Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie bilaterale, volldicke Exzisionswunden bei Mäusen erzeugt werden und wie man anschließend die Wunden für die morphometrische Analyse überwacht, erntet und vorbereitet. Enthalten ist eine ausführliche Beschreibung der Verwendung von seriellen histologischen Abschnitten zur Definition, präzisen Quantifizierung und Erkennung morphometrischer Defekte.
Abstract
Das murine excisionale Wundmodell wurde ausgiebig verwendet, um jede der sequenziell überlappenden Phasen der Wundheilung zu untersuchen: Entzündung, Proliferation und Umbau. Murine Wunden haben ein histologisch gut definiertes und leicht erkennbares Wundbett, über das diese verschiedenen Phasen des Heilungsprozesses messbar sind. Innerhalb des Feldes ist es üblich, eine willkürlich definierte "Mitte" der Wunde für histologische Analysen zu verwenden. Wunden sind jedoch ein dreidimensionales Gebilde und oft nicht histologisch symmetrisch, was die Notwendigkeit einer klar definierten und robusten Methode der Quantifizierung zur Erkennung morphometrischer Defekte mit geringer Effektgröße unterstützt. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren zum Erstellen bilateraler, volldickender Exzisionswunden bei Mäusen sowie eine detaillierte Anleitung zur Messung morphometrischer Parameter mithilfe eines Bildverarbeitungsprogramms auf ausgewählten seriellen Abschnitten. Die zweidimensionigen Messungen von Wundlänge, epidermaler Länge, epidermaler Fläche und Wundfläche werden in Kombination mit dem bekannten Abstand zwischen abschnittsweise verwendet, um den dreidimensionigen epidermalen Bereich zu extrapolieren, der die Wunde, die gesamte Wundfläche, das epidermale Volumen und das Wundvolumen abdeckt. Obwohl diese detaillierte histologische Analyse zeitaufwändiger ist als herkömmliche Analysen, erhöht ihre Strenge die Wahrscheinlichkeit, neuartige Phänotypen in einem inhärent komplexen Wundheilungsprozess zu erkennen.
Introduction
Die Hautwundheilung ist ein komplexer biologischer Prozess mit sequenziell überlappenden Phasen. Es erfordert die Koordination zellulärer und molekularer Prozesse, die zeitlich und räumlich reguliert werden, um die Barrierefunktion des beschädigten Epithels wiederherzustellen. In der ersten Phase wandern Entzündungen, Neutrophile und Makrophagen in die Wunde und mobilisieren lokale und systemische Abwehrkräfte1. Nach und überlappend ist die Entzündliche Phase das Proliferationsstadium. Fibroblasten beginnen sich schnell auszumehren und in das Granulationsgewebe zu wandern. Keratinozyten weg von der Vorderkante, die sich richtungsweisend zur Wunde ausbreiten, während differenzierte Keratinozyten in der Vorderkante wandern, um die Wunde2wieder zu epithelisieren. Schließlich beginnt die Umbau- und Reifungsphase, in der Fibroblasten im Granulationsgewebe zu synthetisieren und Kollagen ablagern. Der Umbau und die Organisation der neuen Matrix kann bis zu 1 Jahr nach Verletzungdauern 3. Aufgrund der Komplexität überlappender Ereignisse mit Cross-Talk zwischen mehreren Zelltypen und trotz jahrelanger Forschung bleiben viele der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Wundheilung zugrunde liegen, schlecht verstanden.
Das Mausmodell ist das vorherrschende Säugetiermodell zur Untersuchung von Mechanismen der Wundheilung aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, relativ niedrigen Kosten und genetischen Manipulierbarkeit1,4,5. Obwohl verschiedene Arten von Wunden im murinen Modell beschrieben wurden, ist die häufigste eine exzistive Wunde (entweder bilateraler Schlag oder direkte Schlagbiopsie), gefolgt von Inzisionswundmodellen4. Das exzisionale Wundmodell hat einen deutlichen Vorteil gegenüber dem Inzisionsmodell, da es von Natur aus Kontrollgewebe erzeugt, das den Heilungsprozess nicht durchlaufen hat. Das im Rahmen des Operationsprotokolls ausgeschnittene Schlagbiopsiegewebe kann auf die gleiche Weise wie das verwundete Gewebe verarbeitet und zur Ermittlung der otostatischen Bedingungen für ein gewünschtes Kriterium verwendet werden. Verbrauchgesteuertes Kontrollgewebe kann auch nützlich sein, wenn die Auswirkungen einer Hautvorbehandlung beurteilt oder eine erfolgreiche Genveränderung zum Zeitpunkt der Verletzung bestätigt wird4.
Heilparameter können mit vielen verschiedenen Techniken bewertet werden, einschließlich Planimetrie oder Histologie. Die Planimetrie kann jedoch nur sichtbare Eigenschaften der Wunde bewerten und korreliert aufgrund des Vorhandenseins eines Schorfes oft nicht mit Messungen der Heilung, die durch histologische Visualisierung visualisiert werden, wodurch die Histologie zum "Goldstandard" der Analyse4wird. Obwohl die histologische Analyse der Goldstandard ist, wird sie am häufigsten auf einer beliebigen Teilmenge der Wunde6,7durchgeführt. Zum Beispiel ist das Schneiden der Wunde in "halb" vor dem Einbetten und Schneiden der Wunde derzeit gängige Praxis, um den Zeit- und Ressourcenaufwand für das Schneiden von Materialien und die Datenanalyse zu reduzieren. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode der morphometrischen Analyse wurde entwickelt, um das gesamte Wundgewebe zu umfassen, die morphologischen Eigenschaften der Wunde genau widerzuspiegeln und die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, Wundheilungsdefekte mit einer geringen Effektgröße zu erkennen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine chirurgische Methode zur Erzeugung der am häufigsten untersuchten murinen Wunde, der bilateralen Volldicke excisionalwunde, sowie eine detaillierte und strenge Methode für die histologische Analyse, die selten auf dem Feld verwendet wird.
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Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Bundesbestimmungen und der Politik der University of Iowa und Verfahren abgeschlossen und wurden von der University of Iowa IACUC genehmigt.
1. Tiere und Haltung
- Verwenden Sie erwachsene Mäuse der gewünschten Mauslinie im Alter von 8-10 Wochen, wenn das Haarfollikelstadium in Telogen ist.
- Trennen Sie am Tag der Operation Mäuse in saubere Käfige und einzeln, um Wundstörungen zu minimieren.
2. Chirurgie
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, sterile chirurgische Bedingungen aufrechtzuerhalten. Während darauf geachtet werden sollte, die Sterilität zwischen Tieren aufrechtzuerhalten, erfolgt die Stanzbiopsie selbst auf einer sauberen, aber nicht sterilen Oberfläche. Die Operationsdauer pro Tier liegt zwischen 10 und 15 Minuten.
- Anästhesisierung
- Anästhesisieren Sie das Tier für 1-2 min in einer Induktionskammer mit dem Isofluran-Verdampfer auf eine Durchflussrate von 4-5% eingestellt und der Sauerstoffdurchflusszähler auf 1 Liter pro Minute eingestellt. Siehe Diskussion für alternative Anästhesieoptionen.
- Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, bevor Sie mit dem Verfahren beginnen. Die Tiefe der Anästhesie kann durch eine feste Zehenklemme bestätigt werden.
- Übertragen Sie die Maus aus dem Induktionsbehälter auf einen Nasenkegel und reduzieren Sie den Isofluran-Durchfluss auf 1,5 % und den Sauerstoffdurchflusszähler auf 0,5 l/min.
- Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf beide Augen auf, da das Verfahren 5 min überschreitet.
- Halten Sie die normale Körpertemperatur mit einem Thermopad aufrecht.
- Vorbereitung der Wundstelle
- Verwenden Sie einen elektrischen Rasiermesser Clipper in einer kaudalen rostralen Bewegung, um das Fell auf der Rückseite der Maus auf schulterebene zu entfernen. Entfernen Sie das Haar niedriger auf dem Rücken nach Bedarf, wenn mehr als zwei Wunden durchführen.
- Entfernen Sie das restliche Haar mit einer Rasierklinge in einer rostralen Kaudalbewegung, die bei 20° von der Rückseite der Maus gehalten wird, um den abgeschnittenen Bereich eng zu rasieren (Abbildung 1A).
- Reinigen Sie den rasierten Bereich mit einem Povidon-Jod-Tupfer.
- Wischen Sie die Haut mit einem sterilen 70% Isopropylalkohol-Präparat ab, um mögliche hautnahe Reizungen durch den Jodabstrich zu reduzieren.
- Verletzt
- Kneifen Sie die Haut zwischen den Schulterblättern entlang der dorsalen Mittellinie und ziehen Sie die eingeklemmte Hautfalte vom Körper weg (Abbildung 1B).
- Positionieren Sie die Maus auf der Seite mit der Hautfalte auf einer flachen Oberfläche, die mit einem sauberen Handtuch auf Papierbasis oder einem gleichwertigen Tuch drapiert ist. Verwenden Sie ein Blatt Zahnwachs unter dem Handtuch, um die darunter liegende Oberfläche vor Beschädigungen zu schützen (Abbildung 1C).
- Legen Sie den Biopsie-Punch der gewünschten Größe so nah wie möglich am Körper und lassen Sie die Haut entspannen. Dehnen Sie die Haut nicht, oder die Wundgröße ist größer als die angegebene Stempelgröße(Abbildung 1D).
- Punch die Haut durch Drücken nach unten, kann eine Schaukelbewegung verwendet werden, um sicherzustellen, dass alle Schichten der Haut auf beiden Seiten durchdrungen wurden (Abbildung 1E). Verwenden Sie einen neuen Biopsie-Punch für jedes Tier.
- Entfernen Sie die Schlagbiopsien von den Wunden (Abbildung 1F). Wenn es noch Befestigungsstellen gibt, verwenden Sie sterile Schere und Pinzette, um den Schlag von der umgebenden Haut zu befreien. Verarbeiten Sie das Schlagbiopsiekontrollgewebe nach Bedarf auf der Grundlage nachgelagerter Pläne für Wundheilungsanalysen (siehe Diskussion für Vorschläge).
- Nehmen Sie makroskopische Fotos aus der gleichen Entfernung zu den Wundstellen oder mit einem Lineal im Rahmen auf, um die anfängliche Wundfläche zu messen und Ausreißer aus der Analyse zu entfernen.
- Analgesie für mindestens 24 h gemäß einem zugelassenen Tierprotokoll verabreichen. Zum Beispiel: Buprenorphin SR-LAB, subkutan bei 0,5-2 mg/kg für 48 h Schmerzlinderung injiziert (siehe Diskussion für alternative Vorschläge und Überlegungen).
- Überwachen Sie die Maus, wie sie aus der Anästhesie kommt, bis sie eine aufrechte Haltung behält und normal um den Käfig herumläuft.
3. Post-Wund-Überwachung
- Überwachen Sie Mäuse täglich auf experimentelle Endpunkte, die vom Prüfer festgelegt werden und in Übereinstimmung mit und Einhaltung institutioneller Protokolle. Beispiele sind: Infektion, sichtbare Gewichtsabnahme, oder eine geknickte Körperhaltung.
- Nehmen Sie täglich makroskopische Fotos in kontrollierter Weise auf, wie es nach der ersten Operation getan wurde.
4. Wunden ernten
- Euthanisieren Sie Mäuse zum gewünschten Zeitpunkt nach der Wundung gemäß einem zugelassenen Tierprotokoll.
- Nehmen Sie makroskopische Fotos der Wundstellen in kontrollierter Weise im Einklang mit früheren Fotoaufnahmen auf (Abbildung 2A,C).
- Schneiden Sie ein breites Rechteck um die Wundstellen mit einem Skalpell (Abbildung 2D,E).
- Befreien Sie das rechteckige Stück Gewebe mit Schere und Pinzette, um zurück zu schälen und schneiden Sie die Haut weg vom darunter liegenden Gewebe(Abbildung 2F). In eine Petrischale geben (Abbildung 2G).
- Ernten Sie die Wunden. Schneiden Sie bis zu 2 mm unverwundetes Gewebe um alle Seiten der Wunde in einer rechteckigen Form(Abbildung 2H,I). Siehe Diskussion für alternative Optionen, um die Wunde zu ernten.
- Verarbeiten Sie die Wunden nach Bedarf für nachfolgende Studien. Reservieren Sie mindestens eine Wunde pro Maus für Paraffineinbettung und histologische Analyse.
5. Wundfixierung und Einbettung
- Beheben Der Wunde
- Fixieren Sie das Wundgewebe in einer frisch zubereiteten 4% Paraformaldehydlösung8 für 3 h bei Raumtemperatur und übertragen Sie es dann über Nacht auf 4 °C. Die Elektronenmikroskopie (EM) ist nicht erforderlich.
- Waschen Sie die Wunden zweimal für 30 min in 1x PBS.
- PBS durch 70% ETOH ersetzen und bei 4 °C bis zum Einbetten lagern. Verarbeiten Sie Gewebe innerhalb von 24-48 h, um Antigenverlust zu vermeiden oder innerhalb von 1-2 Wochen, wenn nur die Bewertung histologischer Eigenschaften.
- Prozess und Einbettung der Wunde
- Übertragen Sie jede Wunde auf eine Einbettkassette. Beschriften Sie das Einbetten von Kassetten in Bleistift, während der Vorgang Tinten entfernt.
- Verarbeiten Sie das Gewebe entweder manuell oder mit einem automatisierten Prozessor, indem Sie das Gewebe mit steigenden Ethanol-Prozentsätzen dehydrieren, mit Xylol löschen und dann das Gewebe mit Paraffinwachs infiltrieren (Tabelle 1).
- Die Wunde 90° ("stehend") von der horizontalen Oberfläche der Einbettform einbetten (Abbildung 3A,B).
6. Tag 0 Wundbereichsanalyse
- NIH-Image J oder NIH-Fiji freie Software herunterladen (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Öffnen Sie eine Datei mit einem Foto von Tag 0 Wunden.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für "Bereich" unter Analysieren | Messen einstellen.
- Wählen Sie "Skalierung festlegen" unter Analysierenaus. Geben Sie den Abstand in Pixel, den bekannten entsprechenden Abstand und die Einheit des Abstands (= Längeneinheit) ein, wenn makroskopische Messungen Teil der Studie sind, oder überspringen Sie diesen Schritt, wenn nur relative Messungen erforderlich sind.
- Wählen Sie "Freihandauswahl" auf der Fidschi-Symbolleiste aus.
- Umreißen Sie den Umfang der Wunde.
- Klicken Sie unter Analysierenauf Measure .
- Erstellen Sie eine Tabelle, um die Messungen pro Tier pro Wunde nachzuverfolgen.
- Kopieren Sie die Messung des Wundbereichs in der Kalkulationstabelle.
- Berechnen Sie die mittlere Fläche und die Standardabweichung aller Wunden für ein bestimmtes Experiment.
- Ausgeschlossen eige alle Wunden außerhalb von zwei Standardabweichungen des Mittelwerts von der histologischen Analyse.
7. Serielle Steilierung
- Kühlen Sie die paraffin-eingebetteten Wundblöcke über Nacht bei 4 °C.
- Setzen Sie den Paraffinblock auf den Blockhalter des Mikrotom und orientieren Sie sich so, dass die Klinge gerade über den Block schneidet. Richten Sie den Block so aus, dass das Gewebe bei 90° "steht", was die gleichzeitige Schnittung der Epidermis und Dermis ermöglicht (Abbildung 3C,D).
- Machen Sie 2-4 Bänder mit 20-30 Paraffinabschnitten von je 7 m.
- Verwenden Sie einen trockenen Pinsel und eine Seziernadel, um jedes Band auf eine feste, aber mantisierbare Oberfläche wie eine feste schwarze Kunststofffolie zu übertragen.
- Lösen Sie den oberen Teil jedes Bandes mit einer Rasierklinge und legen Sie sie auf ein Mikroskopschlitten.
- Beobachten Sie die ungefärbten Abschnitte unter einem Hellfeldmikroskop, um festzustellen, welche verwundetes Gewebe enthalten, das durch das Fehlen von Haarfollikel, Veränderungen im Aussehen des Bindegewebes oder der Epidermis und/oder das Vorhandensein eines Schorfes identifiziert werden kann (Abbildung 4A,B).
- Entsorgen Sie unverwundete Abschnitte bis zu 20 Abschnitte vor Dem Beginn der Wunde.
- Abschnitt durch die Wunde durch die Wiederholung der Schritte 7.3 und 7.4, bis keine Wunde in unbefleckten Abschnitten erkannt wird.
8. Montage von Paraffinabschnitten
- Separate Paraffinabschnitte alle 5 Abschnitte mit einer Rasierklinge, beginnend mit dem ersten Band (Abbildung 3E).
- Etikettenmikroskopgleitet sowohl mit der Foliennummer als auch mit allen Schnittnummern.
- Schnappen Sie sich die Gruppe von 5 Abschnitten mit einem nassen Pinsel und schwimmen Sie sie auf der Wasseroberfläche eines warmen Wasserbades (40-45 °C), um sie abzuflachen.
- Wählen Sie die Gruppe von 5 Abschnitten aus dem Wasserbad mit einem der beschrifteten Mikroskopschlitten (Abbildung 3F) und legen Sie auf einem Diawärmer-Set bei 37 °C für bis zu 24 h.
- Bewahren Sie die Folien aufrecht in einer Folienbox auf.
9. Histologische Färbung
- Übertragen Sie jeden8. Mikroskopschlitten (entspricht jedem40. Paraffinabschnitt) auf ein Färbegestell und färben Sie mit Hämatoxylin und Eosin.
10. Mikroskopische Bildgebung
- Erfassen Sie Bilder mit einem Hellfeldmikroskop, das mit einer 4-fachen objektiven und digitalen Erfassungsfähigkeit ausgestattet ist. Zeichnen Sie den Maßstab auf, auf dem das Bild aufgenommen wird.
- Stellen Sie die gesamte Wunde des oberen Abschnitts jeder gebeizten Rutsche vor und stellen Sie sicher, dass auf beiden Seiten ein unverwundetes Gewebe enthalten ist. Nehmen Sie mehrere überlappende Bilder auf, wenn die Wunde größer als der Rahmen eines einzelnen Bildes ist.
- Speichern Sie die Datei einschließlich der Abschnittsnummer für die morphometrische Analyse. Verwenden Sie die Schnittnummer gefolgt von a, b, c usw. für überlappende Bilder derselben Wunde.
11. Morphometrische Analyse
HINWEIS: Wenn sich die Wunde über mehrere Bilder erstreckt, summieren Sie die Ausdenmesswerte der einzelnen Bilder, um einen Wert pro Metrik pro Gewickeltschnitt zu erhalten, der in der Kalkulationstabelle aufzeichnet.
- Öffnen Sie in Bild J eine digitale Datei eines befleckten Wundbildes. Verwenden Sie keine genähten Bilder für die Analyse. Führen Sie Messungen an vergrößerten überlappenden Bildern durch, indem Sie Sehenswürdigkeiten zum Auslassen und Aufnehmen von Messungen von Bild zu Bild finden.
- Legen Sie die Skalierungs- und Messeinstellungen fest.
- Wählen Sie "Skalierung festlegen" unter Analysierenaus. Geben Sie den Abstand in Pixel, den bekannten entsprechenden Abstand und die Einheit des Abstands (= Längeneinheit) ein. Die Skala sollte im Fenster angezeigt werden und dem Maßstab entsprechen, bei dem das Bild aufgenommen wurde.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Global", um die Skalierung für jedes geöffnete Bild gleich zu halten.
- Wiederholen Sie die Schritte 11.2.1 bis 11.2.2 jedes Mal, wenn Bild J geschlossen und wieder geöffnet wird.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für "Bereich" unter Analysieren | Messen einstellen.
- Messen Sie die Wundlänge
- Wählen Sie "Freihandauswahl" auf der Fidschi-Symbolleiste aus.
- Messen Sie vom letzten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf einer Seite der Wunde bis zum ersten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf der anderen Seite der Wunde (Abbildung 4A,B).
- Verfolgen Sie entlang der dermo-epidermalen Kreuzung, um diese beiden Sehenswürdigkeiten zu erreichen. Wenn die Epidermis nicht die gesamte Wunde bedeckt, folgen Sie der dermo-epidermalen Kreuzung auf einer Seite der Wunde und wo die wandernde Zunge endet, folgen Sie dem überlegenen Aspekt des Granulationsgewebes oder der Kreuzung zwischen dem Granulationsgewebe und dem Schorf, bis Sie die wandernde Zunge erreichen und schließlich der erste Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf der anderen Seite(Abbildung 4E,F).
- Klicken Sie unter Analysierenauf Messen. Die Länge der Messung wird in den gleichen Einheiten angezeigt, die in der Skala festgelegt sind.
- Erstellen Sie eine Kalkulationstabelle, um die Messungen nachzuverfolgen (Ergänzende Tabelle 1).
- Kopieren Sie die Wundlänge in die Kalkulationstabelle.
- Messen sie die epidermale Länge
- Wenn die Epidermis die gesamte Wunde bedeckt, ist die epidermale Länge die gleiche wie die Wundlänge.
- Kopieren Sie die Messung "Wundlänge" in die Spalte "epidermale Länge" in der Excel-Tabelle, und fahren Sie mit Schritt 11.5 fort.
- Wenn die Epidermis nicht die gesamte Wunde abdeckt, wählen Sie die "Freihandauswahl" und messen Sie den Abstand zwischen jeder epidermalen Vorderkante nach dem überlegenen Aspekt des Granulationsgewebes oder der Kreuzung zwischen dem Granulationsgewebe und dem Schorf zum ersten Haarfollikel (Abbildung 4C,D).
- Klicken Sie unter Analysierenauf Messen.
- Subtrahieren Sie diese Messung von der Wundlänge und notieren Sie die Zahl unter "epidermale Länge" in der Excel-Tabelle.
- Wenn die Epidermis die gesamte Wunde bedeckt, ist die epidermale Länge die gleiche wie die Wundlänge.
- Messen Sie den Wundbereich
- Wählen Sie "Freihandauswahl" auf der Fidschi-Symbolleiste aus.
- Messen Sie vom letzten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf einer Seite der Wunde bis zum ersten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf der anderen Seite der Wunde (Abbildung 4A,B,E,F).
- Verfolgen Sie entlang des überlegenen Aspekts der Epidermis (nicht den Schorf enthalten) oder den überlegenen Aspekt des Granulationsgewebes, wenn die Wunde nicht vollständig von der Epidermis bedeckt ist.
- Fahren Sie fort, vertikal entlang der Haarfollikel in das Granulationsgewebe zu verfolgen, sobald der gegenüberliegende Haarfollikel erreicht ist und bis Fettgewebe oder Muskel erreicht ist. Folgen Sie der unteren Grenze des Granulationsgewebes auf der gegenüberliegenden Seite der Wunde und verbinden Sie den Ausgangspunkt entlang des Haarfollikels, um den Bereich zu schließen (Abbildung 4E,F).
- Klicken Sie unter Analysierenauf Messen.
- Kopieren Sie den Wundbereich in die Tabelle unter "Wundbereich gemessen".
- Messen Sie den epidermalen Bereich
- Wählen Sie "Freihandauswahl" auf der Fidschi-Symbolleiste aus.
- Wenn die Wunde vollständig epithelialisiert ist:
- Verfolgen Sie entlang des überlegenen Aspekts der Epidermis, bis der gegenüberliegende Haarfollikel erreicht ist, und vervollständigen Sie den Bereich, indem Sie zum Ausgangspunkt nach der dermo-epidermalen Kreuzung zwischen Epidermis und Dermis zurückkehren (Abbildung 4D).
- Klicken Sie unter Analysierenauf Messen.
- Kopieren Sie den epidermalen Bereich in die Excel-Tabelle unter "epidermaler Bereich gemessen" und fahren Sie mit Schritt 11.7 fort.
- Wenn die Wunde nicht vollständig epithelialisiert ist:
- Verfolgen Sie entlang des überlegenen Aspekts der Epidermis bis zur Vorderkante und kehren Sie zum Ausgangspunkt nach der dermo-epidermalen Kreuzung zurück (Abbildung 4C).
- Klicken Sie unter Analysierenauf Messen.
- Wiederholen Sie Schritt 11.6.3.1 und 11.6.3.2 auf der gegenüberliegenden Seite der Wunde.
- Klicken Sie unter Analysieren auf Messen.
- Summieren Sie sich die beiden Zahlen, die in den Schritten 11.6.3.2 und 11.6.3.4 erhalten wurden, und geben Sie das Ergebnis unter "epidermaler Fläche gemessen" in die Tabelle ein.
- Wiederholen Sie die Schritte 11.3 bis 11.6 auf jedem40. Abschnitt (jeder8. Schlitten).
- Berechnen Sie den epidermalen Bereich der gesamten Wunde.
- Erstellen Sie eine neue Spalte in der Tabelle "epidermaler Bereich berechnet" neben "epidermaler Länge".
- Multiplizieren Sie die Zahl für "epidermale Länge" mit 280 für jeden Abschnitt mit Ausnahme des letzten Abschnitts (7 m dicker Abschnitt x 40 Abschnitte).
- Multiplizieren Sie die Zahl für "epidermale Länge" mit 7 für den letzten Abschnitt (Dicke des Abschnitts).
- Summieren Sie den Wert der "epidermalen Fläche berechnet" für jeden Abschnitt, um die epidermale Fläche der gesamten Wunde zu erhalten.
- Berechnen Sie die Wundfläche der gesamten Wunde.
- Wiederholen Sie die Schritte 11.8.1 bis 11.8.4 mit den Wundlängenmessungen.
- Berechnen Sie das epidermale Volumen der gesamten Wunde.
- Wiederholen Sie die Schritte 11.8.1 bis 11.8.4 mit den Messungen "epidermaler Fläche".
- Berechnen Sie das Wundvolumen der gesamten Wunde.
- Wiederholen Sie die Schritte 11.8.1 bis 11.8.4 mit den Messungen "Wundbereich gemessen".
- Berechnen Sie den Prozentsatz des epidermalen Volumens in der Wunde.
- Dividieren Sie das gesamte epidermale Volumen durch das gesamte Wundvolumen und multiplizieren Sie es mit 100, um den Prozentsatz zu erhalten (tun Sie dieses Verhältnis nicht für jeden Abschnitt).
- Berechnen Sie den Prozentsatz der epidermalen Fläche unter der Wundfläche.
- Dividieren Sie die gesamte epidermale Fläche durch die gesamte Wundfläche und multiplizieren Sie sie mit 100, um den Prozentsatz zu erhalten. Wenn eine Wunde vollständig epithelialisiert ist, sollte diese Zahl 100 sein.
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Representative Results
Abbildung 5 zeigt den Bereich der gemessenen und berechneten Werte, die durch morphometrische Analysen an Wildtypwunden erzielt wurden, die in verschiedenen Mausstämmen von mehreren Chirurgen erzeugt und von verschiedenen Individuen analysiert wurden. Wildtyp-Mäuse aus verschiedenen Stämmen können statistische Unterschiede aufweisen, wie sie sowohl in unseren Studien als auch in der Literatur9,10beschrieben werden. Basierend auf diesen repräsentativen Ergebnissen empfehlen wir, innerhalb einer Studie Mäuse aus nur einem Stamm zu verwenden. Obwohl wir empfehlen, dass die gleiche Person alle Wunden innerhalb einer bestimmten Studie durchführen, könnten mehrere Personen als Chirurgen handeln, solange sich der Bereich der Wunden an Tag 0 nicht statistisch zwischen der Arbeit des Einzelnen unterscheidet. Da die in diesem Protokoll beschriebene morphometrische Analyse umfangreich sein kann, konnten mehrere Personen Teile desselben Experiments analysieren, jedoch nur, wenn die Ergebnisse ihrer Analyse von zwei Proben innerhalb von 5 % voneinander liegen. Es ist jedoch vorzuziehen, dass eine einzelne Person die Wunden in einer blinden Weise analysiert, um Voreingenommenheit zu vermeiden.
Abbildung 6 zeigt eine Metaanalyse, in der die Wundmessungen verglichen werden, die durch Befolgung des in dieser Studie11 beschriebenen Protokolls mit Messungen aus der "Mitte" der Wunde und 40 umgebenden Abschnitten gewonnen wurden. In Abbildung 6Awurden die epidermale Fläche und die Wundfläche aus der Messung der epidermalen und Wundlängen an Wundabschnitten berechnet, gefolgt von der Berechnung des Prozentsatzes der epidermalen Fläche zwischen der Wundfläche (manchmal auch als "Prozentsatz des Verschlusses" oder "Prozentsatz der Epithelisierung" bezeichnet). In ähnlicher Weise wurde in Abbildung 6Bder Prozentsatz der Epidermis in der Wunde als verhältnis des epidermalen Volumens (berechnet aus der gemessenen epidermalen Fläche) zum Wundvolumen (berechnet aus der gemessenen Wundfläche) ermittelt. Für beide Parameter zeigte die Analyse der gesamten Wunde starke statistische Unterschiede zwischen den Gruppen (bis zu P < 0,001 nach Einweg-Anova). Allerdings wurde die Signifikanz verringert (bis zu P < 0,01 nach Einweg-Anova), wenn nur 40 Abschnitte in der Mitte des Würdes analysiert wurden. Diese Ergebnisse zeigen eine Abnahme des Signifikanzniveaus, wenn nur eine Teilmenge der Wunde analysiert wird. Diese Daten deuten darauf hin, dass Defekte mit einer geringen Effektgröße wahrscheinlich nur bei der Durchführung morphometrischer Analysen an der gesamten Wunde erkannt werden und dass leichtere Wundheilungs-Phänotypen von einer "Mitte der Wunde"-Analyse übersehen werden.
Die übliche Praxis für die Analyse der in vivo Wundheilung beinhaltet die Messung des Bereichs der Wunde auf histologischen Abschnitten, die irgendwo in der Wunde12ausgewählt wurden. Vor diesem Hintergrund wurde der Durchschnitt der gemessenen Wundfläche aus den seriellen Abschnitten ganzer Wunden mit dem aus den mittleren Teilmengenabschnitten gewonnenen verglichen. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen Versuchsgruppen und Analysemethoden (Abbildung 6C). Das aktuelle Protokoll verwendet jedoch den gemessenen Bereich (siehe Abbildung 6C)über die gesamte Wunde, um das Wundvolumen zu berechnen. Wie in Abbildung 6Ddargestellt, unterscheidet sich das berechnete Wundvolumen (das nur mit hilfe der Analyse der gesamten Wunde berechnet werden kann) zwischen den Versuchsgruppen erheblich. Zusammenfassend zeigen diese repräsentativen Ergebnisse die Bedeutung einer tiefgehenden histologischen Analyse der in diesem Protokoll beschriebenen Wundheilungsparameter, um Phänotypen zu erkennen, die andernfalls mit einer traditionelleren Wundheilungsanalyse übersehen worden wären.
Abbildung 1: Bilaterales exzisionales Wundverfahren. (A) Repräsentatives Foto einer Maus nach dem Schneiden und Rasieren von Haaren aus dem chirurgischen Bereich. (B) Die Haut eingeklemmt zwischen den Schulterblättern entlang der dorsalen Mittellinie. (C) Die Maus auf ihrer Seite mit der Hautfalte flach gelegt positioniert. (D) Darstellung der Biopsie-Punch-Platzierung. (E) Gestanzte Hautfalte. (F) Die Maus mit zwei bilateralen Wunden an Tag 0 und die ausgeschnittenen Punschbiopsie-Kontrollgewebe, wie durch die weißen Pfeile angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Wundernteverfahren. (A-C) Makroskopische Fotografien von 6 mm exzisenden Wunden nach 4 Tagen (A), 7 Tage (B) und 11 Tagen (C). (D-E) Mit einer Skalpellklinge wurde ein hautförmiger Schnitt in Form eines breiten Rechtecks gemacht, das die Wunden und das umgebende unverwundete Gewebe umfasst. (F) Die Haut wurde mit Zangen und Schere aus dem darunter liegenden Gewebe befreit. (G) Darstellung der geernteten bilateralen Wunden. (H) Die gepunktete weiße Linie stellt den Rand des Gewebes dar, das nach der Verwendung einer Punschbiopsie geerntet würde (diese Methode ermöglicht eine standardisierte Menge an geerntetem Gewebe). (I) Die gepunktete weiße Linie stellt den Rahmen des Gewebes dar, das für die Histologie gestutzt würde (rechteckige Form ermöglicht eine einfachere Einbettung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lösung | Zeit (Minuten) | Temperatur (Celsius) | Druck (kPa) |
| 80% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| 95% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| 100% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| Xylol | 30 | Rt | N/A |
| Xylol | 30 | Rt | N/A |
| Paraffin | 30 | 60 | 20 |
| Paraffin | 30 | 60 | 20 |
Tabelle 1: Probenverarbeitungsverfahren für paraffineinbettende Verfahren. RT = Raumtemperatur. N/A = nicht anwendbar.
Abbildung 3: Wundeinbettung und Schnittung. (A) Paraffin-verarbeitete Wunde, die flach in einer Einbettform liegt. (B) Die Wunde wurde bei 90° ("stehend") von der horizontalen Oberfläche der Form zum Einbetten gehalten. (C) Paraffin-eingebettete Wunde, die ordnungsgemäß für die Schnitte ausgerichtet ist (D) Paraffinblock auf dem Mikrotom montiert wurde in Bänder von etwa 20 Abschnitten (E) Paraffin Bänder in 5-Abschnitt-Schritten geschnitten, wie durch die weißen Klammern angegeben. (F) In einem Warmwasserbad (40-45 °C) flach verlegte Serienteile wurden auf einem Mikroskopschlitten montiert. Die Karikatur in (A-C) stellt die Wunde (orange) in der Haut (blau) mit der richtigen Ausrichtung der Epidermis (e) und der Dermis (d) für jeden Schritt dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Histologische Merkmale von Wunden und Abbildung morphometrischer Parameter. (A, B) Histologische Merkmale eines Tages 4 (A) und eines Tages 7 (B) 6 mm Wunde. (C-F) Darstellung der verschiedenen Messungen, die zur Durchführung der quantitativen morphometrischen Analyse verwendet werden: Länge der Epidermis (C, D, gepunktete schwarze Linie), gemessener Bereich der Epidermis (C, D, gelb schattierter Bereich), Länge der Wunde (E, F, gepunktete gelbe Linie) und gemessene Fläche der gesamten Wunde (E, F, grau schattierte Fläche). HF = Haarfollikel; Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Morphometrische Merkmale repräsentativer 6 mm Wild-Typ-Wunden an Tag 4, Tag 7 und Tag 11 nach der Verwundung. Streudiagramme stellen Daten dar, die aus morphometrischen Analysen von 6 mm Wild-Typ-Wunden gewonnen werden, die in verschiedenen Mausstämmen von mehreren Chirurgen erzeugt und von verschiedenen Individuen analysiert werden. (A) Wundvolumen, (B) epidermales Volumen, (C) Prozentsatz der Epidermis in der Wunde, (D) Wundfläche (berechnet), (E) epidermale Fläche (berechnet) und (F) Prozentsatz der epidermalen Fläche unter der Wundfläche zeigen den Variationsbereich der morphometrischen Werte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Metaanalyse Vergleichsparameter aus der ganzen Wunde mit der Mitte der Wunde identifiziert neue Defekte mit höherer Bedeutung. Die Wundheilungsmorphometrie wurde am 7. Tag mit Saline (Kontrolle), Transforming Growth Factor Beta 3 (Tgfb3), Tgfb3 mit neutralisierendem Antikörper (Tgfb3 + NAB) und neutralisierendem Antikörper allein (NAB) injiziert. Messungen wurden an seriellen schnittigen Wunden ("ganz") oder an 40 Abschnitten aus der Mitte der Wunde ("Mitte") durchgeführt und verwendet, um den Prozentsatz der epidermalen Fläche über die Wundfläche (A), den Prozentsatz der Epidermis in der Wunde (B) und das Wundvolumen (D) zu berechnen. (C) stellt den Durchschnitt der Wundfläche dar, die auf der ganzen oder mittleren Derwunde gemessen wird. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, ns = nicht signifikant, Einweg-Anova). Diese Zahl wurde anhand von Daten von Le et al.11geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Tabelle 1: Ein Beispiel für eine Kalkulationstabelle zur Aufzeichnung morphometrischer Messungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Das bilaterale Exzisions-Wundmodell ist ein hochgradig anpassbares Verfahren, das verwendet werden kann, um viele verschiedene Aspekte der Wundheilung zu studieren. Bevor die Ermittler ein Wundheilungsprojekt beginnen, sollten sie eine Leistungsanalyse durchführen, um die Anzahl der Wunden zu ermitteln, die erforderlich sind, um einen Defekt einer bestimmten Effektgröße zu erkennen. In der Literatur gibt es Ungereimtheiten darüber, ob einzelne Mäuse oder Wunden als biologische Repliken verwendet werden sollten, jedoch zeigte eine aktuelle Studie, dass es keine signifikante Korrelation zwischen zwei Wunden an einem einzelnen Tier gibt4. Dies deutet darauf hin, dass Wunden von einem einzelnen Tier voneinander unabhängig sind und als biologische Repliken betrachtet werden können, wodurch die Anzahl der Mäuse reduziert wird, die zum Erkennen eines Defekts erforderlich sind. Dies ist relevant, wenn man kleine Effektgrößen berücksichtigt, für die eine hohe Anzahl von Wunden erforderlich ist, um die Bedeutung4zu erreichen. Darüber hinaus können die Ergebnisse der Leistungsberechnung beeinflussen, wie viele Wunden an jedem Tier durchgeführt werden, wobei 2 und 4 Wunden pro Tier am häufigsten sind.
Auch das Operationsprotokoll selbst ist hochflexibel. Während wir die Anästhesisierung durch Isofluran-Verdampfer aufgrund der kurzen Verfahrenslänge und schnellen Erholung (10-15 min pro Maus) empfehlen, können Forscher ohne Zugang zu einem Verdampfer injizierbare Anästhesie einschließlich Ketamin/Xylazin oder Pentobarbital verwenden. Die Auswahl eines geeigneten Schmerzmittels ist besonders kritisch, da es sich auf die entzündlichen Phasen der Wundheilung bezieht. Die Verwendung von nichtsteroidalen entzündungshemmenden Medikamenten (NSAIDS) wie Flunixin-Meglumin oder Meloxicam sollte mit Vorsicht angewendet werden, da sie Entzündungen verringern können. Opioide werden daher in Studien bevorzugt, in denen Entzündungen untersucht werden. Wir empfehlen Analgetika (z.B. Buprenorphin Sustained-Release), die bis zu 48 h Analgesie bieten und die Notwendigkeit wiederholter, zusätzlicher Dosen eliminieren. Alle chirurgischen Eingriffe sollten in Übereinstimmung mit den Bundesrichtlinien durchgeführt und durch ein zugelassenes Tierprotokoll unterstützt werden.
Wundheilung ist ein Prozess, der mehrere Phasen umfasst, von denen jede durch verschiedene biologische Prozesse mit unterschiedlichenZelltypen3 gekennzeichnet ist. Die entzündliche Phase tritt zwischen den Tagen 0 und 5 auf, mit der frühen Migration von polymorphonutorischen Neutrophilen (PMN) und Makrophagen an den Ort der Verletzung13. Die proliferative Phase tritt zwischen 3 und 14 Tagen auf, wobei die Reepithelisierung je nach Größe der Wunde14eine unterschiedliche Zeitdauer in Gedauert hat. In diesem Protokoll verwendeten wir einen 6 mm Biopsie-Punch und die meisten Wunden wurden um 7 Tage reepithelisiert. Dieser Zeitrahmen müsste jedoch verkürzt werden, wenn kleinere Stempel verwendet werden (sie sind bereits in 1 mm mm erhältlich). In Kombination mit früheren Zeitpunkten können diese kleineren Wunden vorzuziehen sein, um die Menge der histologischen Analysen15zu reduzieren. Schließlich treten die Umbau- und Reifungsphasen nach 7 Tagen und bis zu einem Jahr nach der Verletzung16auf. Diese späteren Zeitpunkte können erforderlich sein, um die Reifung der Wunde zu untersuchen oder um Wundheilungsverzögerungen bei Versuchstieren zu untersuchen. Daher muss der Prüfer die kritischen Zeitpunkte bestimmen, die erforderlich sind, um bestimmte Phasen der Wundheilung auf der Grundlage ihrer speziellen Hypothese zu untersuchen5.
Die Analyse der Wundheilung beschränkt sich oft nicht auf histologische Analysen. Ungefärbte Paraffinabschnitte können für zusätzliche Analysen wie Immunfluoreszenz oder Massons Trichrom zur Kollagenablagerung verwendet werden. Die Verarbeitung von Kontrollgewebe (Punchbiopsien) und die Ernteschritte des Gewebes hängen davon ab, wie neben histologischen Analysen auch die Wundheilung bewertet wird. Im Rahmen des operationsischen Protokolls werden Schlagbiopsien entfernt, um die exzissionale Wunde zu erzeugen. Diese Stempel können als unverwundetes Kontrollgewebe für nachgelagerte Anwendungen wie Protein (für Western- oder Zytokinprofilierung), DNA- oder RNA-Extraktion dienen und sollten entsprechend verarbeitet werden. Es wird empfohlen, mindestens einen Stempel für die histologische Analyse zu speichern, insbesondere in Fällen, in denen die Haut vor der Wundung behandelt wird (z. B. Anwendung von Tamoxifen zur Induktion der Cre-Lox-Rekombination17). Die Untersuchung des Stempels kann die Wirkung der Behandlung auf die kutane Morphologie bestimmen oder einfach die Beurteilung der Basis-Kutanmorphologie des verwendeten Mausmodells ermöglichen. Wunden, die nicht für die Histologie verwendet werden, können mit einer Schlagbiopsie geerntet werden, die die Größe der Wunde umfasst. Dieses Verfahren hat ein paar Vorteile, einschließlich der Ernte der gleichen Menge an Gewebe unabhängig von der Wundgröße (größere Wunden haben weniger umgebendes gesundes Gewebe). Schließlich beschreiben wir die Verwendung von 4% Paraformaldehyd als Fixativ und Paraffin als Material für die Konservierung bzw. Einbettung von Geweben. Andere Fixative können für bestimmte Anwendungen erforderlich sein und ersetzt werden (z. B. Carnoys oder Bouin-Fixative). Für die beste immunfluoreszierende Färbung, das Einfrieren und die Einbettung der Wunde in die Optimale Schnitttemperaturverbindung gefolgt von gefrorenem Schnitt bleibt die Methode der Wahl.
Das Abteilen von verwundetem Gewebe kann viele Herausforderungen mit sich bringen, insbesondere Wunden am 4. Tag, da der Schorf vorhanden ist. Um hochwertige Abschnitte zu erzeugen, wird empfohlen, zu überprüfen, ob alle Teile des Mikrotom dicht befestigt sind, der Blockhalter in seine Ausgangsposition zurückgezogen wird, der Klingenhalter zwischen 0 und 10° eingestellt ist und die Klinge fest befestigt, aber nicht überdrig ist. Obwohl der Paraffinblock gekühlt ist, kann das Gewebe noch zerkleinern. Wenn das Zerkleinern anhält, kann ein Stück Eis für 5 Minuten auf den Block gelegt werden, während es noch montiert ist. Sobald der Schnitt begonnen hat, wird dringend empfohlen, den Block aus dem Mikrotome zu entfernen, um den Verlust von Paraffinabschnitten zu verhindern. Es ist zwingend notwendig, alle verlorenen Paraffinabschnitte aufzuzeichnen, sowohl ihre Anzahl als auch ihre Rangfolge in der seriellen Sektion. Dies wirkt sich auf die morphometrische Analyse aus und muss berücksichtigt werden. Nach Beginn der Schnitte kann die Identifizierung von verwundetem Gewebe auf ungefärbten Abschnitten schwierig sein, insbesondere wenn sie nicht mit der Histologie vertraut ist. Im Zweifelsfall wird empfohlen, konservativ zu sein und alle Abschnitte, die Gewebe enthalten, aufzubewahren. Sobald der histologische Fleck durchgeführt wird, wird die Gewebeorganisation deutlicher und die Wunde deutlicher. Gelegentlich sind Haarfollikel möglicherweise nicht deutlich sichtbar oder weit von der Wundkante entfernt. Wenn dies der Fall ist, können andere Schlüsselmerkmale des verwundeten Gewebes verwendet werden, um die Grenzen der Wunde zu bestimmen, einschließlich einer abrupten Zunahme gefolgt von einer sofortigen Abnahme der epidermalen Dicke und scharfen Veränderungen in der Organisation des Bindegewebes (Abbildung 4A-B).
Digitale Bildgebung ist ein wichtiger Schritt in der morphometrischen Analyse. Die morphometrische Analyse sollte an einzelnen Bildern mit einem Wahrzeichen auf jedem Bild durchgeführt werden, um wiederholte Messungen zu vermeiden. Es ist jedoch möglich, alle Rahmen mit digitaler Software zusammenzufügen und die Analyse auf einem einzigen Bild durchzuführen. Obwohl dies auf den ersten Blick einfacher erscheint, kann die Manipulation eines großen Bildes den Analyseprozess verlangsamen. Die Wahl des Abschnitts ist auch für die Analyse von entscheidender Bedeutung. Obwohl wir empfehlen, den oberen Bereich jeder8. Folie digital zu erwerben, sollte die Qualität des Abschnitts priorisiert und die besten der 5 Abschnitte auf dieser Folie abgebildet werden. Abschnitte mit kleinen Falten konnten noch analysiert werden, indem der Bereich/die Länge der Falte geschätzt wurde. Die Nummer dieses abschnitts sollte sowohl in der digitalen Datei als auch in der Excel-Tabelle aufgezeichnet werden, sodass der Abstand zwischen dem vorherigen und dem nächsten analysierten Abschnitt entsprechend angepasst werden kann.
Schwere Wunden betreffen schätzungsweise 6,5 Millionen Menschen mit einer Behandlung, die jährlich über 25 Milliarden US-Dollar kostet,und sind ein fester Bestandteil chirurgischer Eingriffe und sind nicht nur für viele andere Gesundheitsprobleme, einschließlich Diabetes und Adipositas, zweitrangig. Die Maus wurde als bequemes Modell verwendet, um menschliche Krankheiten zu studieren, weil es einfach ist, sein Genom zu manipulieren, obwohl sie im Vergleich zur menschlichen Störung oft einen subtilen Phänotyp aufweist. Das in diesem Protokoll beschriebene bilaterale exzisionale Wundmodell und die anschließende morphometrische Analyse ist aufgrund seiner Fähigkeit, die Schwierigkeit zu beheben, kleinere Defekte in einem inhärent komplexen Wundheilungsprozess zu erkennen,signifikant. Aufgrund seiner höheren Empfindlichkeit und reduzierten Variabilität bietet dieses Protokoll die Möglichkeit, weniger Tiere zu verwenden, um die gleiche experimentelle Empfindlichkeit zu erhalten. Das Protokoll ist hochgradig anpassbar und kann verwendet werden, um alle Stadien der Gewebereparatur zu studieren. Detaillierte histologische morphometrische Analysen in Kombination mit der phänotypischen Charakterisierung des Gewebes haben ein großes Potenzial, das Wissen zu erweitern, das erforderlich ist, um das Verständnis kritischer Faktoren zu fördern, die die Gewebereparatur modulieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken allen Mitgliedern des Dunnwald Lab, die im Laufe der Jahre zur Optimierung dieses Protokolls beigetragen haben, und Gina Schatteman, deren Beharrlichkeit bei der Förderung des Einsatzes von seriellen Sektionen für die Wundanalyse seine Entstehung ermöglichte. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel von NIH/NIAMS an Martine Dunnwald (AR067739) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
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