Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

اختبار تصوير أحادي الجزيء في المختبر لتحليل حركية الترجمة المعتمدة على الغطاء

Published: September 15, 2020 doi: 10.3791/61648
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

يتيح تتبع أحداث الترجمة الفردية إجراء دراسات حركية عالية الدقة لآليات الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى. هنا نظهر في المختبر اختبار جزيء واحد على أساس التفاعلات التصوير بين الأجسام المضادة وصفت الفلورسنت والببتيدات الناشئة الموسومة epitope. تمكن هذه الطريقة من توصيف جزيء واحد للبدء وحركية استطالة الببتيد أثناء الترجمة النشطة في المختبر المعتمدة على الغطاء.

Abstract

تخليق البروتين المعتمد على الغطاء هو مسار الترجمة السائد في الخلايا النواة. وفي حين سمحت مختلف النهج الكيميائية الحيوية والجينية بإجراء دراسات مستفيضة للترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وتنظيمها، لا يزال هناك نقص في التوصيف الحركي عالي الدقة لمسار الترجمة هذا. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير اختبار في المختبر لقياس الحركية الترجمة المعتمدة على الغطاء مع قرار جزيء واحد. ويستند المقايسة على الأجسام المضادة المسمى fluorescently ملزمة لepiptide epitope الموسومة الوليدة. من خلال تصوير ربط وتفكك الأجسام المضادة من وإلى مجمعات الببتيد-ريبوسوم-ميرنا الوليدة، يمكن تتبع تطور الترجمة على الحمض النووي الريبي الفردي. هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء هذا المقايسة، بما في ذلك الاستعدادات الشريحة ميرنا وPEGylated، والتصوير في الوقت الحقيقي للترجمة، وتحليل مسارات جزيء واحد. يتيح هذا الفحص تتبع أحداث الترجمة الفردية المعتمدة على الحد الأقصى ويحل الحركية الرئيسية للترجمة، مثل معدلات البدء والإطالة. يمكن تطبيق المقايسة على نطاق واسع على أنظمة الترجمة المتميزة وينبغي أن تستفيد بشكل عام في الدراسات المختبرية حركية الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وآليات التحكم في الترجمة.

Introduction

الترجمة في أنظمة eukaryotic يحدث في الغالب من خلال 7-ميثيلguanosine (م7G) مسارات تعتمد على الغطاء1. تشير الدراسات إلى أن الخطوة الأولى للترجمة eukaryotic هو الحد من معدل وهدف مشترك للائحة2،3،4. وقد درست آليات الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى على نطاق واسع باستخدامالوراثية 5، البيوكيميائية6،7،8،الهيكلية 9، والجينومية10 النهج السائبة. وعلى الرغم من أن هذه الأساليب قد حددت آليات متنوعة تنظم البدء المعتمد على الحد الأقصى، فإن حلها يقصرها على مجموعة متوسط الإشارات من أحداث البدء غير المتجانسة وغير المتزامنة. في الآونة الأخيرة ، تم تصور الفردية في أحداث الترجمة في الجسم الحي من خلال الأساليب التي تقيس الأجسام المضادة الفلورية ملزمة لepitopes على polypeptidesالوليدة 11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن هذه النهج الجديدة محدودة أيضا في قدرتها على حل أحداث البدء الفردية لأن الأجسام المضادة الفلورية المتعددة يجب أن تربط الببتيد الوليد للسماح بحل أحداث الترجمة الفردية من خلفية مفلورة عالية داخل الخلايا. في العديد من التفاعلات البيولوجية، قدمت الأحداث الحركية الفردية التي تم حلها رؤى حاسمة لفهم العمليات البيولوجية المعقدة متعددة الخطوات والمتكررة التي لا يمكن مزامنتها على المستوى الجزيئي. هناك حاجة إلى أساليب جديدة يمكنها تتبع ديناميكيات أحداث الترجمة الفردية من أجل فهم أفضل للبدء والتنظيم المعتمدين على الحد الأقصى.

قمنا مؤخرا بتطوير اختبار في المختبر يقيس الحركية بدء تعتمد على الغطاء مع قرار جزيء واحد15. وبالنظر إلى العدد الكبير من عوامل البروتين المعروفة وغير المعروفة المشاركة في مسار البدء هذا3،16، تم تطوير المقايسة أحادية الجزيء لتكون متوافقة مع أنظمة الترجمة الخالية من الخلايا المختبرية الحالية للاستفادة من الحفاظ على العوامل الخلوية ونشاط الترجمة القوي17و18و19و20و21و22و23و24و25. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام نظم الترجمة الخالية من الخلايا يتيح إجراء مقارنات أكثر توافقا بين الملاحظات أحادية الجزيء والنتائج السائبة السابقة. يوفر هذا النهج تكاملا مباشرا بين الرؤى الحركية الجديدة أحادية الجزيء في الإطار الآلي الحالي للبدء المعتمد على الغطاء. لإنشاء المقايسة أحادية الجزيء، يتم تعديل نظام الترجمة التقليدية الخالية من الخلايا بثلاث طرق: يتم إدخال تسلسل ترميز الظهارة في بداية إطار القراءة المفتوح (ORF) لمراسل مرنا. 3' نهاية مراسل مرنا هو البيوتينيلات لتسهيل مرنا نهاية الربط إلى سطح الكشف عن جزيء واحد; ويتم استكمال الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لمخرج الترجمة. تتطلب هذه التعديلات فقط تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأساسية والكواشف المتاحة عادة. وعلاوة على ذلك، تحافظ هذه التعديلات وظروف التصوير أحادية الجزيء على الحركية التحريرية لتفاعلات الترجمة السائبة الخالية من الخلايا15.

في هذا المقايسة (الشكل 1), 5′-نهاية توج و 3′-end مراسل biotinylated مرنا هو شلت إلى سطح الكشف streptavidin المغلفة في غرفة تدفق. ثم تمتلئ غرفة التدفق بخليط ترجمة خال من الخلايا تكمله أجسام مضادة تحمل علامة fluorescently. بعد ترجمة مرنا قد حدث لحوالي 30-40 codons المصب من تسلسل epitope26،27، وepitope يخرج من نفق الخروج ريبوسوم ويصبح من السهل الوصول إليها للتفاعل مع الأجسام المضادة المسمى fluorescently. هذا التفاعل سريع والكشف عنه عن طريق تقنيات التصوير الفلوري أحادي الجزيء يتيح تتبع حركية الترجمة بدقة جزيء واحد أثناء الترجمة النشطة الخالية من الخلايا. وينبغي أن يفيد هذا المقايسة على نطاق واسع في الدراسات المختبرية حركية الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وتنظيمها، ولا سيما بالنسبة للأنظمة التي تعمل بكميات كبيرة في الفحص المختبري.

شرط أساسي لإنشاء هذا المقايسة جزيء واحد هو العمل السائبة الخلية خالية من ترجمة المقايسة، والتي يمكن تحقيقها باستخدام استخراج الترجمة التي هي إما متاحة تجاريا أو أعدت باتباع الأساليب الموصوفة سابقا28. يمكن الحصول على استخراج الترجمة Eukaryotic من خلايا متنوعة، بما في ذلك الفطرية والثدييات والنبات28. للتصوير، يتطلب هذا الفحص مجهر TIRF مجهز بكثافة الليزر غير القادرة وزاوية الحادث، ومرحلة عينة مزودة بمحرك، ونظام سوائل آلي، وجهاز التحكم في درجة الحرارة العينة. هذه المتطلبات هي عامة للتجارب الحديثة في المختبر TIRF جزيء واحد ويمكن تحقيقها بشكل مختلف. تستخدم التجربة المعروضة هنا نظام TIRF من النوع الموضوعي يتكون من المجهر والبرامج والملحقات المتاحة تجاريا والمدرجة جميعها في جدول المواد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جيل مراسل مرنا

  1. تعديل قالب نسخ الحمض النووي الذي يشفر "untagged" مراسل mRNA السائبة عن طريق إدراج تسلسل ترميز العلامة N-terminus لإنشاء قالب نسخ الحمض النووي لمراسل "الموسومة" مرنا (الشكل 2A).
    ملاحظة: يوصى بتفاعل 3xFLAG/anti-FLAG لهذا المقايسة نظرا لحساسية الفائقة وطول العلامة 3xFLAG القصير. ومع ذلك ، فإن المقايسة متوافقة مع أزواج epitope / الأجسام المضادة الأخرى.
  2. توليف RNAs غير الموسومة والموسومة باستخدام قوالب الحمض النووي الخطية ومجموعة النسخ في المختبر (انظر جدول المواد). عادة، 10-20 pmol من الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر كافية لمعالجة الحمض النووي الريبي اللاحقة للسماح لدراسة منهجية جزيء واحد.
  3. كاب RNA 5′ نهاية (الشكل 2B) مع M7G توج عدة (انظر جدول المواد) بعد توصية الشركة المصنعة.
  4. Biotinylate RNA 3' نهاية (الشكل 2B) باستخدام مجموعة البيوتينيليشن (انظر جدول المواد)وفقا للبروتوكول المقدمة مع عدة. تنقية RNAs بواسطة استخراج الفينول الكلوروفورم تليها تنقية مع عمود تدور. إلوت الجيش الملكي النيبالي في 10-20 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase. يتم استرداد ما يقرب من 40-50٪ من الحمض النووي الريبي المدخلات غير المغطاة.
  5. تقييم سلامة الحمض النووي الريبي والتركيز عن طريق إزالة الكهروفلوريس هلام الأكريلاميد وتلطيخ الحمض النووي الريبي، كما هو موضح سابقا29.
  6. تنفيذ ترجمة بالجملة خالية من الخلايا30 مع 3′نهاية البيوتينية الموسومة مراسل مرنا لتأكيد أن مرنا المعدلة يحافظ على خصائص الترجمة التي هي ذات أهمية. وكمثال على ذلك، يمكن تأكيد الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى من خلال قياس ومقارنة أنشطة المراسلين في ردود الفعل بالجملة للترجمة الخالية من الخلايا مع mRNAs المراسل غير المقيد والم توج (انظر النتائج التمثيلية).

2. تدفق غرفة إعداد

  1. حدد سمك غطاء مناسب، كما هو محدد في ورقة المواصفات الموضوعية للمجهر. حدد شريحة زجاجية أو كوارتز لأنظمة التصوير ذات الإضاءة الداخلية الكلية (TIRF) من النوع الموضوعي أو المنشوري31على التوالي.
  2. قم بالتنظيف والتملح وال PEGylation وتجميع غرفة الأغطية والشرائح وفقا للبروتوكول الذي وصفه Chandradoss et al.32 مع التعديلات التالية.
    1. اغسل الشرائح التي تحتوي على ثقوب محفورة في المنظفات السائلة القلوية بنسبة 10٪ (v/v) لمدة 20 دقيقة مع سونيكيشن. اجمع الشرائح والأغطية لجميع خطوات التنظيف المتبقية.
    2. تخطي خطوة غسل الأسيتون. تمديد فترة حضانة البيرانا من 20 دقيقة إلى ساعة واحدة. احتضان PEGylation الجولة الأولى لمدة 3 ساعة. احتضان PEGylation الجولة الثانية مع MS (PEG)4 لمدة 3 ساعة.

3. إعداد المعدات

  1. على الأقل 3 ساعة قبل إجراء تجربة جزيء واحد، قم بتشغيل حاضنة المجهر وتقليل تدفق الهواء إلى معدل منخفض لتجنب الاضطرابات الصوتية المفرطة للتجارب. قم بتعيين درجة حرارة الحاضنة إلى درجة الحرارة المثلى لنظام الترجمة الخالي من الخلايا.
    ملاحظة: الترجمة حساسة للغاية لدرجة الحرارة. درجة حرارة رد الفعل الأمثل محددة لكل نظام استخراج الخلية. يعد توصيف درجة حرارة التفاعل خطوة حيوية في تطوير نظام ترجمة بالجملة خال من الخلايا. وينبغي إجراء هذا المقايسة جزيء واحد تحت نفس درجة الحرارة المثلى كشرط الترجمة السائبة المقابلة.
  2. 1 ساعة على الأقل قبل إجراء تجربة جزيء واحد تشغيل الليزر عن طريق الضغط على زر طاقة الليزر وراء مربع الليزر، وتحويل مفتاح السلامة الليزر، واضغط على زر البدء. قم بتشغيل المجهر واضغط على لوحة التحكم بشاشة اللمس لتحديد وضع التصوير، والهدف، ومجموعة الفلتر.
  3. قم بتشغيل كاميرا EMCCD ووحدة تحكم المرحلة السابقة ومضخة الحقنة عن طريق الضغط على أزرار الطاقة الخاصة بهم. بدوره على الكمبيوتر والبرمجيات المفتوحة أندور سوليس (البرمجيات 1) للسيطرة على كاميرا EMCCD، TirfCtrl (البرمجيات 2) للسيطرة على الليزر، PriorTest (البرنامج 3) للسيطرة على المرحلة الآلية، وكولترم للسيطرة على مضخة حقنة. السماح للكاميرا بالتبريد والاستقرار في درجة حرارة العمل المعينة قبل بدء اكتساب البيانات.
  4. في البرنامج 2، تأكد من أن المعلمات الصحيحة يتم تعيينها للطول الموجي بالليزر، ونوع الهدف، ومؤشر الانكسار للزجاج والعينة. انقر فوق الزر الاتصال. لضبط كثافة الليزر، انقر فوق زر التحكم بجوار الطول الموجي بالليزر، ثم اسحب شريط الشرائح الكثافة في إطار التحكم بالليزر. تعيين الليزر إلى الزاوية المطلوبة عن طريق سحب شريط الشريحة موقف الألياف أو إدخال عمق الاختراق المقابلة. تأكد من تحديد مربع الغالق للحفاظ على الليزر في وضع إيقاف التشغيل عند عدم التصوير.
    ملاحظة: افتح مصراع الليزر وأغلقه عن طريق التحقق من مربع الغالق. عند إنشاء المقايسة في البداية ، يجب اختبار كثافة الليزر المختلفة وزوايا الحوادث للكشف الأمثل عن جزيء واحد. توازن كثافة الليزر المثلى بين الفلورسينس الساطع أحادي الجزيء والbleaching الضوئية السريعة للفلوروفوريس. وينبغي زيادة زاوية الحادث إلى ما وراء الزاوية الحرجة للحد من الخلفية الفلورية العالية من الأجسام المضادة المسماة الانتشار حتى يتم حل الأجسام المضادة المرتبطة بالمرنا بوضوح. كمرجع، تم تعيين ليزر 532 نانومتر إلى 10 ميكروواط عند الهدف مع تعيين زاوية حادث الليزر إلى 71.5 درجة في دراسة15 باستخدام Cy3 المسمى المضادة FLAG مع نسبة وضع العلامات من 2-7 الأصباغ لكل الأجسام المضادة.
  5. في البرنامج 1 ، اختر الحركية تحت وضع الاستحواذ، وإدخال المعلمات لوقت التعرض ، وطول سلسلة الحركية ، وEM كسب القيمة. اختيار الدليل وتعيين أسماء الملفات لحفظ ملف صورة البيانات.
  6. تعيين مضخة حقنة إلى معدل تدفق متواضعة وسريعة لخطوة غسل الأنابيب اللاحقة.
    Pipette a aliquot من الإيثانول 70٪ في أنبوب microfuge، إدراج أنبوب مضخة حقنة نهاية في محلول الإيثانول، واستخدام Coolterm لتبديل مضخة حقنة بين سحب وصرف وسائط ثلاث مرات لغسل الأنابيب. كرر استخدام المياه الخالية من RNase.
    ملاحظة: يجب أن يكون طول الأنابيب طويلا بما يكفي للسماح بالاستغناء عن مزيج الترجمة في الخطوة 5 للاتصال فقط بالأنابيب ، وليس المحقنة. يجب أن يكون حجم الشطف هنا أكبر من حجم مزيج الترجمة الموزع لضمان بقاء مزيج الترجمة في الخطوة 5 على اتصال بالأنابيب المطهرة.
  7. بعد أن يتم الاستغناء عن شطف الماء النهائي ، قم بإزالة المياه المتبقية من داخل الأنابيب عن طريق غمس نهاية الأنبوب على مسح الأنسجة النظيفة. الحفاظ على نهاية الأنابيب الجافة عن طريق وضعه في أنبوب microfuge نظيفة.

4. تعطيل 3′-نهاية البيوتينلاتED مرنا

  1. الحفاظ على استخراج الخلية ومزيج الترجمة المجمدة على الجليد الجاف حتى قبل استخدامها مباشرة. إذابة الكواشف المجمدة المتبقية والحفاظ عليها على الجليد.
  2. ضع غرفة التدفق في حامل عينة المجهر مع الجانب coverslip التي تواجه لأسفل وتأمينه في مكانه مع الشريط. استخدم الشريط لتغطية مداخل ومنافذ قنوات التدفق غير المستخدمة.
  3. ماصة حجم 1.5x (نسبة إلى حجم القناة; ينطبق أيضا على خطوات أخرى في الخطوة 4 والخطوة 5) من 0.2 ملغ / مل streptavidin في قناة تدفق واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. لإزالة streptavidin غير المنضمة، اغسل القناة ثلاث مرات عن طريق الأنابيب في حجم 3x من المخزن المؤقت لغسل T50 (20 mM Tris HCl، درجة الحموضة 7.0، 50 mM NaCl، 0.2 U/μL RNase كاشف تثبيط) لكل غسل.
    ملاحظة: من المهم منع تدفق النفايات السائلة مرة أخرى إلى القناة. إذا لم يكن منفذ قناة التدفق متصلا بأنبوب لجمع النفايات، ضع ورقة نسيج مطوية بالقرب من المنفذ لامتصاص السائل الذي يتدفق من القناة.
  5. نقل استخراج الترجمة ومزيج من الجليد الجاف إلى الجليد والسماح لهم ذوبان الجليد.
  6. وضع قطرة من زيت الغمر على الهدف. ضع حامل عينة المجهر مع غرفة التدفق في مرحلة المجهر. جعل الهدف على مقربة من coverlip حتى الغمر النفط على الاتصالات الهدف coverslip. حرك مرحلة العينة بحيث يكون موضع قناة التدفق فوق العدسة الهدف مباشرة.
  7. في البرنامج 2، افتح مصراع الليزر وضبط مستوى كثافة الليزر.
  8. على شاشة اللمس للتحكم بالمجهر، حدد علامة التبويب التركيز وانقر فوق الزر بحث التركيز والبدء. يتم سماع صوت تنبيه عندما يتم تحقيق طائرة التركيز بنجاح.
  9. صورة سطح قناة التدفق في الوضع المباشر في البرنامج 1. تحسين التركيز لصورة أكثر وضوحا عن طريق ضبط الموقف الهدف مع عنصر تحكم خطوة غرامة على الشاشة التي تعمل باللمس.
  10. في البرنامج 3، قم بتحريك المرحلة لتقييم مستوى الخلفية الفلورية في مناطق مختلفة من سطح الكشف عن قناة التدفق. إذا كان الفلورسينس منخفضا، فاستمر في التجربة. إذا كانت الخلفية الفلورية مرتفعة بشكل مفرط ، ففكر في التخلص من قناة التدفق.
  11. في البرنامج 2، أغلق مصراع الليزر.
  12. ماصة خارج المخزن المؤقت غسل T50 من قناة تدفق وماصة على الفور في حجم 2x من محلول مرنا البيوتينيلات إلى قناة التدفق. حضانة لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: لكل دفعة من إعداد مرنا، ينبغي اختبار تركيزات مرنا وأوقات الحضانة لتحقيق كثافة سطح مرنا اللازمة للكشف عن جزيء واحد. تتوسط كثافة سطح مرنا المناسبة ربط الأجسام المضادة التي تظهر بقع الفلورسنت مع ما لا يزيد عن ~ 5٪ متداخلة (انظر النتائج التمثيلية). كنقطة انطلاق، ينصح ميرنا البيوتينية في تركيز 2-20 nM.
  13. اغسل القناة ثلاث مرات عن طريق توجيه وحدة تخزين مؤقتة متوافقة مع الترجمة بمقدار 3 أضعاف لكل مغسلة.

5. تجميع مزيج الترجمة وتسليمها إلى قناة تدفق للكشف عن جزيء واحد

  1. على الجليد، تجميع 3x مجلدات من مزيج الترجمة30 في أنبوب الطرد المركزي الدقيق بعد بروتوكول الترجمة السائبة من الخطوة 1.7، باستثناء حذف مرنا وتكملة مع تركيز الأمثل من الأجسام المضادة وصفت الفلورسنت. تدور لفترة وجيزة أنبوب الطرد الدقيق لجمع مزيج الترجمة في الجزء السفلي من الأنبوب.
    ملاحظة: عند تحديد المقايسة، يتم اختبار تركيزات الأجسام المضادة المختلفة. يظهر التركيز الأمثل كميات منخفضة من الأجسام المضادة غير المحددة الملزمة لسطح الكشف والأجسام المضادة السريعة الملزمة للببتيد الوليد (انظر الخطوتين 7.1. و 7.2.، على التوالي، للحصول على تفاصيل معايرة المقايسة).
  2. نقل مزيج الترجمة إلى الداخل من غطاء أنبوب microfuge 0.7 مل. تعيين مضخة حقنة إلى وضع الانسحاب. أدخل نهاية أنابيب المضخة في مزيج الترجمة. بدء سحب حقنة لجمع مزيج الترجمة في أنابيب مضخة. عكس إعداد مضخة حقنة لوضع الاستغناء وتعيين تدفق إلى معدل الأمثل لتسليم مزيج الترجمة.
    ملاحظة: تجنب توليد فقاعات في مزيج الترجمة عند نقله إلى أنابيب المضخة. تجنب سحب مزيج الترجمة عميقا جدا في جزء من الأنابيب التي لم يتم تطهيرها وشطفها في الخطوة 3.6. عند تحديد المقايسة، يتم اختبار معدلات تدفق تسليم مختلفة لتحديد المعدل الأمثل (انظر الخطوة 6.2. للحصول على تفاصيل حول معايرة المقايسة).
  3. إذا كان هناك فجوة بين نهاية الأنابيب وخليط الترجمة، بدء مضخة حقنة والسماح للخليط الترجمة للوصول إلى نهاية الأنابيب، ثم وقف مضخة حقنة.
  4. أدخل نهاية أنابيب المضخة في مدخل قناة التدفق. تجنب إدخال فقاعات الهواء في مزيج الترجمة عند إجراء الاتصال. استقرار الاتصال عن طريق الشد قوس معدني حسب الطلب على لوحة حامل عينة المجهر. تقييم تركيز المجهر وفلورسينس منطقة التصوير.
    ملاحظة: يمكن أن تكون فرضت أنابيب إلى غرفة التدفق مع جزء مخصص كما هو موضح سابقا33. ويمكن أيضا أن تستخدم أنواع أخرى من أنظمة fluidics لهذا المقايسة34. يجب أن يظهر مجال الرؤية مشابها قبل وبعد توصيل الأنابيب. إذا ظهرت المزيد من البقع الفلورية بعد الاتصال، فمن المرجح أن يتسرب مزيج الترجمة من أنابيب التسليم. اعتمادا على التطبيق، قد تحتاج القناة التي بها مزيج ترجمة مسرب إلى التخلص منها.
  5. تأكد من صحة معلمات الحصول على الفيلم وأنه تم إدخال اسم الملف المناسب والدليل لحفظ الملفات.
  6. حرك المرحلة لتصوير منطقة في وسط سطح الكشف عن قناة التدفق. على شاشة اللمس للتحكم بالمجهر، حدد علامة التبويب "التركيز البؤري البؤري المستمر" وانقر على زر البحث البؤري والبدء للحفاظ على الموضع البؤري أثناء التجربة. يتم سماع صوت تنبيه عندما يتم تحقيق طائرة التركيز بنجاح.
  7. في البرنامج 2، افتح مصراع الليزر. في البرنامج 1، انقر فوق الزر "أخذ إشارة" لبدء التسجيل. بعد ما يقرب من 5 ق من تسجيل، أدخل الأمر تشغيل في Coolterm لتقديم مزيج الترجمة في قناة تدفق. سجل لمدة تصل إلى 2 ساعة مع دقة زمنية من 0.5-2 ثانية / إطار.
    ملاحظة: يعتمد الحد الأقصى لمدى الحصول على البيانات على مدى سرعة فقدان استخراج الترجمة للنشاط بمرور الوقت ، والتي يمكن أن تتميز بشكل ملائم بإجراء ترجمة بالجملة خالية من الخلايا مع مراسل luciferase mRNA وقياس نشاط لوسيفيراز في ردود فعل الترجمة في نقاط زمنية مختلفة35.
  8. عند اكتمال عملية الحصول على البيانات، قم بإيقاف تشغيل الليزر وإيقاف تشغيل شاشة التحكم المستمر AF على شاشة اللمس للتحكم بالمجهر، ثم قم بتفكيك الأنابيب من غرفة التدفق.
  9. ماصة من خليط الترجمة من مدخل قناة تدفق، ونقله إلى أنبوب microfuge، والمفاجئة تجميد الحل عن طريق وضع أنبوب في النيتروجين السائل. مخزن في وقت لاحق في -80 درجة مئوية.
  10. غسل أنابيب مضخة حقنة ثلاث مرات مع المياه الخالية من RNase، ثم ثلاث مرات مع الإيثانول 70٪. سحب الإيثانول 70٪ في أنابيب مضخة حقنة للتخزين.
  11. قم بإيقاف تشغيل المجهر وجميع الملحقات. تنظيف.

6. تحليل البيانات

ملاحظة: تحليل البيانات لهذا المقايسة يتطلب أساليب شائعة في الدراسات الفيزيائية الحيوية جزيء واحد. يمكن تحقيق جميع الخطوات المكثفة حسابيا باستخدام الخوارزميات والبرامج الموجودة (يتم تضمين المراجع أدناه في خطواتها المقابلة).

  1. اختياري: إذا كان ذلك ممكنا، قم بتحويل ملف سلسلة الصور المكتسبة إلى تنسيق متوافق مع برنامج معالجة الصور المختار أو لغة البرمجة.
  2. تحديد نقطة بداية رد فعل الترجمة ووقت تبادل الكاشف.
    ملاحظة: نظرا للأجسام المضادة الفلورية المنتشرة في مزيج الترجمة، ستزداد كثافة الإضاءة الخلفية لمنطقة مصورة أثناء تبادل الكاشف داخل القناة من المخزن المؤقت المتوافق مع الترجمة إلى مزيج الترجمة. يتم تعيين نقطة بداية رد فعل الترجمة كنقطة زمنية عند اكتمال تبادل الكاشف. تم العثور على نقطة الإكمال هذه من خلال قياس كثافة مضان الخلفية أثناء تسليم مزيج الترجمة وتحديد النقطة الزمنية عندما هضاب كثافة الفلورية المتزايدة15، كما هو موضح أدناه.
    1. احسب إجمالي عدد الفلورسينس لكل إطار صورة ورسم ملف تعريف الوقت المقابل. تحديد الزيادة المفاجئة في الفلورسينس الكلي في مؤامرة الملف الشخصي الوقت.
      ملاحظة: تعزى الزيادة الإجمالية في الإضاءة الفلورية إلى التركيز المتزايد للأجسام المضادة المسماة بالفلورسنت أثناء تبادل الكاشفات.
    2. حدد نقطة النهاية لمرحلة زيادة الفلورسينس الإجمالية وحدد هذه النقطة الزمنية كنقطة بداية (أي الوقت 0) لرد فعل الترجمة. تحديد كل من نقطة البداية والنهاية لمرحلة زيادة الفلورسينس الكلي وتعيين الفرق الزمني ككاشف وقت الصرف.
      ملاحظة: يعتمد إجمالي الفترة الزمنية للكواشف على أبعاد قناة التدفق ومعدل التدفق المحدد. فمن الممكن أن بعض عوامل الترجمة يمكن أن تبدأ ملزمة لرنا قبل اكتمال تبادل كاشف، والتي يمكن أن تقلل من قرار تحديد وقت بدء الجولة الأولى. لذلك يوصى باختبار معدلات تدفق مختلفة عند إعداد المقايسة وتحديد معدلات التدفق التي تسمح بإكمال الصرف الكاشف في غضون 3-4 ثانية لسرعات اكتساب البيانات من 0.5-2 ثانية / إطار.
  3. اختياري: تنفيذ تصحيح الانجراف الفيلم.
    ملاحظة: قد تتغير مواقع الأجسام المضادة المقيدة في صورة البيانات بمرور الوقت بسبب انجراف أجزاء المجهر والملحقات. الانجراف الذي هو ملحوظ بصريا في فيلم يتطلب تصحيح قبل المضي قدما في تحليل البيانات. تتوفر عدة خوارزميات التصحيح الانجراف المكاني والنصوص36،37،38.
    1. في كل صورة، ابحث عن الحد الأقصى المحلي في عدد البكسل لتحديد مواقع الأجسام المضادة المنضمة في كل إطار بدقة على مستوى البكسل. تعيين عتبة لعدد البكسل بحيث يتم تحديد المواقع التي تكون بوضوح فوق ضجيج الخلفية.
    2. احسب التغييرات في أوضاع الأجسام المضادة الفردية في كل اتجاه بين إطارين متتاليين للصور.
    3. رسم الرسم البياني للتغيرات الموضعية للأجسام المضادة بين إطارين متتاليين والقيام بذلك بشكل منفصل لكل اتجاه. الغاوسية تناسب كل رسم بياني وتعيين موقف مركز القمم والانجراف الاتجاهي بين إطارين متتاليين.
    4. لمواجهة الانجراف الملاحظ، حول كل إطار صورة في الاتجاه المعاكس بمقدار الانجراف المحسوب.
  4. بناء مسارات جزيء واحد.
    ملاحظة: الكشف / تتبع البرمجيات متاحة لتحديد النقاط المضيئة واستخراج كثافتها من سلسلة صورة البيانات39،40.
    1. تحديد مواقع الأجسام المضادة كما هو موضح في الخطوة 6.3.1.
      ملاحظة: يوصى بالتفتيش البصري للتأكد من أن العتبة المختارة لا تؤدي إلى الإفراط في قطف الجسيمات أو نقصها. يمكن تحقيق الفحص البصري من خلال تراكب مواقع المائد المحددة فوق كل إطار صورة وتقييم اتفاقها بصريا (انظر النتائج التمثيلية).
    2. الجمع بين الجسيمات التي تم انتقاؤها من جميع الإطارات وإزالة مواقف الجسيمات زائدة عن الحاجة.
    3. فحص بصريا صور الأجسام المضادة ملزمة وحدد منطقة مربعة مرفقة بكسل مع التهم التي هي بوضوح فوق الخلفية وممثل للأجسام المضادة ملزمة بشكل فردي.
      ملاحظة: يتم تحديد وظيفة انتشار النقطة (أي حجم المربع لجزيء واحد) من خلال الإعداد البصري وحجم بكسل الكاشف.
    4. لكل موضع جسيم، قم ببناء مسار جزيء واحد عن طريق حساب الكثافة الإجمالية لجميع وحدات البكسل في المنطقة المربعة حول موضع الجسيمات. يتم إنشاء مسارات لكل موقف، الإطار حسب الإطار، وبالنسبة للفيلم البيانات بأكملها.
  5. اختياري: تطبيق مرشح غير خطي إلى الأمام إلى الخلف41 للحد من الضوضاء الخلفية في مسارات جزيء واحد.
  6. اختياري: رقمنة المسارات مع خوارزميات الكشف عن الخطوة الموجودة42،43،44،45.
    ملاحظة: يعتمد اختيار خوارزمية الكشف خطوة على تعقيد ديناميات جزيء واحد. بالنسبة لأبسط سيناريو للترجمة الريبوسومية المعزولة فقط (أي عدم وجود تشكيل متعدد الأضلاع) ونسبة الإشارة الجيدة إلى الضوضاء ، فإن تطبيق العتبة على عدد الفلورسينس يكفي لتحديد توقيت أحداث ربط الأجسام المضادة وتفككها في مسارات جزيء واحد. يوصى بإجراء فحص مرئي لما لا يقل عن 100 مسار لكل حالة لضمان اختيار خطوات المسار بشكل مناسب من خلال استراتيجية الكشف عن الخطوات.
  7. تحديد وقت أول حدث ملزم للأجسام المضادة لكل مسار (أي وقت الوصول الأول، t1)،إما باستخدام مسارات رقمية أو تطبيق عتبة على المسارات غير الرقمية.
    ملاحظة: يمكن مقارنة القيمة الوسيطة لتوزيع وقت الوصول الأول بين شروط الترجمة المختلفة. بدلا من ذلك، يمكن تركيب توزيع وقت الوصول الأول إلى وظيفة سجل طبيعي متغيرة (3 معلمات) لتحديد متوسط القيمة15 <t1>. نظرا لأن توزيع وقت الوصول الأول عادة ما يكون منحرفا وذيله طويلا ، فلا تحسب المتوسط عن طريق المتوسط المباشر خلال أوقات الوصول الأولى الملاحظة.
  8. اختياري: يسكن تحليل الوقت وحساب متوسط معدل تخليق الببتيد.
    1. استخدم المسارات الرقمية لتحديد أحداث الترجمة أحادية (الريبوسوم الواحد) في كل مسار وحساب أوقات سكن الحدث الملزم الوحيد كفرق زمني بين أحداث ربط الأجسام المضادة المقابلة وأحداث الانفصال.
      ملاحظة: تكون خوارزميات الكشف عن الخطوات لرقمنة المسارات أقل موثوقية بشكل عام عندما تتداخل أحداث جزيئية متعددة في الوقت المناسب. ولذلك يوصى باستبعاد الأحداث المتعددة من تحليل الوقت المستفيض. بالنسبة لأنظمة الترجمة النشطة للغاية التي يتم إثراءها بالأحداث المتعددة ونادرا ما تعرض أحداثا أحادية ، يمكن استخدام مزيج من الأجسام المضادة المسماة وغير المسماة لزيادة فرصة مراقبة أحداث الترجمة المعزولة في مسارات جزيء واحد.
    2. تناسب التوزيع إلى وظيفة السجل الطبيعي واستخدام الدالة المجهزة لحساب متوسط وقت الإقامة.
      ملاحظة: لا ينصح بحساب المتوسط مباشرة عن طريق متوسط أوقات الإسهاب الملاحظة لأن توزيعات وقت الإسهاب عادة ما تكون منحرفة مع ذيول طويلة.
    3. تحديد عدد الأحماض الأمينية التي تترجم خلال وقت الربط الأجسام المضادة يسكن عن طريق طرح مجموع طول الأحماض الأمينية epitope و 35 (متوسط طول الأحماض الأمينية من الببتيد الوليدة داخل نفق الخروج ريبوسوم) من العدد الإجمالي لل codons ORF.
    4. لتحديد متوسط معدل تخليق الببتيد، قم بتقسيم عدد الأحماض الأمينية المترجمة على متوسط وقت الإقامة.
  9. اختياري: حساب متوسط وقت بدء الجولة الأولى (<t1_I>).
    ملاحظة: شروط البدء والإطالة، مثل سياق تسلسل موقع البدء وتسلسل الترميز، يتم الحفاظ عليها بشكل عام عن عمد لدراسات الحركية الاستهلالية. لذلك، متوسط وقت الوصول الأول <t1> من الخطوة 6.7. يمكن استخدامها مباشرة لحساب التغيير في حركية بدء الجولة الأولى بين ظروف مختلفة. التصحيح التالي ضروري فقط لتحديد القيمة الفعلية لوقت البدء في الجولة الأولى.
    1. تقسيم مجموع طول epitope و 35 (متوسط طول الأحماض الأمينية من الببتيد الوليدة داخل نفق الخروج ريبوسوم) على متوسط معدل توليف الببتيد (من الخطوة 6.8.4.) لحساب متوسط وقت استطالة الببتيد من هذه المنطقة N-المحطة الطرفية (<ر1_tag>).
    2. بما أن وقت الوصول الأول هو مجموع وقت بدء الجولة الأولى و t1_tag، طرح <t1_tag> من متوسط وقت الوصول الأول <t1> لحساب متوسط وقت بدء الجولة الأولى <t1_I>: <t1_I> = <t1> - <t1_tag>

7. معايرة المقايسة

ملاحظة: تنفيذ خطوات المعايرة التالية عند تأسيس المقايسة في البداية.

  1. لفحص خصوصية ربط الأجسام المضادة، قم بتنفيذ خطوات البروتوكول في القسمين 4 و5 بشكل منفصل ل mRNAs غير الموسومة والموسومة (الشكل 2). تمثل مستويات ربط الأجسام المضادة في القنوات مع هذه الرنانات المعنية مدى ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة بسطح الكشف والأجسام المضادة المحددة الملزمة للببتيد الوليد.
    ملاحظة: يوصى بأن تكون نسبة الربط المحددة إلى غير المحددة >10 ويمكن زيادتها مع استراتيجيات مختلفة لتخميل السطح أو تركيز أقل للأجسام المضادة أو كثافة سطح مرنا أعلى.
  2. لقياس معدل ربط الأجسام المضادة، نفذ البروتوكول بخطوة إضافية بين الخطوة 4 والخطوة 5.
    1. بعد الخطوة 4، احتضان القناة مع خليط الترجمة التي تفتقر إلى الأجسام المضادة لتوليد ما قبل مرنا / ريبوسوم / مجمعات الببتيد.
    2. ثم انتقل إلى الخطوة 5 وتدفق خليط الترجمة المكمل للأجسام المضادة إلى القناة.
    3. قياس متوسط معدل ربط الأجسام المضادة للببتيد الوليدة التي تم إنشاؤها مسبقا مع تركيب الأسي لأول مرة وصول الرسم البياني.
      ملاحظة: يجب أن يكون ربط الأجسام المضادة بالببتيد الذي تم إنشاؤه مسبقا سريعا ، حسب ترتيب الثواني ، ويجب أن يكون أسرع من حركية الترجمة. يمكن استخدام تركيز أعلى للأجسام المضادة لزيادة معدل ربط الأجسام المضادة.
  3. قابلية التصوير الضوئي للأجسام المضادة المسماة بالفلوروفور.
    1. إعداد شريحة وفقا للبروتوكول في الخطوة 2 ولكن تخطي خطوة PEGylation. تجميع غرفة التدفق بعد خطوة الملوحة. طلاء السيلان يسمح كفاءة الأجسام المضادة غير محدد ملزمة لسطح الكشف.
    2. أضف الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية إلى القناة لتحقيق كثافة جزيء واحد من الأجسام المضادة غير المحددة الملزمة لسطح الكشف. ابدأ بإضافة الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية المخففة للغاية في مخزن غسيل T50 وزيادة تركيز الأجسام المضادة تدريجيا حتى يتم تحقيق كثافة جزيء واحد المطلوبة.
    3. صورة سطح الكشف حتى معظم مضان الأجسام المضادة لم يعد يمكن الكشف عنها.
    4. رسم العدد الإجمالي للأجسام المضادة المرئية مع مرور الوقت لتقييم معدل فقدان مضان الأجسام المضادة بسبب التوهج الضوئي.
      ملاحظة: عادة ما ينتج عن وضع العلامات على الأجسام المضادة فلوروفوريس متعددة لكل الأجسام المضادة. تبقى الأجسام المضادة الفردية قابلة للكشف حتى جميع الفلوروفوريس المترافق photobleach.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد البروتوكول الموصوف يتيح التصوير من التفاعلات الأجسام المضادة الفردية مع الوليدة N-الطرفية الموسومة polypeptides مع قرار جزيء واحد خلال ترجمة نشطة خالية من الخلايا من 3 'نهاية المربوطة مراسل مرنا (الشكل 1). يتم الإبلاغ عن تجربة مظاهرة الحد الأدنى مع استخدام ثلاثة mRNAs الاصطناعية: LUC (ترميز لوسيفيراز غير الموسومة), LUCFLAG (ترميز 3xFLAG الموسومة لوسيفراز), وHP-LUCFLAG (LUCFLAG مع مستقر الجذعية حلقة في المنطقة زعيم 5' ( الشكل2C). ويتيح استخدام الحمض النووي الريبي المشفر للوسيفيراز إجراء مقارنات بين عمليات رصد جزيء واحد وقياسات التلألأ السائبة. تم تقييم سلامة 3 'الحمض النووي الريبي البيوتينية من قبل إزالة الفلورة هلام البولي أكريلاميد (PAGE) وتلطيخ الحمض النووي الريبي. يظهر مرنا ذات نوعية جيدة شريط نظيف واحد وينبغي أن لا تظهر إشارات ترحيل أسرع إضافية(الشكل 3A). Saccharomyces cerevisiae استخراج الترجمة استخدمت هنا وأعدت بعد البروتوكول الذي سبق وصفه30 وتعديل15. القياسات السائبة للنشاط لوسيفيراز في ردود الفعل ترجمة خالية من الخلايا مع استخراج الخميرة وbiotinylated LUCFLAG مرنا إما يفتقر أو يحتوي على قبعة م7G يظهر تحفيز الغطاء من ترجمة الجيش الملكي النيبالي LUCFLAG ( الشكل3B).

للتصوير أحادي الجزيء، تم استكمال مستخلص الترجمة ب 67 nM من الأجسام المضادة FLAG المسماة Cy3 (Cy3-αFLAG). وكان هذا الجسم المضاد نسبة وضع العلامات عالية من 2-7 الأصباغ لكل الأجسام المضادة. تم تعيين الليزر 532 نانومتر إلى 10 ميكروواط في الهدف. تم تعيين زاوية حادث الليزر إلى 71.5 درجة ، والتي كانت أكبر من الزاوية الحرجة البالغة 63.8 درجة لإعدادنا. تم تصوير مستوى منخفض من الفلورسينس من أسطح الكشف التي تحتوي على مرنا ولكن تفتقر إلى مزيج الترجمة(الشكل 4A). بالنسبة لأبعاد القناة التي تبلغ حوالي 2 مم (عرض) × 50 ميكرومتر (العمق) × 24 مم (الطول)، أسفر معدل تسليم التدفق الذي يبلغ 150 ميكرولتر/دقيقة عن وقت تبادل للكواشف من 3 إلى 4 ثانية. في غضون 5 ق من تسليم مزيج الترجمة ، ويزيد مستوى الفلورية الخلفية بسبب نشر الأجسام المضادة الفلورسنت. حوالي 2 دقيقة بعد تسليم مزيج الترجمة إلى قنوات LUCFLAG التي تحتوي على الحمض النووي الريبي ، بدأت بقع Cy3 في الظهور في مجال الرؤية واستمرت في التراكم لمدة ~ 30 دقيقة (الشكل 4B). الأجسام المضادة غير محددة ملزمة للسطح، وقياسها باستخدام 3xFLAG تفتقر إلى الحمض النووي الريبي لوك (الشكل 2C)،ظلت عند مستوى منخفض جدا15. الإشارات من مرنا / ريبوسوم / الببتيد ملزمة Cy3 - αFLAG كانت واضحة للعيان مع زاوية الحادث الليزر الأمثل ولكن يمكن أن تكون ملثمين من قبل خلفية مضان عالية مع زوايا أقل حادث ليزر(الشكل 4C).

لتحليل الأحداث الملزمة Cy3-αFLAG، تم حساب شدة الفلورسينس من بقع Cy3-αFLAG المختارة(الشكل 5A)إطارا بإطار للفيلم بأكمله ثم تم توصيلها لتشكيل مسار كثافة(الشكل 5B). يمكن أن تظهر المسارات الخام صاخبة وقد تتطلب التحسين باستخدام فلتر غير خطي إلى الأمام إلى الخلف لتقليل ضوضاء الخلفية41. ويمكن تحقيق مزيد من الصقل باستخدام خوارزميات الكشف عن الخطوة لرقمنة المسارات42. وبالنسبة لجميع المسارات، تظهر زيادة عالمية في مستوى مضان الخلفية أثناء تبادل الكاشفات بسبب الأجسام المضادة الفلورية المنتشرة في مزيج الترجمة(الشكل 5B). الأجسام المضادة ملزمة لتعدد الببتيد الوليدة تسبب زيادة فورية في الفلورسينس في حين أن الأجسام المضادة / التفكك polypeptide من الحمض النووي الريبي يسبب انخفاض مضان لحظي(الشكل 5B).

يمكن استخدام وقت الإسهاب في ربط الأجسام المضادة لقياس إجمالي وقت فك ترميز إطار القراءة المفتوح. الرسم البياني الوقت يسكن ل LUCFLAG مرنا يناسب توزيع سجل طبيعي ( الشكل6A) وأسفرت عن معدل توليف الببتيد من 2.5 ± 0.1 الأحماض الأمينية في الثانية15. في المرة الأولى وصول الرسم البياني يناسب وظيفة تحول (3 معلمة) سجل طبيعي (الشكل 6B). يظهر الانتشار الواسع لأول مرة وصول المدرج التكراري درجة عالية من التغايرية في نشاط ترجمة مرنا واحد. وأشار الرسم البياني إلى أن أول حدث توليف الببتيد على جزيئات واحدة LUCFLAG مرنا يمكن أن تبدأ في وقت مبكر من 2 دقيقة، وفي وقت متأخر من 20 دقيقة، بعد تسليم مزيج الترجمة(الشكل 6B). بالمقارنة مع الترجمة مع LUCFLAG mRNA، أظهرت أول مرة وصول الرسم البياني مع HP-LUCFLAG mRNA الترجمة أبطأ ملزمة الأجسام المضادة(الشكل 7A). باستخدام قياسات التسلية السائبة من ردود الفعل الترجمة الخالية من الخلايا مع هذه mRNAs نفسه، ومع ذلك، لا يحل الاختلافات في الحركية الترجمة(الشكل 7B، C). تظهر هذه النتائج دقة أعلى لطريقتنا مقارنة بقياسات نشاط لوسيفيراز الحركية السائبة للكشف عن التغيرات الصغيرة في حركية البدء.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تدفق البروتوكول. يتم عرض التمثيلات التخطيطية لإعداد الأغطية والانزلاق ، وتجميع غرفة جزيء واحد ، والتصوير TIRF والحصول على البيانات ، وخطوات تحليل البيانات. تتضمن خطوة التصوير TIRF تصوير تخطيطي لشل حركة الحمض النووي الريبي والترجمة في قناة تدفق. يتم الإشارة إلى مكونات سطح الكشف والأجسام المضادة المسماة بالفلورسنت ومكونات استخراج الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تصاميم مرنا لل المقايسة جزيء واحد. (أ)لتكييف مقايسة الترجمة السائبة إلى المقايسة أحادية الجزيء، تم تعديل قالب الحمض النووي للمراسل السائب ORF مع إدراج تسلسل علامة epitope N-terminal لتوليد ORF ترميز المراسل الموسومة. يتم الإشارة إلى مناطق ترميز العلامة ORF وN-terminal. (ب) كانت mRNAs 5′-m7G توج للسماح الترجمة المعتمدة على الغطاء و3′-biotinylated لشل الحركة إلى سطح الكشف عن جزيء واحد. 5′-M7قبعة G و 3′-البيوتين يشار إليها على غير الموسومة والمعلمة ORF RNAs. (ج)تم استخدام MRNAs ترميز لوسيفيراز لإثبات المقايسة جزيء واحد. LUC و LUCFLAG mRNAs ترميز لوسيفيراز الذي يفتقر ويحتوي على علامة N-terminal 3xFLAG، على التوالي. يحتوي HP-LUCFLAG mRNA على إدراج إضافي يقدم بنية ثانوية دبوس الشعر في LUCFLAG mRNA 5′-leader. وtherstability دبوس، 3′-بولي(A) الذيل، ويشار إلى 3′-البيوتين. وشملت جميع mRNAs الثلاثة ذيل 30 NT 3′-poly(A) لترجمة أكثر كفاءة تعتمد على الغطاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: واحد جزيء مراسل ميرنا سلامة والترجمة السائبة. (أ) ممثل إزالة التصوير PAGE من mRNA مراسل جزيء واحد. 5′-M7G توج و 3′-biotinylated تم تحميل لوسفلاج مرنا على هلام البولي أكريلاميد 10٪ إلى جانب سلم الجيش الملكي النيبالي. (ب)حافظ مراسل جزيء واحد مرنا على اعتماد 5'cap-dependence في ردود فعل الترجمة الخالية من الخلايا السائبة. 3′-biotinylated LUCFLAG مرنا التي تفتقر إما (-كاب) أو الواردة (+ كاب) تمت ترجمة 5′-m7G cap في S. cerevisiae استخراج الترجمة لمدة 30 دقيقة في 25 درجة مئوية. تم قياس نشاط لوسيفيراز من ردين فعل مستقلين وتم تطبيعه مع -cap mRNA ، والذي تم تعيينه بشكل تعسفي إلى 1.0. تتم الإشارة إلى الانحرافات المعيارية عن قيم الوسط بواسطة أشرطة الخطأ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تصوير أسطح الكشف التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المشل الحركة. (أ)تفلور الخلفية في غياب مزيج الترجمة. (ب) Cy3 بقع الفلورسنت في مجال الرؤية 30 دقيقة بعد تسليم مزيج الترجمة ومع زاوية حادث ليزر الأمثل. (ج) صورة مجال الرؤية 30 دقيقة بعد تسليم مزيج الترجمة ومع انخفاض زاوية الحادث الليزر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تحليل الصورة. (أ) بقع Cy3 في مجال الرؤية دون (اللوحة اليسرى) أو مع (اللوحة اليمنى) تحديد بقعة. (ب)مثال مسار جزيء واحد لبقعة Cy3 مختارة. يشير السهم الأسود إلى الارتفاع في مضان الخلفية بسبب نشر الأجسام المضادة أثناء تسليم مزيج الترجمة. يشير السهم الأخضر إلى الزيادة المفاجئة في كثافة الفلورسينس بسبب ربط Cy3-αFLAG. يشير السهم الأحمر إلى الانخفاض المفاجئ في كثافة الفلورسينس بسبب انفصال الببتيد Cy3-αFLAG/nascent عن الحمض النووي الريبي. يشار إلى وقت الإسهاب لحدث ربط Cy3-αFLAG بسهم برأسين. يتم الإشارة إلى البيانات الخام والمصفاة والرقمنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التحليل الحركي لربط Cy3-αFLAG مع ترجمة LUCFLAG mRNA. (أ)الربط Cy3-αFLAG يسكن الوقت المدرج التكراري يناسب توزيع سجل طبيعي. (ب)ربط Cy3-αFLAG أول وصول الوقت المدرج التكراري يناسب وظيفة تحول (3 معلمة) السجل العادي. مقتبس من وانغ وآخرون15 بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: يحتوي المقايسة أحادية الجزيء على دقة أعلى لحركية البدء من المقايسة التلألؤ السائبة. (أ)أول وقت وصول المدرجات التكرارية لCy3-αFLAG ملزمة مع ترجمةالعلم لوس وHP-LUCالعلم mRNAs كشفت بدء أبطأ الناجمة عن هيكل دبوس الشعر الصغيرة في 5′-الزعيم مرنا. N = 10650 مسارات (LUCFLAG), مجتمعة من 3 مجموعات البيانات وN = 4079 مسارات (HP-LUCFLAG), مجتمعة من 2 مجموعات البيانات. (B, C) لم تحليل نشاط لوسيفيراز السائبة القياسات الحركية تحليل الاختلافات في حركية بدء ل LUCFLAG (N = 9 مجموعات البيانات) وHP-LUCFLAG (N = 6 مجموعات البيانات) ترجمة مرنا. (ب) حركية التلألؤ السائب. (C) مبعثر المؤامرات من الجولة الأولى أوقات الترجمة التي يحددها الغاوسي المناسب للمشتق الثاني من منحنيات الحركية التلألؤ في (ب)، كما وصفها فاسيلينكو وآخرون. 46.تمثل الدوائر والأشرطة الحمراء في(C)متوسط القيمة والانحراف المعياري لوقت الترجمة الجولة الأولى المحسوبة، على التوالي. مقتبس من وانغ وآخرون15 بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بالمقارنة مع التجارب النموذجية في المختبر TIRF جزيء واحد، والتصوير جزيء واحد مع المقايسة الموصوفة هنا معقدة بالإضافة إلى ذلك بسبب استخدام استخراج الخلية وتركيز عال من الأجسام المضادة المسمى فلوريا. بالمقارنة مع الممارسة الأكثر شيوعا لجولة واحدة من PEGylation السطح، جولة ثانية من PEGylation (الخطوة 2) يقلل إلى حد كبير ملزمة الأجسام المضادة غير محددة للكشف عن السطح15. التركيز العالي لنشر الأجسام المضادة الفلورية يسبب خلفية فلورية عالية للغاية تخفي الكشف عن جزيء واحد من ربط الأجسام المضادة. للحد من هذه الخلفية الفلورية ، يتم زيادة زاوية حادث الليزر أعلى بكثير من الزاوية الحرجة (الخطوة 3.4). كما يتضاءل اكتشاف الأجسام المضادة بسبب عدم الاستقرار المفرط في الفلوروفور، الذي يمكن أن يحد من القدرة على تحديد وقت الإقامة. عند مواجهة هذه المشكلة، استبدل الفلوروفور بفلوروفور أكثر قوة، مثل تلك المقترنة ب quencher47ثلاثي الحالة، أو خفض كثافة إضاءة الليزر. على الرغم من أن تستخدم عادة نظم مسح الأكسجين في المختبر تجارب جزيء واحد لقمع الفلوروفور photobleaching48،49، يمكن أن يوفر الفحص الموصوف هنا نافذة كشف سخية جدا دون تنفيذ أي أنظمة مسح الأكسجين15. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تقلل أنظمة مسح الأكسجين بشكل كبير من كفاءة الترجمة الخالية من الخلايا eukaryotic. ولذلك، ينبغي تقييم نظم مسح الأكسجين بعناية قبل استخدامها مع هذا المقايسة.

من المهم الإشارة إلى أن الاختلافات الصغيرة في إعداد الكاشف يتم اكتشافها عن طريق الفحص بسبب دقة جزيء واحد. على سبيل المثال، النسخ المتماثل تحضيرات استخراج الترجمة يمكن عرض الأنشطة المختلفة التي قد أو قد لا يمكن الكشف عنها بواسطة أساليب مجمعة. وعلاوة على ذلك، يمكن لدورات التجميد والذوبان لاستخراج الترجمة وغيرها من الكواشف أن تعوق بسرعة نشاط الترجمة. نوصي بإجراء تجارب تجريبية صغيرة النطاق مع مواد يمكن الوصول إليها بسهولة لاختبار الظروف قبل التخطيط لدراسة منهجية. من أجل دراسة منهجية، يوصى بالتحضيرات واسعة النطاق لكواشف الترجمة، والاقتباسات أحادية الاستخدام للكواشف الحساسة للتجميد/الذوبان، والاتساق في تنفيذ خطوات البروتوكول. استخراج الترجمة التي فلاش المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية يظهر الحد الأدنى من فقدان النشاط لمدة عامين على الأقل. تطبيق هذه التدابير يمكن قمع الاختلافات التجريبية على نحو فعال وزيادة قوة المقايسة جزيء واحد.

وبما أن هذه الطريقة تجمع بين أنظمة الترجمة السائبة الخالية من الخلايا وتقنيات التصوير أحادية الجزيء في المختبر، فإن استكشاف الأخطاء وإصلاحها للمشاكل العامة في هذين المجالين لا يناقش هنا. وتشمل الأمثلة على هذه القضايا العامة الاستعدادات منخفضة الجودة لمراسل مرنا أو PEGylated coverlip وانخفاض نشاط الترجمة لاستخراج الخلية. هنا، سوف نركز على القضايا المحددة لهذه الطريقة. بالإضافة إلى العديد من المسائل التقنية التي تمت مناقشتها في البروتوكول، قد تكون هناك مشكلة محتملة أخرى منخفضة أو عدم ربط أي شخص مضاد في قناة التدفق لحالة ترجمة من المتوقع أن يكون لها نشاط جيد. هناك العديد من الاحتمالات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. يمكن تقييم كفاءة شل الحمض النووي الريبي البيوتيني إلى سطح الكشف عن طريق تمليك أوليغومرات الحمض النووي التكميلية والمقترنة بالفلوروفوري إلى الحمض النووي الريبي غير المشلول وتصوير الحمض النووي الفلوري: الدوبلس الحمض النووي الريبي. ويمكن التحقق من جودة مزيج الترجمة وmRNAs مراسل البيوتينية عن طريق تشغيل المقايسة الترجمة السائبة. وعلاوة على ذلك، بعد تنفيذ رد فعل الترجمة في قناة تدفق mRNA معطلة، يمكن إخراج حل رد فعل الترجمة من القناة واستخدامه في فحص نشاط المراسل لتأكيد حدوث الترجمة داخل القناة. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام كثافة سطح مرنا عالية للغاية لرد فعل الترجمة داخل القناة للسماح بالكشف الأسهل من خلال فحص نشاط المراسل.

القيد الرئيسي لهذا المقايسة هو قرارها لحركية البدء. في هذا المقايسة ، يحتوي الإخراج التجريبي المباشر ، لأول مرة وصول ، على كل من وقت البدء في الجولة الأولى ووقت استطالة الببتيد لترجمة الظهارة و 35 كودون إضافي. على الرغم من أن مساهمة وقت استطالة الببتيد يمكن تصحيحها (الخطوة 6.9.) ، فإن هذا المقايسة هي بالتالي الأكثر حساسية لقياس حركية البدء التي تحدث في ترتيب الدقائق ، والتي يبدو أنها خاصية عامة للبدء المعتمد على الحد الأقصى15. من الناحية التجريبية ، من السهل تكييف هذا المقايسة لدراسة آليات البدء الأخرى. ومع ذلك ، إذا كانت آلية بدء يحدث بسرعة كبيرة على ترتيب الثواني ، وهذا المقايسة من غير المرجح أن تحل الحركية بدء.

يجمع نهج الجزيء الواحد الموصوف هنا بين التصوير أحادي الجزيء والترجمة القائمة على الاستخراج لتمكين قياسات أحداث الترجمة الفردية المعتمدة على الغطاء في الوقت الفعلي وأثناء الترجمة النشطة الخالية من الخلايا. يسمح المقايسة بالانتقال بسهولة من فحص الترجمة السائبة إلى المقايسة ذات الجزيء الواحد ، مع الحفاظ على حركية الترجمة السائبة. وهكذا، يمكن تفسير الملاحظات الحركية ذات الجزيء الواحد في إشارة مباشرة إلى النتائج السائبة المقابلة. الأساليب السابقة، بما في ذلك التي وضعت مؤخرا في الحي النهج11،12،13،14، تفتقر إلى القرار لقياسات الحركية للأحداث بدء الترجمة الفردية وتتطلب افتراضات آليات الترجمة لاستخراج متوسطات وقت البدء من المقاييس التجريبية. توفر طريقة الجزيء الواحد المعروضة هنا أول نهج خال من الفرضيات لتحديد متوسط وقت بدء الترجمة النشطة المعتمدة على الغطاء. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن القياسات الحركية السائبة مع المقايسة التلألؤ قد استخدمت لتوفير الأوصاف السائبة الأكثر كمية ومنهجية من الحركية الترجمة تعتمد على الحد الأقصى حتى الآن46،50،المقايسة جزيء واحد وصفها هنا يقيس متوسط التغيرات الحركية بدء مع حساسية أكبر من المقايسة السائبة(الشكل 7). وبالإضافة إلى ذلك، تحافظ بيانات الجزيء الواحد على استوشاستية ترجمة مرنا واحدة وتغايريتها، وهي خصائص يتم متوسطها في القياسات السائبة. يمكن استخدام دقة جزيء واحد من حركية الترجمة للتحليلات الحركية المنهجية للكشف عن رؤى آليات الترجمة التي لا يمكن تحقيقها مع أساليب أخرى.

ويتوافق هذا المقايسة مع النهج البيوكيميائية والجينية القائمة التي تستخدم عادة في دراسات الترجمة. فعلى سبيل المثال، يمكن دراسة الوظيفة التحويلية لعامل معين عن طريق توليد استخراج مستنفد للعامل واستكماله بعامل من النوع البري أو المتحول. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال استكمال عامل المسمى fluorescently، يمكن للدراسات يحتمل التحقيق في العلاقة الحركية بين عامل ملزم وتطور الترجمة. مع استخدام اثنين من أزواج epitope / الأجسام المضادة متميزة ، يمكن توسيع هذا البروتوكول من فحص لون واحد إلى فحص لونين التي تمكن من الكشف في وقت واحد من تسلسلين الترميز متميزة. ومن شأن هذا التكيف أن يسمح بتتبع ترجمة أطر القراءة المختلفة ويمكن تطبيقه على دراسات تحويل الإطارات وبدء اختيار الموقع. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام نظام ذو لونين للكشف عن تفاعلات الأجسام المضادة مع البوليبتيدات الموسومة المشفرة بواسطة إطارات القراءة المفتوحة في المنبع والمصب لرصد أحداث الترجمة في المنبع والمصب على الرنانات الفردية. ويمكن لهذه التوسعات تمكين مجموعة واسعة من الدراسات الميكانيكية التي تحقق في الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وتنظيمها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة [R01GM121847]؛ مركز سلون كيترينج التذكاري للسرطان (MSKCC) منحة الدعم / المنحة الأساسية (P30 CA008748); ومبادرة MSKCC لعلم الجينوم الوظيفي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
  3. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
  4. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
  5. Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
  6. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
  8. Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
  9. Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
  10. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  11. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  12. Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
  13. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  14. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  15. Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6 (2020).
  16. Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
  17. Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
  18. Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
  19. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
  20. Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
  21. Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
  22. Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
  23. Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
  24. Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
  25. Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
  26. Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
  27. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
  28. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24 (2019).
  29. Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
  30. Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
  31. Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
  32. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  33. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  34. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  35. Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
  36. Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
  37. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
  38. Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
  39. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
  40. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  41. Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
  42. Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
  43. Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
  44. Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
  45. White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357 (2020).
  46. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
  47. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
  48. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  49. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
  50. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 163، الترجمة eukaryotic الخالية من الخلايا، حركية الترجمة أحادية الجزيء، التصوير الفلوري في المختبر، بدء الاعتماد على الغطاء، التحكم في الترجمة، في الفحص المختبري
اختبار تصوير أحادي الجزيء <em>في المختبر</em> لتحليل حركية الترجمة المعتمدة على الغطاء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In … More

Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter