Summary
该协议描述了如何在小鼠中生成双边全厚度切除伤口，以及如何随后监测、收获和准备伤口以进行形态分析。其中包括一个深入的描述，说明如何使用串行组织学部分来定义、精确量化和检测形态缺陷。
Abstract
穆林切除伤口模型已被广泛使用，用于研究伤口愈合的每个连续重叠阶段：炎症，增殖和重塑。Murine 伤口具有组织学上定义明确且易于识别的伤口床，这些不同阶段的愈合过程是可测量的。在该领域，通常使用任意定义的伤口"中间"进行组织学分析。然而，伤口是一个三维实体，往往不是组织对称的，支持需要一个定义明确和稳健的定量方法，以检测小效果尺寸的形态缺陷。在该协议中，我们描述了在小鼠中创建双边全厚度切除伤口的过程，以及有关如何使用特定序列部分的图像处理程序测量形态参数的详细说明。伤口长度、表皮长度、表皮面积和伤口面积的两维测量与各部之间的已知距离相结合，以推断覆盖伤口、整体伤口面积、表皮体积和伤口体积的三维表皮面积。虽然这种详细的组织学分析比常规分析更耗时和资源，但其严谨性增加了在固有的复杂伤口愈合过程中检测新表型的可能性。
Introduction
皮肤伤口愈合是一个复杂的生物过程，连续重叠阶段。它要求协调在时间和空间上调节的细胞和分子过程，以恢复受损上皮的屏障功能。在第一阶段，炎症，嗜中性粒细胞和巨噬细胞迁移到伤口，调动局部和全身防御1。炎症阶段的跟随和重叠是增殖阶段。成纤维细胞开始迅速增殖并迁移到造粒组织中。角膜细胞远离前缘方向扩散到伤口，因为前缘的分化角细胞迁移至伤口2的再上皮化。最后，改造和成熟阶段开始，在此期间，造粒组织中的成纤维细胞开始合成和沉积胶原蛋白。新矩阵的改造和组织可以持续长达1年后受伤3。由于涉及多种细胞类型交谈的重叠事件的复杂性，尽管经过多年的研究，许多细胞和分子机制的基础伤口愈合仍然不太了解。
小鼠模型是研究伤口愈合机制的主要哺乳动物模型，由于其易用性，相对较低的成本和遗传操纵性1，4，5。虽然在穆林模型中描述了不同类型的伤口，但最常见的是切除伤口（双边冲孔或直接打孔活检），其次是切口伤口模型4。切除伤口模型比切口模型有明显的优势，因为它固有的产生控制组织，没有经过愈合过程。作为手术方案的一部分切除的冲孔活检组织可以与受伤组织相同的方式进行处理，并用于确定所需标准的恒时条件。如果评估皮肤预处理的效果或在受伤时确认成功的基因改变，可切除控制组织也很有用。
治疗参数可以通过许多不同的技术进行评估，包括平面学或组织学。然而，平面测量只能评估伤口的可见特征，由于有疤痕的存在，往往与组织学所可视化的愈合测量不相关，从而使组织学成为分析4的"黄金标准"。尽管组织学分析是金本位标准，但它通常对伤口6、7的任意子集进行。例如，在嵌入和切段伤口之前将伤口切割到"一半"是目前常见的做法，以减少用于分段材料和数据分析所花费的时间和资源。本协议中描述的形态分析方法被开发为包括整个伤口组织，准确反映伤口的形态特征，并增加检测伤口愈合缺陷的可能性，效果较小。在该协议中，我们详细介绍了产生最常研究的穆林伤口的手术方法、双边全厚切除伤口，以及一种详细而严格的组织学分析方法，这种方法在实地很少使用。
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Protocol
所有实验都按照联邦法规完成，爱荷华大学的政策和程序已获爱荷华大学 IACUC 批准。
1. 畜牧业
- 在毛囊阶段为细胞原时，在8-10周大时使用所需小鼠线的成年小鼠。
- 在手术当天，将老鼠分开进入干净的笼子和单独的房子，以尽量减少伤口的破坏。
2. 手术
注：没有必要保持无菌的手术条件。虽然应注意保持动物之间的无菌性，但打孔活检本身是在干净但非无菌的表面完成的。每个动物的手术时间在10到15分钟之间。
- 麻醉
- 在感应室中对动物进行1-2分钟的麻醉，异氟蒸发器设置为4-5%的流速，氧气流量计设置为每分钟1升。有关 替代 麻醉选项，请参阅讨论。
- 在开始手术前确认正确的麻醉。麻醉的深度可以通过一个坚定的脚跟捏来证实。
- 将鼠标从感应容器转移到鼻锥，将异氟流速降低至 1.5%，将氧流量计降低至 0.5 L/min。
- 当手术超过5分钟时，将眼科软膏涂抹在两只眼睛上。
- 使用热垫保持正常体温。
- 伤口场的准备工作
- 使用电动剃须刀剪子在肩道运动去除鼠标背部在肩部水平的毛皮。如果进行两个多伤口，请根据需要去除背部下部的头发。
- 使用剃须刀刀片从鼠标背面以 20° 保持的左极形运动来清除剩余的头发，以密切剃光夹紧区域（图 1A）。
- 用波维酮碘拭子清洁剃光区域。
- 用无菌的 70% 异丙醇准备垫擦拭皮肤，以减少碘拭子中潜在的皮肤刺激。
- 伤
- 沿着后心中线捏住肩部刀片之间的皮肤，将夹紧的皮肤从身体上拉开（图1B）。
- 将鼠标放在其一侧，将皮折叠放在平面上，用干净的纸毛巾或等价物覆盖。使用毛巾下方的牙蜡片保护底层表面免受损坏（图1C）。
- 将所需尺寸的活检冲头尽可能靠近身体，让皮肤放松。不要拉伸皮肤，否则伤口尺寸将大于指定的冲孔尺寸（图 1D）。
- 通过按下来打压皮肤，可以使用摇摆运动来确保两侧皮肤的所有层都已被穿透（图1E）。对每种动物使用新的活检冲头。
- 从伤口上取下冲孔活检（图1F）。如果仍有附件点，请使用无菌剪刀和钳子从周围皮肤上释放冲孔。根据伤口愈合分析的下游计划，根据要求处理冲孔活检控制组织（有关建议 ，请参阅 讨论）。
- 从距离伤口点相等的距离或框架中的尺子拍摄宏观照片，以测量初始伤口区域并消除分析中的异常值。
- 根据批准的动物协议，至少24小时管理镇痛。例如：丁丙诺啡SR-LAB，以单剂量皮下注射，在0.5-2毫克/千克48小时止痛（见 讨论 ，了解替代建议和注意事项）。
- 监测鼠标，因为它从麻醉出来，直到它保持一个直立的姿势，并正常在笼子周围行走。
3. 伤口后监测
- 每天监测小鼠的实验终点，由调查人员确定，并遵守机构协议。示例包括：感染、可见的体重减轻或驼背姿势。
- 像最初手术后一样，以受控的方式拍摄每日宏观照片。
4. 收获伤口
- 根据批准的动物协议，在伤口后所需的时间点对小鼠实施安乐死。
- 以与之前拍摄照片一致控制的方式拍摄伤口地点的宏观照片（图2A，C）。
- 使用手术刀在伤口周围切割一个宽矩形（图2D，E）。
- 用剪刀和钳子释放矩形纸巾，剥回皮肤，将皮肤从底层组织切开（图2F）。放在培养皿中（图2G）。
- 收获伤口以矩形形状修剪至伤口四侧周围 2 mm 的未缠绕组织（图 2H，I）。有关 收获 伤口的替代选项，请参阅讨论。
- 根据后续研究所需的处理伤口。每只小鼠至少保留一个伤口，用于石蜡嵌入和组织学分析。
5. 伤口固定和嵌入
- 修复伤口
- 将伤口组织在新鲜准备好的4%半甲醛溶液8 中固定3小时，在室温下，然后隔夜转移到4°C。不需要电子显微镜 （EM） 级对甲醛和溶液过滤。
- 在 1x PBS 中清洗伤口两次 30 分钟。
- 将 PBS 替换为 70% ETOH，并在 4 °C 下存储，直到嵌入。在24-48小时内处理组织，以避免抗原损失，或在1-2周内，如果只评估组织学特征。
- 处理并嵌入伤口
- 将每个伤口转移到嵌入的盒式磁带上。标签嵌入铅笔盒，因为这个过程将删除墨水。
- 手动或使用自动处理器处理组织，通过增加乙醇百分比使组织脱水，用二甲苯清除，然后用石蜡渗入组织（表1）。
- 从嵌入模具的水平表面嵌入伤口 90°（"站立"）（图 3A，B）。
6. 第 0 天伤口区域分析
- 下载NIH-图片J或NIH-Fiji免费软件（https://imagej.net/Fiji/Downloads）。
- 打开一张有第 0 天伤口照片的文件。
- 选中"分析"下的"区域 "|设置测量。
- 在"分析"下选择"设置 比例"。如果宏观测量是研究的一部分，则输入以像素为单位的距离、已知的相应距离和距离单位（= 长度单位），如果只需要相对测量，则跳过此步骤。
- 在斐济工具栏上选择"手绘选择"。
- 勾勒出伤口的周长。
- 单击"分析"下的"度量"。
- 创建电子表格以跟踪每个动物每个伤口的测量结果。
- 在电子表格中复制伤口区域的测量值。
- 计算给定实验的所有伤口的均值面积和标准偏差。
- 从组织学分析中排除平均值两个标准偏差以外的任何伤口。
7. 串行剖面
- 在 4 °C 下冷却石蜡嵌入的伤口块过夜。
- 将石蜡块插入微原子的块架上并定向，使刀片直接穿过块。定向块，使组织"站立"在90°允许表皮和真皮的同步切块（图3C，D）。
- 制作 2-4 条带子，每个色带为 20-30 个石蜡部分，每个色带为 7 μm。
- 使用干漆刷和解剖戏弄针将每条丝带转移到一个坚定但可管理的表面，如一个坚定的黑色塑料板。
- 用剃须刀刀片分离每个功能区的顶部，并放在显微镜幻灯片上。
- 在光明场显微镜下观察未污染的部分，确定哪些部分含有受伤的组织，这些部分可以通过没有毛囊、结缔组织或表皮外观的变化和/或鳞片的存在来识别（图4A，B）。
- 在伤口开始前丢弃长达 20 节的未缠绕部分。
- 通过重复步骤 7.3 和 7.4 穿过伤口，直到未在未污染的节中检测到伤口。
8. 石蜡部分的安装
- 用剃须刀刀片每 5 节分开石蜡部分，从第一个色带开始（图 3E）。
- 使用幻灯片编号和所有节号为显微镜幻灯片添加标签。
- 用湿漆刷抓住 5 个部分，将它们漂浮在温水浴（40-45 °C）的水面上，将其压平。
- 使用标有显微镜的幻灯片之一（图3F）从水浴中选取 5个部分，并放在 37 °C 的滑动加热器上，长达 24 小时。
- 将幻灯片直立存放在幻灯片框中。
9. 组织染色
- 每 8个显微镜幻灯片（相当于每 40个石蜡部分）转移到染色架和沾染色素和 eosin。
10. 显微成像
- 使用配备 4 倍目标和数字采集功能的明亮场显微镜获取图像。记录拍摄图像的刻度。
- 成像每个染色幻灯片顶部部分的整个伤口，并确保在两侧包括一些未缠绕的组织。如果伤口大于单个图片的帧，请拍摄多个重叠图片。
- 保存文件（包括用于变形分析的节号）。使用节号后跟 a、b、c 等进行同一伤口的重叠图片。
11. 形态分析
注：当伤口跨越多张图片时，对从单个图片中拍摄的测量值进行求和 ，以 在电子表格中记录每个伤口部分每个公制值。
- 在图像 J 中，打开彩色伤口图片的数字文件。请勿使用拼接图片进行分析。通过查找要离开的地标并选取从图片到图片的测量，对放大的重叠图片执行测量。
- 设置比例和测量首选项。
- 在"分析"下选择"设置 比例"。输入以像素为单位的距离、已知的对应距离和距离的单位（= 长度单位）。比例应显示在窗口中，并且应对应于在窗口获取图像的刻度。
- 选中"全局"框，使每个打开的图像的缩放比例保持不变。
- 每次关闭并重新打开图像 J 时，重复步骤 11.2.1 到 11.2.2。
- 选中"分析"下的"区域 "|设置测量。
- 测量伤口长度
- 在斐济工具栏上选择"手绘选择"。
- 测量从伤口一侧未受伤组织的上一个毛囊到伤口另一侧未受伤组织的第一毛囊（图4A，B）。
- 沿着皮肤表皮结线追踪，到达这两个地标。如果表皮没有覆盖整个伤口，沿着伤口一侧的皮皮-表皮结，迁移的舌头末端继续沿着造粒组织或造粒组织与鳞片之间的交汇点，直到你到达迁移的舌头，最后到达另一侧未受伤的组织的第一个毛囊（图4E，F）。
- 在" 分析"下，单击 "测量"。测量的长度将显示为与刻度中设置的相同单位。
- 创建电子表格以跟踪测量值（补充表 1）。
- 将伤口长度复制到电子表格中。
- 测量表皮长度
- 如果表皮覆盖了整个伤口，表皮长度与伤口长度相同。
- 将"伤口长度"测量值复制到 Excel 电子表格中的"表皮长度"列中，然后跳到步骤 11.5。
- 如果表皮没有覆盖整个伤口，选择"手选择"，并测量每个表皮前缘之间的距离，遵循造粒组织的优越方面或造粒组织与鳞片之间的交汇点，第一个毛囊（图4C，D）。
- 在"分析"下，单击"测量"。
- 从伤口长度中减去此测量值，并在 Excel 电子表格中的"表皮长度"下记录数字。
- 如果表皮覆盖了整个伤口，表皮长度与伤口长度相同。
- 测量伤口区域
- 在斐济工具栏上选择"手绘选择"。
- 测量从伤口一侧未受伤组织的最后一个毛囊到伤口另一侧未受伤组织的第一毛囊（图4A、B、E、F）。
- 如果伤口未完全被表皮覆盖，沿表皮的优越方面（不包括疤痕）或造粒组织的上级方面进行跟踪。
- 一旦到达相反的毛囊，继续沿着毛囊垂直跟踪到造粒组织，直到脂肪组织或肌肉达到。沿着造粒组织的劣等边界到伤口的对面，沿着毛囊连接起点以关闭区域（图4E，F）。
- 在"分析"下，单击"测量"。
- 在"测量伤口区域"下将伤口区域复制到电子表格中。
- 测量表皮面积
- 在斐济工具栏上选择"手绘选择"。
- 如果伤口完全上皮化：
- 沿着表皮的优越方面跟踪，直到到达相反的毛囊，通过"返回"到表皮和真皮之间的皮皮-表皮结后的起点（图4D）完成该区域。
- 在"分析"下，单击"测量"。
- 在"表皮面积测量"下将表皮区域复制到 Excel 电子表格中，然后跳到步骤 11.7。
- 如果伤口未完全上皮化：
- 沿着表皮的优越方面跟踪，直到前缘，并返回到皮肤-表皮结后的起点（图4C）。
- 在"分析"下，单击"测量"。
- 在伤口的对面重复步骤 11.6.3.1 和 11.6.3.2。
- 在"分析"下，单击"测量"。
- 将步骤 11.6.3.2 和 11.6.3.4 中获得的两个数字相加，并在电子表格中的"测量表皮面积"下输入结果。
- 每 40 节（每 8 张幻灯片）重复步骤 11.3 到11.6。
- 计算整个伤口的表皮面积。
- 在电子表格"表皮面积计算"旁边创建一个新列，旁边是"表皮长度"。
- 将"表皮长度"的数字乘以 280，但最后一个节（7 μm 厚节 x 40 节除外）。
- 将"表皮长度"的数字乘以最后一节的 7（节的厚度）。
- 汇总每个部分的"表皮面积计算"值，以获得整个伤口的表皮面积。
- 计算整个伤口的伤口面积。
- 使用伤口长度测量重复步骤 11.8.1 到 11.8.4。
- 计算整个伤口的表皮体积。
- 使用"测量面积"测量步骤 11.8.1 到 11.8.4 重复步骤 11.8.1。
- 计算整个伤口的伤口体积。
- 使用"伤口测量"测量步骤 11.8.1 到 11.8.4 重复步骤 11.8.1。
- 计算伤口中表皮体积的百分比。
- 将总表皮体积除以总伤口体积，乘以 100 以获得百分比（不要对每个部分进行此比率）。
- 计算伤口区域中表皮面积的百分比。
- 将总表皮面积除以总伤口面积，乘以 100 以获得百分比。如果伤口完全上皮化，则此数字应为 100。
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Representative Results
图5描述了通过对多个外科医生在不同小鼠菌株中产生的野生型伤口进行形态分析，并由不同个体进行分析，获得的测量和计算值的范围。不同菌株的野生小鼠可以显示统计差异，如我们的研究和文献9，10所述。根据这些具有代表性的结果，我们建议在一项研究中，只使用一种菌株的小鼠。虽然我们建议同一个人在特定研究中执行所有伤口，但只要第 0 天的伤口区域在个人的工作之间没有统计上不同，多个个体就可以充当外科医生。最后，由于此协议中描述的形态分析范围可能很广，因此多个个体可以分析同一实验的部分，但只有当他们对两个样本的分析结果在彼此的 5% 以内时。然而，最好让一个人以盲目的方式分析伤口，以避免偏见。
图 6 显示了一个荟萃分析，比较通过遵循本研究中描述的协议获得的伤口测量结果 11 与从伤口的"中间"和周围 40 个部分获得的测量结果。在 图6A中，表皮面积和伤口面积的计算方法是测量伤口部分的表皮和伤口长度，然后计算伤口区中表皮面积的百分比（有时称为"闭合百分比"或"表皮化百分比"）。同样， 在图6B中，伤口表皮的百分比作为表皮体积（从测量表皮面积计算）与伤口体积（从测量的伤口面积计算）的比率获得。对于这两个参数，对整个伤口的分析显示各组之间的统计差异很大（ 在双向 Anova 之后，P < 0.001）。然而，当只分析 将中间的40 个部分时，显著性会降低（在单向 Anova 之后，P < 0.01）。这些结果表明，当只分析伤口的一部分时，显著性水平会降低。这些数据表明，只有对整个伤口进行形态分析时，才可能检测到效果小的缺陷，并且从"伤口中间"类型的分析中，将遗漏更温和的伤口愈合表型。
分析体内伤口愈合的常见做法是测量伤口在伤口12某处选择的组织学部分的面积。有鉴于此，将整个伤口序列部分的测量伤口面积的平均值与从中间子段获得的伤口面积的平均值进行比较。结果表明，实验组与分析方法之间没有显著差异（图6C）。然而，当前协议使用测量面积（如图 6C所示）计算伤口体积。如图 6D所示，计算伤口体积（只能使用整个伤口的分析来计算）在实验组之间有显著差异。总之，这些具有代表性的结果证明了对本协议中描述的伤口愈合参数进行深入组织学分析的重要性，以便检测使用更传统的伤口愈合分析会遗漏的表型。
图1：双边切除伤口手术。（A） 从手术区剪发和剃毛后，老鼠的代表性照片。（B） 皮肤沿着后道中线在肩部刀片之间挤压。（C） 鼠标位于其一侧，皮折平放。（D） 活检打孔放置的表示。（E） 打孔皮肤折叠.（F） 在第 0 天有两个双边伤口的小鼠和白色箭头所示的冲孔活检控制组织。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：伤口收获程序。（A-C）4天后（A）、7天（B）和11天（C）的6毫米切除伤口的宏观照片。（D-E）用手术刀刀片，一个皮肤切口是一个宽矩形的形状，包括伤口和周围的未剥松的组织。（F） 皮肤用钳子和剪刀从底层组织中释放。（G） 代表收获的双边伤口。（H） 虚线白线表示使用冲孔活检后将收获的组织的边界（此方法允许标准化的组织量收获）。（I） 虚线白线表示组织为组织学修剪的边框（矩形形状允许更容易嵌入）。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 解决 方案 | 时间（分钟） | 温度（摄氏度） | 压力（千帕） |
| 80% ETOH | 30 | Rt | 不和 |
| 95% ETOH | 30 | Rt | 不和 |
| 100% ETOH | 30 | Rt | 不和 |
| 二甲苯 | 30 | Rt | 不和 |
| 二甲苯 | 30 | Rt | 不和 |
| 石蜡 | 30 | 60 | 20 |
| 石蜡 | 30 | 60 | 20 |
表1：石蜡嵌入的样品处理过程。 RT = 室温。不适用。
图3：伤口嵌入和剖面。（A） 石蜡加工的伤口平躺在嵌入模具中。（B） 伤口从模具的水平表面以90°（"站立"）进行嵌入。（C） 石蜡内嵌伤口适当定向切截 （D） 安装在微原子上的石蜡块被切成丝带，约20节（E） 石蜡丝带，按白色支架所示，以5个部分的增量切割。（F） 安装在显微镜幻灯片上，平放在温水浴（40-45°C）中。（A-C） 中的卡通表示皮肤（蓝色）中的伤口（橙色），每个步骤的表皮 （e） 和真皮 （d） 方向正确。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：伤口的组织学特征和形态参数图解。（A ， B）组织学特征为第4天 （A） 和一天 7 （B） 6毫米伤口.（C-F）用于执行定量形态分析的不同测量值的表示：表皮的长度（C、D、虚线）、表皮的测量面积（C、D、黄色阴影区域）、伤口长度（E、F、虚线）和整个伤口的测量面积（E、F、灰色阴影区域）。 HF = 毛囊;比例线 = 1 毫米。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：第4天、第7天、第11天伤后6毫米野生型伤口的变形特征。分散的地块代表从多个外科医生在不同小鼠菌株中生成的6毫米野生型伤口的形态分析中获得的数据，并由不同的个体进行分析。（A） 伤口体积、 （B） 表皮体积 、（ C） 伤口表皮百分比、伤口面积 （计算）、 （E） 表皮面积 （计算） 和 （ F ） 伤口区表皮面积百分比显示形态测量值的变化范围。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：元分析比较从整个伤口获得的参数与伤口中间找出具有较高意义的新缺陷。伤口愈合形态测定在注射盐水（控制）的第7天伤口，转化生长因子β3（Tgfb3），Tgfb3，中和抗体（Tgfb3+ NAB）和单独中和抗体（NAB）。对连续分段伤口（"整体"）或伤口中间的40个节（"中"）进行测量，用于计算伤口面积（A）、伤口（B）中表皮百分比和伤口体积（D）的表皮面积百分比。（C） 表示伤口整个或中间测量的伤口面积的平均值。* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， ns = 不显著， 单向 Anova）。这个数字已经修改了使用从Le等人11号的数据。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充表1：用于记录形态测量的电子表格示例。请点击这里下载此表。
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Discussion
双边切除伤口模型是一种高度可定制的程序，可用于研究伤口愈合的许多不同的方面。在开始伤口愈合项目之前，调查人员应执行功率分析，以确定检测特定效果大小的缺陷所需的伤口数量。文献中对于单个小鼠或伤口是否应用作生物复制，存在不一致之处，然而，最近的一项研究表明，单个动物4上的两个伤口之间没有显著的相关性。这表明，单个动物的伤口彼此独立，可以被认为是生物复制，减少了检测缺陷所需的小鼠数量。当考虑需要大量伤口才能达到显著性4的小效果时，这是相关的。此外，功率计算的结果可能会影响每个动物的伤口数，每个动物有2和4个伤口是最常见的。
手术方案本身也是高度灵活的。虽然我们建议通过异氟烷蒸发器麻醉，由于手术时间短和快速恢复（每只小鼠10-15分钟），但无法获得蒸发器的调查人员可以使用注射麻醉，包括氯胺酮/西拉辛或五巴比妥。选择适当的镇痛剂是特别重要的，因为它涉及到伤口愈合的炎症阶段。使用非类固醇抗炎药物 （NSAIDS），如氟尼辛葡萄糖胺或梅洛西卡姆应谨慎使用，因为它们可以减少炎症。因此，在正在调查炎症的研究中，阿片类药物是首选。我们建议镇痛药（例如，布丙诺啡持续释放），提供高达48小时镇痛，并消除重复，额外的剂量。所有外科手术应按照联邦准则执行，并得到经批准的动物协议的支持。
伤口愈合是一个过程，包括几个阶段，每个阶段的特点是不同的生物过程，涉及不同的细胞类型3。炎症阶段发生在第0天至第5天之间，多态核嗜中性粒细胞（PMN）和巨噬细胞的早期迁移到损伤13的位点。增殖阶段发生在3至14天之间，再上皮化需要根据伤口14的大小不同的时间量。在该协议中，我们使用6毫米活检冲头，大多数伤口被重新上皮7天。但是，如果使用较小的冲孔（可提供小到 1 mm 的冲孔），则需要缩短此时间范围。结合较早的时间点，这些较小的伤口可能更可取，以减少组织学分析的数量15。最后，改造和成熟阶段发生在7天后，最多一年后受伤16。可能需要这些后期时间点来调查伤口的成熟或研究实验动物的伤口愈合延迟。因此，调查人员将需要根据特定的假设5确定调查伤口愈合的特定阶段所需的关键时间点。
伤口愈合分析往往不限于组织学分析。未污染的石蜡部分可用于其他分析，如免疫荧光或马森三色胶原蛋白沉积。控制组织（打孔活检）的处理和组织收获步骤都将取决于如何，除了组织学分析，伤口愈合评估。作为手术规程的一部分，冲孔活检被移除，以产生切除伤口。这些冲孔可以作为下游应用的未松织的控制组织，如蛋白质（用于西式或细胞因子分析）、DNA 或 RNA 提取，应进行相应的处理。建议至少保存一拳进行组织学分析，特别是在皮肤在受伤前治疗的情况下（例如，应用塔莫西芬诱导Cre-Lox重组17）。冲孔的检查可以确定治疗对皮肤形态的影响，或者仅仅允许评估使用的特定小鼠模型的基线皮肤形态。不用于组织学的伤口可以通过包括伤口大小的重拳活检来收获。这个过程有几个优点，包括收获相同数量的组织，无论伤口大小（较大的伤口有较少周围的健康组织）。最后，我们分别描述使用4%的甲醛作为固定物和石蜡作为保存和嵌入组织的材料。某些应用可能需要其他固定器，并可以替代（例如，Carnoy 或 Bouin 的固定器）。为了获得最佳的免疫荧光染色，将伤口冷冻和嵌入到最佳切割温度化合物中，然后是冷冻分切，仍然是首选的方法。
分段受伤的组织可以带来许多挑战，特别是第4天伤口，因为存在疤痕。为了生成高质量的截面，建议验证微切器的所有部分是否紧固，块架已缩回其初始位置，刀片支架设置在 0 到 10° 之间，刀片紧固但未过度紧固。虽然石蜡块是冷藏的，但组织可能仍然碎碎。如果继续切碎，一块冰可以在块上放置 5 分钟，同时仍然安装。一旦开始切块，强烈建议避免从微原子中去除块，以防止石蜡部分的损失。必须记录任何丢失的石蜡部分，包括它们的数量和在串行分区中的排名。这将影响形态分析，需要考虑。开始分段后，在未污染的截面上识别受伤组织可能很困难，尤其是不熟悉组织学。当有疑问时，建议保持保守，并保留所有包含组织的部分。一旦进行组织染色，组织组织将更加明显，伤口更加明显。有时，毛囊可能不清晰可见，或者可能远离伤口边缘。如果是这样的话，受伤的组织的其他关键特征可以用来确定伤口的边界，包括突然增加，然后表皮厚度立即减少和结缔组织组织的急剧变化（图4A-B）。
数字成像是形态分析的关键步骤。应使用每个图像上的地标对单个图像进行形态分析，以避免重复测量。但是，使用数字软件将所有帧拼接在一起，并在单个图像上执行分析。虽然这一开始似乎比较容易，但大图像的操作可能会减慢分析过程。该部分的选择对于分析也至关重要。尽管我们建议以数字方式获取每8 张幻灯片的顶部部分 ，但应确定该部分的质量优先级，并成像该幻灯片上的 5 个部分中的最佳状态。通过估计褶皱的面积/长度，仍可以通过分析小折的截面。该特定节的数量应同时记录在数字文件和 Excel 电子表格中，以便可以相应地调整上一部分和下一个分析部分之间的距离。
皮肤伤口影响约650万人，治疗费用每年超过250亿美元18， 是外科手术的固有组成部分，除了是次要的许多其他健康问题，包括糖尿病和肥胖症。尽管与人类疾病相比，老鼠经常表现出一种微妙的表型，但由于操作基因组的易用性，因此作为研究人类疾病的方便模型。本协议中描述的双边切除伤口模型和随后的形态分析意义重大，因为它能够解决在固有的复杂伤口愈合过程中难以发现小缺陷的能力。由于其灵敏度更高，变异性降低，该协议提供了使用较少的动物获得相同实验灵敏度的机会。该协议是高度可定制的，可用于研究组织修复的所有阶段。详细的组织学形态学分析，结合组织表型表征，具有增加知识的潜力，可以进一步理解调节组织修复的关键因素。
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Disclosures
提交人宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢邓恩瓦尔德实验室的所有成员，他们多年来为优化该协议做出了贡献，并感谢吉娜·沙特曼，他坚持推广使用串行分段进行伤口分析，使该协议的创建成为可能。这项工作得到了国家卫生和、国家艾滋病和国家卫生系统向马丁·邓恩瓦尔德（AR067739）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
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