Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية توليد الجروح الثنائية ذات السماكة الكاملة في الفئران وكيفية مراقبة الجروح وحصدها وإعدادها لتحليلها. يتضمن وصفاً متعمقاً لكيفية استخدام أقسام النسيج التسلسلية لتحديد عيوب المورفوميات وتحديدها بدقة والكشف عنها.
Abstract
وقد استخدم نموذج الجرح استئصال المورين على نطاق واسع لدراسة كل من المراحل المتداخلة بالتتابع من التئام الجروح: التهاب, انتشار وإعادة عرض. يتلقّى مورين جروح هدّم جيّدا نوعيّة جيّدا ويمكن التعرف على سرير جرح على أيّ هذا مراحل مختلفة من ال يشفي عملية يكون قابل للقياس. داخل الحقل، من الشائع استخدام "وسط" محدد بشكل تعسفي للجرح لإجراء تحليلات النسيج. ومع ذلك، فإن الجروح هي كيان ثلاثي الأبعاد وغالباً ما لا تكون متماثلة من الناحية النسيجية، مما يدعم الحاجة إلى طريقة واضحة المعالم وقوية للقياس الكمي للكشف عن عيوب المورفوميتري ذات الحجم الصغير للتأثير. في هذا البروتوكول، نحن وصف الإجراء لإنشاء الثنائية، كامل سمك الجروح الختان في الفئران، فضلا عن تعليمات مفصلة حول كيفية قياس معلمات morphometric باستخدام برنامج معالجة الصور على أقسام تسلسلية مختارة. وتستخدم قياسات البعدين لطول الجرح، وطول البشرة، ومنطقة البشرة، ومنطقة الجرح بالاقتران مع المسافة المعروفة بين الأقسام لاستقراء منطقة البشرة ذات الأبعاد الثلاثة التي تغطي الجرح، ومنطقة الجرح العام، وحجم البشرة وحجم الجرح. على الرغم من أن هذا التحليل النسيجي التفصيلي يستهلك الوقت والموارد أكثر من التحليلات التقليدية ، فإن دقته تزيد من احتمال اكتشاف الأنماط الظاهرية الجديدة في عملية شفاء الجروح المعقدة بطبيعتها.
Introduction
التئام الجروح الجلدية هو عملية بيولوجية معقدة مع مراحل متداخلة بالتتابع. وهو يتطلب تنسيق العمليات الخلوية والجزيئية التي يتم تنظيمها زمانيا ومكانيا من أجل استعادة وظيفة الحاجز للظهارة التالفة. في المرحلة الأولى، الالتهاب، العدلات والظامة تهاجر إلى الجرح، وحشد الدفاعات المحلية والنظامية1. وبعد المرحلة التحريضية وتداخلها هي مرحلة الانتشار. تبدأ الخلايا الليفية في الانتشار بسرعة والهجرة إلى أنسجة التحبيب. Keratinocytes بعيدا عن الحافة الرائدة تتكاثر اتجاهها نحو الجرح كما keratinocytes متباينة في الحافة الرائدة تهاجر لإعادة الظهارة الجرح2. وأخيرا، تبدأ مرحلة إعادة عرض ونضج، خلالها الخلايا الليفية في الأنسجة الحبيبية بدء توليف وإيداع الكولاجين. إعادة عرض وتنظيم المصفوفة الجديدة يمكن أن تستمر حتى 1 سنة بعد الإصابة3. بسبب تعقيد الأحداث المتداخلة التي تنطوي على عبر الحديث بين أنواع الخلايا المتعددة، وعلى الرغم من سنوات من البحث، العديد من الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة التئام الجروح لا تزال غير مفهومة.
نموذج الفأر هو نموذج الثدييات السائدة للتحقيق في آليات التئام الجروح نظرا لسهولة استخدامها، وانخفاض التكلفة نسبيا و المنقلبية الوراثية1،4،5. على الرغم من أن أنواع مختلفة من الجروح قد وصفت في نموذج مورين, الأكثر شيوعا هو جرح ختان (إما لكمة ثنائية أو خزعة لكمة مباشرة), تليها نماذج الجرح شقي4. نموذج الجرح الختان له ميزة متميزة على نموذج شقي كما أنه يولد بطبيعته الأنسجة السيطرة التي لم تخضع لعملية الشفاء. يمكن معالجة نسيج الخزعة التي يتم استئصالها كجزء من البروتوكول الجراحي بنفس الطريقة التي تتم بها معالجة الأنسجة المجروحة واستخدامها لتحديد الظروف المثلية للمعيار المطلوب. قد تكون أنسجة التحكم المُخَلَّة مفيدة أيضًا إذا قيّم آثار المعالجة المسبقة للجلد أو تأكيد التغيير الجيني الناجح في وقت الإصابة4.
يمكن تقييم المعلمات الشفاء من خلال العديد من التقنيات المختلفة، بما في ذلك قياس الألواح أو علم الأنسجة. ومع ذلك ، يمكن تقييم المقاييس فقط تقييم الخصائص المرئية للجرح ، وبسبب وجود الجرب ، في كثير من الأحيان لا يرتبط بقياسات الشفاء التي تصورها الأنسجة ، مما يجعل علم الأنسجة "المعيار الذهبي" للتحليل4. على الرغم من التحليل النسيجي كونه معيار الذهب، وغالبا ما يتم تنفيذها على مجموعة فرعية تعسفية من الجرح6،7. على سبيل المثال، قطع الجرح في "نصف" قبل تضمين وقسمة الجرح هو حاليا ممارسة شائعة للحد من الوقت والموارد التي تنفق على مواد القسم وتحليل البيانات. وقد تم تطوير طريقة تحليل morphometric الموصوفة في هذا البروتوكول لتشمل كامل أنسجة الجرح، لتعكس بدقة الخصائص المورفولوجية للجرح، وزيادة احتمال الكشف عن عيوب التئام الجروح ذات الحجم الصغير. في هذا البروتوكول، ونحن بالتفصيل طريقة جراحية لتوليد الجرح مورين الأكثر شيوعا درس، والثنائية كامل سمك الجرح الختان، فضلا عن طريقة مفصلة وصارمة لتحليل النسيجية نادرا ما تستخدم في هذا المجال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم الانتهاء من جميع التجارب وفقا للأنظمة الاتحادية وسياسة جامعة ايوا والإجراءات التي وافقت عليها جامعة ايوا IACUC.
1- الحيوانات وتربية الحيوانات
- استخدام الفئران الكبار من خط الماوس المطلوب في 8-10 أسابيع من العمر عندما تكون مرحلة بصيلات الشعر في telogen.
- في يوم الجراحة ، فصل الفئران إلى أقفاص نظيفة ومنزل فردي لتقليل اضطراب الجروح.
2. الجراحة
ملاحظة: من غير الضروري الحفاظ على ظروف جراحية معقمة. في حين ينبغي توخي الحذر للحفاظ على العقم بين الحيوانات ، يتم خزعة اللكمة نفسها على سطح نظيف ، ولكن غير معقمة. مدة الجراحة لكل هي بين 10 و 15 دقيقة.
- تخدير
- تخدير الحيوان لمدة 1-2 دقيقة في غرفة التعريفي مع مرذاذ isoflurane تعيين إلى معدل تدفق 4-5٪ ومقياس تدفق الأكسجين تعيين في 1 لتر في الدقيقة. انظر مناقشة لخيارات التخدير البديلة.
- تأكيد التخدير السليم قبل البدء في الإجراء. يمكن تأكيد عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع إصبع قوية.
- نقل الماوس من حاوية التعريفي إلى مخروط الأنف وخفض معدل تدفق isoflurane إلى 1.5٪ ومقياس تدفق الأكسجين إلى 0.5 لتر / دقيقة.
- تطبيق مرهم العيون على كلتا العينين حيث يتجاوز الإجراء 5 دقائق.
- الحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية باستخدام لوحة حرارية.
- إعداد موقع الجرح
- استخدام مقص الحلاقة الكهربائية في الحركة مجرى السد لإزالة الفراء على الجزء الخلفي من الماوس على مستوى الكتف. إزالة الشعر أقل على ظهره حسب الحاجة إذا كان أداء أكثر من اثنين من الجروح.
- إزالة الشعر المتبقية باستخدام شفرة الحلاقة في حركة السدس rostral عقد في 20 درجة من الجزء الخلفي من الماوس لحلق المنطقة قص عن كثب (الشكل 1A).
- تنظيف المنطقة الحليقة مع مسحة بوديوني اليود.
- مسح الجلد مع العقيمة 70٪ isopropyl الكحول الإعدادية وسادة للحد من تهيج الجلد المحتملة من مسحة اليود.
- اصابه
- قرصة الجلد بين ريش الكتف على طول خط الوسط الظهر وسحب جلد تقع بعيدا عن الجسم (الشكل 1B).
- ضع الماوس على جانبه مع مضاعفة الجلد على سطح مستوٍ مع منشفة نظيفة مبنية على الورق أو ما يعادلها. استخدام ورقة من الشمع الأسنان تحت منشفة لحماية السطح الكامنة من التلف (الشكل 1C).
- ضع لكمة الخزعة من الحجم المطلوب أقرب ما يكون إلى الجسم قدر الإمكان، واسمح للبشرة بالاسترخاء. لا تمتد الجلد، أو حجم الجرح سوف يكون أكبر من حجم لكمة المعينة (الشكل 1D).
- لكمة الجلد عن طريق الضغط على أسفل، ويمكن استخدام حركة هزاز لضمان جميع طبقات الجلد على كلا الجانبين قد اخترقت (الشكل 1E). استخدام لكمة خزعة جديدة لكل.
- إزالة الخزعات لكمة من الجروح (الشكل 1F). إذا كان هناك لا تزال مواقع المرفق استخدام مقص معقمة وملاقط لتحرير لكمة من الجلد المحيطة بها. معالجة نسيج التحكم في خزعة لكمة كما هو مطلوب استناداً إلى خطط المصب لتحليل الجروح الشفاء (انظر مناقشة للحصول على اقتراحات).
- التقاط صور العيانية من مسافة متساوية إلى مواقع الجروح أو مع مسطرة في الإطار من أجل قياس منطقة الجرح الأولي وإزالة القيم المتطرفة من التحليل.
- إدارة المسكنات بحد أدنى 24 ساعة وفقا لبروتوكول معتمد الحيوانية. على سبيل المثال: Buprenorphine SR-LAB، حقن كجرعة واحدة تحت الجلد في 0.5-2 ملغ/كغ لمدة 48 ساعة من تخفيف الألم (انظر المناقشة للحصول على اقتراحات واعتبارات بديلة).
- مراقبة الماوس لأنها تأتي من التخدير حتى يحافظ على وضعية تستقيم ويسير عادة حول القفص.
3- رصد الجروح بعد
- مراقبة الفئران يوميا لنقاط النهاية التجريبية كما يحددها المحقق ووفقا للبروتوكولات المؤسسية والامتثال لها. ومن الأمثلة على ذلك: العدوى، وفقدان الوزن المرئي، أو وضعية الحدس.
- التقاط صور العيانية يوميا بطريقة خاضعة للرقابة كما تم القيام به بعد الجراحة الأولية.
4- حصاد الجروح
- القتل الرحيم الفئران في نقطة الوقت المطلوب بعد الجرح وفقا لبروتوكول الحيوان المعتمدة.
- التقاط صور العيانية لمواقع الجروح بطريقة خاضعة للرقابة بما يتفق مع اقتناء الصور السابقة (الشكل 2A, C).
- قطع مستطيل واسع حول مواقع الجروح باستخدام مشرط (الشكل 2D, E).
- حرّر قطعة مستطيلة من الأنسجة باستخدام المقصات والملاقط لتقشيرها وقطع الجلد بعيداً عن النسيج الكامن(الشكل 2F). مكان في طبق بيتري (الشكل 2G).
- احصد الجروح تقليم وصولا الى 2 ملم من الأنسجة غير المفككة المحيطة بجميع جوانب الجرح في شكل مستطيل(الشكل 2H,I). انظر مناقشة لخيارات بديلة لحصاد الجرح.
- معالجة الجروح كما هو مطلوب للدراسات اللاحقة. حجز جرح واحد على الأقل لكل فأرة لتضمين البارافين والتحليل النسيجي.
5. تثبيت الجروح وتضمينها
- إصلاح الجرح
- إصلاح نسيج الجرح في حديثا أعد 4٪ حل شبه شكلي8 ل 3 ح في درجة حرارة الغرفة ثم نقل إلى 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لا يلزم إجراء المجهر الإلكتروني (EM) من الدرجة شبه الشكلية وتصفية الحل.
- غسل الجروح مرتين لمدة 30 دقيقة في 1X PBS.
- استبدال برنامج تلفزيوني مع ETOH 70٪ وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى تضمين. معالجة الأنسجة داخل 24-48 ساعة لتجنب فقدان المستضد أو في غضون 1-2 أسابيع إذا فقط تقييم الخصائص النسيجية.
- معالجة الجرح وتضمينه
- نقل كل جرح إلى شريط التضمين. تسمية التضمين كاسيت في قلم رصاص كما عملية إزالة الأحبار.
- معالجة الأنسجة إما يدويا أو باستخدام معالج الآلي عن طريق التجفيف الأنسجة مع زيادة النسب المئوية الإيثانول، وإزالة مع الزيلين، ومن ثم التسلل الأنسجة مع الشمع البارافين(الجدول 1).
- تضمين الجرح 90 درجة ("الدائمة") من السطح الأفقي للقالب التضمين (الشكل 3A, B).
6. اليوم 0 تحليل منطقة الجرح
- تنزيل البرامج الخالية من NIH-Image J أو NIH-Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- افتح ملفاً مع صورة لجروح اليوم 0.
- حدد خانة"المنطقة"ضمن تحليل | تعيين القياسات.
- حدد "تعيين مقياس" ضمن تحليل. أدخل المسافة بالبكسل، والمسافة المقابلة المعروفة ووحدة المسافة (= وحدة الطول) إذا كانت القياسات العيانية جزءًا من الدراسة أو تخطي هذه الخطوة إذا كانت القياسات النسبية مطلوبة فقط.
- حدد"التحديدات اليدوي"على شريط أدوات فيجي.
- الخطوط العريضة محيط الجرح.
- انقر على قياس ضمن تحليل.
- إنشاء جدول بيانات لتتبع القياسات لكل لكل جرح.
- انسخ قياس منطقة الجرح في جدول البيانات.
- احسب المنطقة الوسطية والانحراف المعياري لكافة الجروح لتجربة معينة.
- استبعاد أي جروح خارج انحرافين معياريين للوسط من التحليل النسيجي.
7- القطاعات التسلسلية
- هدئ كتل الجرح البارافين جزءا لا يتجزأ في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- إدراج كتلة البارافين على حامل كتلة من microtome والمتجه حتى شفرة سوف تقطع مباشرة عبر الكتلة. توجيه كتلة بحيث الأنسجة "تقف" في 90 درجة مما يسمح في وقت واحد من قسم البشرة والأدمة (الشكل 3C, D).
- جعل 2-4 شرائط من 20-30 أقسام البارافين من 7 ميكرومتر لكل من.
- استخدام فرشاة الطلاء الجاف وإبرة إغاظة تشريح لنقل كل الشريط إلى سطح الشركة بعد التلاعب مثل ورقة بلاستيكية سوداء ثابتة.
- فصل الجزء العلوي من كل شريط مع شفرة حلاقة ووضعها على شريحة المجهر.
- مراقبة المقاطع غير المطهوة تحت المجهر brightfield لتحديد تلك التي تحتوي على الأنسجة الجرحى، والتي يمكن تحديدها من خلال عدم وجود بصيلات الشعر، والتغيرات في مظهر النسيج الضام أو البشرة، و / أو وجود الجرب (الشكل 4A، B).
- تجاهل الأجزاء غير المُجَوَّلة حتى 20 مقطعًا قبل بداية الجرح.
- مقطع من خلال الجرح عن طريق تكرار الخطوتين 7.3 و 7.4 حتى يتم الكشف عن أي جرح في المقاطع غير الملطخة.
8. تركيب من أقسام البارافين
- مقاطع البارافين منفصلة كل 5 أقسام مع شفرة حلاقة، بدءا من الشريط الأول (الشكل 3E).
- تسمية شرائح المجهر مع كل من رقم الشريحة وجميع أرقام المقطع.
- الاستيلاء على مجموعة من 5 أقسام مع فرشاة الطلاء الرطب وتعويم لهم على سطح الماء من حمام الماء الدافئ (40-45 درجة مئوية) لتسطيح بها.
- اختيار مجموعة من 5 أقسام من حمام الماء باستخدام واحدة من الشرائح المجهر المسمى(الشكل 3F)ووضع على مجموعة الشرائح أكثر دفئا في 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.
- تخزين الشرائح في مربع شريحة.
9. التلطيخ النسيجي
- نقل كل شريحة المجهر8 (أي ما يعادل كل 40th قسم البارافين) إلى رف تلطيخ وصمة عار مع الهماتوسلين ويوسين.
10. التصوير المجهري
- الحصول على الصور باستخدام مجهر حقل مشرق مجهزة 4x الهدف وقدرات اقتناء الرقمية. تسجيل المقياس الذي يتم به التقاط الصورة.
- صورة الجرح الكامل من الجزء العلوي من كل شريحة ملطخة وتأكد من أن تشمل بعض الأنسجة غير مفككة على جانبي. التقاط صور متعددة متداخلة إذا كان الجرح أكبر من إطار صورة واحدة.
- حفظ الملف بما في ذلك رقم المقطع لتحليل morphometric. استخدم رقم القسم متبوعاً بـ a، b، c، إلخ، للحصول على صور متداخلة لنفس الجرح.
11- التحليل المورفومي
ملاحظة: عندما يمتد الجرح إلى صور متعددة، قم بتلخيص القياسات المأخوذة من الصور الفردية للحصول على قيمة واحدة لكل وحدة قياس لكل جرح لتسجيلها في جدول البيانات.
- في صورة J، فتح ملف رقمي من صورة الجرح الملون. لا تستخدم الصور المخيطة للتحليل. قم بإجراء قياسات على الصور المتراكبة المكبرة عن طريق العثور على معالم لتتركها وتلتقط القياسات من صورة إلى أخرى.
- تعيين تفضيلات القياس والقياس.
- حدد "تعيين مقياس" ضمن تحليل. أدخل المسافة بالبكسل، والمسافة المقابلة المعروفة، ووحدة المسافة (= وحدة الطول). وينبغي أن يظهر الجدول في النافذة وأن يتوافق مع المقياس الذي تم الحصول عليه من الصورة.
- حدد المربع "Global" للحفاظ على نفس المقياس لكل صورة مفتوحة.
- كرر الخطوات من 11.2.1 إلى 11.2.2 كل مرة يتم فيها إغلاق صورة J وإعادة فتحها.
- حدد خانة"المنطقة"ضمن تحليل | تعيين القياسات.
- قياس طول الجرح
- حدد"التحديدات اليدوي"على شريط أدوات فيجي.
- قياس بدءا من بصيلات الشعر الأخير من الأنسجة غير المصابة على جانب واحد من الجرح إلى بصيلات الشعر الأولى من الأنسجة غير المصابة على الجانب الآخر من الجرح(الشكل 4A, B).
- تتبع على طول تقاطع dermo البشرة للوصول إلى هذين المعلمين. إذا لم تغط البشرة الجرح بأكمله، اتبع تقاطع البشرة الجلدية على جانب واحد من الجرح وحيث ينتهي اللسان المهاجر يستمر في متابعة الجانب المتفوق من أنسجة التحبيب أو التقاطع بين أنسجة التحبيب والجرب حتى تصل إلى اللسان المهاجر ثم أخيراً أول جريب شعر للأنسجة غير المصابة على الجانب الآخر(الشكل 4E, F).
- ضمن تحليل، انقر فوق قياس. سيظهر طول القياس في نفس الوحدات كما هو مُحدد في المقياس.
- إنشاء جدول بيانات لتتبع القياسات (الجدول التكميلي 1).
- انسخ طول الجرح في جدول البيانات.
- قياس طول البشرة
- إذا كانت البشرة تغطي الجرح بأكمله، طول البشرة هو نفس طول الجرح.
- نسخ قياس "طول الجرح" في العمود "طول البشرة" في جدول بيانات Excel ثم تخطي إلى الخطوة 11.5.
- إذا لم يغطي البشرة الجرح بأكمله، حدد"التحديدات الحرة"وقياس المسافة بين كل حافة رائدة البشرة التالية الجانب متفوقة من نسيج التحبيب أو تقاطع بين أنسجة التحبيب والجرب إلى بصيلات الشعر الأولى(الشكل 4C، D).
- ضمن تحليل، انقر فوق قياس.
- طرح هذا القياس من طول الجرح وتسجيل الرقم تحت "طول البشرة" في جدول بيانات Excel.
- إذا كانت البشرة تغطي الجرح بأكمله، طول البشرة هو نفس طول الجرح.
- قياس منطقة الجرح
- حدد"التحديدات اليدوي"على شريط أدوات فيجي.
- قياس بدءا من بصيلات الشعر الأخير من الأنسجة غير المصابة على جانب واحد من الجرح إلى بصيلات الشعر الأولى من الأنسجة غير المصابة على الجانب الآخر من الجرح(الشكل 4A, B, E, F).
- تتبع على طول الجانب متفوقة من البشرة (لا تشمل الجرب) أو الجانب متفوقة من نسيج التحبيب إذا لم يكن الجرح مغطى بالكامل من قبل البشرة.
- الاستمرار في تتبع عموديا على طول بصيلات الشعر في أنسجة التحبيب مرة واحدة يتم التوصل إلى بصيلات الشعر المعاكس وحتى يتم التوصل إلى الأنسجة الدهنية أو العضلات. اتبع الحدود السفلية للأنسجة المحببة إلى الجانب الآخر من الجرح وانضم إلى نقطة البداية على طول بصيلات الشعر لإغلاق المنطقة (الشكل 4E, F).
- ضمن تحليل، انقر فوق قياس.
- انسخ منطقة الجرح في جدول البيانات تحت "منطقة الجرح المقاسة".
- قياس منطقة البشرة
- حدد"التحديدات اليدوي"على شريط أدوات فيجي.
- إذا كان الجرح ظهاري بالكامل:
- تتبع على طول الجانب متفوقة من البشرة حتى يتم التوصل إلى بصيلات الشعر المعاكس واستكمال المنطقة عن طريق "العودة" إلى نقطة البداية التالية تقاطع البشرة dermo بين البشرة والأدمة (الشكل 4D).
- ضمن تحليل، انقر فوق قياس.
- انسخ منطقة البشرة في جدول بيانات Excel تحت "منطقة البشرة المقاسة" ثم انتقل إلى الخطوة 11.7.
- إذا لم يكن الجرح ظهاري بالكامل:
- تتبع على طول الجانب متفوقة من البشرة حتى الحافة الرائدة والعودة إلى نقطة البداية بعد تقاطع dermo-البشرة (الشكل 4C).
- ضمن تحليل، انقر فوق قياس.
- كرر الخطوة 11.6.3.1 و 11.6.3.2 على الجانب المقابل من الجرح.
- ضمن تحليل، انقر فوق قياس.
- جمع الرقمين المحصّلين في الخطوتين 11.6.3.2 و11.6.3.4 وأدخل النتيجة تحت "منطقة البشرة مقيسة" في جدول البيانات.
- كرر الخطوات من 11.3 إلى 11.6 على كل مقطع40 (كل شريحة8).
- حساب منطقة البشرة من الجرح بأكمله.
- إنشاء عمود جديد في جدول البيانات "منطقة البشرة محسوبة" بجانب "طول البشرة".
- اضرب الرقم لـ "طول البشرة" في 280 لكل قسم باستثناء المقطع الأخير (7 ميكرومتر سميكة قسم × 40 قسم).
- اضرب الرقم ل "طول البشرة" في 7 للقسم الأخير (سمك القسم).
- جمع قيمة "منطقة البشرة المحسوبة" لكل قسم للحصول على منطقة البشرة من الجرح بأكمله.
- حساب منطقة الجرح من الجرح بأكمله.
- كرر الخطوات من 11.8.1 إلى 11.8.4 باستخدام قياسات طول الجرح.
- حساب حجم البشرة من الجرح بأكمله.
- كرر الخطوات من 11.8.1 إلى 11.8.4 باستخدام قياسات "قياس المنطقة الجلدية".
- حساب حجم الجرح من الجرح بأكمله.
- كرر الخطوات من 11.8.1 إلى 11.8.4 باستخدام قياسات "قياس منطقة الجرح".
- حساب النسبة المئوية لحجم البشرة في الجرح.
- تقسيم حجم البشرة الإجمالي على حجم الجرح الإجمالي وضرب 100 للحصول على النسبة المئوية (لا تفعل هذه النسبة لكل قسم).
- حساب النسبة المئوية لمنطقة البشرة بين منطقة الجرح.
- تقسيم مجموع منطقة البشرة على مجموع منطقة الجرح وضرب 100 للحصول على النسبة المئوية. إذا كان الجرح ظهاري بالكامل، يجب أن يكون هذا العدد 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
5- يصور الشكل 5 النطاق في القيم المقاسة والمحسوبة التي تم الحصول عليها من خلال إجراء تحليل مُرفومتري على الجروح البرية التي تُولَّد في سلالات ماوس مختلفة من قبل جراحين متعددين وتحليلها من قبل أفراد مختلفين. يمكن للفئران البرية من نوع من سلالات مختلفة عرض الاختلافات الإحصائية كما هو موضح في كل من دراساتنا وفي الأدب9،10. وبناء على هذه النتائج التمثيلية، نوصي باستخدام فئران من سلالة واحدة فقط ضمن دراسة واحدة. على الرغم من أننا نوصي بأن نفس الفرد أداء جميع الجروح في دراسة معينة، يمكن أن يكون عدة أفراد بمثابة الجراحين طالما أن منطقة الجروح في اليوم 0 لا تختلف إحصائيا بين عمل الفرد. وأخيراً، لأن التحليل المُرُفومي الموصوف في هذا البروتوكول يمكن أن يكون واسع النطاق، فإن العديد من الأفراد يمكنهم تحليل أجزاء من نفس التجربة، ولكن فقط إذا كانت نتائج تحليلهم لعينتين ضمن 5٪ من بعضهم البعض. ومع ذلك، فمن الأفضل أن يكون فرد واحد تحليل الجروح بطريقة أعمى لتجنب التحيز.
ويعرض الشكل 6 تحليلاً تلويًا يقارن قياسات الجروح التي تم الحصول عليها باتباع البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة11 مع القياسات التي تم الحصول عليها من "وسط" الجرح و40 قسماً محيطاً. في الشكل 6A،تم حساب منطقة البشرة ومنطقة الجرح من قياس أطوال البشرة والجرح على أقسام الجروح متبوعة بحساب النسبة المئوية لمنطقة البشرة بين منطقة الجرح (يشار إليها أحيانًا باسم "النسبة المئوية للإغلاق" أو "النسبة المئوية للظهارة"). وبالمثل، في الشكل 6B، تم الحصول على النسبة المئوية للبشرة في الجرح كنسبة من حجم البشرة (محسوبة من منطقة البشرة المقاسة) على حجم الجرح (محسوبة من منطقة الجرح المقاس). بالنسبة لكلا المعلمتين ، أظهر تحليل الجرح بأكمله اختلافات إحصائية قوية بين المجموعات (حتى P < 0.001 بعد أنوفا ذات اتجاه واحد). ومع ذلك ، فقد انخفضت الأهمية (حتى P < 0.01 بعد Anova ذات اتجاه واحد) عندما تم تحليل 40 مقطعًا فقط في منتصف الـ. هذه النتائج تظهر انخفاضا في مستوى الأهمية عندما يتم تحليل مجموعة فرعية فقط من الجرح. وتشير هذه البيانات إلى أن العيوب ذات الحجم الصغير للتأثير من المرجح أن يتم الكشف عنها فقط عند إجراء تحليل مورفوميتري على الجرح بأكمله، وأنه سيتم تفويت الأنماط الظاهرية التئام الجروح أكثر من "منتصف الجرح" نوع من التحليل.
الممارسة الشائعة لتحليل في التئام الجروح في الجسم الحي ينطوي على قياس منطقة الجرح على أقسام النسيج المختارة في مكان ما في الجرح12. مع أخذ ذلك في الاعتبار، تم مقارنة متوسط منطقة الجرح قياس من المقاطع المسلسل من الجروح بأكملها مع واحد من الأجزاء الفرعية الوسطى. وأظهرت النتائج لا فرق كبير بين المجموعات التجريبية وبين طريقة التحليل (الشكل 6C). ومع ذلك، يستخدم البروتوكول الحالي المنطقة المقاسة (الموضحة في الشكل 6C)على الجرح بأكمله لحساب حجم الجرح. كما هو مبين في الشكل 6D، فإن حجم الجرح المحسوب (الذي يمكن حسابه فقط باستخدام تحليل الجرح بأكمله) يختلف بشكل كبير بين المجموعات التجريبية. باختصار، هذه النتائج التمثيلية توضح أهمية التحليل النسيجي المتعمق لبارامترات التئام الجروح الموصوفة في هذا البروتوكول من أجل الكشف عن الأنماط الظاهرية التي كانت ستفوت باستخدام تحليل التئام الجروح التقليدي.
الشكل 1: إجراء ثنائي لجرح الختان. (أ)صورة تمثيلية ماوس بعد قص الشعر من المنطقة الجراحية. (B) الجلد مقروص بين ريش الكتف على طول خط الوسط الظهري. (C) وضع الماوس على جانبها مع الجلد وضعت شقة. (D) تمثيل خزعة لكمة التنسيب. (E) لكمات الجلد. (F) الفأر مع اثنين من الجروح الثنائية في اليوم 0 وختانة خزعة الأنسجة التحكم كما هو مبين من السهام البيضاء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إجراء حصاد الجروح. (أ - ج) صور العيانية لجروح ختان 6 مم بعد 4 أيام (A) ، 7 أيام (B) و 11 يومًا (C). (D-E) مع شفرة مشرط ، تم إجراء شق الجلدي في شكل مستطيل واسع يتضمن الجروح والأنسجة المحيطة. (F) تم إطلاق الجلد من الأنسجة الكامنة مع ملقط ومقص. (G) تمثيل الجروح الثنائية المقطوعة. (H) الخط الأبيض المنقط يمثل حدود الأنسجة التي سيتم حصادها بعد استخدام خزعة لكمة (هذه الطريقة تسمح لكمية موحدة من الأنسجة المقطوعة). (I) يمثل الخط الأبيض المنقط حدود الأنسجة التي سيتم تشذيبها لل النسيج (الشكل المستطيل يسمح بسهولة التضمين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حل | الوقت (دقائق) | درجة الحرارة (مئوية) | الضغط (كيلو باسكال) |
| 80٪ ETOH | 30 | Rt | غير مُنَدِيًا |
| 95٪ ETOH | 30 | Rt | غير مُنَدِيًا |
| 100٪ ETOH | 30 | Rt | غير مُنَدِيًا |
| زيلين | 30 | Rt | غير مُنَدِيًا |
| زيلين | 30 | Rt | غير مُنَدِيًا |
| البارافين | 30 | 60 | 20 |
| البارافين | 30 | 60 | 20 |
الجدول 1: إجراء معالجة العينات من أجل تضمين البارافين. RT = درجة حرارة الغرفة. غير قابل للتطبيق.
الشكل 3: تضمين الجروح والقطع. (A) الجرح البارافين المجهزة ملقاة مسطحة في قالب التضمين. (ب) تم عقد الجرح في 90 درجة ("الدائمة") من السطح الأفقي للقالب لتضمينها. (C) البارافين جزءا لا يتجزأ من الجرح الموجه بشكل صحيح للقطع (D) تم تقسيم كتلة البارافين التي شنت على microtome إلى شرائط من حوالي 20 قسما (E) شرائط البارافين قص في 5-قسم الزيادات كما هو مبين من قبل الأقواس البيضاء. (F) وضعت أقسام المسلسل شقة في حمام الماء الدافئ (40-45 درجة مئوية) شنت على شريحة المجهر. الكرتون في (A-C) يمثل الجرح (البرتقالي) في الجلد (الأزرق) مع الاتجاه السليم للبشرة (ه) والأدمة (د) لكل خطوة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الخصائص النسيجية للجروح وتوضيح المعلمات المورفوميترية. (أ، ب) الملامح النسيجية ليوم 4 (أ) ويوم 7 (B) 6 ملم الجرح. (C-F) تمثيل القياسات المختلفة المستخدمة لإجراء التحليل الكمي للمورومتر: طول البشرة (C, D, خط أسود منقط) ، منطقة مقاسة من البشرة (C, D, منطقة مظللة صفراء) ، طول الجرح (E, F, خط أصفر منقط) ومنطقة قياس الجرح بأكمله (E, F, منطقة مظللة باللون الرمادي). HF = بصيلات الشعر; شريط مقياس = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الخصائص المورفومية لجروح من النوع البري من نوع 6 مم في اليوم 4 واليوم 7 واليوم 11 بعد الإصابة. تمثل المؤامرات المتناثرة بيانات تم الحصول عليها من تحليلات morphometric لجروح من نوع البرية 6 مم ولدت في سلالات فأر مختلفة من قبل جراحين متعددين وتحليلها من قبل أفراد مختلفين. (أ) حجم الجرح،(ب) حجم البشرة، (C) النسبة المئوية للبشرة في الجرح، (D) منطقة الجرح (محسوبة)،(E) منطقة البشرة (محسوبة)، و (F) النسبة المئوية لمنطقة البشرة بين منطقة الجرح توضح مدى الاختلاف في قيم المورفومترية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تحليل التلوي مقارنة المعلمات التي تم الحصول عليها من الجرح كله مع منتصف الجرح يحدد العيوب الجديدة ذات الأهمية العليا. تم إجراء morphometry التئام الجروح في اليوم 7 الجروح حقنها مع المالحة (السيطرة)، وتحويل عامل النمو بيتا 3 (Tgfb3)، Tgfb3 مع تحييد الأجسام المضادة (Tgfb3 + NAB) وتحييد الأجسام المضادة وحدها (NAB). تم إجراء القياسات على الجروح المتسلسلة ("كاملة") أو على 40 قسماً من منتصف الجرح ("الوسط") واستخدمت لحساب النسبة المئوية لمنطقة البشرة فوق منطقة الجرح (أ) ، ونسبة البشرة في الجرح (B) وحجم الجرح (D). (C) يمثل متوسط منطقة الجرح التي تقاس على كل أو منتصف الجرح. * P < 0.05، ** P < 0.01، *** P < 0.001، ns = غير هام، Anova ذات اتجاه واحد). وقد تم تعديل هذا الرقم باستخدام بيانات من Le et al.11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول التكميلي 1: مثال على جدول بيانات لتسجيل القياسات المُرُفِيّة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نموذج الجرح الختان الثنائي هو إجراء قابل للتخصيص للغاية والذي يمكن استخدامه لدراسة العديد من الجوانب المختلفة لتضميد الجروح. قبل البدء في مشروع التئام الجروح، يجب على المحققين إجراء تحليل للطاقة لتحديد عدد الجروح اللازمة للكشف عن عيب في حجم تأثير معين. توجد تناقضات داخل الأدبيات حول ما إذا كان ينبغي استخدام الفئران أو الجروح الفردية كمحاكيات بيولوجية ، ومع ذلك ، أظهرت دراسة حديثة أنه لا يوجد ارتباط كبير بين جرحين على واحد4. وهذا يشير إلى أن الجروح من واحد مستقلة عن بعضها البعض ويمكن اعتبارها نسخاً بيولوجية، مما يقلل من عدد الفئران المطلوبة للكشف عن عيب. وهذا أمر ذو صلة عند النظر في أحجام تأثير صغير الذي يتطلب عددا كبيرا من الجروح للوصول إلى أهمية4. بالإضافة إلى ذلك، قد تؤثر نتائج حساب الطاقة على عدد الجروح التي يتم تنفيذها على كل حيوان، مع وجود أكثر شيوعاً من 2 و 4 جروح لكل.
البروتوكول الجراحي نفسه هو أيضا مرنة للغاية. في حين أننا نوصي التخدير بواسطة مرذاذ isoflurane بسبب طول الإجراء القصير والانتعاش السريع (10-15 دقيقة لكل فأرة)، يمكن للمحققين دون الوصول إلى المبخر استخدام التخدير عن طريق الحقن بما في ذلك الكيتامين / زيلازين أو pentobarbital. اختيار مسكن مناسب أمر بالغ الأهمية بشكل خاص ، لأنه يتعلق بالمراحل الالتهابية لتضميد الجروح. يجب استخدام العقاقير المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (NSAIDS) مثل فلونيسين ميغلومين أو ميلوكسيكام بحذر لأنها يمكن أن تقلل من الالتهاب. ولذلك، فإن المواد الأفيونية المفعول مفضلة في الدراسات التي يجري فيها التحقيق في الالتهاب. نوصي المسكنات (على سبيل المثال، Buprenorphine Sustained-Release) التي توفر ما يصل إلى 48 ساعة من المسكنات وتقضي على الحاجة إلى جرعات إضافية متكررة. يجب تنفيذ جميع العمليات الجراحية وفقا للمبادئ التوجيهية الاتحادية وبدعم من بروتوكول معتمد على الحيوانات.
التئام الجروح هي عملية تشمل عدة مراحل، كل منها تتميز بعمليات بيولوجية مختلفة تنطوي على أنواع خلايا متميزة3. تحدث المرحلة الالتهابية بين أيام 0 و 5 ، مع الهجرة المبكرة من العدلات المتعددة الأشكال (PMN) وال الضامة إلى موقع الإصابة13. تحدث المرحلة التكاثرية بين 3 و 14 يوما مع إعادة الظهارة مع أخذ كمية متفاوتة من الوقت على أساس حجم الجرح14. في هذا البروتوكول ، استخدمنا لكمة خزعة 6 مم وتم إعادة ظهار معظم الجروح من قبل 7 أيام. ومع ذلك، فإن هذا الإطار الزمني تحتاج إلى تقصير إذا تم استخدام اللكمات أصغر (وهي متوفرة صغيرة مثل 1 ملم). في تركيبة مع نقاط زمنية في وقت سابق، قد تكون هذه الجروح الصغيرة أفضل للحد من كمية التحليلات النسيجية15. وأخيراً، فإن مراحل إعادة البناء والنضوج تحدث بعد 7 أيام وما يصل إلى سنة بعد الإصابة16. قد تكون هناك حاجة إلى هذه النقاط الزمنية في وقت لاحق للتحقيق في نضوج الجرح أو للتحقيق في تأخير التئام الجروح في الحيوانات التجريبية. ولذلك، فإن المحقق بحاجة إلى تحديد النقاط الزمنية الحرجة اللازمة للتحقيق في مراحل معينة من التئام الجروح على أساس فرضيتهم الخاصة5.
تحليل التئام الجروح غالباً لا يقتصر على التحليلات النسيجية. يمكن استخدام أقسام البارافين غير المطّع لإجراء تحليلات إضافية مثل الفلوروسين المناعي أو ثلاثية الألوان لماسون لترسب الكولاجين. إن معالجة الأنسجة المتحكمة (الخزعات اللكمية) وخطوات الحصاد للأنسجة تعتمد جميعها على كيفية تقييم التئام الجروح، بالإضافة إلى التحليلات النسيجية. كجزء من البروتوكول الجراحي، تتم إزالة خزعات اللكمة من أجل توليد الجرح الختان. هذه اللكمات يمكن أن تكون بمثابة أنسجة التحكم غير مفككة لتطبيقات المصب مثل البروتين (لالوسيط الغربية أو السيتوكين)، والحمض النووي أو استخراج الحمض النووي الريبي وينبغي معالجتها وفقا لذلك. فمن المستحسن أن يتم حفظ لكمة واحدة على الأقل لتحليل النسيج، وخاصة في الحالات التي يتم فيها علاج الجلد قبل الجرح (على سبيل المثال، تطبيق تاموكسيفين لالتحث عن إعادة الكومبونيشن17Cre-Lox ). فحص لكمة يمكن تحديد تأثير العلاج على مورفولوجيا الجلد أو ببساطة تسمح بتقييم مورفولوجيا الجلد الأساسية لنموذج الماوس معين قيد الاستخدام. يمكن حصاد الجروح غير المستخدمة في علم الأنسجة مع خزعة لكمة تشمل حجم الجرح. هذا الإجراء له بعض المزايا، بما في ذلك حصاد نفس الكمية من الأنسجة بغض النظر عن حجم الجرح (الجروح الأكبر لديها أقل المحيطة الأنسجة السليمة). وأخيراً، فإننا نصف استخدام 4٪ شبهformaldehyde كما المثبت والبارافين كمادة للحفاظ على وتضمين الأنسجة، على التوالي. قد تكون هناك حاجة إلى تثبيتات أخرى لتطبيقات معينة ويمكن استبدالها (على سبيل المثال، تثبيتات كارنوي أو بوين). للحصول على أفضل تلطيخ مناعي، وتجميد وتضمين الجرح في مجمع درجة حرارة القطع الأمثل تليها القطع المجمدة يبقى الأسلوب المفضل.
يمكن أن يمثل تقسيم الأنسجة المجروحة العديد من التحديات ، ولا سيما جراح اليوم الرابع بسبب وجود الجرب. لتوليد أقسام عالية الجودة ، فمن المستحسن التحقق من أن جميع أجزاء من microtome مثبتة بإحكام ، يتم سحب حامل الكتلة إلى موقعها الأولي ، يتم تعيين حامل النصل بين 0 و 10 درجة ويتم تثبيت النصل بإحكام ولكن ليس مبالغًا فيه. على الرغم من أن كتلة البارافين مبردة، قد لا تزال تُقطع الأنسجة. إذا استمر التقطيع، يمكن وضع قطعة من الثلج على الكتلة لمدة 5 دقائق بينما لا تزال مثبتة. مرة واحدة وقد بدأت القطاعات، فمن المستحسن للغاية لتجنب إزالة كتلة من microtome لمنع فقدان أقسام البارافين. ومن الضروري تسجيل أي أقسام البارافين المفقودة، سواء أرقامها وترتيبها في قسم تسلسلي. وهذا سيؤثر على التحليل morphometric ويحتاج إلى النظر. بعد بدء اقسام, قد يكون من الصعب تحديد الأنسجة المصابة على الأجزاء غير الملطخة, خاصة إذا لم تكن مألوفة مع علم الأنسجة. عندما تكون في شك، فمن المستحسن أن تكون محافظة والحفاظ على جميع المقاطع التي تحتوي على الأنسجة. مرة واحدة يتم تنفيذ وصمة عار النسيج، وتنظيم الأنسجة تكون أكثر وضوحا والجرح أكثر وضوحا. أحياناً، قد لا تكون بصيلات الشعر مرئية بوضوح أو قد تكون بعيدة عن حافة الجرح. إذا كان هذا هو الحال، يمكن استخدام الخصائص الرئيسية الأخرى للأنسجة المجروحة لتحديد حدود الجرح بما في ذلك زيادة مفاجئة تليها انخفاض فوري في سمك البشرة والتغيرات الحادة في تنظيم النسيج الضام(الشكل 4A-B).
التصوير الرقمي هو خطوة حاسمة في تحليل مورفوميتري. وينبغي إجراء تحليل المورفوميتري على الصور الفردية باستخدام معلم على كل صورة لتجنب القياسات المتكررة. ومع ذلك، فمن الممكن لغرزة جميع الإطارات معا باستخدام البرمجيات الرقمية وإجراء التحليل على صورة واحدة. على الرغم من أن هذا يبدو أسهل في البداية ، قد يؤدي التلاعب في صورة كبيرة إلى إبطاء عملية التحليل. اختيار القسم هو أيضاً أمر حاسم للتحليل. على الرغم من أننا نوصي بالحصول على القسم العلوي من كلشريحة 8 رقميًا ، يجب إعطاء الأولوية لجودة القسم وينبغي تصوير أفضل الأقسام الخمسة على تلك الشريحة. يمكن تحليل المقاطع ذات طيات صغيرة من خلال تقدير المساحة / طول الطية. يجب تسجيل عدد هذا المقطع المحدد في كل من الملف الرقمي وفي جدول بيانات Excel، بحيث يمكن تعديل المسافة بين المقطع السابق والملفّل التالي وفقًا لذلك.
وتصيب الجروح الجلدية ما يقدر بنحو 6.5 مليون شخص مع العلاج بتكلفة تزيد على 25 مليار دولار سنويا18 وهي عنصر متأصل في العمليات الجراحية بالإضافة إلى كونها ثانوية للعديد من المخاوف الصحية الأخرى، بما في ذلك مرض السكري والسمنة. وقد استخدم الماوس كنموذج مناسب لدراسة الأمراض البشرية بسبب سهولة في التلاعب الجينوم، على الرغم من أن غالبا ما تظهر نمط ظاهري خفية بالمقارنة مع اضطراب الإنسان. نموذج الجرح الختان الثنائي والتحليل اللاحق morphometric الموصوفة في هذا البروتوكول هو كبير بسبب قدرته على معالجة صعوبة في الكشف عن عيوب طفيفة في عملية التئام الجروح معقدة بطبيعتها19. ونظراً لحساسية هذا البروتوكول وزيادة حساسيته وانخفاض درجة التقلبات، فإن هذا البروتوكول يتيح فرصاً لاستخدام عدد أقل من الحيوانات للحصول على نفس الحساسية التجريبية. البروتوكول هو تخصيص للغاية، ويمكن استخدامها لدراسة جميع مراحل إصلاح الأنسجة. التحليل الهرسيولوجي المفصل في اقتران مع توصيف فينوتيبيك للأنسجة لديها إمكانات كبيرة لزيادة المعرفة اللازمة لزيادة فهم العوامل الحرجة تحوير إصلاح الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لجميع أعضاء مختبر دونوالد الذين ساهموا في تحسين هذا البروتوكول على مر السنين، ولجينا شاتيمان التي جعلت إصرارها في تعزيز استخدام قسم المسلسل لتحليل الجروح من الممكن إنشائها. وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد القومية للصحة/NIAMS إلى مارتين دونوالد (AR067739).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
