратам, что привело к увеличению числа случаев отказа от лечения антибиотиками. Устойчивость к противомикробным препаратам определяется как бактериальный рост в присутствии в противном случае смертельных антибиотиков. Антимикробный колистин «последней линии» используется для лечения грамотрицательных бактериальных инфекций. Тем не менее, несколько грамотрицательных патогенов, в том числе Acinetobacter baumannii может развиться устойчивость к колистину через ряд молекулярных механизмов, некоторые из которых были охарактеризованы с помощью Tn-seq. Кроме того, пути трансдукции сигнала, которые регулируют устойчивость к колистину, различаются в пределах грам-отрицательных бактерий. Здесь мы предлагаем эффективный метод транспосонного мутагенеза в A. baumannii, который упрощает генерацию насыщающих транспосонной библиотеки вставки и строительства библиотеки ампликона, устраняя необходимость ограничения ферментов, перевязки адаптера и очистки геля. Методы, описанные в этом позволит углубленный анализ молекулярных детерминантов, которые способствуют A. baumannii фитнес, когда оспаривается с колистином. Протокол также применим к другим грамотрицательных патогенам ESKAPE, которые в первую очередь связаны с лекарственно устойчивыми больничнымиинфекциями.

Introduction

Открытие антибиотиков, несомненно, является одним из наиболее эффективных событий,th связанных со здоровьем 20-го века. Антибиотики не только быстро разрешают серьезные бактериальные инфекции, но и играют ключевую роль в современной медицине. Основные операции, трансплантации и достижения в области неонатальной медицины и химиотерапии оставляют пациентов восприимчивыми к опасным для жизни инфекциям, и этиметоды лечения не были бы возможны без антибиотиков 1,,2. Однако быстрое развитие и распространение устойчивости к антибиотикам среди патогенных микроорганизмов человека значительно снизило эффективность всех клинически важных классов антибиотиков3. Многие бактериальные инфекции, которые когда-то были легко очищены с помощью антибиотиков лечения, больше не реагировать на классические протоколы лечения, вызывая серьезную угрозу для глобальногообщественного здравоохранения 1. Устойчивость к противомикробным препаратам (AMR) является, где бактериальные клетки растут в противном случае смертельные концентрации антибиотиков, независимо отпродолжительности лечения 4,5. Существует настоятельная необходимость понимания молекулярных и биохимических факторов, регулирующих АМР, которые помогут направлять развитие альтернативных противомикробных препаратов. В частности, патогены ESKAPE являются проблематичными в клинических условиях и связаны с обширным AMR. К ним относятся Enterococcus faecium, S taphylococcusaureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, P seudomonasaeruginosa и E nterobacter spp. В то время как несколько механизмов способствуют АМР в патогенах ESKAPE, последние четыре организма являются грам-отрицательными.

Грамотрицающие бактерии собирают определяющую внешнюю мембрану, которая защищает их от неблагоприятных условий окружающей среды. Внешняя мембрана служит проницаемым барьером для ограничения проникновения токсичных молекул, таких как антибиотики, в клетку. В отличие от других биологических мембран, внешняя мембрана асимметрична. Внешняя листовка обогащена поверхностно открытым липополисахаридом, в то время как внутренняя листовка представляет собой смесь фосфолипидов6. Молекулы липополисахарида закреплены на внешней мембране сохраненным липидом A moiety, встроенным в липидный билейлер7. Канонический липид домен Escherichia coli lipopolysaccharide необходим для роста большинства грамотрицательных бактерий и синтезируется девятишаговым энзиматическимпутем,который является одним из самых фундаментальных и сохранившихся путей в Грам-отрицательныхорганизмах 6,,7,8.

Полимиксины являются катионическими антимикробными пептидами, которые нацелены на липидный домен липополисахарид, чтобы возмущать внешнюю мембрану и окисить клетку. Электростатическое взаимодействие между положительно заряженными остатками полимиксином и отрицательно заряженными липидными фосфатными группами нарушает бактериальную клеточную мембрану, что вконечном итоге приводит к гибели клеток 9,,10,,11,,12,,13. Колистин (полимиксин E) является последним курортом противомикробных препаратов, используемых для лечения инфекций, вызванных множественной лекарственной устойчивостью Грам-отрицательных нозокомиальных патогенов, таких как Acinetobacter baumannii14,15,16. Впервые обнаружены в 1947 году, полимиксины производятся почвенными бактериями, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Полимиксины были предписаны для лечения грамотрицательных инфекций в течение многих лет, прежде чем их клиническое использование было ограничено из-за сообщений о значительной нефро-и нейротоксичности 20,21.

A. baumannii является нозокомиальным грам-отрицательным патогеном, который резко увеличил заболеваемость и смертность исходов пациентов за последниедесятилетия 22. То, что когда-то рассматривалось как патоген с низкой угрозой, в настоящее время представляет значительный риск для больничной инфекции во всем мире из-за его невероятной способности приобретать АМР ивысокого риска эпидемии 23,,24. На долю A. baumannii приходится более 10% нозокомиальных инфекций в Соединенных Штатах. Болезнь проявляется как пневмония, бактериемия, инфекции мочевыводящих путей, инфекции кожи и мягких тканей, менингит и эндокардит25. Варианты лечения инфекций A. baumannii сократились из-за устойчивости почти ко всем классам антибиотиков, включая β-лактамы, фторхинолоны, тетрациклин и аминогликозиды23,24. Распространенность множественной лекарственной устойчивостью, широко лекарственно-устойчивой и пан-лекарственной устойчивостью A. baumannii изолирует привело к возрождению лечения колистином, который считается одним из немногих оставшихся терапевтических вариантов по-прежнему эффективны против множественной лекарственной устойчивостью A. baumannii. Однако повышенная устойчивость к колистину среди изолятов A. baumannii еще больше усилиласвою угрозу глобальному общественному здравоохранению 10,,11,,12,,13,,27,,30,,31.

Недавние достижения в технологиях секвенирования с высокой пропускной способностью, таких как транспосонное секвенирование (Tn-seq), предоставили важные инструменты для продвижения нашего понимания бактериальной пригодности in vitro и in vivo. Tn-seq является мощным инструментом, который может быть использован для изучения генотипно-фенотипных взаимодействий у бактерий. Tn-seq широко применим к бактериальным патогенам, где он сочетает в себе традиционный транспозонный мутагенез с массивным параллельным секвенированием для быстрого вставки карты сайтов, которые могут быть использованы для связи мутаций ДНК с фенотипическими вариантамив масштабах генома 32,33,34,35. Хотя методы транспозона мутагенез были ранее описаны, общие шаги аналогичны33. Во-первых, библиотека вставки генерируется с использованием транспосонного мутагенеза, где каждая бактериальная клетка в популяции ограничивается одной транспосонной вставкой в геномную ДНК (гДНК). После мутагенеза объединяются отдельные мутанты. gDNA извлекается из пула мутантов вставки, а транспосонные соединения усиливаются и подвергаются секвенированию высокой пропускной способности. Считывает представляют места вставки, которые можно отобразить к геному. Транспосон вставки, которые уменьшают фитнес быстро выпадают из населения, в то время как полезные вставки обогащаются. Tn-seq сыграл важную роль для продвижения нашего понимания того, как гены влияют на бактериальную пригодность встрессе 33.

Система транспосона моряка Himar1, закодированная в pJNW684, была специально построена и оптимизирована для транспозонного мутагенеза. Она включает в себя маринер-семейныйтранспосон, обрамляющий ген резистентности к канамицину, который используется для выбора транспосонных мутантов в A. baumannii. Он также кодирует A. baumannii конкретных промоутер, что диски выражение транспозазы кодирования гена36. Морскойтранспосон также содержит два трансляционных терминатора вниз по течению гена резистентности канамицина, который предотвращает чтение вниз по течению вставки37. pJNW684 также несет RP4/oriT/oriR6K-условное происхождение репликации, которая требует гена спир, внесенного донорским штаммом, чтобывоспроизвести 38. В отсутствие гена «Спир» вектор pJNW684, несущий транспозиционное оборудование, не сможет воспроизвести в штамме получателя A. baumannii 10,,36,,38. Поэтому во время бактериального спряжения в геном реципиента вставляется только транспозон без фоновой вставки плазмиды, которая несет в себе ген транспозазы. Это важно, потому что потеря активности транспозазы вместе с плазмидой приводит к одному, стабильному событию транспозиции, которое предотвращает перемещение транспозона в разные места, как только он вставляется в геном получателя.

pJNW648 также был протестирован на активность в другом грам-негативном организме, кишечной палочке. Успешная сборка насыщенной библиотеки Tn-seq в штамме кишечной палочки W3110 показала, что система может выполнять мутагенез в широком диапазоне патогенов, включая энтеробактерии. Кроме того, A. baumannii конкретных промоутер, что диски транспозазы выражение можно быстро обмениваться с видом конкретных промоутер. Наконец, ген резистентности к канамицину можно обменять на другие кассеты сопротивления, в зависимости от фенотипа AMR изучаемого организма.

Одним из факторов, способствующих устойчивости колистина в A. baumannii является введения недостаточных доз, где бактерии подвергаются селективного давления на нелетальныхуровнях 39. Несколько докладов показали, что субибибиторные концентрации противомикробных препаратов может вызвать регулируемые реакции, которые изменяют физиологиюклеток, чтобы уменьшить восприимчивость всей бактериальной популяции 11,,12,,30,,31. Используя Tn-seq, мы обнаружили факторы, которые регулируют устойчивость колистина в штамме A. baumannii ATCC 17978 послевоздействия ингибирующей 10 и субибибиторных концентраций колистина. В этом примере подробно Tn-seq метод, который упрощает строительство и обогащение насыщенной библиотеки транспозонных мутантов с использованием морякаоснове семьитранспозонов 40,41. В то время как несколько протоколов Tn-seq генерируют 20,000 - 100,000мутантов 35,42,43,44,45,46, протокол, описанный в настоящем может быстро генерировать транспосон библиотеки 400000 й мутантов, что примерно приравнивается к транспосонной вставке каждые 10-базовые пары в A. baumannii10. Кроме того, размер библиотеки может быть увеличен без значительных дополнительных усилий. Этот метод также устраняет необходимость ограничения эндонуклейсов, перевязки адаптера и очистки геля, что может уменьшить окончательное разнообразие библиотек.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Препарат бактериального штамма

  1. Полоса "донорский" штамм (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Таблицаматериалов ) для изолированных колоний на Лурия-Бертани агар дополнен 600 ЗМ диаминопимеловой кислоты (DAP), 100 мг/л ампициллина и 25 мг/л канамицина. Инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию. Используя одну изолированную колонию, привить 50 мл бульона Лурия (LB) в дополнение к 600 МКМ DAP, 100 мг/л ампициллина и 25 мг/л канамицина в колбе 250 мл Эрленмейера и обозначить его как "донор".
  2. Streak "реципиент" штамм (A. baumannii штамм ATCC 17978, Таблицаматериалов ) для изолированных колоний на Лурия-Бертани агар. Инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию. Используя одну изолированную колонию, прививка 50 мл LB в 250 мл Erlenmeyer колбу и пометить его как "получатель".
  3. Инкубировать обе культуры ("донор" и "реципиент") на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской.

2. Бактериальное спаривание

  1. Передача ночных культур на 50 мл конических труб.
  2. Пеллет как реципиента и донорской культуры с использованием центрифугации на 5000 х г в течение 7 мин.
  3. Откажитесь от супернатанта и повторно смахните гранулы штамма «донор» в 35 мл LB, дополненном DAP, чтобы смыть остаточные антибиотики.
  4. Пеллет "донор" штамм клеток с использованием центрифугации на 5000 х г в течение 7 мин.
  5. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелайте гранулы штамма «донор» в 4,5 мл LB, дополненном DAP. Используйте серологическую пипетут 10 мл.
  6. Передача повторного "донорского" штамма в "реципиентную" трубку штамма, которая содержит гранулированное "реципиентное" клеток. Используйте тот же 10 мл серологической пипетки из шага 2.5, чтобы смешать культуры. Немедленно перейти к следующему шагу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем окончательной подвески должен быть 5 мл.
  7. Распределив подвеску спаривания как отдельные капли 100 л на пластинах LB agar, дополненных DAP (5-7 капель на тарелку)(рисунок 1A).
  8. Инкубационые пластины при комнатной температуре в течение 30 мин.
  9. Не нарушая капель, тщательно перенесите пластины в инкубатор 37 градусов по Цельсию и позвольте культурам спариваться в течение 1ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационые периоды, превышающие 1 ч, рискуют стать поколениями братов-мутантов.
  10. После инкубации добавьте 1,5 мл ЛБ на каждую тарелку и урожай, повторно высасыв бактерии из пластин. Используйте микропипюту 1 мл для повторного получения. Окончательный объем должен быть примерно 12 - 15 мл.
  11. Смешайте собранные клетки в конической трубке 50 мл.
  12. Пеллетные матированные клетки с использованием центрифугации на 5000 х г в течение 7 мин.
  13. Отбросьте сверхнатантные и повторное течение клеток в 50 мл LB, чтобы удалить остаточные DAP.
  14. Пеллет спаривания с использованием центрифуги при 5000 х г в течение 7 мин.
  15. Повторите шаг мытья (шаги 2.13 и 2.14).
  16. Используя серологический пипетку 10 мл, повторно усыпляйте гранулы в 10 мл LB, дополненные 25% глицеролом.
  17. Используя промытые клетки, сделайте пять серийных разбавлений в бульоне LB (1:10, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Распространение 100 йл каждого разбавления на 4 различных пластин с использованием стерильных стеклянных бусин: Лурия-Бертани агар дополнен канамицин, агар дополняется ампициллин, агар дополняется DAP и агар только.
  19. Инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию на ночь.
  20. Aliquot оставшиеся спаривания в 1 мл aliquots и хранить при -80 градусов по Цельсию.

3. Определить соответствующее разбавление транспосонной библиотеки

  1. Запись колоний-формирующих единиц (CFU) от ночных пластин.
  2. Изображение пластины с подсчитывается колоний для каждого различных условий пластины (Рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: И "донор" и "реципиент" штаммы должны расти на агар пластин, дополненных DAP, так что большинство поваленной разбавления даст газон. Только "реципиент" штамм может расти на агарных пластин. Ни «донор», ни штамм «реципиент» не могут расти на агаровых пластинах, дополненных ампициллином, поэтому не должно быть ни одного/минимального роста. Только целевые клетки штамма, кодирующие транспосонную вставку, могут расти на агарных пластинах, дополненных канамицином. Колонии должны варьироваться в размерах, что указывает на транспосон вставки в генах, которые способствуют фитнес на агар дополняется канамицин.
  3. Рассчитайте количество транспосонных мутантов в замороженном спаривание, подсчитав количество колоний на пластинах LB agar, дополненных канамицином.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для генома А. бауманни (примерно 4 Мбит/с) цель состояла в том, чтобы получить около 400 000 колоний для создания библиотеки мутантов высокого разрешения (примерно одна транспосонная вставка/10 базовых пар). Однако это число должно быть оптимизировано в зависимости от размера генома целевого вида).

4. Поколение окончательной библиотеки бактериальных мутантов

  1. Оттепель aliquot замороженных спаривания на льду.
  2. Плита спаривания на 150 мм Лурия-Бертани агар пластины дополнены канамицин на основе CFUs рассчитывается в шаге 3.1. Отрегулируйте том с LB для того чтобы дать 13.333 колонии в 150 L перед покрытием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CFU рассчитывать здесь было установлено, что около 105 CFU / МЛ, так что объем спаривания был скорректирован, чтобы получить 13333 колоний на тарелку, поскольку это обеспечит оптимальное количество колоний на 30 пластин для высокого разрешения мутант библиотеки без переполненности пластин.
  3. Используйте стерильные стеклянные бусины для распространения 150 МКЛ разбавления на тарелку на 30 х 150 мм Лурия-Бертани агар пластины дополнены канамицин для получения 400000 колоний (Рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные стержни или любой стерильный инструмент распространения (т.е. стеклянные бусы) могут быть использованы для распространения бактерий на тарелках.
  4. Утилизировать использованную трубку, содержащую избыток спаривания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Циклы замораживания/оттепели добавляют селективное давление на бактериальную культуру, что может исказить результаты эксперимента Tn-seq. Используйте свежий aliquot каждый раз.
  5. Инкубационые пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 14 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации оптимизировано для предотвращения разрастания (колонии трогательно). Предлагается минимизировать рост за счет сокращения инкубациония.

5. Оценка плотности библиотек и объединение для хранения

  1. Подсчитайте CFUs на каждой пластине, чтобы оценить общее количество мутантов в библиотеке транспосонов. Подсчитайте 20% из по крайней мере 3 плит для того чтобы обусловить оценку отсчета колонии для всей группы плит(рисунок 2A). Убедитесь, что колонии не касаются другой колонии.
  2. После расчета предполагаемой урожайности колонии, добавить 3-5 мл LB (или более, если это необходимо) для каждой пластины и соскребать бактерии с помощью стерильного инструмента соскабливания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные инокулирующие петли были использованы для эффективного соскабливания пластин.
  3. Бассейн бактериальных суспензий от всех пластин в 50 мл конических труб(рисунок 1D). Это потребует нескольких 50 мл конических труб, по крайней мере 3.
  4. Пеллет объединили бактериальную суспензию с использованием центрифугации при 5000 х г в течение 7 мин.
  5. Откажитесь от супернатантных и повторно гранул в 5 мл LB дополняется 30% глицерол.
  6. Aliquot 1 мл транспозальной библиотеки в криовиалы и хранить при -80 градусов по Цельсию.

6. Выявление факторов, регулирующих устойчивость к колистину у А. бауманни

  1. Подготовка 4 х 250 мл Erlenmeyer колбы с каждым из которых содержит 50 мл бульона LB и этикетки, как (Рисунок 2B)
    1. A. baumannii штамм ATCC 17978 Tn-seq библиотека; (-) colistin_1
    2. A. baumannii штамм ATCC 17978 Tn-seq библиотека; (-) colistin_2
    3. A. baumannii штамм ATCC 17978 Tn-seq библиотека; (В) colistin_1
    4. A. baumannii штамм ATCC 17978 Tn-seq библиотека; (В) colistin_2
      ПРИМЕЧАНИЕ: В вызов роста описано здесь, каждое условие, (-) колистин контроля и (я) колистин вызов, в настоящее время тестируется в дубликат. Таким образом, установка требует 4 х 250 мл Erlenmeyer колбы, два в состоянии.
  2. Добавьте 50 л 0,5 мг/л колистина в колистин колбы (6,1,3 и 6,1,4) и 50 л воды в колистин колбы (6.1.1 и 6.1.2).
  3. Оттепель замороженных Tn-seq библиотеки aliquot от шага 5 на льду.
  4. Pipette 1 йл оттаялой библиотеки в 1 мл PBS.
  5. Измерьте оптическую плотность на уровне 600 нм (OD600) и умножьте на 1000.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это определяет OD600 из 1 йл Tn-библиотеки.
  6. На основе расчета в шаге 6.5, привить каждую колбу, содержащую 50 мл LB до окончательного OD600 0.001.
  7. Выращиваем культуры в трясущимся инкубаторе при 37 градусов поЦельсию до OD 600 0.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы культуры оставались в фазе логаритмического роста, так что если ваш штамм находится на другой OD600 во время экспоненциального роста, OD600 должен быть скорректирован, чтобы обеспечить культуру повторяет как можно больше раз в рамках логаритмической фазы роста. Если культура воспроизводится только 3 раза, власть для обнаружения дефектов пригодности у мутантов ограничена в 3 раза различия, в теории. В виду того что по-разному бактерии имеют по-разному удваивая времена, важно засеять культуры наем 600 OD для того чтобы нормализовать начиная inoculum. Это обеспечивает последовательное представление всей библиотеки во всех культурах.
  8. Урожай культур с использованием центрифугации на 5000 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 7 мин.
  9. Удалить супернатант и мыть с 50 мл PBS.
  10. Пеллет с использованием центрифугации при 5000 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 7 мин.
  11. Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в 1 мл PBS. Aliquot 200 йл в 5 микроцентрифугных труб.
  12. Пеллет с использованием центрифугации при 5000 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Удалите все супернатанты с помощью наконечника пипетки.
  13. Храните гранулы при -20 градусах по Цельсию или продолжайте добычу гДНА.

7. добыча гДНА

  1. Оттепель одной клеточной гранулы на льду.
  2. Добавьте буфер лиза 0,6 мл(Таблица материалов)и вихрь, чтобы полностью повторно использовать гранулы.
  3. Инкубационный при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
  4. Добавьте в образец 0,6 мл фенола/хлороформа/изоамилового спирта и энергично вихрем.
  5. Отдельные фазы с использованием центрифугации в микроцентрифуге на максимальной скорости при температуре помещения в течение 5 мин.
  6. Перенесите верхнюю aqueous фазу к новой пробке. Избегайте нарушений фазового интерфейса во время передачи.
  7. Добавьте равный объем хлороформа в полученную выше aqueous фазу и вихрь энергично.
  8. Отдельные фазы с использованием центрифугации в микроцентрифуге на максимальной скорости при комнатной температуре в течение 5 мин.
  9. Перенесите верхнюю aqueous фазу к новой пробке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте избежать нарушений интерфейса во время передачи.
  10. Добавить 2,5x aqueous фазовый объем холодного 100% этанола и аккуратно перемешать. Осажденная ДНК будет видна.
  11. Поместите трубку при -80 градусов по Цельсию, по крайней мере 1 ч.
  12. Пеллет ДНК с использованием центрифугации на максимальной скорости при 4 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
  13. Тщательно удалите супернатант, не нарушая гранулы ДНК и мыть с 150 йл 70% этанола путем пипетки.
  14. Пеллет ДНК с использованием центрифугации на максимальной скорости при 4 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
  15. Аккуратно удалите супернатант.
  16. Повторите шаг 7.14 один раз. Аккуратно удалите весь оставшийся этанол.
  17. Сухая ДНК путем инкубации при комнатной температуре в течение 5-10 мин.
  18. Resuspend гранулы ДНК в 100 йл TE буфера по пипетки.

8. Стрижка ДНК(рисунок 3A)

  1. Разбавить гДНА буфером TE до концентрации 250 нг/мл в общем объеме 200 мкл.
  2. Поместите трубки в звуковую ванну.
  3. Sonicate ДНК, чтобы дать фрагменты около 300 нуклеотидов. Мощность: 60%, Общее время: 20 мин, Циклы: 10 с ON и 10 s OFF при 4 C(рисунок 3A).
  4. Подтвердить ДНК стрижки надлежащим образом, отделяя 10 йл неподохлысшей ДНК и 10 йл стрижки ДНК на 1% агарозного геля. Повторите sonication или оптимизировать по мере необходимости (Рисунок 3B).

9. Поли-C хвост дополнение к 3' конец (Рисунок 3A)

  1. Настройка реакции поли-C в соответствии с таблицей 1.
  2. Инкубационная реакция при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
  3. Очистить поли-C реакции с 40 йл размера выбора парамагнитныхбусин (рисунок 3A), следуя шагам ниже.
    1. Добавьте в каждый образец 40 мкл парамагнитных бусин. Вихрь 5 с или пипетки вверх и вниз.
    2. Инкубация образцов при комнатной температуре в течение 5 мин.
    3. Короче говоря, центрифуга трубки для сбора жидкости в нижней части трубки (No 2 с).
    4. Перенесите трубки на магнитную стойку и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 минут, пока раствор не будет ясен.
    5. С трубками на магнитной стойке, тщательно удалите супернатант.
    6. С трубками на магнитной стойке добавьте 200 л свежеприготовленного 80% этанола (не беспокоить бисер).
    7. Инкубировать образцы, по крайней мере 30 с, пока решение не ясно.
    8. С трубками на магнитной стойке, тщательно удалите супернатант.
    9. Повторите шаг стирки (шаги 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Соберите жидкость в нижней части трубки с помощью краткого шага центрифугации (No 2 с).
    11. Перенесите трубки на магнитную стойку и удалите оставшуюся жидкость.
    12. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2-5 минут, чтобы высушить образцы. Не более сухой.
    13. Снимите трубки с магнитной стойки и добавьте по 25 мкл воды. Вихрь для 5 с или пипетки вверх и вниз.
    14. Короче говоря, центрифуга трубки для сбора жидкости в нижней части трубки (No 2 с).
    15. Перенесите трубки на магнитную стойку и дайте посидеть 2 мин, пока раствор не будет ясен.
    16. С трубками на магнитной стойке, удалите жидкость, не нарушая бисера и перенесите в новую трубку (23 МКЛ ДНК).

10. Усиление транспосонового соединения(рисунок 3A)

  1. Настройка PCR 1, описанная в таблице 1 для первого вложенного ПЦР(таблица 2).
  2. Выполните PCR 1 с использованием условий, описанных в таблице 1.
  3. Очистить продукты ПЦР с помощью 40 МКЛ парамагнитных бусин выбора размера (шаги 9.3.1 - 9.3-12). Elute в 50 йл воды (шаги 9.3.13 - 9.3.16). На этом этапе образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию.
  4. Приготовьте парамагнитные бусы со стрептавидином:
    1. Resuspend Стрептавидин бисер, встряхивая энергично.
    2. Добавьте 32 йл бисера на образец в свежую трубку микроцентрифуга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бисер для 6 образцов можно подготовить в одной трубке.
    3. Перенесите трубку на магнитную стойку. Инкубация в течение 2 мин, пока решение не будет ясным.
    4. С трубкой на магнитной стойке, удалить супернатант.
    5. Снимите трубку с магнитной стойки. Вымойте бисер путем повторного перерасхода в 1 мл 1x буфера B и W путем трубопроводов вверх и вниз.
    6. Перенесите трубку на магнитную стойку. Инкубация в течение 2 мин, пока решение не будет ясным.
    7. С трубкой на магнитной стойке, удалить супернатант.
    8. Повторите шаг мытья с буфером 1 мл 1x B и W (шаги 10.4.5 - 10.4.7) в два раза больше в общей сложности 3 моет.
    9. Снимите трубку с магнитной стойки и повторно снимите бусинки в 52 йл буфера 2x B и W на образец.
  5. Объедините 50 МКЛ подготовленных бусинок с 50 МКЛ очищенного ПЦР1 (от шага 10,3). Пипетт смешивать.
  6. Поверните при комнатной температуре в течение 30 мин.
  7. Смойте неохвачью ДНК:
    1. Короче говоря, центрифуга для сбора жидкости в нижней части трубки (No 2 с).
    2. Перенесите трубку на магнитную стойку. Инкубировать в течение 2 мин, пока решение не будет ясно.
    3. С трубкой на магнитной стойке, удалить супернатант.
    4. Удалите трубку из магнитной стойки, мыть бисер путем повторного перерасхода в 100 йл 1x B и W буфера и трубопроводов вверх и вниз.
    5. Перенесите трубку на магнитную стойку. Инкубировать в течение 2 мин, пока решение не будет ясно.
    6. С трубкой на магнитной стойке, удалить супернатант.
    7. Повторите шаги мытья с 100 йл LoTE (шаги 10.7.4 - 10.7.6) в два раза больше в общей сложности 3 моет.
  8. Настройка PCR 2, описанная в таблице 1, чтобы усилить транспосонные соединения и добавить один штрих-код к каждому образцу(таблица 2 и таблица 3).
  9. Выполните PCR 2 с использованием условий, описанных в таблице 1.
  10. Очистка с 40 йл размера выбора парамагнитных бусин (шаги 9,3,1 - 9,3,12). Elute в 17 йл воды (шаги 9.3.13 - 9.3.16), собирают 15 йл.
  11. Количественная оценка концентрации ДНК с помощью флюорометра. Окончательные концентрации должны быть от 50 до 250 нг/мл.
  12. Оцените качество ДНК с помощью капиллярного электрофореза на основе чипов(рисунок 4A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изложенные методы описывают генерацию высокой плотности транспосон библиотеки в штамме A. baumannii ATCC 17978 через бактериальное спряжение с использованием E. coli MFD DAP-, который повторяет плазмидный pJNW684 (Рисунок 4B). В подробном протоколе используется двухроциальное бактериальное спряжение для переноса pJNW684 из штамма E. coli и донора в штамм реципиента A. baumannii. Это эффективный и недорогой метод для создания плотных библиотек транспосонных мутантов. Бактерии смешивались при оптимизированных соотношениях, а спаривания были замечены на агарных пластинах Лурия-Бертани на 1 ч(рисунок 1А). Во время спаривания, транспосон был передан от донора к реципиенту штамма, где он вставляется в gDNA(рисунок 1B). Были собраны спаривания, приблизительно 105 CFU/mL были рассчитаны и починили на 150 мм х 15 мм агар пластины дополнены канамицин. После 14 ч роста при 37 градусов по Цельсию пластины содержали тысячи колоний разного размера(рисунок 1С),что указывает на успешное поколение библиотеки транспосонных мутантов. Мутанты вставки транспосона были объединились(рисунок 1D)и заморожены в алицитах, чтобы предотвратить повторные циклы замораживания-оттепели, которые могли бы добавить селективное давление на библиотеку вставки.

Объединение библиотеки транспосонных мутантов A. baumannii использовалось для определения фитнес-факторов, важных для устойчивости к колистину при субгибиторных концентрациях противомикробныхпрепаратов (рисунок 2B). Библиотека мутантов была выращена до логаритмической фазы при отсутствии/присутствии 0,5 мг/л колистина в дубликате для истощения мутантных клеток, кодирующих вставки в гены, способствующие устойчивости к колистину. Общая гДНК оставшегося библиотечного пула была изолирована от контрольных и экспериментальных культур и обработана для подготовки ДНК к секвенированию(рисунок 3A).

Изолированная гДНК была раздроблена с помощью механического стрижки, а на фрагменты ДНК был добавлен хвост поли-С(рисунок 3A). После добавления поли-C хвост, ДНК была очищена и транспосон-геном соединения были обогащены с помощью поли-C конкретных грунтовки следуют второй раунд ПЦР с использованием другого поли-C конкретных грунтовки, которая представила P7 секвенирования сайта, который необходим для связывания Illumina потока клеток и кластерного поколения, и шестибазный штрих-код, который используется для demultiplex библиотекпосле последовательности 37.47 Концентрации ДНК были рассчитаны и образцы были проанализированы с использованием чипа основе капиллярного электрофореза для подтверждения успешных библиотек строит (Рисунок 4A), которые готовы к высокой пропускной способности секвенирования.

Библиотеки ДНК были секвенированы секвенированием следующего поколения. Был выполнен одиночный, 50 циклный запуск, который дал 30 миллионов высококачественных считывай/образцов, обеспечивая 62,5-кратное покрытие библиотеки транспосона. Транспосонные соединения (считывает) были отображены на эталонныйгеном 48, используя коммерчески доступное программное обеспечение для анализа биоинформатики. Количество считывай на каждом месте вставки в образцах ввода, (-) состояние контроля колистина, были сопоставлены с числом считывается в образцах выхода, (я) колистин экспериментальное состояние, и фитнес баллы для каждого места вставки были рассчитаны. Фитнес-оценки были затем сгруппированы по гену. Гены, демонстрирующие уменьшенные баллы, когда библиотека была выращена в присутствии колистина по отношению к входным образцам, считались фитнес-детерминантами для выживания A. baumannii при субибибиторных концентрациях колистина. Например, в выборке входных данных присутствовали транспосонные вставки в двухкомпонентной системе PmrAB, но они не были обнаружены в выходной выборке. PmrAB непосредственно регулирует выражение pmrC, который передает фосфоэтаноламин на липидЫ, чтобы нейтрализовать заряд на поверхностиклетки 12,31. Считается, что нейтрализация бактериального поверхностного заряда снижает электростатический потенциал, необходимый для убийства при посредничестве колистина. Выявление истощенных генов, которые, как известно, способствуют фенотипу резистентности, подтвердило метод.

Figure 1
Рисунок 1: Схема строительства библиотеки транспосонных мутантов. (A)Бактериальное спряжение. Штамм "донор", кодируемый транспозиционной техникой, смешивали с штаммом "реципиент". Смесь была замечена на пластинах LB агар и позволил спариваться в течение 1 ч. (B) Поколение транспосон библиотеки. Плазмида, несущая транспозиционное оборудование, была перенесена из штамма «донор» в штамм «реципиент», а транспосон был случайным образом вставлен по всему геному штамма «реципиента». (C)Выбор. В результате клетки были поцарапываны на агарных пластинах, дополненных канамицином, чтобы выбрать для транспосонной вставки мутантов. (D)Бассейн библиотеки. Колонии были соскоблечены с тарелок, перерасходуются в LB и объединяются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные результаты бактериального спряжения и схема эксперимента colistin Tn-seq. (A)Представитель kanamycin выбор пластины. Пластина разделена на пять равных секций. Синие точки представляют собой колонию, рассчитывая на оценку транспосонных мутантов A. baumannii. Для расчета окончательной оценки были подсчитаны по крайней мере три отдельные пластины. (B)Определение фитнес-факторов при субибибиторных концентрациях колистина. Объединение приднефсонской библиотеки было выращено до логарифмической фазы роста либо в отсутствие (контроль), либо в присутствии (экспериментального) колистина. Как только культуры достигли соответствующей оптической плотности, клетки были гранулированы и gDNA был извлечен из каждого образца. Каждое условие было протестировано в дубликате в общей сложности для четырех образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Flowchart библиотеки ДНК amplicon построить для массивного параллельного секвенирования и представитель стрижки gDNA. (A)Tn-seq библиотека ДНК построить схему. После извлечения, gDNA был фрагментирован с помощью механического стрижки. Терминал деоксинуклеотидил трансфераза был использован для добавления поли-C хвост 3 'конец фрагментированной ДНК до усиления ПЦР транспосон-генома соединений и штрих-кодов. (B) 1% агарозный гель из unsheared и стрижки A. baumannii мутант библиотек после gDNA стрижки шаг. 1Kb лестница была использована в качестве маркера ДНК. Стрижка мазка gDNA в основном колеблется от 100 до 500 базовых пар. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные результаты контроля качества (КК) и карта плазмиды, несущей гены транспозиции. (A)КК след для создания библиотеки ДНК. Существует пик в 350 базовых пар, что свидетельствует об успешном построении библиотеки. Если некоторые большие ДНК были обнаружены в результатах КК, образцы могут быть очищены дальше, чтобы удалить большие фрагменты ДНК. (B) Плазмид pJNW684 состоит из Himar1 моряк транспосон (зеленый) с кассетой сопротивления канамицина (фиолетовый) для выбора мутантов, ген, кодирующий гиперактивный маринер Himar1 C9 транспозазы (красный) под контролем A. baumannii 17978 конкретных промоутер (синий), ген устойчивости ампициллина(бла, оранжевый) и RP4/oriT/oriR6K-условное происхождение репликации (желтый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Реакции Установки Условия
Реакция Поли-С 30 йл стрижки gDNA
2,5 МЛ 9,5 мМ DCTP/0,5 мм ddCTP
10 МКЛ 5X Терминал деоксинуклеотидил трансферазы (Tdt) буфер реакции
1.25 йл rTdt
6,25 мл воды до 50 мл		 Инкубационный при 37oC в течение 1 часа
ПЦР 1 Очищенная ДНК (весь образец с предыдущего шага) 23 йл 3'-поли-С
10 йл 10x высокой точности ДНК полимеразы реакции смеси
2 дНТП 10 мММ
2 л 50 мМ МгСО4
1 МКЛ 30 МК Олж 510 биотин
3 хл 30 МКМ olj 376
Полимераза ДНК высокой точности 0,5 йл
8,5 мкл чистой воды до 50 йл всего		 1 цикл: 2 мин 94 oC
15 циклов: 15 s 94 oC
30 s 60 oC
2 мин 68 oC
1 цикл: 4 мин 68 oC
Удержание: ∞ 4 oC
ПЦР 2 ДНК связаны бусы от предыдущего шага
10 йл 10x высокой точности ДНК полимеразы реакции смеси
2 МКЛ 10 мМ дНТП
2 л 50 мМ МгСО4
1 хл 30 МКМ olj 511
1 МКЛ 30 МКМ праймер штрих-кода (Таблица 2)
Полимераза ДНК высокой точности 0,5 йл
33,5 мкл чистой воды до 50 йл		 1 цикл: 2 мин 94 oC
15 циклов: 15 s 94 oC
30 s 60 oC
2 мин 68 oC
1 цикл: 4 мин 68 oC
Удержание: ∞ 4 oC

Таблица 1: Настройка реакции. Настройка и условия для реакций poly-C, PCR 1 и PCR 2.

Цель Имя Последовательности
Анналы в транспосон olj510-Биотин Биотин-GATGGCCTTTTTGCGTCTCTACCTGCAGGGCG
Анналы к хвосту поли-C olj376 GTGACTGGAGTTCACGTGGCTCTTCCGATCTGG
GGGGGGGGGGGG
Вложенный в транспосон и адаптер P5:
P5 захват сайта - P5 последовательности сайта- N5 -Tn		 olj511 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTCTTT
CCCTACACGACGCTCCCGATCTNNNNNGGACTTA
TCATCCAACCTGTTAG
Гнездо на olj376: сайт последовательности P7
- штрих-код XXXXXX - P7 захват сайта)		 Bc ## CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxGTGA
CTGGAGTTCACGTGTG
см. Таблицу 2 для конкретных штрих-кодов

Таблица 2: праймеры для усиления ПЦР. Праймеры усиления ПЦР, используемые в протоколе для усиления транспозных соединений. Цель каждого из них указана в первом столбце.

Грунтовка Прочитать Штрихкодов Последовательности
BC1 ATCACG CGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGT
ГАТГТГАКГГАГТКАГГТГТГ
BC2 CGATGT ACATCG КААГАГАГАГАГАГКАТАКГАГАТАК
ATCGGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC3 TTAGGC ССЗТАА CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCC
ТААГТГАКГГАГТКАГГТГТГ
BC4 TGACCA TGGTCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
ГГТКАГТГГАГТАГТКАКГТГТГТГТГТГ
BC5 АКАГТГ CACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CACTGTGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC6 ГККААТ ATTGGC КААГАГААГАГАГАГГКАТАКГАГАТА
TTGGCGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC7 CAGATC ГЭТКТГ CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ГАТКТГГТГАГГАГТКАГГТГТГТГТГ
BC8 АКТТГА TCAAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCAAGTGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC9 ГАТКАГ CTGATC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TCTGATCGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC10 ТАГКТ ААГКТА CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
AAGCTAGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC11 GGCTAC GTAGCC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTAGCCGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC12 CTTGTA ТАКААГ CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
ACAAGGTGACTGGAGTTCACGTGGTG
BC13 АГТКАА ТТГАКТ CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTGACTGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC14 АГТТК GGAACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
ГААКТГТГАГГАГТКАГГТГТГТГ
BC15 АТГТКА TGACAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TTGACATGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC16 CCGTCC GGACGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GGACGGGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC17 ГТАГАГ КТКТАК CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CTCTACGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC18 GTCCGC ГКГГАК CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCGGACGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC19 ГТГАА ТТТКАК CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTTCACGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC20 GTGGCC GGCCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GCCACGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC21 ГТТКГ CGAAAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGAAACGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC22 CGTACG CGTACG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGTACGGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC23 GAGTGG CCACTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
CACTCGTGACTGGAGTTCACGTGGTG
BC24 GGTAGC GCTACC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTACCGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC25 АКТГАТ ATCAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATCAGTGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC26 ATGAGC GCTCAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTCATGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC27 ATTCCT АГГААТ КААГАГААГАГАГАГГКАТАКГАГАТА
GGAATGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC28 CAAAAG CTTTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTTTGGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC29 КААКТА ТАГТГ CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TAGTTGGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC30 КАККГГ CCGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CCGGTGGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC39 CTATAC ГТАТАГ CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTATAGGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC40 КТКАГА ТКТГАГ CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTGAGGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC42 ТААТКГ КГАТТА CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
ГАТТАГТГАКГГАГТКАГГТГТГТГ
BC43 ТакаГК ГКТГТА CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTGTAGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC44 ТАТААТ АТТАТА CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
АТТАТАГТГАКГГАГТАКТАКГТГТГ
BC45 TCATTC ГААТГА CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ГААТГАГТГГАГТАГТКАКГТГТГТГТГТГ
BC46 TCCCGA ТКГГГА CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCGGGAGTGACTGGAGTTCACGTGTGG
BC47 ТКГААГ CTTCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTCGAGTGACTGGAGTTCACGTGTG
BC48 ТКГГКА TGCCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TGCCGAGTGACTGGAGTTCACGTGTG

Таблица 3: Праймеры штрих-кодов. Праймеры штрих-кодов используются во втором этапе ПЦР для усиления транспосонных соединений при добавлении сайта секвенирования P7 и штрих-кодов к ампликону. Не все праймеры штрих-кодов необходимы для создания библиотеки. Требуются только праймеры штрих-кодов для количества образцов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A. baumannii является новой угрозой для глобального общественного здравоохранения в связи с быстрым приобретением AMR против "последней линии" терапии, такие какколистин 10,,11,,12,,23,,24,30,31. В последние десятилетия, Tn-seq сыграл важную роль в выяснении генотип-фенотип взаимодействия между многочисленными бактериальными видами и расширения нашего пониманиябактериальной генетики 34,35,42,43. Tn-seq протоколы сыграли важную роль в выявлении основных генов в различных бактериальных видов, таких как Campylobacter jejuni, золотистый стафилококк, пародонтальный патоген Porphyromonas gingivalis, и даже Mycobacterium туберкулез37,49,50,51. Помимо идентификации основных генов, Tn-seq был использован для выявления генов устойчивости к антибиотикам в Pseudomonas aeruginosa, несколько условно необходимых генов в salmonella typhimurium, и многочисленные генотип-фенотипные отношения в стрептококковойпневмонии 52,53,54. Совсем недавно, транспосон секвенирования Vibrio cholerae был использован в модели кролика младенца холеры для выявления генов, которые имеют важное значение для in vivo фитнес во времяинфекции 47. Эти исследования демонстрируют универсальность Tn-seq, поскольку он может быть использован как для in vitro, так и для исследований in vivo.

Основным преимуществом Tn-seq по сравнению с другими методами, такими как технологии микроаррей, 2D гель электрофорез, и qPCR, является то, что он не требует предварительного знания генома или геномнойинформации 55. Таким образом, транспозозный мутагенез в сочетании с массированно-параллельным секвенированием позволяет изучать известные гены и геномы, а также открытие новых генетических взаимодействий. Здесь мы представили комплексный метод для создания очень плотной библиотеки транспозозных мутантов в A. baumannii для выявления факторов, которые необходимы для бактериальной пригодности при воздействии субибибиторных концентраций колистина. Описанный метод также был успешно использован в кишечной палочке (неопубликованные данные), демонстрируя, что система может выполнять анализ Tn-seq в других грам-отрицательных патогенах, включая Enterobacteriaceae.

Использование морских транспозонов для вставки мутагенеза имеет ряд преимуществ. Семья транспосон возникла из эукариотических хостов и широко используется для создания насыщающих библиотек мутантов в различных бактериальных популяциях. Морские транспононы являются хост-независимыми, а это означает, что стабильные случайные вставки могут быть достигнуты при отсутствииконкретных факторов хозяина 40,41. Кроме того, мореплавательные транспозоны имеют определенное количество событий вставки, потому что они преимущественно вставляют в тимин-аденин ("TA") мотивы, что уменьшает вставки смещения и приводит к более надежномустатистическому анализу 37,56,57,58.

Несколько маринероснове Tn-seq методы используют MmeI ограничение пищеварения для фрагментации gDNA32,42,43. В то время как энзиматическая фрагментация ДНК является популярным и успешным методом, он добавляет ненужные шаги к процедуре и увеличивает потенциальнуюпредвзятость 37. Эти методы не только требуют большого количества стартовых материалов, но и потенциально могут привести к неравному представлению последовательностей вставки в нисходящеманализе 37,,59. Как и некоторые другие методы, которые не полагаются на MmeI нуклеазнойактивности 52,60,61, метод, изложенный в настоящем основывается на механическом стрижке фрагмента GDNA, и TdT, чтобы добавить поли-C хвост 3 'конец фрагментов ДНК. По сравнению с энзиматической фрагментации ДНК и методы перевязки адаптера, этот подход требует значительно меньшего количества исходной ДНК, обеспечивая при этом более последовательные результаты, он также снижает риск перекрестного загрязнения ДНК и уменьшает потерю образца из-за заключения в запечатаннойтрубке 37,59,62. Кроме того, этот метод дает больше, высокое качество секвенирования читает 50 нуклеотидов, которые помогают в более эффективном и точном отображении последовательностей и более надежныйанализ вниз по течению 37,59. Добавление синтетического хвоста поли-С игнорирует потенциальные свесы, которые могут возникнуть в результате фрагментации, поскольку этот метод опирается на экзогенно добавленный хвост поли-С в качестве места распознавания обратной грунтовки, которая содержит 16 нуклеотидов dG в конце 3' и последовательность, специфичную для последовательности следующего поколения (например, секвенирование Illumina) в конце 5' до простогосинтеза 47,59. Использование синтетического нуклеотидного хвоста расширяет применение этого метода для многих различных геномов независимо от их родного содержания59. Впоследствии, транспосон-геном соединения усиливаются с помощью поли-C конкретных грунтовки37. Эта альтернатива упрощает процедуру, устраняя необходимость в дорогих ферментах ограничения, перевязки адаптера, формировании адаптерных димеров и шагах по очистке геля. Мы также оптимизировали протокол для эффективного создания высоконасыщенных библиотек вставки транссексуалов в нескольких грам-отрицательных патогенах ESKAPE, включая Acinetobacter baumannii и могут быть использованы для изучения генетических взаимодействий в различных условиях in vitro и in vivo 10.

Одним из ограничений Tn mutagenesis является то, что он опирается на маркеры устойчивости к антибиотикам для отбора. Тем не менее, многие грам-отрицательные патогены ESKAPE являются мультимедикаментозными или широко лекарственно устойчивыми, что означает, что пользователю, возможно, придется обменять кассету сопротивления в соответствии с конкретным патогеном, представляющим интерес. Кроме того, некоторые клинические изоляты не подменяются транспосон мутагенезом с использованием морского транспосона.

Критическим шагом протокола является расчет количества Tn мутантов на пластину. Покрытие слишком много колоний приведет к газон, который может осложнить вниз по течению анализа. Если колонии находятся слишком близко или касаются, они могут добавить нежелательное избирательное давление на библиотеку, что может привести к артефактам. В идеале, колонии не будут касаться и равномерно расположены по всей пластине, как попродемонстрировано(рисунок 2A). И наоборот, если слишком мало колоний помойки, это будет трудно изолировать несколько Tn вставки в каждом гене.

Важно также выполнять элементы управления, перечисленные в шаге 2.18. Об этом говорится в примечании к разделу 3. 2, ни "донор" или "реципиент" штамм должен расти на пластинах, дополненных ампициллин. Поскольку для роста штамма "донор" необходим экзогенный DAP, любой рост будет указывать на то, что штамм "реципиента" повторяет pJNW684. Это является значительной проблемой, потому что если транспосон не интегрируется в gDNA, секвенирование читает будет только карта плазмид, а не интеграции сайта. В этом случае эксперимент, скорее всего, не даст использовать данные.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана финансированием от Национального института здравоохранения (Грант AI146829 к J.M.B.) и с благодарностью признается.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, I. M., Bal, A. M. New antibiotic agents in the pipeline and how they can help overcome microbial resistance. Virulence. 4 (2), 185-191 (2013).
  2. Holzheimer, R. G. Antibiotic induced endotoxin release and clinical sepsis: a review. Journal of Chemotherapy. 13 (1), Florence, Italy. Spec No 1 159-172 (2001).
  3. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). , (2019).
  4. Scholar, E. M., Pratt, W. B. The antimicrobial drugs. , Oxford University Press. New York. (2000).
  5. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  6. Henderson, J. C., et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annual Review of Microbiology. 70, 255-278 (2016).
  7. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  8. Raetz, C. R. H., Whitfield, C. Lipopolysaccharide Endotoxins. Annual Review of Biochemistry. 71 (1), 635-700 (2002).
  9. Kang, K. N., et al. Colistin heteroresistance in Enterobacter cloacae is regulated by PhoPQ-dependent 4-amino-4-deoxy- L -arabinose addition to lipid A. Molecular Microbiology. 111 (6), 1604-1616 (2019).
  10. Boll, J. M., et al. A penicillin-binding protein inhibits selection of colistin-resistant, lipooligosaccharide-deficient Acinetobacter baumannii. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (41), 6228-6237 (2016).
  11. Boll, J. M., et al. Reinforcing Lipid A Acylation on the Cell Surface of Acinetobacter baumannii Promotes Cationic Antimicrobial Peptide Resistance and Desiccation Survival. mBio. 6 (3), 00478 (2015).
  12. Arroyo, L. A., et al. The pmrCAB operon mediates polymyxin resistance in Acinetobacter baumannii ATCC 17978 and clinical isolates through phosphoethanolamine modification of lipid A. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (8), 3743-3751 (2011).
  13. Harris, T. L., et al. Small molecule downregulation of PmrAB reverses lipid A modification and breaks colistin resistance. ACS Chemical Biology. 9 (1), 122-127 (2014).
  14. Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiological Reviews. 56 (3), 395-411 (1992).
  15. Vaara, M. Polymyxins and their novel derivatives. Current Opinion in Microbiology. 13 (5), 574-581 (2010).
  16. Kassamali, Z., Rotschafer, J. C., Jones, R. N., Prince, R. A., Danziger, L. H. Polymyxins: wisdom does not always come with age. Clinical Infectious Diseases: An Official publication of the Infectious Diseases Society of America. 57 (6), 877-883 (2013).
  17. Ainsworth, G. C., Brown, A. M., Brownlee, G. Aerosporin, an antibiotic produced by Bacillus aerosporus Greer. Nature. 159 (4060), 263 (1947).
  18. Benedict, R. G., Langlykke, A. F. Antibiotic activity of Bacillus polymyxa. Journal of Bacteriology. 54 (1), 24 (1947).
  19. Stansly, P. G., Shepherd, R. G., White, H. J. Polymyxin: a new chemotherapeutic agent. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital. 81 (1), 43-54 (1947).
  20. Hermsen, E. D., Sullivan, C. J., Rotschafer, J. C. Polymyxins: pharmacology, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical applications. Infectious Disease Clinics of North America. 17 (3), 545-562 (2003).
  21. Pedersen, M. F., Pedersen, J. F., Adsen, P. O. A clinical and experimental comparative study of sodium colistimethate and polymyxin B sulfate. Investigative Urology. 9 (3), 234-237 (1971).
  22. Falagas, M. E., Bliziotis, I. A. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era. International Journal of Antimicrobial Agents. 29 (6), 630-636 (2007).
  23. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 21 (3), 538-582 (2008).
  24. Beceiro, A., Tomás, M., Bou, G. Antimicrobial resistance and virulence: a successful or deleterious association in the bacterial world. Clinical Microbiology Reviews. 26 (2), 185-230 (2013).
  25. Eliopoulos, G. M., Maragakis, L. L., Perl, T. M. Acinetobacter baumannii: Epidemiology, Antimicrobial Resistance, and Treatment Options. Clinical Infectious Diseases. 46 (8), 1254-1263 (2008).
  26. Lee, A., Nolan, A., Watson, J., Tristem, M. Identification of an ancient endogenous retrovirus, predating the divergence of the placental mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1626), 20120503 (2013).
  27. Moffatt, J. H., et al. Colistin Resistance in Acinetobacter baumannii Is Mediated by Complete Loss of Lipopolysaccharide Production. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 4971-4977 (2010).
  28. Cai, Y., Chai, D., Wang, R., Liang, B., Bai, N. Colistin resistance of Acinetobacter baumannii: clinical reports, mechanisms and antimicrobial strategies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (7), 1607-1615 (2012).
  29. Da Silva, G., Domingues, S. Interplay between Colistin Resistance, Virulence and Fitness in Acinetobacter baumannii. Antibiotics. 6 (4), 28 (2017).
  30. Chin, C. -Y., Gregg, K. A., Napier, B. A., Ernst, R. K., Weiss, D. S. A PmrB-Regulated Deacetylase Required for Lipid A Modification and Polymyxin Resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7911-7914 (2015).
  31. Beceiro, A., et al. Phosphoethanolamine modification of lipid A in colistin-resistant variants of Acinetobacter baumannii mediated by the pmrAB two-component regulatory system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3370-3379 (2011).
  32. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-Wide Fitness and Genetic Interactions Determined by Tn-seq, a High-Throughput Massively Parallel Sequencing Method for Microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36, 1-24 (2015).
  33. Kwon, Y. M., Ricke, S. C., Mandal, R. K. Transposon sequencing: methods and expanding applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (1), 31-43 (2016).
  34. Yamaichi, Y., Dörr, T. Transposon Insertion Site Sequencing for Synthetic Lethal Screening. Methods in Molecular Biology. 1624, Clifton, N.J. 39-49 (2017).
  35. Goodman, A. L., et al. Identifying Genetic Determinants Needed to Establish a Human Gut Symbiont in Its Habitat. Cell Host & Microbe. 6 (3), 279-289 (2009).
  36. Wang, N., Ozer, E. A., Mandel, M. J., Hauser, A. R. Genome-Wide Identification of Acinetobacter baumannii Genes Necessary for Persistence in the Lung. mBio. 5 (3), 01163 (2014).
  37. Klein, B. A., et al. Identification of essential genes of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. BMC Genomics. 13 (1), 578 (2012).
  38. Ferrieres, L., et al. Silent Mischief: Bacteriophage Mu Insertions Contaminate Products of Escherichia coli Random Mutagenesis Performed Using Suicidal Transposon Delivery Plasmids Mobilized by Broad-Host-Range RP4 Conjugative Machinery. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6418-6427 (2010).
  39. Lim, L. M., et al. Resurgence of Colistin: A Review of Resistance, Toxicity, Pharmacodynamics, and Dosing. Pharmacotherapy. 30 (12), 1279-1291 (2010).
  40. Lampe, D. J., Churchill, M. E., Robertson, H. M. A purified mariner transposase is sufficient to mediate transposition in vitro. The EMBO Journal. 15 (19), 5470-5479 (1996).
  41. Mazurkiewicz, P., Tang, C. M., Boone, C., Holden, D. W. Signature-tagged mutagenesis: barcoding mutants for genome-wide screens. Nature Reviews. Genetics. 7 (12), 929-939 (2006).
  42. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nature Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  43. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews. Microbiology. 11 (7), 3033 (2013).
  44. Liu, H., Bouillaut, L., Sonenshein, A. L., Melville, S. B. Use of a Mariner-Based Transposon Mutagenesis System To Isolate Clostridium perfringens Mutants Deficient in Gliding Motility. Journal of Bacteriology. 195 (3), 629-636 (2013).
  45. Singer, J. T., Finnerty, W. R. Insertional specificity of transposon Tn5 in Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 157 (2), 607-611 (1984).
  46. Subashchandrabose, S., et al. Acinetobacter baumannii Genes Required for Bacterial Survival during Bloodstream Infection. mSphere. 1 (1), 13-15 (2015).
  47. Shull, L. M., Camilli, A. Transposon Sequencing of Vibrio cholerae in the Infant Rabbit Model of Cholera. Vibrio Cholerae. 1839, 103-116 (2018).
  48. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes & Development. 21 (5), 601-614 (2007).
  49. Stahl, M., Stintzi, A. Identification of essential genes in C. jejuni genome highlights hyper-variable plasticity regions. Functional & Integrative Genomics. 11 (2), 241-257 (2011).
  50. Chaudhuri, R. R., et al. Comprehensive identification of essential Staphylococcus aureus genes using Transposon-Mediated Differential Hybridisation (TMDH). BMC Genomics. 10 (1), 291 (2009).
  51. Griffin, J. E., et al. High-resolution phenotypic profiling defines genes essential for mycobacterial growth and cholesterol catabolism. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002251 (2011).
  52. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. mBio. 2 (1), 00315 (2011).
  53. Khatiwara, A., et al. Genome scanning for conditionally essential genes in Salmonella enterica Serotype Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology. 78 (9), 3098-3107 (2012).
  54. van Opijnen, T., Camilli, A. A fine scale phenotype-genotype virulence map of a bacterial pathogen. Genome Research. 22 (12), 2541-2551 (2012).
  55. Hurd, P. J., Nelson, C. J. Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (3), 174-183 (2009).
  56. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  57. Perry, B. J., Yost, C. K. Construction of a mariner-based transposon vector for use in insertion sequence mutagenesis in selected members of the Rhizobiaceae. BMC Microbiology. 14 (1), 298 (2014).
  58. Plasterk, R. H. A., Izsvák, Z., Ivics, Z. Resident aliens: the Tc1/ mariner superfamily of transposable elements. Trends in Genetics. 15 (8), 326-332 (1999).
  59. Lazinski, D. W., Camilli, A. Homopolymer tail-mediated ligation PCR: a streamlined and highly efficient method for DNA cloning and library construction. BioTechniques. 54 (1), (2013).
  60. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  61. Langridge, G. C., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  62. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved Protocols for the Illumina Genome Analyzer Sequencing System. Current Protocols in Human Genetics. 62 (1), (2009).

Tags

Биология выпуск 161 транспосон секвенирование высокой пропускной способности Грам-отрицательный Acinetobacter baumannii колистин ESKAPE
Создание транспосонных библиотек в грам-отрицательных бактериях для секвенирования высокой пропускной способности
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll,… More

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter