Summary
Ce protocole décrit comment générer des blessures excisionnelles bilatérales et pleine épaisseur chez la souris et comment surveiller, récolter et préparer les plaies pour l’analyse morphométrique. On y trouve une description détaillée de la façon d’utiliser les sections histologiques périodiques pour définir, quantifier et détecter avec précision les défauts morphométriques.
Abstract
Le modèle de blessure excisional murine a été employé intensivement pour étudier chacune des phases séquentiellement superposées de la guérison de blessure : inflammation, prolifération et remodelage. Les plaies murines ont un lit de plaie histologiquement bien défini et facilement reconnaissable sur lequel ces différentes phases du processus de guérison sont mesurables. Sur le terrain, il est courant d’utiliser un « milieu » arbitrairement défini de la plaie pour des analyses histologiques. Cependant, les blessures sont une entité tridimensionnelle et souvent pas histologically symétrique, soutenant la nécessité d’une méthode bien définie et robuste de quantification pour détecter des défauts morphométriques avec une petite taille d’effet. Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour créer des plaies excisionnelles bilatérales de pleine épaisseur chez la souris ainsi qu’une instruction détaillée sur la façon de mesurer les paramètres morphométriques à l’aide d’un programme de traitement d’image sur certaines sections de série. Les mesures en deux dimensions de la longueur de la plaie, de la longueur épidermique, de la zone épidermique et de la zone de la plaie sont utilisées en combinaison avec la distance connue entre les sections pour extrapoler la zone épidermique à trois dimensions couvrant la plaie, la zone globale de la plaie, le volume épidermique et le volume des plaies. Bien que cette analyse histologique détaillée soit plus longue et plus gourmande en ressources que les analyses conventionnelles, sa rigueur augmente la probabilité de détecter de nouveaux phénotypes dans un processus intrinsèquement complexe de cicatrisation des plaies.
Introduction
La cicatrisation cutanée des plaies est un processus biologique complexe dont les phases se chevauchent séquentiellement. Il nécessite la coordination des processus cellulaires et moléculaires qui sont régulés temporellement et spatialement afin de restaurer la fonction barrière de l’épithélium endommagé. Dans la première phase, l’inflammation, les neutrophiles et les macrophages migrent dans la plaie, mobilisant les défenses locales etsystémiques 1. Suivre et chevaucher la phase inflammatoire est le stade de prolifération. Les fibroblastes commencent à proliférer rapidement et à migrer dans le tissu de granulation. Les kératinocytes éloignés du bord d’attaque prolifèrent vers la plaie à mesure que les kératinocytes différenciés du bord d’attaque migrent pour rééthélialiserla plaie 2. Enfin, la phase de remodelage et de maturation commence, au cours de laquelle les fibroblastes dans le tissu de granulation commencent à synthétiser et à déposer le collagène. Le remodelage et l’organisation de la nouvelle matrice peuvent durer jusqu’à 1 an après la blessure3. En raison de la complexité des événements qui se chevauchent impliquant des discussions croisées entre plusieurs types de cellules, et malgré des années de recherche, bon nombre des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la cicatrisation des plaies demeurent mal compris.
Le modèle de souris est le modèle mammifère prédominant pour étudier les mécanismes de cicatrisation des plaies en raison de leur facilité d’utilisation, de leur coût relativement faible et de leur manipulabilitégénétique 1,4,5. Bien que différents types de blessures aient été décrits dans le modèle murin, le plus commun est une blessure excisionnelle (coup de poing bilatéral ou biopsie directe de poinçon), suivie des modèles incisionnelsde blessure 4. Le modèle excisionnel de blessure a un avantage distinct au-dessus du modèle incisionnel car il génère intrinsèquement le tissu de contrôle qui n’a pas subi le processus curatif. Le tissu de biopsie de poinçon qui est excisé dans le cadre du protocole chirurgical peut être traité de la même manière que le tissu blessé et employé pour établir les conditions homéostatiques pour un critère désiré. Le tissu de contrôle excisé peut également être utile si l’évaluation des effets d’un prétraitement de peau ou la confirmation de l’altération réussie de gène au moment de lablessure 4.
Les paramètres de guérison peuvent être évalués par de nombreuses techniques différentes, y compris la planimétrie ou l’histologie. Cependant, la planimétrie ne peut évaluer que les caractéristiques visibles de la plaie, et en raison de la présence d’une croûte, souvent n’est pas corrélée aux mesures de guérison qui sont visualisées par l’histologie, faisant ainsi de l’histologie l’étalon-or del’analyse 4. Bien que l’analyse histologique soit l’étalon-or, elle est le plus souvent effectuée sur un sous-ensemble arbitraire dela plaie 6,7. Par exemple, couper la plaie en « moitié » avant d’intégrer et de sectionner la plaie est actuellement une pratique courante pour réduire le temps et les ressources consacrés à la section des matériaux et à l’analyse des données. La méthode d’analyse morphométrique décrite dans ce protocole a été développée pour englober le tissu entier de blessure, pour refléter exactement les caractéristiques morphologiques de la blessure, et pour augmenter la probabilité de détecter des défauts curatifs de blessure avec une petite taille d’effet. Dans ce protocole, nous détaillons une méthode chirurgicale pour générer la blessure murine la plus couramment étudiée, la blessure excisionnelle bilatérale pleine épaisseur, aussi bien qu’une méthode détaillée et rigoureuse pour l’analyse histologique telle est rarement employée dans le domaine.
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Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la réglementation fédérale et la politique et les procédures de l’Université de l’Iowa ont été approuvées par l’IACUC de l’Université de l’Iowa.
1. Animaux et élevage
- Utilisez des souris adultes de la lignée de souris désirée à l’âge de 8-10 semaines lorsque le stade du follicule pileux est en télogène.
- Le jour de la chirurgie, séparez les souris dans des cages propres et individuellement maison pour minimiser la perturbation des plaies.
2. Chirurgie
REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de maintenir des conditions chirurgicales stériles. Bien qu’il soit nécessaire de prendre soin de maintenir la stérilité entre les animaux, la biopsie de poinçon elle-même se fait sur une surface propre, mais non stérile. La durée de la chirurgie par animal se situe entre 10 et 15 min.
- Anesthésie
- Anesthésier l’animal pendant 1-2 min dans une chambre d’induction avec le vaporisateur d’isoflurane réglé à un débit de 4-5% et le compteur d’écoulement d’oxygène fixé à 1 litre par minute. Voir Discussion pour d’autres options d’anesthésie.
- Confirmer l’anesthésie appropriée avant de commencer la procédure. La profondeur de l’anesthésie peut être confirmée par un pincement ferme des pieds.
- Transférer la souris du récipient d’induction vers un cône nasal et réduire le débit d’isoflurane à 1,5% et le débit d’oxygène à 0,5 L/min.
- Appliquez de l’onguent ophtalmique sur les deux yeux car la procédure dépasse 5 min.
- Maintenez la température normale du corps à l’aide d’un tampon thermique.
- Préparation du site de la plaie
- Utilisez une tondeuse à rasoir électrique dans un mouvement rostral caudal pour enlever la fourrure sur le dos de la souris au niveau des épaules. Retirez les cheveux plus bas sur le dos au besoin si vous effectuez plus de deux blessures.
- Retirez le reste des cheveux à l’aide d’une lame de rasoir dans un mouvement caudal rostral maintenu à 20° de l’arrière de la souris pour raser de près la zone coupée (figure 1A).
- Nettoyez la zone rasée avec un écouvillon povidone-iode.
- Essuyez la peau avec un tampon stérile de préparation à l’alcool isopropylique à 70 % pour réduire l’irritation cutanée potentielle de l’écouvillon d’iode.
- Blessant
- Pincez la peau entre les omoplates le long de la ligne médiane dorsale et tirez le skinfold pris en sandwich loin du corps (Figure 1B).
- Placez la souris sur le côté avec le bandeau sur une surface plane drapée d’une serviette propre à base de papier ou équivalent. Utilisez une feuille de cire dentaire sous la serviette pour protéger la surface sous-jacente contre les dommages (figure 1C).
- Placez le punch biopsie de la taille désirée aussi près du corps que possible et laissez la peau se détendre. Ne pas étirer la peau, ou la taille de la plaie sera plus grande que la taille de poinçon désigné( Figure 1D).
- Perforer la peau en appuyant sur le bas, un mouvement de bascule peut être utilisé pour s’assurer que toutes les couches de la peau des deux côtés ont été pénétrées (Figure 1E). Utilisez un nouveau punch biopsie pour chaque animal.
- Retirez les biopsies perforées desplaies ( Figure 1F). S’il ya encore des sites d’attachement utiliser des ciseaux stériles et pinces à épiler pour libérer le punch de la peau environnante. Traiter le tissu de contrôle de la biopsie par poinçon au besoin en fonction des plans en aval pour les analyses de cicatrisation des plaies (voir Discussion pour obtenir des suggestions).
- Prenez des photos macroscopiques à distance égale des sites de plaie ou avec une règle dans le cadre afin de mesurer la zone de la plaie initiale et d’éliminer les valeurs aberrantes de l’analyse.
- Administrer l’analgésie pendant au moins 24 h conformément à un protocole animal approuvé. Par exemple : Buprénorphine SR-LAB, injectée sous forme de dose unique sous-cutanée à 0,5-2 mg/kg pour 48 h de soulagement de la douleur (voir Discussion pour d’autres suggestions et considérations).
- Surveillez la souris pendant qu’elle sort de l’anesthésie jusqu’à ce qu’elle maintienne une posture verticale et marche normalement autour de la cage.
3. Surveillance post-blessure
- Surveillez quotidiennement les souris pour les critères d’évaluation expérimentaux déterminés par l’investigateur et conformément aux protocoles institutionnels. Par exemple: infection, perte de poids visible, ou une posture voûtée.
- Prenez quotidiennement des photos macroscopiques d’une manière contrôlée comme cela a été fait après la chirurgie initiale.
4. Récolte des blessures
- Euthanasier les souris au moment désiré après la blessure conformément à un protocole animal approuvé.
- Prenez des photographies macroscopiques des sites de plaies d’une manière contrôlée, conformément à l’acquisition de photographies antérieures (figure 2A,C).
- Couper un large rectangle autour des sites de plaies à l’aide d’un scalpel( Figure 2D,E).
- Libérez le morceau rectangulaire de tissu à l’aide de ciseaux et de pinces à épiler pour peler et couper la peau du tissusous-jacent (figure 2F). Placer dans une boîte de Pétri( Figure 2G).
- Récoltez les blessures. Coupez jusqu’à 2 mm de tissu non enroulé entourant tous les côtés de la plaie en forme rectangulaire (Figure 2H,I). Voir Discussion pour d’autres options pour récolter la plaie.
- Traiter les plaies selon les besoins pour les études subséquentes. Réservez au moins une plaie par souris pour l’intégration de la paraffine et l’analyse histologique.
5. Fixation et intégration des plaies
- Réparer la plaie
- Fixer le tissu de la plaie dans une solution de paraformaldéhyde fraîchement préparée4% 8 pour 3 h à température ambiante, puis transférer à 4 °C pendant la nuit. La microscopie électronique (EM) de qualité paraformaldéhyde et la filtration de solution ne sont pas nécessaires.
- Laver les plaies deux fois pendant 30 min en 1x PBS.
- Remplacer PBS par 70% ETOH et conserver à 4 °C jusqu’à l’intégration. Traiter les tissus dans les 24-48 h pour éviter la perte d’antigène ou dans les 1-2 semaines si seulement l’évaluation des caractéristiques histologiques.
- Traiter et intégrer la plaie
- Transférer chaque plaie sur une cassette d’intégration. Étiquetez les cassettes d’intégration au crayon car le processus enlèvera les encres.
- Traiter le tissu manuellement ou à l’aide d’un processeur automatisé en déshydratant le tissu avec des pourcentages croissants d’éthanol, en dégageant avec du xylène, puis en infiltrant le tissu avec de la cire de paraffine (tableau 1).
- Intégrer la plaie à 90° (« debout ») de la surface horizontale du moule d’intégration (Figure 3A,B).
6. Analyse de la zone des plaies du jour 0
- Téléchargez le logiciel libre NIH-Image J ou NIH-Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Ouvrez un dossier avec une photo des blessures du jour 0.
- Cochez la case "Zone" sous Analysez | Définir les mesures.
- Sélectionnez "Set Scale" sous Analyser. Entrez la distance en pixels, la distance correspondante connue et l’unité de la distance (= unité de longueur) si les mesures macroscopiques font partie de l’étude ou sautent cette étape si seules des mesures relatives sont nécessaires.
- Sélectionnez "Sélections à main levée" sur la barre d’outils fidjienne.
- Décrire le périmètre de la plaie.
- Cliquez sur Mesurer sous Analyser.
- Créez une feuille de calcul pour suivre les mesures par animal et par plaie.
- Copiez la mesure de la zone de la plaie dans la feuille de calcul.
- Calculez la zone moyenne et l’écart type de toutes les blessures pour une expérience donnée.
- Exclure les blessures en dehors de deux écarts types de la moyenne de l’analyse histologique.
7. Sections en série
- Réfrigérer les blocs de plaies encastrés paraffine à 4 °C pendant la nuit.
- Insérez le bloc de paraffine sur le support de bloc de la microtome et orientez de sorte que la lame coupera directement à travers le bloc. Orientez le bloc de telle sorte que le tissu « se trouve » à 90° permettant la section simultanée de l’épiderme et du derme (Figure 3C,D).
- Faire 2-4 rubans de 20-30 sections de paraffine de 7 μm chacun.
- Utilisez un pinceau sec et une aiguille de taquinerie de dissection pour transférer chaque ruban sur une surface ferme mais maniable comme une feuille de plastique noir ferme.
- Détachez la partie supérieure de chaque ruban à l’aide d’une lame de rasoir et placez-la sur une lame de microscope.
- Observez les sections non tachées sous un microscope à champ lumineux pour déterminer lesquelles contiennent des tissus blessés, qui peuvent être identifiés par l’absence de follicule pileux, les changements dans l’apparence du tissu conjonctif ou de l’épiderme, et/ou la présence d’une tavelure (figure 4A,B).
- Jeter les sections non enroulées jusqu’à 20 sections avant le début de la plaie.
- Section à travers la plaie en répétant les étapes 7.3 et 7.4 jusqu’à ce qu’aucune blessure ne soit détectée dans les sections non tachées.
8. Montage de sections de paraffine
- Séparez les sections de paraffine toutes les 5 sections avec une lame de rasoir, en commençant par le premier ruban( Figure 3E).
- Étiquetez les diapositives au microscope avec le numéro de diapositives et tous les numéros de section.
- Prenez le groupe de 5 sections avec un pinceau humide et faites-les flotter à la surface de l’eau d’un bain d’eau chaude (40-45 °C) pour les aplatir.
- Choisissez le groupe de 5 sections du bain d’eau à l’aide d’une des diapositives au microscope étiquetées (figure 3F) et placez-les sur un chauffe-glissière réglé à 37 °C jusqu’à 24 h.
- Rangez les diapositives verticalement dans une boîte à diapositives.
9. Coloration histologique
- Transférer chaque diapositive de microscope8 e (équivalent à chaque section de paraffine40 e) sur une grille de coloration et une tache avec de l’hématoxyline et de l’éosine.
10. Imagerie microscopique
- Acquérir des images à l’aide d’un microscope à champ lumineux équipé d’un objectif 4x et de capacités d’acquisition numérique. Enregistrez l’échelle à laquelle l’image est prise.
- Imagez toute la plaie de la partie supérieure de chaque glissière tachée et assurez-vous d’inclure du tissu non tissé de chaque côté. Prenez plusieurs photos qui se chevauchent si la plaie est plus grande que le cadre d’une seule image.
- Enregistrez le fichier, y compris le numéro de section pour l’analyse morphométrique. Utilisez le numéro de section suivi d’un, b, c, etc. pour les images qui se chevauchent de la même blessure.
11. Analyse morphométrique
REMARQUE : Lorsque la plaie s’étend sur plusieurs photos, résumez les mesures prises à partir des photos individuelles pour obtenir une valeur par section métrique par blessure à enregistrer dans la feuille de calcul.
- Dans Image J, ouvrez un fichier numérique d’une image de plaie tachée. N’utilisez pas d’images cousues pour l’analyse. Effectuez des mesures sur les images superposées zoomées en trouvant des repères à laisser de côté et prenez des mesures d’une image à l’autre.
- Définissez l’échelle et les préférences de mesure.
- Sélectionnez "Set Scale" sous Analyser. Entrez la distance en pixels, la distance correspondante connue et l’unité de la distance (= unité de longueur). L’échelle doit apparaître dans la fenêtre et doit correspondre à l’échelle à l’échelle à l’image acquise.
- Cochez la case" Global" pour garder l’échelle la même pour chaque image ouverte.
- Répétez les étapes 11.2.1 à 11.2.2 chaque fois que l’image J est fermée et rouverte.
- Cochez la case "Zone" sous Analysez | Définir les mesures.
- Mesurer la longueur de la plaie
- Sélectionnez "Sélections à main levée" sur la barre d’outils fidjienne.
- Mesure à partir du dernier follicule pileux du tissu non blessé d’un côté de la plaie au premier follicule pileux du tissu non blessé de l’autre côté de la plaie (Figure 4A,B).
- Tracez le long de la jonction dermo-épidermique pour atteindre ces deux points de repère. Si l’épiderme ne couvre pas toute la plaie, suivez la jonction dermo-épidermique d’un côté de la plaie et où la langue migrante se termine continuer à suivre l’aspect supérieur du tissu granulation ou la jonction entre le tissu de granulation et la tavelure jusqu’à ce que vous atteigniez la langue migrante, puis enfin le premier follicule pileux du tissu non blessé de l’autre côté (Figure 4E,F).
- Sous Analyser, cliquez sur Mesurer. La longueur de la mesure apparaîtra dans les mêmes unités que dans l’échelle.
- Créez une feuille de calcul pour suivre les mesures (Tableau supplémentaire 1).
- Copiez la longueur de la plaie dans la feuille de calcul.
- Mesurer la longueur épidermique
- Si l’épiderme couvre toute la plaie, la longueur épidermique est la même que la longueur de la plaie.
- Copiez la mesure de la « longueur des plaies » dans la colonne « longueur épidermique » de la feuille de calcul Excel et passez à l’étape 11.5.
- Si l’épiderme ne couvre pas toute la plaie, sélectionnez les «sélections à main levée» et mesurez la distance entre chaque bord d’attaque épidermique suivant l’aspect supérieur du tissu granulation ou la jonction entre le tissu granulationnel et la tavelure au premier follicule pileux(figure 4C,D).
- Sous Analyser, cliquez sur Mesurer.
- Soustrayez cette mesure de la longueur de la plaie et enregistrez le nombre sous « longueur épidermique » dans la feuille de calcul Excel.
- Si l’épiderme couvre toute la plaie, la longueur épidermique est la même que la longueur de la plaie.
- Mesurer la zone de la plaie
- Sélectionnez "Sélections à main levée" sur la barre d’outils fidjienne.
- Mesurez à partir du dernier follicule pileux du tissu non blessé d’un côté de la plaie au premier follicule pileux du tissu non blessé de l’autre côté de la plaie (Figure 4A,B,E,F).
- Tracez l’aspect supérieur de l’épiderme (n’incluez pas la tavelure) ou l’aspect supérieur du tissu de granulation si la plaie n’est pas entièrement couverte par l’épiderme.
- Continuer à tracer verticalement le long du follicule pileux dans le tissu de granulation une fois que le follicule pileux opposé est atteint et jusqu’à ce que le tissu adipeux ou le muscle est atteint. Suivez la bordure inférieure du tissu granulé de l’autre côté de la plaie et rejoignez le point de départ le long du follicule pileux pour fermer la zone (Figure 4E,F).
- Sous Analyser, cliquez sur Mesurer.
- Copiez la zone de la plaie dans la feuille de calcul sous « zone de blessure mesurée ».
- Mesurer la zone épidermique
- Sélectionnez "Sélections à main levée" sur la barre d’outils fidjienne.
- Si la plaie est entièrement épithélialisée :
- Tracez le long de l’aspect supérieur de l’épiderme jusqu’à ce que le follicule pileux opposé soit atteint et complétez la zone en « revenant » au point de départ suivant la jonction dermo-épidermique entre l’épiderme et le derme (figure 4D).
- Sous Analyser, cliquez sur Mesurer.
- Copiez la zone épidermique dans la feuille de calcul Excel sous « zone épidermique mesurée » et passez à l’étape 11.7.
- Si la plaie n’est pas entièrement épithélialisée :
- Tracez le long de l’aspect supérieur de l’épiderme jusqu’au bord d’attaque et retournez au point de départ suivant la jonction dermo-épidermique(figure 4C).
- Sous Analyser, cliquez sur Mesurer.
- Répétez l’étape 11.6.3.1 et 11.6.3.2 de l’autre côté de la plaie.
- Sous Analyser, cliquez sur Mesurer.
- Résumer les deux chiffres obtenus aux étapes 11.6.3.2 et 11.6.3.4 et entrer le résultat sous « zone épidermique mesurée » dans la feuille de calcul.
- Répétez les étapes 11.3 à 11.6 sur chaque40ème section (chaque 8ème diapositive).
- Calculer la zone épidermique de toute la plaie.
- Créez une nouvelle colonne dans la feuille de calcul « zone épidermique calculée » à côté de la « longueur épidermique ».
- Multipliez le nombre de « longueur épidermique » par 280 pour chaque section à l’exception de la dernière (section de 7 μm d’épaisseur x 40 sections).
- Multipliez le nombre de « longueur épidermique » par 7 pour la dernière section (épaisseur de la section).
- Sommez la valeur de la « zone épidermique calculée » pour chaque section afin d’obtenir la zone épidermique de l’ensemble de la plaie.
- Calculer la zone de la plaie de toute la plaie.
- Répétez les étapes 11.8.1 à 11.8.4 en utilisant les mesures de longueur de la plaie.
- Calculer le volume épidermique de toute la plaie.
- Répétez les étapes 11.8.1 à 11.8.4 en utilisant les mesures « zone épidermique mesurée ».
- Calculer le volume de la plaie entière.
- Répétez les étapes 11.8.1 à 11.8.4 en utilisant les mesures de la « zone de blessure mesurée ».
- Calculer le pourcentage de volume épidermique dans la plaie.
- Divisez le volume épidermique total par le volume total de plaies et multipliez par 100 pour obtenir le pourcentage (ne faites pas ce ratio pour chaque section).
- Calculer le pourcentage de zone épidermique parmi la zone de la plaie.
- Diviser la zone épidermique totale par la zone de plaie totale et multiplier par 100 pour obtenir le pourcentage. Si une plaie est entièrement épithélialisée, ce nombre devrait être de 100.
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Representative Results
La figure 5 représente la fourchette des valeurs mesurées et calculées obtenues en effectuant une analyse morphométrique sur des plaies de type sauvage générées par plusieurs chirurgiens et analysées par différents individus dans différentes souches de souris. Les souris de type sauvage de différentes souches peuvent afficher des différences statistiques telles que décrites dans nos études et dans lalittérature 9,10. Sur la base de ces résultats représentatifs, nous recommandons que, dans une seule étude, des souris provenant d’une seule souche soient utilisées. Bien que nous recommandons que la même personne effectue toutes les blessures dans une étude particulière, plusieurs personnes pourraient agir en tant que chirurgiens tant que la zone des blessures au jour 0 n’est pas statistiquement différente entre le travail de l’individu. Enfin, comme l’analyse morphométrique décrite dans ce protocole peut être approfondie, plusieurs individus pourraient analyser des parties d’une même expérience, mais seulement si les résultats de leur analyse de deux échantillons se trouvent à moins de 5 % l’un de l’autre. Cependant, il est préférable d’avoir une seule personne analysant les blessures d’une manière aveuglée pour éviter les biais.
La figure 6 présente une méta-analyse comparant les mesures des plaies obtenues en suivant le protocole décrit dans cetteétude 11 avec des mesures obtenues à partir du « milieu » de la plaie et de 40 sections environnantes. Dans la figure 6A, la zone épidermique et la zone de la plaie ont été calculées à partir de la mesure des longueurs épidermiques et des plaies sur les sections des plaies, suivie du calcul du pourcentage de la zone épidermique parmi la zone de la plaie (parfois appelée « pourcentage de fermeture » ou « pourcentage d’épithélialisation »). De même, dans la figure 6B, le pourcentage de l’épiderme dans la plaie a été obtenu en tant que rapport entre le volume épidermique (calculé à partir de la zone épidermique mesurée) et le volume de la plaie (calculé à partir de la zone de plaie mesurée). Pour les deux paramètres, l’analyse de l’ensemble de la plaie a montré de fortes différences statistiques entre les groupes (jusqu’à P < 0,001 après Anova uni-sens). Cependant, l’importance a été diminuée (jusqu’à P < 0,01 après Anova uni-sens) lorsque seulement 40 sections au milieu de la would ont été analysées. Ces résultats démontrent une diminution du niveau d’importance lorsque seul un sous-ensemble de la plaie est analysé. Ces données suggèrent que les défauts avec une petite taille d’effet seront probablement seulement détectés en effectuant l’analyse morphométrique sur la blessure entière, et que les phénotypes plus doux de guérison de blessure seront manqués d’un type « moyen de la blessure » d’analyse.
La pratique courante pour analyser la cicatrisation in vivo des plaies consiste à mesurer la zone de la plaie sur les sections histologiques choisies quelque part dans laplaie 12. Dans cet esprit, la moyenne de la zone de blessure mesurée à partir des sections sérielles de plaies entières a été comparée à celle obtenue à partir des sections intermédiaires du sous-ensemble. Les résultats n’ont montré aucune différence significative entre les groupes expérimentaux et entre la méthoded’analyse ( figure 6C). Toutefois, le protocole actuel utilise la zone mesurée (indiquée dans la figure 6C)sur toute la plaie pour calculer le volume de la plaie. Comme le montre la figure 6D,le volume calculé des plaies (qui ne peut être calculé qu’à l’aide de l’analyse de l’ensemble de la plaie) est sensiblement différent d’un groupe expérimental à l’autre. En résumé, ces résultats représentatifs démontrent l’importance d’une analyse histologique approfondie des paramètres de cicatrisation des plaies décrits dans ce protocole afin de détecter les phénotypes qui auraient autrement été manqués à l’aide d’une analyse plus traditionnelle de la cicatrisation des plaies.
Figure 1 : Procédure excisionnelle bilatérale de blessure. (A) Photographie représentative d’une souris après la coupure et le rasage des cheveux de la zone chirurgicale. (B) La peau pincée entre les omoplates le long de la ligne médiane dorsale. (C) La souris positionnée sur le côté avec le dépliant posé à plat. (D) Représentation du placement de poinçon de biopsie. (E) Dépliant poinçonné. (F) La souris avec deux blessures bilatérales au jour 0 et les tissus de contrôle de biopsie de poinçon excisés comme indiqué par les flèches blanches. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Procédure de récolte des plaies. (A-C) Photographies macroscopiques de 6 mm blessures excisionales après 4 jours (A), 7 jours (B) et 11 jours (C). (D-E) Avec une lame de scalpel, une incision cutanée a été faite sous la forme d’un large rectangle qui inclut les blessures et les tissus non tissés environnants. (F) La peau a été libérée du tissu sous-jacent avec des forceps et des ciseaux. (G) Représentation des blessures bilatérales récoltées. (H) La ligne blanche pointillée représente la bordure du tissu qui serait récoltée à la suite de l’utilisation d’une biopsie par poinçon (cette méthode permet une quantité normalisée de tissu récolté). (I) La ligne blanche pointillée représente la bordure du tissu qui serait taillée pour l’histologie (forme rectangulaire permet une intégration plus facile). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Solution | Temps (minutes) | Température (Celsius) | Pression (kPa) |
| 80% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| 95% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| 100% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| Xylène | 30 | Rt | N/A |
| Xylène | 30 | Rt | N/A |
| Paraffine | 30 | 60 | 20 |
| Paraffine | 30 | 60 | 20 |
Tableau 1 : Procédure de traitement de l’échantillon pour l’intégration de la paraffine. RT = température ambiante. N/A = non applicable.
Figure 3 : Intégration et section des plaies. (A) Plaie traitée par la paraffine couchée à plat dans un moule d’intégration. (B) La plaie a été maintenue à 90° (« debout ») de la surface horizontale du moule pour l’intégration. (C) La plaie encastrée dans la paraffine correctement orientée pour le sectionnement (D) Bloc de paraffine monté sur la microtome a été sectionné en rubans d’environ 20 sections (E) rubans de paraffine coupés en incréments de 5 sections comme indiqué par les supports blancs. (F) Des sections en série posées à plat dans un bain d’eau chaude (40-45 °C) ont été montées sur une lame de microscope. Le dessin animé dans (A-C) représente la plaie (orange) dans la peau (bleu) avec l’orientation correcte de l’épiderme (e) et le derme (d) pour chaque étape. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Caractéristiques histologiques des blessures et illustration des paramètres morphométriques. (A, B) Caractéristiques histologiques d’un jour 4 (A) et un jour 7 (B) 6 mm blessure. (C-F) Représentation des différentes mesures utilisées pour effectuer l’analyse morphométrique quantitative : longueur de l’épiderme (C, D, ligne noire pointillée), zone mesurée de l’épiderme (C, D, zone ombrée jaune), longueur dela plaie( E , F, ligne jaune pointillée) et zone mesurée de toute la plaie (E, F, zone grise ombragée). HF = follicule pileux; barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Caractéristiques morphométriques des plaies représentatives de type sauvage de 6 mm aux jours 4, 7e et 11e jour après la blessure. Les parcelles éparses représentent des données obtenues à partir d’analyses morphométriques de blessures de type sauvage de 6 mm générées dans différentes souches de souris par plusieurs chirurgiens et analysées par différentes personnes. (A) volume de plaie, (B) volume épidermique, (C) pourcentage d’épiderme dans la plaie, (D) zone de blessure (calculée), (E) zone épidermique (calculée), et (F) pourcentage de zone épidermique parmi la zone de la plaie démontrent la gamme de variation dans les valeurs morphométriques. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : La méta-analyse comparant les paramètres obtenus de la plaie entière avec le milieu de la plaie identifie de nouveaux défauts ayant une signification plus élevée. La morphométrie de guérison de blessure a été exécutée le jour 7 des blessures injectées avec la solution saline (commande), transformant le facteur de croissance bêta 3 (Tgfb3), Tgfb3 avec l’anticorps neutralisant (Tgfb3 + NAB) et neutralisant l’anticorps seul (NAB). Des mesures ont été effectuées sur des plaies sectionnées en série (« entières ») ou sur 40 sections à partir du milieu de la plaie (« milieu ») et utilisées pour calculer le pourcentage de surface épidermique au-dessus de la zone dela plaie( A ), le pourcentage d’épiderme dans la plaie (B) et le volume de la plaie (D). (C) représente la moyenne de la zone de la plaie mesurée sur l’ensemble ou le milieu de la plaie. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, ns = non significatif, Anova uni sens unique). Ce chiffre a été modifié à l’aide des données de Le et coll.11. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau supplémentaire 1 : Exemple de feuille de calcul pour l’enregistrement des mesures morphométriques. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette table.
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Discussion
Le modèle bilatéral de blessure excisional est une procédure hautement personnalisable qui peut être employée pour étudier beaucoup de différents aspects de la guérison de blessure. Avant de commencer un projet de cicatrisation des plaies, les chercheurs devraient effectuer une analyse de puissance pour déterminer le nombre de blessures nécessaires pour détecter un défaut d’une taille d’effet particulière. Des incohérences existent dans la littérature sur la question de savoir si des souris ou des blessures individuelles devraient être utilisées comme répliques biologiques, cependant, une étude récente a montré qu’il n’y a pas de corrélation significative entre deux blessures sur un seul animal4. Ceci suggère que les blessures d’un animal simple sont indépendantes les unes des autres et peuvent être considérées comme des répliques biologiques, réduisant le nombre de souris nécessaires pour détecter un défaut. Ceci est pertinent lorsque l’on considère les petites tailles d’effet pour lesquelles un nombre élevé de blessures est nécessaire pour atteindre lasignification 4. En outre, les résultats du calcul de puissance peuvent influencer le nombre de blessures effectuées sur chaque animal, avec 2 et 4 blessures par animal étant les plus courantes.
Le protocole chirurgical lui-même est également très flexible. Alors que nous recommandons l’anesthésie par vaporisateur isoflurane en raison de la courte durée de la procédure et la récupération rapide (10-15 min par souris), les chercheurs sans accès à un vaporisateur peuvent utiliser une anesthésie injectable, y compris la kétamine / xylazine ou pentobarbital. La sélection d’un analgésique approprié est particulièrement critique, car elle concerne les phases inflammatoires de la cicatrisation des plaies. L’utilisation de médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) tels que flunixin meglumine ou Meloxicam doit être utilisée avec prudence car ils peuvent diminuer l’inflammation. Les opioïdes sont donc préférés dans les études où l’inflammation est étudiée. Nous recommandons des analgésiques (p. ex., buprénorphine à libération soutenue) qui fournissent jusqu’à 48 h d’analgésie et éliminent le besoin de doses supplémentaires répétées. Toutes les interventions chirurgicales doivent être exécutées conformément aux lignes directrices fédérales et appuyées par un protocole animal approuvé.
La cicatrisation des plaies est un processus qui englobe plusieurs phases, chacune étant caractérisée par différents processus biologiques impliquant des types de cellules distincts3. La phase inflammatoire se produit entre les jours 0 et 5, avec la migration tôt des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) et des macrophages au site de la blessure13. La phase proliférative se produit entre 3 et 14 jours avec la rééthélialisation prenant une quantité variable de temps basé sur la taille de la blessure14. Dans ce protocole, nous avons employé un poinçon de biopsie de 6 millimètres et la plupart des blessures ont été ré-épithélialisées par 7 jours. Toutefois, ce délai devrait être raccourci si de plus petits poinçons étaient utilisés (ils sont disponibles aussi petits que 1 mm). En combinaison avec des points de temps plus tôt, ces blessures plus petites peuvent être préférables pour réduire la quantité d’analyses histologiques15. Enfin, les phases de remodelage et de maturation se produisent après 7 jours et jusqu’à un an après lablessure 16. Ces moments ultérieurs peuvent être nécessaires pour étudier la maturation de la plaie ou pour étudier les retards de cicatrisation des plaies chez les animaux expérimentaux. Par conséquent, l’enquêteur devra déterminer les points de temps critiques requis pour étudier des phases particulières de la cicatrisation des plaies en fonction de leur hypothèseparticulière 5.
L’analyse de la cicatrisation des plaies ne se limite souvent pas aux analyses histologiques. Les sections de paraffine non tachées peuvent être utilisées pour des analyses supplémentaires telles que l’immunofluorescence ou le trichrome de Masson pour le dépôt de collagène. Le traitement du tissu de contrôle (biopsies de poinçon) et les étapes de récolte du tissu dépendront tous de la façon dont, en plus des analyses histologiques, la cicatrisation des plaies est évaluée. Dans le cadre du protocole chirurgical, des biopsies de poinçon sont enlevées afin de générer la blessure excisionnelle. Ces poinçons peuvent servir de tissu de contrôle non tissé pour des applications en aval telles que les protéines (pour le profilage occidental ou cytokine), l’extraction de l’ADN ou de l’ARN et doivent être traités en conséquence. Il est recommandé d’économiser au moins un poinçon pour l’analyse histologique, en particulier dans les cas où la peau est traitée avant la blessure (par exemple, l’application de tamoxifène pour l’induction de la recombinaison Cre-Lox17). L’examen du poinçon peut déterminer l’effet du traitement sur la morphologie cutanée ou tout simplement permettre l’évaluation de la morphologie cutanée de base du modèle de souris en question utilisé. Les blessures non utilisées pour l’histologie peuvent être récoltées avec une biopsie de poinçon qui englobe la taille de la blessure. Cette procédure présente quelques avantages, y compris la récolte de la même quantité de tissu, quelle que soit la taille de la plaie (les plaies plus grandes ont moins de tissus sains environnants). Enfin, nous décrivons l’utilisation de 4% de paraformaldéhyde comme fixatif et paraffine comme matériau pour la conservation et l’intégration des tissus, respectivement. D’autres fixatifs peuvent être nécessaires pour certaines applications et peuvent être substitués (par exemple, les fixatifs de Carnoy ou bouin). Pour une meilleure coloration immunofluorescente, la congélation et l’intégration de la plaie dans le composé optimal de température de coupe suivie d’une section gelée reste la méthode de choix.
La section des tissus blessés peut présenter de nombreux défis, en particulier les blessures du jour 4 en raison de la présence de la tavelure. Pour générer des sections de haute qualité, il est recommandé de vérifier que toutes les parties de la microtome sont bien attachées, que le support du bloc est rétracté à sa position initiale, que le support de la lame est fixé entre 0 et 10° et que la lame est bien attachée mais pas trop serrée. Bien que le bloc de paraffine soit refroidi, le tissu peut encore déchiqueter. Si le déchiquetage se poursuit, un morceau de glace peut être placé sur le bloc pendant 5 minutes alors qu’il est encore monté. Une fois que la section a commencé, il est fortement recommandé d’éviter d’enlever le bloc de la microtome pour empêcher la perte de sections de paraffine. Il est impératif d’enregistrer toutes les sections perdues de paraffine, à la fois leurs numéros et leur classement dans la section série. Cela affectera l’analyse morphométrique et doit être pris en considération. Après avoir commencé la section, l’identification des tissus blessés sur les sections non tachées peut être difficile, surtout si elle n’est pas familière avec l’histologie. En cas de doute, il est recommandé d’être prudent et de garder toutes les sections qui contiennent des tissus. Une fois la tache histologique effectuée, l’organisation tissulaire sera plus évidente et la plaie plus distincte. Parfois, les follicules pileux peuvent ne pas être clairement visibles ou peuvent être loin du bord de la plaie. Si c’est le cas, d’autres caractéristiques clés du tissu blessé peuvent être utilisées pour établir les limites de la plaie, y compris une augmentation brusque suivie d’une diminution immédiate de l’épaisseur épidermique et de changements brusques dans l’organisation du tissu conjonctif (Figure 4A-B).
L’imagerie numérique est une étape cruciale de l’analyse morphométrique. L’analyse morphométrique doit être effectuée sur des images individuelles à l’aide d’un point de repère sur chaque image afin d’éviter des mesures répétées. Cependant, il est possible de recoudre tous les cadres ensemble à l’aide d’un logiciel numérique et d’effectuer l’analyse sur une seule image. Bien que cela semble plus facile au début, la manipulation d’une grande image peut ralentir le processus d’analyse vers le bas. Le choix de la section est également essentiel pour l’analyse. Bien que nous vous recommandonsd’acquérir numériquement la section supérieure de chaque diapositive 8e, la qualité de la section doit être priorisée et le meilleur des 5 sections de cette diapositive doit être image. Les sections avec de petits plis peuvent encore être analysées en estimant la superficie/la longueur du pli. Le nombre de cette section particulière doit être enregistré à la fois dans le fichier numérique et dans la feuille de calcul Excel, de sorte que la distance entre la section précédente et la section analysée suivante puisse être ajustée en conséquence.
Les plaies cutanées touchent environ 6,5 millions de personnes dont le traitement coûte plus de 25 milliards de dollars par année18 et sont une composante inhérente des interventions chirurgicales en plus d’être secondaires à de nombreux autres problèmes de santé, y compris le diabète et l’obésité. La souris a été utilisée comme modèle pratique pour étudier les maladies humaines en raison de la facilité à manipuler son génome, bien qu’elle présente souvent un phénotype subtil par rapport au trouble humain. Le modèle excisional bilatéral de blessure et l’analyse morphométrique suivante décrites dans ce protocole sont significatifs en raison de sa capacité à adresser la difficulté de détecter des défauts mineurs dans un processus intrinsèquement complexe de guérison deblessure 19. En raison de sa plus grande sensibilité et de sa variabilité réduite, ce protocole offre la possibilité d’utiliser moins d’animaux pour obtenir la même sensibilité expérimentale. Le protocole est hautement personnalisable et peut être utilisé pour étudier toutes les étapes de la réparation des tissus. L’analyse morphométrique histologique détaillée en combination avec la caractérisation phénotypique du tissu ont un grand potentiel pour augmenter les connaissances nécessaires pour avancer la compréhension des facteurs critiques modulant la réparation de tissu.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à tous les membres du Laboratoire Dunnwald qui ont contribué à l’optimisation de ce protocole au fil des ans, et à Gina Schatteman dont la persistance dans la promotion de l’utilisation de la section sérielle pour l’analyse des plaies a rendu possible sa création. Ces travaux ont été soutenus par le financement des NIH/NIAMS à Martine Dunnwald (AR067739).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
