Summary
Este protocolo describe cómo generar heridas de escisión bilaterales de espesor completo en ratones y cómo monitorear, cosechar y preparar las heridas para el análisis morfométrico. Se incluye una descripción detallada de cómo utilizar secciones histológicas seriales para definir, cuantificar y detectar defectos morfométricos con precisión.
Abstract
El modelo de heridas escisionales murinas se ha utilizado ampliamente para estudiar cada una de las fases secuencialmente superpuestas de la cicatrización de heridas: inflamación, proliferación y remodelación. Las heridas murinas tienen un lecho de heridas histológicamente bien definido y fácilmente reconocible sobre el cual estas diferentes fases del proceso de curación son medibles. Dentro del campo, es común utilizar un "medio" definido arbitrariamente de la herida para análisis histológicos. Sin embargo, las heridas son una entidad tridimensional y a menudo no es histológicamente simétricas, lo que apoya la necesidad de un método de cuantificación bien definido y robusto para detectar defectos morfométricos con un tamaño de efecto pequeño. En este protocolo, describimos el procedimiento para crear heridas de escisión bilaterales de espesor completo en ratones, así como una instrucción detallada sobre cómo medir parámetros morfométricos utilizando un programa de procesamiento de imágenes en secciones seriales selectas. Las mediciones de dos dimensiones de la longitud de la herida, la longitud epidérmica, el área epidérmica y el área de la herida se utilizan en combinación con la distancia conocida entre las secciones para extrapolar el área epidérmica de tres dimensiones que cubre la herida, el área general de la herida, el volumen epidérmico y el volumen de la herida. Aunque este análisis histológico detallado consume más tiempo y recursos que los análisis convencionales, su rigor aumenta la probabilidad de detectar nuevos fenotipos en un proceso de cicatrización de heridas inherentemente complejo.
Introduction
La cicatrización de heridas cutáneas es un proceso biológico complejo con fases que se superponen secuencialmente. Requiere la coordinación de procesos celulares y moleculares que están regulados temporal y espacialmente para restaurar la función de barrera del epitelio dañado. En la primera fase, la inflamación, los neutrófilos y los macrófagos migran a la herida, movilizando las defensas locales y sistémicas1. Seguir y superponer la fase inflamatoria es la etapa de proliferación. Los fibroblastos comienzan a proliferar y migrar rápidamente al tejido de granulación. Los queratinocitos alejados del borde delantero proliferan direccionalmente hacia la herida a medida que los queratinocitos diferenciados en el borde delantero migran para volver a epitelizar la herida2. Finalmente, comienza la fase de remodelación y maduración, durante la cual los fibroblastos en el tejido de granulación comienzan a sintetizar y depositar colágeno. La remodelación y organización de la nueva matriz puede durar hasta 1 año después de la lesión3. Debido a la complejidad de los eventos superpuestos que implican conversaciones cruzadas entre múltiples tipos de células, y a pesar de años de investigación, muchos de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la cicatrización de heridas siguen siendo poco entendidos.
El modelo de ratón es el modelo predominante de mamíferos para investigar los mecanismos de cicatrización de heridas debido a su facilidad de uso, relativamente bajo costo y manipulabilidad genética1,4,5. Aunque se han descrito diferentes tipos de heridas en el modelo murino, la más común es una herida escisional (ya sea perforación bilateral o biopsia por punción directa), seguida de los modelos de heridas incisionales4. El modelo de herida escisión tiene una clara ventaja sobre el modelo de incisión, ya que genera intrínsecamente tejido de control que no ha sido sometido al proceso de curación. El tejido de biopsia por punción que se extirpa como parte del protocolo quirúrgico se puede procesar de la misma manera que el tejido herido y se utiliza para establecer las condiciones homeostáticas para un criterio deseado. El tejido de control extirpado también puede ser útil si se evalúan los efectos de un pretratamiento cutáneo o se confirma una alteración genética exitosa en el momento de la lesión4.
Los parámetros de curación se pueden evaluar mediante muchas técnicas diferentes, como la planimetría o la histología. Sin embargo, la planimetría sólo puede evaluar las características visibles de la herida, y debido a la presencia de una costra, a menudo no se correlaciona con las mediciones de curación que se visualizan por histología, haciendo de la histología el "estándar de oro" del análisis4. A pesar de que el análisis histológico es el estándar de oro, se realiza con mayor frecuencia en un subconjunto arbitrario de la herida6,7. Por ejemplo, cortar la herida en "la mitad" antes de incrustar y secciones de la herida es actualmente una práctica común para reducir el tiempo y los recursos invertidos en la sección de materiales y análisis de datos. El método de análisis morfométrico descrito en este protocolo fue desarrollado para abarcar todo el tejido de la herida, para reflejar con precisión las características morfológicas de la herida, y para aumentar la probabilidad de detectar defectos de cicatrización de heridas con un tamaño de efecto pequeño. En este protocolo, detallamos un método quirúrgico para generar la herida murina más comúnmente estudiada, la herida excisional bilateral de espesor completo, así como un método detallado y riguroso para el análisis histológico tal se utiliza raramente en el campo.
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Protocol
Todos los experimentos se completaron de acuerdo con las regulaciones federales y la política y los procedimientos de la Universidad de Iowa han sido aprobados por la Universidad de Iowa IACUC.
1. Animales y cría
- Utilice ratones adultos de la línea de ratón deseada a las 8-10 semanas de edad cuando la etapa del folículo piloso esté en telógeno.
- El día de la cirugía, separe los ratones en jaulas limpias y haga una casa individual para minimizar la interrupción de la herida.
2. Cirugía
NOTA: No es necesario mantener condiciones quirúrgicas estériles. Si bien se debe tener cuidado de mantener la esterilidad entre los animales, la biopsia por punción en sí se realiza en una superficie limpia, pero no estéril. La duración de la cirugía por animal es de entre 10 y 15 minutos.
- Anesthetización
- Anestesar al animal durante 1-2 min en una cámara de inducción con el vaporizador de isoflurano establecido en un caudal de 4-5% y el medidor de flujo de oxígeno establecido en 1 litro por minuto. Consulte Discusión para ver las opciones alternativas de anestesia.
- Confirme la anestesia adecuada antes de comenzar el procedimiento. La profundidad de la anestesia puede ser confirmada por un pellizco firme del dedo del de la dedo del fondo.
- Transfiera el ratón del recipiente de inducción a un cono nasal y reduzca el caudal de isoflurano al 1,5% y el medidor de flujo de oxígeno a 0,5 L/min.
- Aplicar pomada oftálmica en ambos ojos ya que el procedimiento supera los 5 min.
- Mantenga la temperatura corporal normal con una almohadilla térmica.
- Preparación del sitio de la herida
- Utilice un cortacay de afeitar eléctrico en un movimiento rostral caudal para quitar el pelaje en la parte posterior del ratón a nivel del hombro. Retire el vello más bajo de la espalda según sea necesario si realiza más de dos heridas.
- Retire el cabello restante utilizando una cuchilla de afeitar en un movimiento caudal rostral sostenido a 20o desde la parte posterior del ratón para afeitar de cerca la zona recortada (Figura 1A).
- Limpie la zona afeitada con un hisopo de yodo povidona.
- Limpie la piel con una almohadilla de preparación de alcohol isopropílico estéril al 70% para reducir la posible irritación cutánea del hisopo de yodo.
- Herir
- Pinche la piel entre los omóplatos a lo largo de la línea media dorsal y tire del pliegue de piel empareda lejos del cuerpo (Figura 1B).
- Coloque el ratón de lado con el pliegue de piel sobre una superficie plana cubierta con una toalla limpia a base de papel o equivalente. Utilice una lámina de cera dental debajo de la toalla para proteger la superficie subyacente de daños(Figura 1C).
- Coloque el punzón de biopsia del tamaño deseado lo más cerca posible del cuerpo y permita que la piel se relaje. No estire la piel, o el tamaño de la herida será mayor que el tamaño de punzonado designado (Figura 1D).
- Golpear la piel presionando hacia abajo, un movimiento de balanceo se puede utilizar para asegurar que todas las capas de la piel en ambos lados han sido penetradas (Figura 1E). Usa un nuevo punzón de biopsia para cada animal.
- Retire las biopsias de punzonado de las heridas(Figura 1F). Si todavía hay sitios de fijación utilizar tijeras estériles y pinzas para liberar el punzón de la piel circundante. Procesar el tejido de control de la biopsia por punción según sea necesario en función de los planes posteriores para los análisis de cicatrización de heridas (ver Discusión para sugerencias).
- Tome fotografías macroscópicas desde la misma distancia que los sitios de la herida o con una regla en el marco con el fin de medir el área inicial de la herida y eliminar los valores atípicos del análisis.
- Administrar analgesia durante un mínimo de 24 h de acuerdo con un protocolo animal aprobado. Por ejemplo: Buprenorfina SR-LAB, inyectada como dosis única por vía subcutánea a 0,5-2 mg/kg para 48 h de alivio del dolor (ver Discusión para sugerencias alternativas y consideraciones).
- Monitoree el ratón ya que sale de la anestesia hasta que mantiene una postura erguida y está caminando normalmente alrededor de la jaula.
3. Monitoreo posterior de heridas
- Supervise a los ratones diariamente para determinar los puntos finales experimentales según lo determine el investigador y de acuerdo con los protocolos institucionales. Algunos ejemplos son: infección, pérdida de peso visible o postura encorvada.
- Tome fotografías macroscópicas diarias de manera controlada como se hizo después de la cirugía inicial.
4. Cosecha de heridas
- Eutanasiar los ratones en el momento deseado después de la herida de acuerdo con un protocolo animal aprobado.
- Tomar fotografías macroscópicas de los sitios de la herida de manera controlada de manera consistente con la adquisición de fotografías anteriores (Figura 2A,C).
- Cortar un rectángulo ancho alrededor de los sitios de la herida usando un bisturí (Figura 2D,E).
- Libere la pieza rectangular de tejido usando tijeras y pinzas para pelar y cortar la piel lejos del tejido subyacente(Figura 2F). Colocar en un plato de Petri (Figura 2G).
- Cosecha las heridas. Recortar hasta 2 mm de tejido sin rebobinar que rodea todos los lados de la herida en forma rectangular(Figura 2H,I). Consulte Discusión para ver opciones alternativas para cosechar la herida.
- Procesar las heridas según sea necesario para estudios posteriores. Reserve al menos una herida por ratón para la incrustación de parafina y el análisis histológico.
5. Fijación e incrustación de heridas
- Arreglar la herida
- Fijar el tejido de la herida en una solución de paraformaldehído 4% recién preparada8 durante 3 h a temperatura ambiente y luego transferir a 4 oC durante la noche. No se requiere paraformaldehído de grado de microscopía electrónica (EM) y filtración de solución.
- Lave las heridas dos veces durante 30 minutos en 1x PBS.
- Sustituya PBS por 70% ETOH y guárdelo a 4oC hasta que se la incruste. Procesar tejidos dentro de 24-48 h para evitar la pérdida de antígenos o dentro de 1-2 semanas si sólo evalúa las características histológicas.
- Procesar e incrustar la herida
- Transfiera cada herida a un casete incrustado. Etiqueta de los casetes de incrustación en lápiz como el proceso eliminará las tintas.
- Procesar el tejido manualmente o utilizando un procesador automatizado deshidratando el tejido con porcentajes de etanol crecientes, limpiando con xileno, y luego infiltrando el tejido con cera de parafina (Tabla 1).
- Incrustar la herida 90o ("de pie") de la superficie horizontal del molde de incrustación (Figura 3A,B).
6. Análisis del área de la herida del día 0
- Descargar niH-Image J o NIH-Fiji software libre (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Abra un archivo con una fotografía de las heridas del día 0.
- Marque la casilla"Area"en Analizar | Establecer medidas.
- Seleccione "Establecer escala" en Analizar. Introduzca la distancia en píxeles, la distancia correspondiente conocida y la unidad de la distancia (unidad de longitud) si las mediciones macroscópicas forman parte del estudio u omita este paso si solo se requieren mediciones relativas.
- Seleccione "Selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas de Fiji.
- Delinea el perímetro de la herida.
- Haga clic en Medir en Analizar.
- Cree una hoja de cálculo para realizar un seguimiento de las mediciones por animal por herida.
- Copie la medición del área de la herida en la hoja de cálculo.
- Calcular el área media y la desviación estándar de todas las heridas para un experimento dado.
- Excluir cualquier herida fuera de dos desviaciones estándar de la media del análisis histológico.
7. Seccionamiento en serie
- Enfríe los bloques de la herida incrustados en la parafina a 4 oC durante la noche.
- Inserte el bloque de parafina en el soporte del bloque del microtoma y oriente para que la hoja se corte directamente a través del bloque. Orientar el bloque de tal manera que el tejido "se mantenga" a 90o permitiendo el seccionamiento simultáneo de la epidermis y la dermis (Figura 3C,D).
- Hacer 2-4 cintas de 20-30 secciones de parafina de 7 m cada una.
- Utilice un pincel de pintura seca y una aguja de disección para transferir cada cinta a una superficie firme pero manipulable, como una hoja de plástico negro firme.
- Separe la sección superior de cada cinta con una cuchilla de afeitar y colóquela en una diapositiva del microscopio.
- Observar las secciones no manchadas bajo un microscopio de campo brillante para determinar cuáles contienen tejido herido, que puede ser identificado por ausencia de folículo piloso, cambios en la apariencia del tejido conectivo o la epidermis, y / o la presencia de una costra (Figura 4A,B).
- Deseche las secciones sin aserrificar hasta 20 secciones antes del comienzo de la herida.
- Secciones a través de la herida repitiendo los pasos 7.3 y 7.4 hasta que no se detecte ninguna herida en las secciones no detenidas.
8. Montaje de secciones de parafina
- Separe las secciones de parafina cada 5 secciones con una cuchilla de afeitar, comenzando con la primera cinta (Figura 3E).
- Etiqueta las diapositivas del microscopio con el número de diapositiva y todos los números de sección.
- Coge el grupo de 5 secciones con un pincel de pintura húmeda y flota en la superficie del agua de un baño de agua tibia (40-45 oC) para aplanarlas.
- Escoge el grupo de 5 secciones del baño de agua usando uno de los portaobjetos de microscopio etiquetados (Figura 3F) y colóquelo en un calentador de diapositivas a 37 oC durante un máximo de 24 h.
- Guarde las diapositivas en posición vertical en una caja de diapositivas.
9. Tinción histológica
- Transfiera cada diapositiva del microscopio8o (equivalente a cada sección de parafina 40) a un estante de tinción y manche con hematoxilina y eosina.
10. Imágenes microscópicas
- Adquiera imágenes utilizando un microscopio de campo brillante equipado con un objetivo 4x y capacidades de adquisición digital. Registre la escala a la que se toma la imagen.
- Image toda la herida de la sección superior de cada diapositiva teñida y asegúrate de incluir algo de tejido sin rebobinar a cada lado. Tome varias imágenes superpuestas si la herida es más grande que el marco de una sola imagen.
- Guarde el archivo, incluido el número de sección para el análisis morfométrico. Utilice el número de sección seguido de a, b, c, etc. para imágenes superpuestas de la misma herida.
11. Análisis morfométrico
NOTA: Cuando la herida abarque varias imágenes, sume las medidas tomadas de las imágenes individuales para obtener un valor por métrica por sección de herida para registrar en la hoja de cálculo.
- En la imagen J, abra un archivo digital de una imagen de herida manchada. No utilice imágenes cosidas para el análisis. Realice mediciones en imágenes superpuestas ampliadas mediante la búsqueda de puntos de referencia para dejar y recoger las medidas de una imagen a una imagen.
- Establezca la escala y las preferencias de medición.
- Seleccione "Establecer escala" en Analizar. Introduzca la distancia en píxeles, la distancia correspondiente conocida y la unidad de la distancia (unidad de longitud). La escala debe aparecer en la ventana y debe corresponder a la escala en la que se adquirió la imagen.
- Marque la casilla"Global"para mantener la escala igual para cada imagen abierta.
- Repita los pasos 11.2.1 a 11.2.2 cada vez que se cierre y vuelva a abrir la imagen J.
- Marque la casilla"Area"en Analizar | Establecer medidas.
- Mida la longitud de la herida
- Seleccione "Selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas de Fiji.
- Medir a partir del último folículo piloso del tejido no lesionado en un lado de la herida hasta el primer folículo piloso del tejido no lesionado en el otro lado de la herida (Figura 4A,B).
- Traza a lo largo de la unión dermoepidérmica para llegar a estos dos puntos de referencia. Si la epidermis no cubre toda la herida, siga la unión dermoepidérmica en un lado de la herida y donde la lengua migratoria termina siguiendo el aspecto superior del tejido de granulación o la unión entre el tejido de granulación y la costra hasta llegar a la lengua migratoria y finalmente el primer folículo del tejido no lesionado en el otro lado (Figura 4E,F).
- En Analizar, haga clic en Medir. La longitud de la medida aparecerá en las mismas unidades establecidas en la escala.
- Cree una hoja de cálculo para realizar un seguimiento de las medidas(Tabla complementaria 1).
- Copie la longitud de la herida en la hoja de cálculo.
- Medir la longitud epidérmica
- Si la epidermis cubre toda la herida, la longitud epidérmica es la misma que la longitud de la herida.
- Copie la medida de "longitud de la herida" en la columna "longitud epidérmica" en la hoja de cálculo de Excel y vaya al paso 11.5.
- Si la epidermis no cubre toda la herida, seleccione las"selecciones a mano alzada"y mida la distancia entre cada borde delantero epidérmico siguiendo el aspecto superior del tejido de granulación o la unión entre el tejido de granulación y la costra al primer folículo piloso (Figura 4C,D).
- En Analizar, haga clic en Medir.
- Restar esta medida de la longitud de la herida y registrar el número en "longitud epidérmica" en la hoja de cálculo de Excel.
- Si la epidermis cubre toda la herida, la longitud epidérmica es la misma que la longitud de la herida.
- Mida el área de la herida
- Seleccione "Selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas de Fiji.
- Medir a partir del último folículo piloso del tejido no lesionado en un lado de la herida hasta el primer folículo piloso del tejido no lesionado en el otro lado de la herida(Figura 4A,B,E,F).
- Traza a lo largo del aspecto superior de la epidermis (no incluyas la costra) o el aspecto superior del tejido de granulación si la herida no está completamente cubierta por la epidermis.
- Continúe trazando verticalmente a lo largo del folículo piloso en el tejido de granulación una vez que se alcanza el folículo piloso opuesto y hasta que se alcanza el tejido o músculo adiposo. Siga el borde inferior del tejido de granulación hasta el lado opuesto de la herida y únase al punto de partida a lo largo del folículo piloso para cerrar el área(Figura 4E,F).
- En Analizar, haga clic en Medir.
- Copie el área de la herida en la hoja de cálculo debajo del "área de la herida medida".
- Mida el área epidérmica
- Seleccione "Selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas de Fiji.
- Si la herida está completamente epitelializada:
- Traza a lo largo del aspecto superior de la epidermis hasta que se alcanza el folículo piloso opuesto y completa la zona "regresando" al punto de partida después de la unión dermoepidérmica entre la epidermis y la dermis (Figura 4D).
- En Analizar, haga clic en Medir.
- Copie el área epidérmica en la hoja de cálculo de Excel en "área epidérmica medida" y vaya al paso 11.7.
- Si la herida no está completamente epitelializada:
- Trazar a lo largo del aspecto superior de la epidermis hasta el borde de ataque y volver al punto de partida después de la unión dermoepidérmica (Figura 4C).
- En Analizar, haga clic en Medir.
- Repita los pasos 11.6.3.1 y 11.6.3.2 en el lado opuesto de la herida.
- En Analizar, haga clic en Medir.
- Suma los dos números obtenidos en los pasos 11.6.3.2 y 11.6.3.4 e introduce el resultado en "área epidérmica medida" en la hoja de cálculo.
- Repita los pasos 11.3 a 11.6 en cadasección 40 (cada 8diapositivas).
- Calcular el área epidérmica de toda la herida.
- Cree una nueva columna en la hoja de cálculo "área epidérmica calculada" junto a "longitud epidérmica."
- Multiplique el número de "longitud epidérmica" por 280 para cada sección excepto la última (sección de 7 m de espesor x 40 secciones).
- Multiplique el número de "longitud epidérmica" por 7 para la última sección (espesor de la sección).
- Sumar el valor del "área epidérmica calculada" para cada sección para obtener el área epidérmica de toda la herida.
- Calcule el área de la herida de toda la herida.
- Repita los pasos 11.8.1 a 11.8.4 utilizando las medidas de longitud de la herida.
- Calcular el volumen epidérmico de toda la herida.
- Repita los pasos 11.8.1 a 11.8.4 utilizando las mediciones de "área epidérmica medida".
- Calcule el volumen de la herida de toda la herida.
- Repita los pasos 11.8.1 a 11.8.4 utilizando las mediciones de "área de herida medida".
- Calcular el porcentaje de volumen epidérmico en la herida.
- Divida el volumen epidérmico total por el volumen total de la herida y multiplique por 100 para obtener el porcentaje (no haga esta proporción para cada sección).
- Calcular el porcentaje de área epidérmica entre el área de la herida.
- Divida el área epidérmica total por el área total de la herida y multiplique por 100 para obtener el porcentaje. Si una herida está completamente epitelializada, este número debe ser 100.
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Representative Results
La Figura 5 representa el rango en valores medidos y calculados obtenidos mediante la realización de análisis morfométricos en heridas de tipo salvaje generadas en diferentes cepas de ratón por múltiples cirujanos y analizadas por diferentes individuos. Los ratones de tipo salvaje de diferentes cepas pueden mostrar diferencias estadísticas como se describe tanto en nuestros estudios como en la literatura9,10. Sobre la base de estos resultados representativos, recomendamos que, dentro de un estudio, se utilicen ratones de una sola cepa. Aunque recomendamos que el mismo individuo realice todas las heridas dentro de un estudio en particular, varios individuos podrían actuar como cirujanos siempre y cuando el área de las heridas en el día 0 no sea estadísticamente diferente entre el trabajo individual. Por último, debido a que el análisis morfométrico descrito en este protocolo puede ser extenso, varios individuos podrían analizar partes del mismo experimento, pero solo si los resultados de su análisis de dos muestras están dentro del 5% entre sí. Sin embargo, es preferible tener un solo individuo analizando las heridas de una manera cegada para evitar el sesgo.
La Figura 6 muestra un metanálisis comparando las mediciones de heridas obtenidas siguiendo el protocolo descrito en este estudio11 con mediciones obtenidas del "medio" de la herida y 40 secciones circundantes. En la Figura 6A,el área epidérmica y el área de la herida se calcularon a partir de la medición de las longitudes epidérmicas y de la herida en las secciones de la herida, seguido por el cálculo del porcentaje del área epidérmica entre el área de la herida (a veces denominado "porcentaje de cierre" o "porcentaje de epitelización"). Del mismo modo, en la Figura 6B,el porcentaje de la epidermis en la herida se obtuvo como la relación del volumen epidérmico (calculado a partir del área epidérmica medida) sobre el volumen de la herida (calculado a partir de la zona medida de la herida). Para ambos parámetros, el análisis de toda la herida mostró fuertes diferencias estadísticas entre grupos (hasta P < 0.001 después de Anova unidireccional). Sin embargo, la importancia disminuyó (hasta P < 0.01 después de Anova unidireccional) cuando sólo se analizaron 40 secciones en el medio del dispositivo. Estos resultados demuestran una disminución en el nivel de significancia cuando solo se analiza un subconjunto de la herida. Estos datos sugieren que es probable que solo se detecten defectos con un tamaño de efecto pequeño al realizar análisis morfométricos en toda la herida, y que se perderán fenotipos de cicatrización de heridas más leves de un tipo de análisis "medio de la herida".
La práctica común para analizar la cicatrización de heridas in vivo consiste en medir el área de la herida en secciones histológicas elegidas en algún lugar de la herida12. Con esto en mente, el promedio del área de la herida medida de las secciones seriales de enteras heridas se comparó con el obtenido de las secciones del subconjunto medio. Los resultados no mostraron ninguna diferencia significativa entre los grupos experimentales y entre el método de análisis (Figura 6C). Sin embargo, el protocolo actual utiliza el área medida (que se muestra en la Figura 6C)sobre toda la herida para calcular el volumen de la herida. Como se muestra en la Figura 6D, el volumen calculado de la herida (que sólo se puede calcular utilizando el análisis de toda la herida) es significativamente diferente entre los grupos experimentales. En resumen, estos resultados representativos demuestran la importancia del análisis histológico en profundidad de los parámetros de cicatrización de heridas descritos en este protocolo con el fin de detectar fenotipos que de otro modo se habrían perdido utilizando un análisis de cicatrización de heridas más tradicional.
Figura 1: Procedimiento bilateral de la herida por escisión. (A) Fotografía representativa de un ratón después de cortar y afeitar el cabello de la zona quirúrgica. (B) La piel pellizcada entre los omóplatos a lo largo de la línea media dorsal. (C) El ratón colocado de lado con el pliegue de la piel puesto plano. (D) Representación de la colocación del punzón de la biopsia. (E) Pliegue de piel perforado. (F) El ratón con dos heridas bilaterales en el día 0 y los tejidos de control de biopsia por punción extirpados según lo indicado por las flechas blancas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procedimiento de recolección de heridas. (A-C) Fotografías macroscópicas de heridas escisionales de 6 mm después de 4 días (A), 7 días (B) y 11 días (C). (D-E) Con una hoja de bisturí, se hizo una incisión cutánea en forma de un rectángulo ancho que incluye las heridas y el tejido no enrollado circundante. (F) La piel fue liberada del tejido subyacente con fórceps y tijeras. (G) Representación de las heridas bilaterales cosechadas. (H) La línea blanca punteada representa el borde del tejido que se cosecharía tras el uso de una biopsia por punción (este método permite una cantidad estandarizada de tejido cosechado). (I) La línea blanca punteada representa el borde del tejido que se recortaría para la histología (la forma rectangular permite una inserción más fácil). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Tiempo (minutos) | Temperatura (Celsius) | Presión (kPa) |
| 80% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| 95% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| 100% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| Xileno | 30 | Rt | N/A |
| Xileno | 30 | Rt | N/A |
| Parafina | 30 | 60 | 20 |
| Parafina | 30 | 60 | 20 |
Tabla 1: Procedimiento de procesamiento de muestras para la incrustación de parafina. RT a temperatura ambiente. N/A no aplicable.
Figura 3: Incrustación y sección de heridas. (A) Herida procesada por parafina acostada en un molde de incrustación. (B) La herida se sostuvo a 90o ("de pie") desde la superficie horizontal del molde para la incrustación. (C) La herida incrustada en parafina correctamente orientada para el corte (D) Bloque de parafina montado en el microtomo se seccionó en cintas de aproximadamente 20 secciones (E) Cintas de parafina cortadas en incrementos de 5 secciones como se indica por los corchetes blancos. (F) Las secciones serie colocadas planas en un baño de agua caliente (40-45 oC) se montaron en un portaobjetos con microscopio. La caricatura en (A-C) representa la herida (naranja) en la piel (azul) con la orientación adecuada de la epidermis (e) y la dermis (d) para cada paso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Características histológicas de las heridas e ilustración de parámetros morfométricos. (A, B) Características histológicas de un día 4 (A) y un día 7 (B) herida de 6 mm. (C-F) Representación de las diferentes medidas utilizadas para realizar el análisis morfométrico cuantitativo: longitud de la epidermis(C, D, línea negra punteada), área medida de la epidermis(C, D, área sombreada amarilla), longitud de la herida (E, F, línea amarilla punteada) y área medida de toda la herida (E, F, área sombreada gris). HF - folículo piloso; barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Características morfométricas de heridas representativas de tipo salvaje de 6 mm en el día 4, día 7 y día 11 post-herida. Las gráficas dispersas representan datos obtenidos de análisis morfométricos de heridas de tipo salvaje de 6 mm generadas en diferentes cepas de ratón por múltiples cirujanos y analizadas por diferentes individuos. (A) volumen de la herida,( B) volumen epidérmico, (C) porcentaje de epidermis en la herida, (D) área de la herida (calculada), (E) área epidérmica (calculada) y (F) porcentaje de área epidérmica entre el área de la herida demuestran el rango de variación en los valores morfométricos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Metanálisis comparando parámetros obtenidos de toda la herida con el centro de la herida identifica nuevos defectos con mayor importancia. La morfometría curativa de heridas se realizó el día 7 heridas inyectadas con solución salina (control), transformando el factor de crecimiento beta 3 (Tgfb3), Tgfb3 con anticuerpo neutralizante (Tgfb3 + NAB) y anticuerpo neutralizante solo (NAB). Se realizaron mediciones en heridas seccionadas en serie ("total") o en 40 secciones desde el centro de la herida ("medio") y se utilizaron para calcular el porcentaje de área epidérmica sobre el área de la herida (A), el porcentaje de epidermis en la herida (B), y el volumen de la herida (D). (C) representa el promedio del área de la herida medida en la totalidad o en el medio de la herida. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, ns no significativo, Anova unidireccional). Esta cifra se ha modificado utilizando datos de Le et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla complementaria 1: Un ejemplo de una hoja de cálculo para registrar mediciones morfométricas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
El modelo bilateral de heridas por escisión es un procedimiento altamente personalizable que se puede utilizar para estudiar muchos aspectos diferentes de la cicatrización de heridas. Antes de comenzar un proyecto de cicatrización de heridas, los investigadores deben realizar un análisis de potencia para determinar el número de heridas necesarias para detectar un defecto de un tamaño de efecto particular. Existen incoherencias en la literatura sobre si los ratones individuales o las heridas deben utilizarse como réplicas biológicas, sin embargo, un estudio reciente demostró que no hay una correlación significativa entre dos heridas en un solo animal4. Esto sugiere que las heridas de un solo animal son independientes entre sí y pueden considerarse como réplicas biológicas, reduciendo el número de ratones necesarios para detectar un defecto. Esto es relevante cuando se tienen en cuenta tamaños de efectos pequeños para los que se requiere un alto número de heridas para alcanzar la importancia4. Además, los resultados del cálculo de potencia pueden influir en cuántas heridas se realizan en cada animal, siendo más comunes 2 y 4 heridas por animal.
El protocolo quirúrgico en sí también es altamente flexible. Si bien recomendamos la anestesia por vaporizador de isoflurano debido a la corta longitud del procedimiento y la recuperación rápida (10-15 min por ratón), los investigadores sin acceso a un vaporizador pueden utilizar anestesia inyectable incluyendo ketamina/xilazina o pentobarbital. La selección de un analgésico adecuado es particularmente crítica, ya que se refiere a las fases inflamatorias de la cicatrización de heridas. El uso de antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDS) como Flunixin meglumine o Meloxicam debe utilizarse con precaución, ya que pueden disminuir la inflamación. Por lo tanto, los opioides se prefieren en estudios en los que se está investigando la inflamación. Recomendamos analgésicos (p. ej., Buprenorfina de liberación sostenida) que proporcionan hasta 48 h de analgesia y eliminan la necesidad de dosis repetidas y adicionales. Todos los procedimientos quirúrgicos deben ejecutarse de acuerdo con las directrices federales y apoyarse en un protocolo animal aprobado.
La cicatrización de heridas es un proceso que abarca varias fases, cada una de las cuales se caracteriza por diferentes procesos biológicos que involucran distintos tipos celulares3. La fase inflamatoria se produce entre los días 0 y 5, con la migración temprana de neutrófilos polimoronucleares (PMN) y macrófagos al lugar de la lesión13. La fase proliferativa se produce entre 3 y 14 días con la ree epitelización que toma una cantidad variable de tiempo en función del tamaño de la herida14. En este protocolo, usamos un puñetazo de biopsia de 6 mm y la mayoría de las heridas se volvieron a epitelizar por 7 días. Sin embargo, este período de tiempo tendría que acortarse si se utilizaran punzones más pequeños (están disponibles tan pequeños como 1 mm). En combinación con puntos de tiempo anteriores, estas heridas más pequeñas pueden ser preferibles para reducir la cantidad de análisis histológicos15. Finalmente, las fases de remodelación y maduración se producen después de 7 días y hasta un año después de la lesión16. Estos puntos de tiempo posteriores pueden ser necesarios para investigar la maduración de la herida o para investigar los retrasos de cicatrización de heridas en animales experimentales. Por lo tanto, el investigador tendrá que determinar los puntos de tiempo críticos necesarios para investigar determinadas fases de la cicatrización de heridas basadas en su hipótesis particular5.
El análisis de la cicatrización de heridas a menudo no se limita a los análisis histológicos. Las secciones de parafina no mantenidas se pueden utilizar para análisis adicionales como la inmunofluorescencia o el tricromo de Masson para la deposición de colágeno. El procesamiento del tejido de control (biopsias de punzonado) y las pasos de recolección del tejido dependerán de cómo, además de los análisis histológicos, se evalúa la cicatrización de heridas. Como parte del protocolo quirúrgico, se eliminan las biopsias de punzonado para generar la herida escisional. Estos punzones pueden servir como tejido de control no asaltado para aplicaciones posteriores como proteínas (para perfiles occidentales o de citoquinas), extracción de ADN o ARN y deben procesarse en consecuencia. Se recomienda ahorrar al menos un punzón para el análisis histológico, especialmente en los casos en que la piel se trata antes de la herida (por ejemplo, la aplicación de tamoxifeno para la inducción de la recombinación de Cre-Lox17). El examen del punzón puede determinar el efecto del tratamiento sobre la morfología cutánea o simplemente permitir la evaluación de la morfología cutánea basal del modelo de ratón en particular que se está utilizando. Las heridas no utilizadas para la histología se pueden cosechar con una biopsia por punción que abarca el tamaño de la herida. Este procedimiento tiene algunas ventajas, incluyendo la cosecha de la misma cantidad de tejido independientemente del tamaño de la herida (las heridas más grandes tienen menos tejido sano circundante). Por último, describimos el uso de 4% de paraformaldehído como fijador y parafina como material para preservar e incrustar tejidos, respectivamente. Otros fijadores pueden ser necesarios para ciertas aplicaciones y pueden ser sustituidos (por ejemplo, los fijadores de Carnoy o Bouin). Para una mejor tinción inmunofluorescente, la congelación e incrustación de la herida en el compuesto de temperatura de corte óptima seguido de seccionamiento congelado sigue siendo el método de elección.
El seccionamiento del tejido herido puede presentar muchos desafíos, particularmente las heridas del día 4 debido a la presencia de la costra. Para generar secciones de alta calidad, se recomienda verificar que todas las partes del microtomo están bien sujetas, el soporte del bloque se retrae a su posición inicial, el soporte de la hoja se establece entre 0 y 10o y la hoja está bien sujeta pero no demasiado tensada. Aunque el bloque de parafina está refrigerado, el tejido todavía puede desmenuzado. Si la trituración continúa, se puede colocar un pedazo de hielo en el bloque durante 5 minutos mientras se sigue montando. Una vez que el seccionamiento ha comenzado, es muy recomendable evitar la eliminación del bloque del microtoma para evitar la pérdida de secciones de parafina. Es imperativo registrar cualquier sección de parafina perdida, tanto sus números como su clasificación en la sección de serie. Esto afectará al análisis morfométrico y debe ser considerado. Después de iniciar la sección, la identificación del tejido herido en secciones no manchadas puede ser difícil, especialmente si no está familiarizado con la histología. En caso de duda, se recomienda ser conservador y mantener todas las secciones que contienen tejido. Una vez que se realiza la mancha histológica, la organización del tejido será más evidente y la herida más distinta. Ocasionalmente, los folículos pilosos pueden no ser claramente visibles o pueden estar lejos del borde de la herida. Si este es el caso, se pueden utilizar otras características clave del tejido herido para establecer los límites de la herida, incluyendo un aumento abrupto seguido de una disminución inmediata del grosor epidérmico y cambios bruscos en la organización del tejido conectivo (Figura 4A-B).
La imagen digital es un paso crítico en el análisis morfométrico. El análisis morfométrico debe realizarse en imágenes individuales utilizando un punto de referencia en cada imagen para evitar mediciones repetidas. Sin embargo, es posible unir todos los marcos utilizando software digital y realizar el análisis en una sola imagen. Aunque esto parece más fácil al principio, la manipulación de una imagen grande puede ralentizar el proceso de análisis. La elección de la sección también es fundamental para el análisis. Aunque recomendamos adquirir digitalmente la sección superior de cada8a diapositiva, se debe priorizar la calidad de la sección y se debe tomar una imagen de la mejor de las 5 secciones de esa diapositiva. Las secciones con pliegues pequeños todavía se podían analizar estimando el área/longitud del pliegue. El número de esa sección en particular debe registrarse tanto en el archivo digital como en la hoja de cálculo de Excel, de tal manera que la distancia entre la sección anterior y la siguiente analizada se pueda ajustar en consecuencia.
Las heridas cutáneas afectan a unos 6,5 millones de personas con tratamiento que costó más de 25 mil millones de dólares al año18 y son un componente inherente de los procedimientos quirúrgicos, además de ser secundarios a muchos otros problemas de salud, incluyendo la diabetes y la obesidad. El ratón se ha utilizado como un modelo conveniente para estudiar enfermedades humanas debido a la facilidad en la manipulación de su genoma, a pesar de que a menudo exhibe un fenotipo sutil en comparación con el trastorno humano. El modelo de heridas escisionales bilaterales y el posterior análisis morfométrico descrito en este protocolo es significativo debido a su capacidad para abordar la dificultad para detectar defectos menores en un proceso de cicatrización de heridas inherentemente complejo19. Debido a su mayor sensibilidad y menor variabilidad, este protocolo ofrece oportunidades para utilizar menos animales para obtener la misma sensibilidad experimental. El protocolo es altamente personalizable y se puede utilizar para estudiar todas las etapas de la reparación de tejidos. El análisis morfométrico histológico detallado en combinación con la caracterización fenotípica del tejido tiene un gran potencial para aumentar el conocimiento necesario para promover la comprensión de los factores críticos que modulan la reparación del tejido.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.
Acknowledgments
Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio Dunnwald que han contribuido a la optimización de este protocolo a lo largo de los años, y a Gina Schatteman cuya persistencia en la promoción del uso de la sección en serie para el análisis de heridas hizo posible su creación. Este trabajo fue apoyado por la financiación de NIH/NIAMS a Martine Dunnwald (AR067739).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
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