Summary
Questo protocollo descrive come generare ferite escisionali bilaterali a pieno spessore nei topi e come monitorare, raccogliere e preparare successivamente le ferite per l'analisi morfometrica. È inclusa una descrizione approfondita di come utilizzare sezioni istologiche seriali per definire, quantificare e rilevare con precisione i difetti morfometrici.
Abstract
Il modello di ferita escisionale murina è stato ampiamente utilizzato per studiare ciascuna delle fasi sequenzialmente sovrapposte della guarigione delle ferite: infiammazione, proliferazione e rimodellamento. Le ferite murine hanno un letto di ferita istologicamente ben definito e facilmente riconoscibile su cui sono misurabili queste diverse fasi del processo di guarigione. All'interno del campo, è comune usare un "mezzo" arbitrariamente definito della ferita per analisi istologiche. Tuttavia, le ferite sono un'entità tridimensionale e spesso non istologicamente simmetriche, supportando la necessità di un metodo di quantificazione ben definito e robusto per rilevare difetti morfometrici con una piccola dimensione dell'effetto. In questo protocollo, descriviamo la procedura per la creazione di ferite adicisionali bilaterali a pieno spessore nei topi, nonché un'istruzione dettagliata su come misurare i parametri morfometrici utilizzando un programma di elaborazione delle immagini su sezioni seriali selezionate. Le misurazioni a due dimensioni della lunghezza della ferita, della lunghezza epidermica, dell'area epidermica e dell'area della ferita sono utilizzate in combinazione con la distanza nota tra le sezioni per estrapolare l'area epidermica a tre dimensioni che copre la ferita, l'area complessiva della ferita, il volume epidermico e il volume della ferita. Sebbene questa dettagliata analisi istologica sia più dispendiosa in termini di tempo e risorse rispetto alle analisi convenzionali, il suo rigore aumenta la probabilità di rilevare nuovi fenotipi in un processo di guarigione delle ferite intrinsecamente complesso.
Introduction
La guarigione cutanea delle ferite è un processo biologico complesso con fasi di sovrapposizione sequenziale. Richiede la coordinazione di processi cellulari e molecolari che sono regolati in modo temporale e spaziale al fine di ripristinare la funzione barriera dell'epitelio danneggiato. Nella prima fase, infiammazione, neutrofili e macrofagi migrano nella ferita, mobilitando difese locali e sistemiche1. Seguire e sovrapporre la fase infiammatoria è la fase di proliferazione. I fibroblasti iniziano rapidamente a prolifere e migrare nel tessuto di granulazione. I cheratinociti lontano dal bordo d'attacco proliferano direzionale verso la ferita mentre i cheratinociti differenziati nel bordo anteriore migrano per er epitelializzare laferita 2. Infine, inizia la fase di rimodellamento e maturazione, durante la quale i fibroblasti nel tessuto di granulazione iniziano a sintetizzare e depositare collagene. Il rimodellamento e l'organizzazione della nuova matrice possono durare fino a 1 anno dopo l'infortunio3. A causa della complessità degli eventi sovrapposti che coinvolgono il cross-talk tra più tipi di cellule, e nonostante anni di ricerca, molti dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della guarigione delle ferite rimangono poco compresi.
Il modello di topo è il modello di mammifero predominante per lo studio dei meccanismi di guarigione delle ferite a causa della loro facilità d'uso, costo relativamente basso e manipolabilità genetica1,4,5. Sebbene diversi tipi di ferite siano stati descritti nel modello murino, il più comune è una ferita adicisionale (pugno bilaterale o biopsia a pugno diretto), seguita da modelli di ferita incisiva4. Il modello di ferita adicizionale ha un netto vantaggio rispetto al modello incisivo in quanto genera intrinsecamente tessuto di controllo che non ha subito il processo di guarigione. Il tessuto di biopsia del punzone che viene asportato come parte del protocollo chirurgico può essere elaborato allo stesso modo del tessuto ferito e utilizzato per stabilire le condizioni omeostatiche per un criterio desiderato. Il tessuto di controllo delle accise può anche essere utile se si valutano gli effetti di un pretrattamento cutaneo o si conferma un'alterazione genica riuscita al momento dellalesione 4.
I parametri di guarigione possono essere valutati con molte tecniche diverse, tra cui planimetria o istologia. Tuttavia, la planimetria può solo valutare le caratteristiche visibili della ferita, e a causa della presenza di una crosta, spesso non è correlata a misurazioni di guarigione che vengono visualizzate dall'istologia, rendendo così l'istologia il "gold standard" dell'analisi4. Nonostante l'analisi istologica sia il gold standard, viene spesso eseguita su un sottoinsieme arbitrario della ferita6,7. Ad esempio, tagliare la ferita a "metà" prima di incorporare e sessare la ferita è attualmente una pratica comune per ridurre il tempo e le risorse spesi per sezionamento dei materiali e analisi dei dati. Il metodo di analisi morfometrica descritto in questo protocollo è stato sviluppato per comprendere l'intero tessuto della ferita, per riflettere accuratamente le caratteristiche morfologiche della ferita e per aumentare la probabilità di rilevare difetti di guarigione delle ferite con una piccola dimensione dell'effetto. In questo protocollo, dettagliamo un metodo chirurgico per generare la ferita murina più comunemente studiata, la ferita incisiva bilaterale a pieno spessore, nonché un metodo dettagliato e rigoroso per l'analisi istologica che viene usato raramente sul campo.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati completati in conformità con le normative federali e la politica e le procedure dell'Università dell'Iowa sono state approvate dalla IACUC dell'Università dell'Iowa.
1. Animali e allevamento
- Usa topi adulti della linea del mouse desiderata a 8-10 settimane di età quando lo stadio del follicolo pilifero è in telogen.
- Il giorno dell'intervento chirurgico, separare i topi in gabbie pulite e alloggiare individualmente per ridurre al minimo l'interruzione della ferita.
2. Chirurgia
NOTA: Non è necessario mantenere condizioni chirurgiche sterili. Mentre si dovrebbe fare attenzione a mantenere la sterilità tra gli animali, la biopsia del pugno stesso viene eseguita su una superficie pulita, ma nonsterile. La durata dell'intervento chirurgico per animale è compresa tra 10 e 15 minuti.
- Anestesizzazione
- Anestetizzare l'animale per 1-2 minuti in una camera di induzione con il vaporizzatore di isoflurane impostato su una portata del 4-5% e il misuratore di flusso di ossigeno impostato a 1 litro al minuto. Vedere Discussione per le opzioni alternative di anestesia.
- Confermare l'anestesia corretta prima di iniziare la procedura. La profondità dell'anestesia può essere confermata da un dito fermo.
- Trasferire il topo dal contenitore di induzione a un cono nasale e ridurre la portata dell'isoflurane all'1,5% e il misuratore di flusso di ossigeno a 0,5 L/min.
- Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi poiché la procedura supera i 5 minuti.
- Mantenere la normale temperatura corporea utilizzando un cuscinetto termico.
- Preparazione del sito della ferita
- Utilizzare un clipper rasoio elettrico in un movimento rostrale caudale per rimuovere la pelliccia sul retro del mouse a livello della spalla. Rimuovere i capelli più in basso sulla schiena se necessario se si eseguono più di due ferite.
- Rimuovere i capelli rimanenti utilizzando una lama di rasoio in un movimento caudale rostrale tenuto a 20° dalla parte posteriore del mouse per radere da vicino l'area ritagliata (Figura 1A).
- Pulire l'area rasata con un tampone povidone-iodio.
- Pulire la pelle con un tampone sterile per la preparazione dell'alcol isopropile al 70% per ridurre la potenziale irritazione cutanea dal tampone di iodio.
- Ferendo
- Pizzicare la pelle tra le scapole lungo la linea mediana dorsale e allontanare la piega della pelle sandwich dal corpo (Figura 1B).
- Posizionare il mouse su un lato con lo skinfold su una superficie piana drappeggiata con un asciugamano pulito a base di carta o equivalente. Utilizzare un foglio di cera dentale sotto l'asciugamano per proteggere la superficie sottostante dai danni (Figura 1C).
- Posizionare il punzone di biopsia della dimensione desiderata il più vicino possibile al corpo e lasciare che la pelle si rilassi. Non allungare la pelle o la dimensione della ferita sarà maggiore della dimensione del punzone designata (Figura 1D).
- Perforare la pelle premendo verso il basso, è possibile utilizzare un movimento a dondolo per garantire che tutti gli strati della pelle su entrambi i lati siano penetrati (Figura 1E). Usa un nuovo punzone di biopsia per ogni animale.
- Rimuovere le biopsie del punzone dalle ferite(Figura 1F). Se ci sono ancora siti di attaccamento utilizzare forbici sterili e pinzette per liberare il pugno dalla pelle circostante. Elaborare il tessuto di controllo della biopsia del punzone come richiesto in base ai piani a valle per le analisi di guarigione delle ferite (vedere Discussione per suggerimenti).
- Scatta fotografie macroscopiche da una distanza uguale dai siti della ferita o con un righello nel telaio per misurare l'area iniziale della ferita ed eliminare gli outlier dall'analisi.
- Somministrare l'analgesia per un minimo di 24 ore in conformità con un protocollo animale approvato. Ad esempio: Buprenorfina SR-LAB, iniettata come singola dose per via sottocutanea a 0,5-2 mg/kg per 48 ore di sollievo dal dolore (vedere Discussione per suggerimenti e considerazioni alternative).
- Monitorare il mouse mentre esce dall'anestesia fino a quando non mantiene una postura eretta e cammina normalmente intorno alla gabbia.
3. Monitoraggio post ferita
- Monitorare quotidianamente i topi alla ricerca di endpoint sperimentali come determinato dallo sperimentatore e in conformità e conformità con i protocolli istituzionali. Esempi includono: infezione, perdita di peso visibile o postura intuizioneta.
- Scatta fotografie macroscopiche quotidiane in modo controllato come è stato fatto dopo l'intervento chirurgico iniziale.
4. Raccogliere le ferite
- Eutanasia dei topi nel momento desiderato dopo il mento in conformità con un protocollo animale approvato.
- Scattare fotografie macroscopiche dei siti della ferita in modo controllato coerente con la precedente acquisizione di fotografie(Figura 2A,C).
- Tagliare un ampio rettangolo attorno ai siti della ferita utilizzando un bisturi( Figura 2D,E).
- Liberare il pezzo rettangolare di tessuto usando forbici e pinzette per sbucciare e tagliare la pelle lontano dal tessuto sottostante(Figura 2F). Mettere in una piastra di Petri(Figura 2G).
- Raccogli le ferite. Tagliare fino a 2 mm di tessuto non avvolto che circonda tutti i lati della ferita in forma rettangolare (Figura 2H,I). Vedi Discussione per opzioni alternative per raccogliere la ferita.
- Elaborare le ferite come richiesto per studi successivi. Riservare almeno una ferita per topo per l'incorporamento di paraffina e l'analisi istologica.
5. Fissazione e incorporamento delle ferite
- Fissare la ferita
- Fissare il tessuto della ferita in una soluzione di paraformaldeide al 4% preparata almomento 8 per 3 ore a temperatura ambiente, quindi trasferire a 4 °C durante la notte. La paraformaldeide di grado EM (Electron Microscopy) e la filtrazione della soluzione non sono necessarie.
- Lavare le ferite due volte per 30 minuti in 1x PBS.
- Sostituire PBS con 70% ETOH e conservare a 4 °C fino all'incorporamento. Elaborare i tessuti entro 24-48 ore per evitare la perdita di antigene o entro 1-2 settimane se si valutano solo le caratteristiche istologiche.
- Elaborare e incorporare la ferita
- Trasferire ogni ferita in una cassetta di incorporamento. Etichettare l'incorporamento delle cassette a matita in quanto il processo rimuoverà gli inchiostri.
- Elaborare il tessuto manualmente o utilizzando un processore automatizzato disidratando il tessuto con percentuali di etanolo crescenti, cancellando con xilene e quindi infiltrandosi nel tessuto con cera di paraffina(tabella 1).
- Incorporare la ferita di 90° ("in piedi") dalla superficie orizzontale dello stampo di incorporamento (Figura 3A,B).
6. Analisi dell'area ferita del giorno 0
- Scarica il software libero NIH-Image J o NIH-Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Apri un file con una fotografia delle ferite del giorno 0.
- Selezionare la casella "Area" in Analizza | Impostare le misure.
- Selezionare "Imposta scala" in Analizza. Immettere la distanza in pixel, la distanza corrispondente nota e l'unità della distanza (= unità di lunghezza) se le misurazioni macroscopiche fanno parte dello studio o saltare questo passaggio se sono necessarie solo misurazioni relative.
- Selezionate "Selezioni a mano libera " sullabarra degli strumenti delle Figi.
- Delineare il perimetro della ferita.
- Fare clic su Misura in Analizza.
- Creare un foglio di calcolo per tenere traccia delle misurazioni per animale per ferita.
- Copiare la misurazione dell'area della ferita nel foglio di calcolo.
- Calcolare l'area media e la deviazione standard di tutte le ferite per un determinato esperimento.
- Escludere dall'analisi istologica eventuali ferite al di fuori di due deviazioni standard della media.
7. Sessatura seriale
- Raffreddare i blocchi di ferita incorporati nella paraffina a 4 °C durante la notte.
- Inserire il blocco di paraffina sul supporto del blocco del microtomo e orientarlo in modo che la lama tagli direttamente sul blocco. Orientare il blocco in modo che il tessuto "si erge" a 90° consentendo la sessatura simultanea dell'epidermide e del derma (Figura 3C,D).
- Fare 2-4 nastri di 20-30 sezioni di paraffina di 7 μm ciascuna.
- Utilizzare un pennello asciutto e un ago da presa in giro per la dissezione per trasferire ogni nastro su una superficie ferma ma manipolabile come un foglio di plastica nero sodo.
- Staccare la sezione superiore di ogni nastro con una lama di rasoio e posizionarlo su uno scivolo al microscopio.
- Osservare le sezioni non macchiate al microscopio a campo luminoso per determinare quali contengono tessuto ferito, che può essere identificato dall'assenza di follicolo pilifero, cambiamenti nell'aspetto del tessuto connettivo o dell'epidermide e / o la presenza di una crosta (Figura 4A,B).
- Scartare sezioni non arrotondate fino a 20 sezioni prima dell'inizio della ferita.
- Se sezione attraverso la ferita ripetendo i passaggi 7.3 e 7.4 fino a quando non viene rilevata alcuna ferita in sezioni non macchiate.
8. Montaggio di sezioni di paraffina
- Separare le sezioni di paraffina ogni 5 sezioni con una lama di rasoio, a partire dal primo nastro (Figura 3E).
- Il microscopio a etichette scorre sia con il numero di diapositiva che con tutti i numeri di sezione.
- Afferrare il gruppo di 5 sezioni con un pennello bagnato e galleggiarle sulla superficie dell'acqua di un bagno d'acqua calda (40-45 °C) per appiattirle.
- Selezionare il gruppo di 5 sezioni dal bagno d'acqua utilizzando uno dei vetrini del microscopio etichettati (Figura 3F) e posizionarlo su uno scaldascivolo impostato a 37 °C per un massimo di 24 ore.
- Archiviare le diapositive in posizione verticale in una casella di diapositive.
9. Colorazione istologica
- Trasferire ogni8° vetrino del microscopio (equivalente a ogni 40th sezione di paraffina) in un rack di colorazione e macchiare con ematossilina ed eosina.
10. Imaging microscopico
- Acquisire immagini utilizzando un microscopio a campo luminoso dotato di un obiettivo 4x e capacità di acquisizione digitale. Registrare la scala in cui viene scattata l'immagine.
- Immagini l'intera ferita della sezione superiore di ogni diapositiva macchiata e assicurati di includere del tessuto non avvolto su entrambi i lati. Scatta più foto sovrapposte se la ferita è più grande della cornice di una singola immagine.
- Salvate il file, incluso il numero di sezione per l'analisi morfometrica. Utilizzare il numero di sezione seguito da a, b, c, ecc. per sovrapporre immagini della stessa ferita.
11. Analisi morfometrica
NOTA: quando la ferita si estende su più immagini, sommare le misurazioni effettuate dalle singole immagini per ottenere un valore per metrica per sezione ferita da registrare nel foglio di calcolo.
- In Image J, apri un file digitale di un'immagine macchiata della ferita. Non utilizzare immagini cucite per l'analisi. Esegui misurazioni su immagini sovrapposte ingrandite trovando punti di riferimento da lasciare e raccogli le misurazioni da un'immagine all'altra.
- Impostare la scala e le preferenze di misurazione.
- Selezionare "Imposta scala" in Analizza. Immettere la distanza in pixel, la distanza corrispondente nota e l'unità della distanza (= unità di lunghezza). La scala dovrebbe apparire nella finestra e dovrebbe corrispondere alla scala in cui è stata acquisita l'immagine.
- Selezionare la casella "Globale" per mantenere la scala uguale per ogni immagine aperta.
- Ripetere i passaggi da 11.2.1 a 11.2.2 ogni volta che l'immagine J viene chiusa e riaperta.
- Selezionare la casella "Area" in Analizza | Impostare le misure.
- Misurare la lunghezza della ferita
- Selezionate "Selezioni a mano libera " sullabarra degli strumenti delle Figi.
- Misurare a partire dall'ultimo follicolo pilifero del tessuto illeso su un lato della ferita al primo follicolo pilifero del tessuto illeso dall'altro lato della ferita (Figura 4A,B).
- Traccia lungo l'incrocio dermo-epidermico per raggiungere questi due punti di riferimento. Se l'epidermide non copre l'intera ferita, seguire la giunzione dermo-epidermica su un lato della ferita e dove termina la lingua migrata continua seguendo l'aspetto superiore del tessuto di granulazione o la giunzione tra il tessuto di granulazione e la crosta fino a raggiungere la lingua migratare e infine il primo follicolo pilifero del tessuto illeso dall'altra parte(Figura 4E,F).
- In Analizzafare clic su Misura. La lunghezza della misurazione apparirà nelle stesse unità impostate nella scala.
- Creare un foglio di calcolo per tenere traccia delle misurazioni (Tabella complementare 1).
- Copiare la lunghezza della ferita nel foglio di calcolo.
- Misurare la lunghezza epidermica
- Se l'epidermide copre l'intera ferita, la lunghezza epidermica è la stessa della lunghezza della ferita.
- Copiare la misurazione "lunghezza della ferita" nella colonna "lunghezza epidermica" nel foglio di calcolo di Excel e passare al passaggio 11.5.
- Se l'epidermide non copre l'intera ferita, selezionare le "selezioni a mano libera" e misurare la distanza tra ogni bordo d'attacco epidermico seguendo l'aspetto superiore del tessuto di granulazione o la giunzione tra il tessuto di granulazione e la crosta fino al primo follicolo pilifero(Figura 4C,D).
- In Analizzafare clic su Misura.
- Sottrarre questa misurazione dalla lunghezza della ferita e registrare il numero in "lunghezza epidermica" nel foglio di calcolo di Excel.
- Se l'epidermide copre l'intera ferita, la lunghezza epidermica è la stessa della lunghezza della ferita.
- Misurare l'area della ferita
- Selezionate "Selezioni a mano libera " sullabarra degli strumenti delle Figi.
- Misurare a partire dall'ultimo follicolo pilifero del tessuto illeso su un lato della ferita al primo follicolo pilifero del tessuto illeso dall'altra parte della ferita (Figura 4A, B, E,F).
- Tracciare lungo l'aspetto superiore dell'epidermide (non includere la crosta) o l'aspetto superiore del tessuto di granulazione se la ferita non è completamente coperta dall'epidermide.
- Continuare a tracciare verticalmente lungo il follicolo pilifero nel tessuto di granulazione una volta raggiunto il follicolo pilifero opposto e fino a raggiungere il tessuto adiposo o il muscolo. Seguire il bordo inferiore del tessuto di granulazione sul lato opposto della ferita e unire il punto di partenza lungo il follicolo pilifero per chiudere l'area (Figura 4E,F).
- In Analizzafare clic su Misura.
- Copiare l'area della ferita nel foglio di calcolo sotto "area ferita misurata".
- Misurare l'area epidermica
- Selezionate "Selezioni a mano libera " sullabarra degli strumenti delle Figi.
- Se la ferita è completamente epiteliale:
- Tracciare lungo l'aspetto superiore dell'epidermide fino a raggiungere il follicolo pilifero opposto e completare l'area "tornando" al punto di partenza seguendo la giunzione dermo-epidermica tra epidermide e derma(Figura 4D).
- In Analizzafare clic su Misura.
- Copiare l'area epidermica nel foglio di calcolo di Excel in "area epidermica misurata" e passare al passaggio 11.7.
- Se la ferita non è completamente epiteliale:
- Tracciare lungo l'aspetto superiore dell'epidermide fino al bordo anteriore e tornare al punto di partenza dopo la giunzione dermo-epidermica (Figura 4C).
- In Analizzafare clic su Misura.
- Ripetere i gradini 11.6.3.1 e 11.6.3.2 sul lato opposto della ferita.
- In Analizza fare clic su Misura.
- Sommare i due numeri ottenuti nei passaggi 11.6.3.2 e 11.6.3.4 e inserire il risultato sotto "area epidermica misurata" nel foglio di calcolo.
- Ripetere i passaggi da 11.3 a 11.6 ogni 40sezione (ogni8° diapositiva).
- Calcola l'area epidermica dell'intera ferita.
- Creare una nuova colonna nel foglio di calcolo "area epidermica calcolata" accanto a "lunghezza epidermica".
- Moltiplicare il numero per "lunghezza epidermica" per 280 per ogni sezione tranne l'ultima (sezione spessa 7 μm x 40 sezioni).
- Moltiplicare il numero per "lunghezza epidermica" per 7 per l'ultima sezione (spessore della sezione).
- Sommare il valore dell'"area epidermica calcolata" per ogni sezione per ottenere l'area epidermica dell'intera ferita.
- Calcola l'area della ferita dell'intera ferita.
- Ripetere i passaggi da 11.8.1 a 11.8.4 utilizzando le misurazioni della lunghezza della ferita.
- Calcola il volume epidermico dell'intera ferita.
- Ripetere i passaggi da 11.8.1 a 11.8.4 utilizzando le misure "area epidermica misurata".
- Calcola il volume della ferita dell'intera ferita.
- Ripetere i passaggi da 11.8.1 a 11.8.4 utilizzando le misure "area ferita misurata".
- Calcola la percentuale di volume epidermico nella ferita.
- Dividere il volume epidermico totale per il volume totale della ferita e moltiplicare per 100 per ottenere la percentuale (non fare questo rapporto per ogni sezione).
- Calcola la percentuale di area epidermica tra l'area della ferita.
- Dividere l'area epidermica totale per l'area totale della ferita e moltiplicare per 100 per ottenere la percentuale. Se una ferita è completamente epiteliale, questo numero dovrebbe essere 100.
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Representative Results
La figura 5 descrive l'intervallo in valori misurati e calcolati ottenuti eseguendo analisi morfometriche su ferite di tipo selvaggio generate in diversi ceppi di topi da più chirurghi e analizzate da diversi individui. Topi di tipo selvatico di diversi ceppi possono mostrare differenze statistiche come descritto sia nei nostri studi che nellaletteratura 9,10. Sulla base di questi risultati rappresentativi, raccomandiamo che, all'interno di uno studio, si usino topi di un solo ceppo. Sebbene raccomandiamo allo stesso individuo di eseguire tutte le ferite all'interno di un particolare studio, più individui potrebbero agire come chirurghi purché l'area delle ferite al giorno 0 non sia statisticamente diversa tra il lavoro dell'individuo. Infine, poiché l'analisi morfometrica descritta in questo protocollo può essere estesa, più individui potrebbero analizzare parti dello stesso esperimento, ma solo se i risultati della loro analisi di due campioni sono entro il 5% l'uno dall'altro. Tuttavia, è preferibile avere un singolo individuo che analizza le ferite in modo accecato per evitare pregiudizi.
La figura 6 mostra una meta-analisi che confronta le misurazioni delle ferite ottenute seguendo il protocollo descritto nelpresente studio 11 con misurazioni ottenute dal "centro" della ferita e 40 sezioni circostanti. Nella figura 6A, l'area epidermica e l'area della ferita sono state calcolate sulla base della misurazione della lunghezza epidermica e della ferita sulle sezioni delle ferite seguita dal calcolo della percentuale dell'area epidermica tra l'area della ferita (a volte indicata come "percentuale di chiusura" o "percentuale di epitelializzazione"). Analogamente, nella figura 6B, la percentuale dell'epidermide nella ferita è stata ottenuta come rapporto tra il volume epidermico (calcolato dall'area epidermica misurata) rispetto al volume della ferita (calcolato dall'area della ferita misurata). Per entrambi i parametri, l'analisi dell'intera ferita ha mostrato forti differenze statistiche tra i gruppi (fino a P < 0,001 dopo Anova uni-way). Tuttavia, il significato è diminuito (fino a P < 0,01 dopo Anova uni-way) quando sono state analizzate solo 40 sezioni al centro dell'oggetto. Questi risultati dimostrano una diminuzione del livello di significatività quando viene analizzato solo un sottoinsieme della ferita. Questi dati suggeriscono che i difetti con una piccola dimensione dell'effetto saranno probabilmente rilevati solo quando si esegue un'analisi morfometrica sull'intera ferita e che si perderanno fenotipi di guarigione delle ferite più lievi da un tipo di analisi "al centro della ferita".
La pratica comune per l'analisi della guarigione in vivo delle ferite comporta la misurazione dell'area della ferita su sezioni istologiche scelte da qualche parte nellaferita 12. Con questo in mente, la media dell'area della ferita misurata dalle sezioni seriali di intere ferite è stata confrontata con quella ottenuta dalle sezioni del sottoinsieme centrale. I risultati non hanno mostrato differenze significative tra gruppi sperimentali e tra metodo di analisi(figura 6C). Tuttavia, il protocollo corrente utilizza l'area misurata (mostrata nella figura 6C) sull'intera ferita per calcolare il volume della ferita. Come mostrato nella figura 6D, il volume calcolato della ferita (che può essere calcolato solo utilizzando l'analisi dell'intera ferita) è significativamente diverso tra i gruppi sperimentali. In sintesi, questi risultati rappresentativi dimostrano l'importanza di un'analisi istologica approfondita dei parametri di guarigione delle ferite descritti in questo protocollo al fine di rilevare fenotipi che altrimenti sarebbero stati persi utilizzando un'analisi di guarigione delle ferite più tradizionale.
Figura 1: Procedura bilaterale di ferita accisa. (A) Fotografia rappresentativa di un topo dopo il taglio e la rasatura dei capelli dall'area chirurgica. (B) La pelle pizzicata tra le scapole lungo la linea mediana dorsale. (C) Il topo posizionato su un lato con la pelle posata piatta. (D) Rappresentazione del posizionamento del punzone della biopsia. (E) Piegatura per la pelle perforata. (F) Il topo con due ferite bilaterali al giorno 0 e i tessuti di controllo della biopsia del punzone asportato, come indicato dalle frecce bianche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Procedura di raccolta delle ferite. (A-C) Fotografie macroscopiche di ferite eccisionali da 6 mm dopo 4 giorni (A), 7 giorni (B) e 11 giorni (C). (D-E) Con una lama bisturi, è stata fatta un'incisione cutanea a forma di un ampio rettangolo che include le ferite e il tessuto non arrotondato circostante. (F) La pelle è stata rilasciata dal tessuto sottostante con forcelle e forbici. (G) Rappresentazione delle ferite bilaterali raccolte. (H) La linea bianca punteggiata rappresenta il bordo del tessuto che sarebbe raccolto in seguito all'uso di una biopsia del punzone (questo metodo consente una quantità standardizzata di tessuto raccolto). (I) La linea bianca punteggiata rappresenta il bordo del tessuto che sarebbe tagliato per l'istologia (la forma rettangolare consente un più facile incorporamento). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione | Tempo (minuti) | Temperatura (Celsius) | Pressione (kPa) |
| 80% ETOH | 30 | Rt | N/D |
| 95% ETOH | 30 | Rt | N/D |
| 100% ETOH | 30 | Rt | N/D |
| Xilene | 30 | Rt | N/D |
| Xilene | 30 | Rt | N/D |
| Paraffina | 30 | 60 | 20 |
| Paraffina | 30 | 60 | 20 |
Tabella 1: Procedura di elaborazione del campione per l'incorporamento di paraffina. RT = temperatura ambiente. N/D = non applicabile.
Figura 3: Incorporamento e sessatura delle ferite. (A) Ferita lavorata con paraffina giace piatta in uno stampo di incorporamento. (B) La ferita è stata tenuta a 90° ("in piedi") dalla superficie orizzontale dello stampo per l'incorporamento. (C) La ferita incorporata nella paraffina correttamente orientata per la sessatura(D)Il blocco di paraffina montato sul microtomo è stato sesato in nastri di circa 20 sezioni(E)nastri di paraffina tagliati in incrementi a 5 sezioni come indicato dalle staffe bianche. (F) Le sezioni seriali poste piatte in un bagno d'acqua calda (40-45 °C) sono state montate su uno scivolo al microscopio. Il cartone animato in (A-C) rappresenta la ferita (arancione) nella pelle (blu) con il corretto orientamento dell'epidermide (e) e del derma (d) per ogni passo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Caratteristiche istologiche delle ferite e illustrazione dei parametri morfometrici. (A, B) Caratteristiche istologiche di una ferita di 6 mm del giorno 4 (A) e di un giorno 7 (B). (C-F) Rappresentazione delle diverse misure utilizzate per eseguire l'analisi morfometrica quantitativa: lunghezza dell'epidermide(C, D,linea nera punteggiata), area misurata dell'epidermide(C, D,area ombreggiata gialla), lunghezza della ferita(E, F,linea gialla punteggiata) e area misurata dell'intera ferita(E, F,area ombreggiata grigia). HF = follicolo pilifero; barra di scala = 1 mm.
Figura 5: Caratteristiche morfometriche delle ferite rappresentative di tipo selvaggio di 6 mm al giorno 4, al giorno 7 e al giorno 11 dopo il mento. Le trame sparse rappresentano i dati ottenuti dalle analisi morfometriche di ferite di tipo selvaggio di 6 mm generate in diversi ceppi di topi da più chirurghi e analizzate da diversi individui. (A) volume della ferita, (B) volume epidermico, (C) percentuale di epidermide nella ferita, (D) area della ferita (calcolata), (E) area epidermica (calcolata) e (F) percentuale di area epidermica tra l'area della ferita dimostrano l'intervallo di variazione dei valori morfometrici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: La meta-analisi confrontando i parametri ottenuti da tutta la ferita con il centro della ferita identifica nuovi difetti con maggiore significatività. La morfometria di guarigione delle ferite è stata eseguita il giorno 7 ferite iniettate con soluzione salina (controllo), trasformando il fattore di crescita beta 3 (Tgfb3), Tgfb3 con anticorpo neutralizzante (Tgfb3 + NAB) e neutralizzando solo anticorpi (NAB). Le misurazioni sono state effettuate su ferite seghe seriali ("intere") o su 40 sezioni dal centro della ferita ("al centro") e utilizzate per calcolare la percentuale di area epidermica sull'area della ferita(A),la percentuale di epidermide nella ferita (B) e il volume della ferita (D). (C) rappresenta la media della superficie della ferita misurata sull'intero o al centro della ferita. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, ns = anova unirezione non significativa). Questa cifra è stata modificata utilizzando i dati di Le etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella complementare 1: Esempio di foglio di calcolo per la registrazione di misurazioni morfometriche. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Il modello bilaterale di ferita accisa è una procedura altamente personalizzabile che può essere utilizzata per studiare molti aspetti diversi della guarigione delle ferite. Prima di iniziare un progetto di guarigione delle ferite, gli investigatori devono eseguire un'analisi del potere per determinare il numero di ferite necessarie per rilevare un difetto di una particolare dimensione dell'effetto. Esistono incongruenze all'interno della letteratura sul fatto che singoli topi o ferite debbano essere usati come repliche biologiche, tuttavia, un recente studio ha dimostrato che non esiste una correlazione significativa tra due ferite su unsingolo animale 4. Ciò suggerisce che le ferite di un singolo animale sono indipendenti l'una dall'altra e possono essere considerate come repliche biologiche, riducendo il numero di topi necessari per rilevare un difetto. Questo è rilevante quando si considerano piccole dimensioni degli effetti per le quali è richiesto un alto numero di ferite per raggiungere il significato4. Inoltre, i risultati del calcolo del potere possono influenzare quante ferite vengono eseguite su ogni animale, con 2 e 4 ferite per animale più comuni.
Anche il protocollo chirurgico stesso è altamente flessibile. Mentre si consiglia l'anestesia da parte del vaporizzatore di isoflurane a causa della breve lunghezza della procedura e del rapido recupero (10-15 minuti per mouse), gli investigatori senza accesso a un vaporizzatore possono utilizzare anestesia iniettabile tra cui ketamina / xiazina o pentobarbital. La selezione di un analgesico appropriato è particolarmente critica, in quanto riguarda le fasi infiammatorie della guarigione delle ferite. L'uso di farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) come la meglumina flunixina o meloxicam deve essere usato con cautela in quanto possono ridurre l'infiammazione. Gli oppioidi sono quindi preferiti negli studi in cui si sta indagando sull'infiammazione. Si consiglia l'analgesico (ad esempio, Buprenorfina a rilascio prolungato) che forniscono fino a 48 ore di analgesia ed eliminano la necessità di dosi ripetute e aggiuntive. Tutte le procedure chirurgiche devono essere eseguite in conformità con le linee guida federali e supportate da un protocollo animale approvato.
La guarigione delle ferite è un processo che comprende diverse fasi, ognuna delle quali è caratterizzata da diversi processi biologici che coinvolgono tipi cellulari distinti3. La fase infiammatoria si verifica tra i giorni 0 e 5, con la migrazione precoce di neutrofili polimorfonucleari (PMN) e macrofagi al sito della lesione13. La fase proliferativa avviene tra 3 e 14 giorni con la roeliizzazione che prende una quantità variabile di tempo in base alle dimensionidella ferita 14. In questo protocollo, abbiamo usato un pugno di biopsia da 6 mm e la maggior parte delle ferite sono state ro epitelializzate di 7 giorni. Tuttavia, questo lasso di tempo dovrebbe essere abbreviato se si utilizzavano punzoni più piccoli (sono disponibili fino a 1 mm). In combinazione con i punti di tempo precedenti, queste ferite più piccole possono essere preferibili per ridurre la quantità di analisi istologiche15. Infine, le fasi di rimodellamento e maturazione avvengono dopo 7 giorni e fino a un anno dopo l'infortunio16. Questi punti di tempo successivi potrebbero essere necessari per indagare sulla maturazione della ferita o per indagare sui ritardi di guarigione delle ferite negli animali da esperimento. Pertanto, l'investigatore dovrà determinare i punti critici necessari per indagare particolari fasi di guarigione delle ferite in base alla loro particolare ipotesi5.
L'analisi della guarigione delle ferite spesso non si limita alle analisi istologiche. Le sezioni di paraffina non macchiate possono essere utilizzate per analisi aggiuntive come l'immunofluorescenza o il tricromo di Masson per la deposizione di collagene. La lavorazione del tessuto di controllo (biopsie di punzonatura) e le fasi di raccolta del tessuto dipenderanno tutte da come, oltre alle analisi istologiche, viene valutata la guarigione delle ferite. Come parte del protocollo chirurgico, le biopsie dei punzoni vengono rimosse per generare la ferita adicisionale. Questi punzoni possono servire come tessuto di controllo non arrotondato per applicazioni a valle come proteine (per la profilazione occidentale o citochina), estrazione di DNA o RNA e devono essere elaborati di conseguenza. Si raccomanda di salvare almeno un pugno per l'analisi istologica, specialmente nei casi in cui la pelle viene trattata prima del mento (ad esempio, applicazione di tamoxifene per l'induzione della ricombinazione Cre-Lox17). L'esame del punzone può determinare l'effetto del trattamento sulla morfologia cutanea o semplicemente consentire la valutazione della morfologia cutanea di base del particolare modello di topo utilizzato. Le ferite non utilizzate per l'istologia possono essere raccolte con una biopsia del pugno che comprende le dimensioni della ferita. Questa procedura ha alcuni vantaggi, tra cui la raccolta della stessa quantità di tessuto indipendentemente dalle dimensioni della ferita (le ferite più grandi hanno meno tessuto sano circostante). Infine, descriviamo l'uso della paraformaldeide al 4% come fissante e paraffina come materiale per la conservazione e l'incorporamento dei tessuti, rispettivamente. Altri fissivi possono essere richiesti per determinate applicazioni e possono essere sostituiti (ad esempio, i fissivi di Carnoy o Bouin). Per la migliore colorazione immunofluorescente, il congelamento e l'incorporamento della ferita nel composto della temperatura di taglio ottimale seguito da sezionamento congelato rimane il metodo di scelta.
La sezione del tessuto ferito può presentare molte sfide, in particolare le ferite del giorno 4 a causa della presenza della crosta. Per generare sezioni di alta qualità, si consiglia di verificare che tutte le parti del microtomo siano strettamente fissate, che il supporto del blocco sia retratto nella sua posizione iniziale, che il supporto della lama sia impostato tra 0 e 10° e che la lama sia ben fissata ma non troppo tesa. Sebbene il blocco di paraffina sia refrigerato, il tessuto potrebbe ancora distruggere. Se la triturazione continua, un pezzo di ghiaccio può essere posizionato sul blocco per 5 minuti mentre è ancora montato. Una volta iniziato il sessamento, si consiglia vivamente di evitare di rimuovere il blocco dal microtomo per prevenire la perdita di sezioni di paraffina. È imperativo registrare tutte le sezioni di paraffina perse, sia i loro numeri che la loro classifica nel sezioni seriali. Ciò influenzerà l'analisi morfometrica e deve essere considerato. Dopo aver iniziato il sessatura, l'identificazione del tessuto ferito su sezioni non macchiate può essere difficile, specialmente se non ha familiarità con l'istologia. In caso di dubbio, si consiglia di essere conservativi e mantenere tutte le sezioni che contengono tessuto. Una volta eseguita la macchia istologica, l'organizzazione tissutale sarà più evidente e la ferita più distinta. Occasionalmente, i follicoli piliferi potrebbero non essere chiaramente visibili o essere lontani dal bordo della ferita. In tal caso, altre caratteristiche chiave del tessuto ferito possono essere utilizzate per stabilire i confini della ferita, tra cui un brusco aumento seguito da una diminuzione immediata dello spessore epidermico e bruschi cambiamenti nell'organizzazione del tessuto connettivo (Figura 4A-B).
L'imaging digitale è un passo fondamentale nell'analisi morfometrica. L'analisi morfometrica deve essere eseguita su singole immagini utilizzando un punto di riferimento su ogni immagine per evitare misurazioni ripetute. Tuttavia, è possibile cucire tutti i fotogrammi insieme utilizzando il software digitale ed eseguire l'analisi su una singola immagine. Anche se questo sembra più facile all'inizio, la manipolazione di un'immagine di grandi dimensioni può rallentare il processo di analisi. Anche la scelta della sezione è fondamentale per l'analisi. Anche se si consiglia di acquisire digitalmente la sezione superiore di ogni 8° diapositiva, la qualità della sezione dovrebbe essere prioritaria e il meglio delle 5 sezioni su quella diapositiva dovrebbe essere immaginato. Le sezioni con piccole pieghe potrebbero ancora essere analizzate stimando l'area / lunghezza della piega. Il numero di quella particolare sezione deve essere registrato sia nel file digitale che nel foglio di calcolo di Excel, in modo che la distanza tra la sezione analizzata precedente e quella successiva possa essere regolata di conseguenza.
Le ferite cutanee colpiscono circa 6,5 milioni di persone con un trattamento che costa oltre $ 25 miliardi all'anno18 e sono una componente intrinseca delle procedure chirurgiche oltre ad essere secondarie a molte altre preoccupazioni per la salute, tra cui diabete e obesità. Il topo è stato usato come modello conveniente per studiare le malattie umane a causa della facilità nella manipolazione del suo genoma, nonostante spesso mostri un sottile fenotipo rispetto al disturbo umano. Il modello bilaterale di ferita escisionale e la successiva analisi morfometrica descritta in questo protocollo sono significativi a causa della sua capacità di affrontare la difficoltà di rilevare difetti minori in un processo di guarigione delle feriteintrinsecamente complesso 19. Grazie alla sua maggiore sensibilità e alla ridotta variabilità, questo protocollo offre l'opportunità di utilizzare meno animali per ottenere la stessa sensibilità sperimentale. Il protocollo è altamente personalizzabile e può essere utilizzato per studiare tutte le fasi della riparazione dei tessuti. L'analisi morfometrica istologica dettagliata in combinazione con la caratterizzazione fenotipico del tessuto ha un grande potenziale per aumentare le conoscenze necessarie per promuovere la comprensione dei fattori critici che modulano la riparazione dei tessuti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Siamo grati a tutti i membri del Dunnwald Lab che hanno contribuito all'ottimizzazione di questo protocollo nel corso degli anni, e a Gina Schatteman la cui persistenza nel promuovere l'uso del sezionale seriale per l'analisi delle ferite ne ha reso possibile la creazione. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti da NIH /NIAMS a Martine Dunnwald (AR067739).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
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