Summary
מעקב אחר אירועי תרגום בודדים מאפשר מחקרים קינטיים ברזולוציה גבוהה של מנגנוני תרגום תלויי כובע. כאן אנו מדגימים מבחנה במבחנה של מולקולה אחת המבוססת על אינטראקציות הדמיה בין נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית לפפטידים המתהווים המתויגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולה אחת של קינטיקה של חניכה והתארכות פפטיד במהלך תרגום פעיל תלוי כובע במבחנה.
Abstract
סינתזת חלבונים תלוית כיפה היא מסלול התרגום השולט בתאים אוקריוטיים. בעוד גישות ביוכימיות וגנטיות שונות אפשרו מחקרים מקיפים של תרגום תלוי כובע והרגולציה שלה, אפיון קינטי ברזולוציה גבוהה של מסלול תרגום זה עדיין חסר. לאחרונה, פיתחנו מבחנה במבחנה למדידת קינטיקה תרגום תלוית כובע עם רזולוציה של מולקולה אחת. ההסתייגות מבוססת על נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית המחייבים לפוליפפטיד המתהווה עם תווית אפיטופ. על ידי הדמיה של קשירה וניתוק של נוגדנים אל ומן מתחמי פפטיד-ריבוזום-mRNA המתהווה, ניתן לעקוב אחר התקדמות התרגום על mRNAs בודדים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת בדיקה זו, כולל הכנות שקופיות mRNA ו PEGylated, הדמיה בזמן אמת של תרגום, וניתוח של מסלולי מולקולה אחת. בדיקה זו מאפשרת מעקב אחר אירועי תרגום בודדים התלויים בכובע ופותרת קינטיקה של תרגום מרכזי, כגון שיעורי חניכה והתארכות. ניתן ליישם את ההסתעפות באופן נרחב על מערכות תרגום נפרדות, והיא אמורה להפיק תועלת נרחבת ממחקרים במבחנה של קינטיקה של תרגום תלוי כובע ומנגנוני בקרה תרגום.
Introduction
תרגום במערכות אוקריוטיות מתרחש בעיקר באמצעות מסלולים תלויי כובע 7-מתילגואנוסין (m7G)1. מחקרים מראים כי שלב החניכה של תרגום אוקריוטי הוא הגבלת שיעור ויעד נפוץ לתקנה2,3,4. מנגנונים של תרגום תלוי כובע נחקרו בהרחבה באמצעותגנטיקה 5, ביוכימי6,7,8, מבני9, וגנומי10 גישות בתפזורת. למרות ששיטות אלה זיהו מנגנונים מגוונים המווסתים חניכה תלוית כובע, הרזולוציה שלהם מגבילה אותם לממוצע של אותות מאירועי חניכה הטרוגניים ואסינכרוניים. לאחרונה, בודדים באירועי תרגום vivo כבר דמיינו על ידי שיטות למדוד נוגדנים פלואורסצנטי מחייב אפיטופים על פוליפפטידים המתהווה11,12,13,14. עם זאת, גישות חדשות אלה מוגבלות גם ביכולתן לפתור אירועי חניכה בודדים מכיוון שנוגדנים פלואורסצנטיים מרובים חייבים לקשור פפטיד מתפתח כדי לאפשר פענוח אירועי תרגום יחיד מרקע פלואורסצנטי תאי גבוה. באינטראקציות ביולוגיות רבות, אירועים קינטיים אינדיבידואליים שנפתרו סיפקו תובנות קריטיות להבנת תהליכים ביולוגיים מורכבים ורב-שלביים שחוזרים על עצמו, שלא ניתן לסנכרן ברמה המולקולרית. שיטות חדשות שיכולות לעקוב אחר הדינמיקה של אירועי תרגום בודדים נדרשות להבנה טובה יותר של ייזום ורגולציה תלויי כובע.
לאחרונה פיתחנו מבחנה במבחנה המודדת קינטיקה חניכה תלוית כובע עם רזולוציה של מולקולה אחת15. בהתחשב במספר הגדול של גורמי חלבון ידועים ולא ידועים המעורבים במסלול חניכה זה3,16, מבחני המולקולה הבודדת פותחו כדי להיות תואמים למערכות תרגום קיימות ללא תאי במבחנה כדי ליהנות משימור גורמים תאיים ופעילות תרגום חזקה17,18,19,20,21,22,23,24,25. יתר על כן, השימוש במערכות תרגום ללא תאים מאפשר השוואות תואמות יותר בין תצפיות של מולקולות בודדות לבין תוצאות קודמות בצובר. גישה זו מספקת שילוב ישיר קדימה של תובנות קינטיות חדשות של מולקולה אחת למסגרת המכניסטית הקיימת של חניכה תלוית כובע. כדי להקים את מבחני המולקולות הבודדות, מערכת התרגום המסורתית נטולת התאים משתנה בשלוש דרכים: רצף קידוד אפיטופ מוכנס בתחילת מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של mRNA כתב; הסוף 3′ של הכתב mRNA הוא biotinylated כדי להקל על mRNA קצה קשירה למשטח זיהוי מולקולה אחת; ונוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית מתווספים לתמצית התרגום. שינויים אלה דורשים רק טכניקות ביולוגיה מולקולרית בסיסיות ריאגנטים זמינים בדרך כלל. יתר על כן, שינויים אלה ותנאי הדמיה של מולקולה אחת לשמר את קינטיקה תרגום של תגובות תרגום ללא תאים בתפזורת15.
ב assay זה (איור 1), 5′-end כתרים ו 3′-end biotinylated כתב mRNA משותק למשטח זיהוי מצופה סטרפטבידין בתא זרימה. תא הזרימה מתמלא לאחר מכן בתערובת תרגום נטולת תאים בתוספת נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית. לאחר תרגום mRNA התרחשה במשך כ 30-40 קודונים במורד הזרם של רצף האפיטופ26,27, האפיטופ עולה מנהרת היציאה ריבוזום הופך נגיש לאינטראקציה עם נוגדן שכותרתו פלואורסצנטית. אינטראקציה זו מהירה וזיהוי שלה על ידי טכניקות הדמיה פלואורסצנטיות של מולקולה אחת מאפשר מעקב אחר קינטיקה תרגום ברזולוציה של מולקולה אחת במהלך תרגום פעיל ללא תאים. בדיקה זו צריכה להפיק תועלת רחבה במחקרים במבחנה של קינטיקה תרגום תלוי כובע ורגולציה שלה, במיוחד עבור מערכות עם צובר עובד במבחנה.
תנאי מוקדם להקמת בדיקה זו של מולקולה אחת הוא בדיקה תרגום ללא תאים בתפזורת עובד, אשר ניתן להשיג באמצעות תמצית תרגום כי הוא גם זמין מסחרית או מוכן בעקבות שיטות שתוארו בעבר28. תמצית תרגום אוקריוטי ניתן להשיג מתאים מגוונים, כולל פטריות, יונקים, צמח28. להדמיה, מבחנים אלה דורשים מיקרוסקופ TIRF המצויד בעוצמת לייזר מתכווננת וזווית אירוע, שלב מדגם ממונע, מערכת נוזלים ממונעת ומכשיר בקרת טמפרטורה לדוגמה. דרישות כאלה הן גנריות עבור ניסויים מודרניים במבחנה מולקולה אחת TIRF וניתן להשיג באופן שונה. הניסוי המוצג כאן משתמש במערכת TIRF מסוג אובייקטיבי המורכבת ממיקרוסקופ, תוכנה ואביזרים זמינים מסחרית, כולם רשומים בטבלת החומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דור הכתב mRNA
- שנה תבנית שעתוק DNA המקודד mRNA כתב "לא מתויג" בתפזורת על-ידי הוספת רצף קידוד תגים של N-terminus כדי ליצור תבנית שעתוק DNA עבור mRNA כתב "מתויג"(איור 2A).
הערה: אינטראקציה של 3xFLAG/anti-FLAG מומלצת לבדיקה זו בשל הרגישות המעולה שלה ואורך התג הקצר של 3xFLAG. עם זאת, ההסתעפות תואמת לזוגות אפיטופים/נוגדנים אחרים. - לסנתז RNAs מתויגים ולא מתויגים באמצעות תבניות DNA ליניאריות וערכת שעתוק במבחנה (ראה טבלת חומרים). בדרך כלל, 10-20 pmol של RNA מועתק במבחנה מספיק לעיבוד RNA הבאים כדי לאפשר מחקר שיטתי מולקולה אחת.
- כיפה RNA 5′ סוף (איור 2B)עם ערכת m7G capping (ראה טבלה של חומרים)בעקבות המלצת היצרן.
- ביוטינילאט RNA 3′ סוף (איור 2B)באמצעות ערכת biotinylation (ראה טבלה של חומרים)לפי הפרוטוקול המסופק עם הערכה. לטהר RNAs על ידי מיצוי פנול כלורופורם ואחריו טיהור עם עמודת ספין. Elute RNA ב 10-20 μL של מים ללא RNase. כ 40-50% של RNA קלט לא מנוצל הוא התאושש.
- להעריך שלמות RNA וריכוז על ידי denaturing אלקטרופורזה ג'ל אקרילאמיד וכתמים RNA, כפי שתואר קודם לכן29.
- בצע תרגום ללא תאים בתפזורת30 עם 3′-end-biotinylated מתויג כתב mRNA כדי לאשר כי mRNA שונה משמר את מאפייני התרגום כי הם מעניינים. לדוגמה, תרגום תלוי כובע יכול להיות מאושר על ידי מדידה והשוואה של פעילויות כתב בתגובות תרגום ללא תאים בתפזורת עם mRNAs כתב לא מנוצל וכתרים (ראה תוצאות מייצגות).
2. הכנת תא זרימה
- בחר עובי כיסוי מתאים, כפי שצוין על-ידי גיליון המפרט של האובייקט המיקרוסקופ. בחר שקופית זכוכית או קוורץ עבור מערכות הדמיה פלואורסצנטיות השתקפות פנימית (TIRF) מסוג אובייקטיבי או פריזמה31, בהתאמה.
- בצע ניקוי, מליחות, PEGylation, הרכבה קאמרית של coverslip ושקופית בעקבות הפרוטוקול המתואר על ידי Chandradoss ואח'32 עם השינויים הבאים.
- לשטוף שקופיות המכילות חורים שנקדחו ב 10% אבקת נוזל אלקליין (v / v) במשך 20 דקות עם sonication. שלב את השקופיות והכיסויים עבור כל שלבי הניקוי הנותרים.
- דלג על שלב שטיפת האצטון. להאריך את זמן הדגירה תחריט פיראנה מ 20 דקות עד 1 שעה. דגירה PEGylation בסיבוב הראשון עבור 3 שעות. דגירה בסיבוב השני PEGylation עם MS(PEG)4 עבור 3 שעות.
3. הכנת ציוד
- לפחות 3 שעות לפני ביצוע ניסוי מולקולה אחת, להפעיל את החממה מיקרוסקופ ולהפחית את זרימת האוויר לקצב נמוך, כדי למנוע הפרעה אקוסטית מוגזמת של ניסויים. הגדר את טמפרטורת החממה לטמפרטורה האופטימלית עבור מערכת התרגום ללא תאים.
הערה: התרגום רגיש מאוד לטמפרטורה. טמפרטורת התגובה האופטימלית היא ספציפית עבור כל מערכת תמצית תא. אפיון טמפרטורת התגובה הוא צעד חיוני בפיתוח מערכת תרגום ללא תאים בתפזורת. בדיקה זו של מולקולה אחת צריכה להתבצע תחת אותה טמפרטורה אופטימלית כמו תנאי התרגום בצובר המתאים. - לפחות שעה אחת לפני ביצוע ניסוי מולקולה אחת להפעיל את הלייזר על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה לייזר מאחורי תיבת הלייזר, לסובב את מקש בטיחות הלייזר, ולחץ על לחצן התחל; הפעילו את המיקרוסקופ והקישו על לוח הבקרה של מסך המגע כדי לבחור את מצב ההדמיה, המטרה וסדרת המסננים.
- הפעל את מצלמת EMCCD, בקר השלב הקודם ואת משאבת המזרק על-ידי לחיצה על לחצני ההפעלה שלהם. הפעל את המחשב ופתח את התוכנה אנדור סוליס (תוכנה 1) כדי לשלוט במצלמת EMCCD, TirfCtrl (תוכנה 2) כדי לשלוט בלייזר, PriorTest (תוכנה 3) כדי לשלוט על השלב הממונע, ו Coolterm כדי לשלוט במשאבת המזרק. אפשר למצלמה להתקרר ולהתייצב לטמפרטורת העבודה הייעודית שלה לפני תחילת רכישת הנתונים.
- בתוכנה 2, ודא שהפרמטרים הנכונים מוגדרים עבור אורך גל בלייזר, סוג אובייקטיבי ואינדקס שבירה של זכוכית ודגימה. לחץ על לחצן התחבר. כדי להגדיר את עוצמת הלייזר, לחץ על לחצן בקרה לצד אורך הגל של הלייזר ולאחר מכן, בחלון המוקפץ של פקד הלייזר, גרור את סרגל השקופיות בעוצמה. הגדר את הלייזר לזווית הרצויה על-ידי גרירת פס השקופית של מיקום הסיבים או הזנת עומק החדירה המתאים. ודא שהתיבה תריס מסומנת כדי לשמור על הלייזר במצב כבוי כאשר אינו דימות.
הערה: פתח וסגור את תריס הלייזר על-ידי סימון התיבה תריס. כאשר בתחילה הקמת ההסמכה, עוצמות לייזר שונות וזוויות אירוע צריך להיבדק לגילוי מולקולה אחת אופטימלית. עוצמת הלייזר האופטימלית מאזנת פלואורסצנטיות בהירה של מולקולה אחת וצילום מהיר של הפלואורופורים. יש להגדיל את זווית האירוע מעבר לזווית הקריטית כדי להפחית את הרקע הפלואורסצנטי הגבוה מהנוגדנים המסומנים לפיזור עד שהנוגדנים הקשורים ל- mRNA ייפתרו בבירור. כנקודת התייחסות, לייזר 532 ננומטר הוגדר 10 μW במטרה עם זווית אירוע לייזר מוגדר 71.5° במחקר15 באמצעות Cy3 שכותרתו אנטי דגל עם יחס תיוג של 2-7 צבעים לכל נוגדן. - בתוכנה 1, בחר קינטי תחת מצב רכישה, להזין את הפרמטרים עבור זמן החשיפה, אורך סדרה קינטית, ו EM להשיג ערך. בחר את הספריה והקצה שמות קבצים לשמירת קובץ תמונת הנתונים.
- הגדר את משאבת המזרק לקצב זרימה צנוע ומהיר עבור שלב שטיפת הצינור הבא.
פיפט aliquot של 70% אתנול לתוך צינור microfuge, להכניס את קצה משאבת המזרק צינורות לתוך הפתרון אתנול, ולהשתמש Coolterm כדי לעבור את משאבת המזרק בין נסיגה לוותר על מצבים שלוש פעמים כדי לשטוף את הצינור. חזרו על הפעולה באמצעות מים נטולי RNase.
הערה: אורך הצינור חייב להיות ארוך מספיק כדי לאפשר לתערובת התרגום להיות מחולק בשלב 5 רק כדי ליצור קשר עם הצינור, לא המזרק. נפח השטיפה כאן צריך להיות גדול יותר מנפח תערובת התרגום המופקת כדי להבטיח שתמהיל התרגום בשלב 5 יישאר במגע עם צינורות מחוטאים. - לאחר שטיפה המים הסופית כבר מחלק, להסיר מים שיורית מבפנים של צינורות על ידי dabbing קצה צינורות על ניקוי רקמה נקייה. שמור על קצה הצינור יבש על ידי הגדרת אותו לתוך צינור microfuge נקי.
4. קיבוע של 3′-סוף biotinylated mRNA
- שמור על תמצית התא ותרגום לערבב קפוא על קרח יבש עד ממש לפני השימוש בהם. להפשיר את ריאגנטים קפואים הנותרים ולשמור אותם על קרח.
- מניחים את תא הזרימה לתוך מחזיק דגימת המיקרוסקופ כאשר צד הכיסוי פונה כלפי מטה ומאבטחים אותו במקום עם סרט הדבקה. השתמש בקלטת כדי לכסות את כניסת ושקעים של ערוצי זרימה שאינם בשימוש.
- פיפט נפח 1.5x (יחסית לנפח הערוץ; חל גם על שלבים אחרים בשלב 4 ושלב 5) של 0.2 מ"ג / מ"ל סטרפטבידין לתוך ערוץ הזרימה והדגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- כדי להסיר streptavidin מאוגד, לשטוף את הערוץ שלוש פעמים על ידי pipetting בנפח 3x של מאגר לשטוף T50 (20 mM Tris HCl, pH 7.0, 50 mM NaCl, 0.2 U /μL RNase עיכוב ריאגנט) לכל לשטוף.
הערה: חשוב למנוע מפסולת נוזלית לזרום בחזרה לתעלה. אם השקע של ערוץ הזרימה אינו מחובר לצינור איסוף פסולת, הנח נייר טישו מקופל ליד השקע כדי לספוג את הנוזל הזורם מהתעלה. - מעבירים את תמצית התרגום ומערבבים מקרח יבש לקרח ומאפשרים להם להפשיר.
- שים טיפה של שמן טבילה על המטרה. מניחים את מחזיק דגימת המיקרוסקופ עם תא הזרימה לתוך שלב המיקרוסקופ. קרב את המטרה לכיסוי עד ששמן טבילה על המטרה יוצר קשר עם הכיסוי. הזז את שלב הדגימה כך שמיקום ערוץ הזרימה יהיה ישירות מעל העדשה האובייקטיבית.
- בתוכנה 2, פתח את תריס הלייזר והתאם את רמת עוצמת הלייזר.
- במסך המגע של פקד המיקרוסקופ, בחר בכרטיסיה מיקוד ולחץ על לחצן פוקוס חיפוש והתחלה. צפצוף נשמע כאשר מטוס מיקוד מושג בהצלחה.
- תמונה של משטח ערוץ הזרימה במצב Live בתוכנה 1. מטב את המוקד לתמונה חדה יותר על-ידי התאמת המיקום האובייקטיבי באמצעות פקד השלב הדק במסך המגע.
- בתוכנה 3, להזיז את הבמה כדי להעריך את רמת הרקע פלואורסצנטי באזורים שונים של משטח זיהוי ערוץ הזרימה. אם הפלואורסצנטיות נמוכה, המשיכו בניסוי. אם רקע הפלואורסצנטיות גבוה מדי, שקול לבטל את ערוץ הזרימה.
- בתוכנה 2, סגור את תריס הלייזר.
- פיפטה את מאגר לשטוף T50 מערוץ הזרימה ומיד פיפטה בנפח 2x של פתרון mRNA biotinylated לערוץ הזרימה. דגירה במשך 15 דקות.
הערה: עבור כל אצווה של הכנת mRNA, ריכוזי mRNA וזימני דגירה צריך להיבדק כדי להשיג את צפיפות פני השטח mRNA הדרושים לגילוי מולקולה אחת. צפיפות משטח mRNA מתאימה מתווכת כריכת נוגדנים המציגה כתמים פלואורסצנטיים עם חפיפה של לא יותר מ- ~ 5% (ראה תוצאות מייצגות). כנקודת מוצא, מומלץ ל-mRNA ביו-טיניאלי בריכוז של 2-20 ננומטר. - לשטוף את הערוץ שלוש פעמים על ידי pipeting נפח 3x של מאגר תואם תרגום לכל לשטוף.
5. תרגום לערבב הרכבה ואספקה לערוץ זרימה לגילוי מולקולה אחת
- על הקרח, להרכיב 3x כרכים של תמהיל התרגום30 בצינור microcentrifuge בעקבות פרוטוקול תרגום בתפזורת משלב 1.7, למעט להשמיט mRNA ולהוסיף עם ריכוז אופטימיזציה של נוגדנים שכותרתו פלואורסצנטית. בקצרה לסובב את הצינור microcentrifuge כדי לאסוף את תערובת התרגום בתחתית הצינור.
הערה: בעת קביעת הבדיקה, ריכוזי נוגדנים שונים נבדקים. הריכוז האופטימלי מראה כמויות נמוכות של נוגדנים לא ספציפיים המחייבים למשטח הגילוי ונוגדנים מהירים המחייבים את הפפטיד המתהווה (ראו שלבים 7.1. ו-7.2,, בהתאמה, לפרטי כיול מבחנים). - מעבירים את תערובת התרגום לחלק הפנימי של מכסה צינור microfuge 0.7 מ"ל. הגדר את משאבת המזרק למצב נסיגה. הכנס את קצה צינורות המשאבה לתערובת התרגום. התחל את נסיגת המזרק כדי לאסוף את תערובת התרגום לתוך צינורות המשאבה. הפוך את הגדרת משאבת המזרק למצב החלוקה והגדר את הזרימה לקצב אופטימלי למסירת תערובת תרגום.
הערה: הימנע מיצירת בועות בתמהיל התרגום בעת העברתו לתוך צינורות המשאבה. הימנע משיכת תערובת התרגום עמוק מדי לתוך החלק של צינורות כי לא היה מחוטא ושטוף בשלב 3.6. בעת קביעת הבדיקה, נבדקים קצבי זרימת אספקה שונים כדי לקבוע את הקצב האופטימלי (ראה שלב 6.2. לקבלת פרטים על כיול מבחנים). - אם יש פער בין קצה הצינור לתערובת התרגום, התחילו את משאבת המזרקים ואפשרו לתערובת התרגום להגיע לקצה הצינור, ואז עצרו את משאבת המזרק.
- הכנס את קצה צינורות המשאבה לתוך הכניסה של ערוץ הזרימה. הימנע מהכנסת בועות אוויר לתערובת התרגום בעת ביצוע החיבור. לייצב את החיבור על ידי את תושבת מתכת בהתאמה אישית על לוח מחזיק מדגם מיקרוסקופ. להעריך את המיקוד מיקרוסקופ ופלואורסצנטיות אזור הדמיה.
הערה: ניתן להדק את הצינור לתא הזרימה עם חלק מותאם אישית כפי שתואר קודםלכן 33. סוגים אחרים של מערכות fluidics יכול לשמש גם עבור זה assay34. שדה הראייה אמור להיראות דומה לפני ואחרי חיבור הצינור. אם כתמים פלואורסצנטיים נוספים מופיעים לאחר החיבור, סביר להניח שתמהיל התרגום דולף מהצינורות של המסירה. בהתאם ליישום, ייתכן שיהיה צורך למחוק את הערוץ עם תערובת תרגום שהודלפה. - ודא שהפרמטרים של רכישת הסרט נכונים ושהוזנו שם הקובץ והספריה המתאימים לשמירת קבצים.
- הזיזו את הבמה כדי לדמות אזור במרכז משטח זיהוי ערוצי הזרימה. במסך המגע של בקרת המיקרוסקופ, בחר בכרטיסיה AF רציף ולחץ על לחצן פוקוס חיפוש והתחלה כדי לשמור על מיקום המוקד במהלך הניסוי. צפצוף נשמע כאשר מטוס מיקוד מושג בהצלחה.
- בתוכנה 2, פתח את תריס הלייזר. בתוכנה 1, לחץ על לחצן קח אות כדי להתחיל בהקלטה. לאחר כ- 5 שניות של הקלטה, הזן את הפקודה Run ב- Coolterm כדי להעביר את תערובת התרגום לערוץ הזרימה. הקלט עד 2 שעות ברזולוציית זמן של 0.5-2 שניות/מסגרת.
הערה: הטווח המרבי של רכישת נתונים תלוי באיזו מהירות תמצית התרגום מאבדת פעילות לאורך זמן, אשר יכול להיות מאופיין בנוחות על ידי ביצוע תרגום ללא תאים בתפזורת עם כתב לוציפראז mRNA ומדידת פעילות לוציפראז בתגובות התרגום בנקודות זמן שונות35. - לאחר השלמת רכישת הנתונים, כבה את הלייזר, כבה את ה- Af הרציף במסך המגע של בקרת המיקרוסקופ ופרק את הצינור מתא הזרימה.
- פיפטה מוציאה את תערובת התרגום ממפרצון ערוץ הזרימה, מעבירה אותה לצינור מיקרו-פוגה, ומקפיאה את הפתרון על ידי הנחת הצינור בחנקן נוזלי. מאוחר יותר לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את משאבת המזרק צינורות שלוש פעמים עם מים ללא RNase, ואז שלוש פעמים עם 70% אתנול. משוך 70% אתנול לתוך צינורות משאבת המזרק לאחסון.
- כבה את המיקרוסקופ ואת כל האביזרים. תנקה.
6. ניתוח נתונים
הערה: ניתוח נתונים לבדיקה זו דורש שיטות נפוצות במחקרים ביופיזיים של מולקולה אחת. ניתן להשיג את כל השלבים האינטנסיביים מבחינה חישובית באמצעות אלגוריתמים ותוכנות קיימים (הפניות כלולות להלן בשלבים המתאימים).
- אופציונלי: אם ישים, המר את קובץ סדרת התמונות שנרכש לתבנית התואמת לתוכנת עיבוד התמונה שנבחרה או לשפת התכנות שנבחרה.
- קבע את נקודת ההתחלה של תגובת התרגום ואת זמן ההחלפה של ריאגנט.
הערה: בשל הנוגדנים הפלואורסצנטיים המפזרים בתמהיל התרגום, עוצמת פלואורסצנטיות הרקע של אזור בתמונה תגדל במהלך חילופי מגיבים בערוץ ממאגר תואם תרגום לתערובת תרגום. נקודת ההתחלה של תגובת התרגום מוגדרת כנקודת הזמן שבה הושלמה חילופי הריאגנטים. נקודת השלמה זו נמצאת על ידי מדידת עוצמת פלואורסצנטיות הרקע במהלך מסירת תערובת התרגום וזיהוי נקודת הזמן כאשר רמת עוצמת הפלואורסצנטיות הגוברת15, כמתואר להלן.- חשב את ספירת הפלואורסצנטיות הכוללת לפי מסגרת תמונה והתווה את פרופיל הזמן המתאים. זהה את העלייה הפתאומית בפלואורסצנטיות הכוללת בעלילת פרופיל הזמן.
הערה: העלייה הכוללת בפלואורסצנטיות נובעת מהריכוז הגובר של נוגדנים המסומנים בפלורסנטיות במהלך חילופי ריאגנטים. - זהה את נקודת הסיום של שלב הגדלת הפלואורסצנטיות הכולל והגדר נקודת זמן זו כנקודת ההתחלה (כלומר, השעה 0) של תגובת התרגום. זהה הן את נקודות ההתחלה והן את נקודות הסיום של שלב הגדלת הפלואורסצנטיות הכולל והגדר את הפרש הזמן כזמן ההחלפה של ריאגנט.
הערה: משך הזמן הכולל של חילופי מגיבים תלוי בממדי ערוץ הזרימה ובקצב הזרימה שנבחר. ייתכן כי גורמי תרגום מסוימים יכולים להתחיל מחייב mRNA לפני חילופי ריאגנט משלים, אשר יכול להפחית את הרזולוציה של זמן החניכה בסיבוב הראשון שנקבע. לכן מומלץ לבדוק קצבי זרימה שונים בעת הגדרת הבדיקה ולבחור קצבי זרימה המאפשרים השלמת חילופי ריאגנט בתוך 3-4 שניות למהירויות רכישת נתונים של 0.5-2 s/frame.
- חשב את ספירת הפלואורסצנטיות הכוללת לפי מסגרת תמונה והתווה את פרופיל הזמן המתאים. זהה את העלייה הפתאומית בפלואורסצנטיות הכוללת בעלילת פרופיל הזמן.
- אופציונלי: בצע תיקון סחף סרט.
הערה: מיקומם של נוגדנים מאוגדים בתמונת הנתונים עשוי להשתנות עם הזמן עקב סחף של חלקי מיקרוסקופ ואביזרים. להיסחף כי הוא מורגש חזותית בסרט דורש תיקון לפני שתמשיך עם ניתוח נתונים. מספר אלגוריתמים תיקון סחף מרחבי סקריפטים זמינים36,37,38.- בכל תמונה, מצא את המקסימום המקומי בספירת פיקסלים כדי לקבוע את מיקומם של נוגדנים מאוגדים בכל מסגרת בדיוק ברמת הפיקסל. קבעו סף לספירת הפיקסלים כך שרק נקודות שנמצאות בבירור מעל רעשי הרקע ייבחרו.
- חשב את השינויים של מיקומי נוגדנים בודדים בכל כיוון בין שתי מסגרות תמונה עוקבות.
- התווה את ההיסטוגרמה של שינויי מיקום נוגדנים בין שתי מסגרות רצופות ובצע זאת בנפרד לכל כיוון. Gaussian להתאים כל היסטוגרמה ולהגדיר את המיקום המרכזי של פסגות כמו להיסחף כיוונית בין שתי מסגרות רצופות.
- כדי לנטרל את הסחף שנצפה, הסט כל מסגרת תמונה בכיוון ההפוך בכמות הסחף המחושבת.
- לבנות מסלולים של מולקולה אחת.
הערה: תוכנת איתור/מעקב זמינה לזיהוי נקודות אור ולחילוץ העוצמות שלהן מסדרת תמונות נתונים39,40.- זהה תנוחות נוגדנים כמתואר בשלב 6.3.1.
הערה: מומלץ לבצע בדיקה ויזואלית כדי להבטיח שהסף שנבחר לא גורם לקטיף יתר או תת-קטיף יתר של חלקיקים. ניתן להשיג בדיקה חזותית על ידי כיסוי עמדות centroid מזוהה על כל מסגרת תמונה חזותית להעריך את ההסכם שלהם (ראה תוצאות מייצגות). - שלב את החלקיקים שנאספו מכל המסגרות והסר את תנוחות החלקיקים המיותרים.
- בדקו ויזואלית את התמונות של נוגדנים מאוגדים ובחרו אזור מרובע המקיף את הפיקסלים בספירות שנמצאות בבירור מעל הרקע ומייצגות נוגדנים מאוגדים בנפרד.
הערה: פונקציית התפשטות הנקודות (כלומר, גודל הריבוע של מולקולה בודדת) נקבעת על-ידי ההתקנה האופטית וגודל הפיקסל של הגלאי. - עבור כל מיקום חלקיקים, בנה מסלול של מולקולה אחת על-ידי חישוב העוצמה הכוללת של כל הפיקסלים באזור הריבועי סביב מיקום החלקיקים. מסלולים בנויים עבור כל מיקום, מסגרת אחר מסגרת, ועבור סרט הנתונים כולו.
- זהה תנוחות נוגדנים כמתואר בשלב 6.3.1.
- אופציונלי: החל מסנן לא ליניארי קדימה ואחורה41 כדי להפחית את רעשי הרקע במסלולים של מולקולה אחת.
- אופציונלי: דיגיטציה מסלולים עם אלגוריתמים קיימים זיהוי צעדים42,43,44,45.
הערה: הבחירה באלגוריתם זיהוי צעדים תלויה במורכבות הדינמיקה של מולקולות בודדות. עבור התרחיש הפשוט ביותר של תרגום ריבוזום מבודד בלבד (כלומר ללא היווצרות פוליזום) ויחס אות טוב לרעש, יישום סף לספירת הפלואורסצנטיות מספיק לזיהוי העיתוי של אירועי כריכת נוגדנים וניתוק במסלולי המולקולה הבודדת. מומלץ לבצע בדיקה חזותית של לפחות 100 מסלולים עבור כל תנאי כדי להבטיח שצעדי המסלול נבחרו כראוי על-ידי אסטרטגיית זיהוי צעדים. - לקבוע את הזמן של אירוע מחייב הנוגדנים הראשון עבור כל מסלול (כלומר, זמן ההגעה הראשונה, t1), או באמצעות מסלולים דיגיטליים או החלת סף למסלולים לא נסערים.
הערה: ניתן להשוות את הערך החציוני של התפלגות זמן ההגעה הראשונה בין תנאי תרגום שונים. לחלופין, ניתן להתאים את התפלגות זמן ההגעה הראשונה לפונקציית יומן רישום רגילה מוזזת (3 פרמטרים) כדי לקבוע את הערך הממוצע15 <t1>. מכיוון שהתפלגות זמן ההגעה הראשונה מוטה בדרך כלל ויש לה זנב ארוך, אל תחשב את הממוצע על ידי ממוצע ישיר על זמני ההגעה הראשונים שנצפו. - אופציונלי: התעכב על ניתוח זמן וחישוב של שיעור סינתזת פפטיד ממוצע.
- השתמש במסלולים דיגיטליים כדי לזהות אירועי תרגום מונוזום (ריבוזום יחיד) בכל מסלול ולחשב את זמני ההשתהות של אירוע מחייב יחיד כהפרש הזמן בין איגוד הנוגדנים המתאים לבין אירועי ניתוק.
הערה: אלגוריתמים לגילוי צעדים לדיגיטציה של מסלולים הם בדרך כלל פחות אמינים כאשר אירועים מולקולריים מרובים חופפים בזמן. לכן מומלץ לא לכלול אירועים פוליזומים מניתוח זמן השתהות. עבור מערכות תרגום פעילות מאוד המועשרות באירועים פוליזומים ומציגות לעתים רחוקות אירועים מונוזומים, ניתן להשתמש בתערובת של נוגדנים מסומנים וחסרי תווית כדי להגדיל את הסיכוי להתבוננות באירועי תרגום מבודדים במסלולי מולקולה אחת. - התאם את ההתפלגות לפונקציה של יומן רישום רגיל והשתמש בפונקציה המותאמת כדי לחשב את זמן ההשתהות הממוצע.
הערה: חישוב הממוצע ישירות על-ידי חישוב ממוצע זמני השהייה שנצפו אינו מומלץ מכיוון שהתפלגות הזמן השוכנת מוטה בדרך כלל בזנבות ארוכים. - לקבוע את מספר חומצות האמינו המתורגמות במהלך זמן הנוגדן מחייב לשכון על ידי חיסור הסכום של אורך חומצת האמינו epitope ו 35 (אורך חומצת האמינו הממוצע של פפטיד המתהווה בתוך מנהרת היציאה ריבוזום) מהמספר הכולל של קודונים ORF.
- כדי לקבוע את קצב סינתזת הפפטיד הממוצע, חלקו את מספר חומצות האמינו המתורגמות בזמן השהות הממוצע.
- השתמש במסלולים דיגיטליים כדי לזהות אירועי תרגום מונוזום (ריבוזום יחיד) בכל מסלול ולחשב את זמני ההשתהות של אירוע מחייב יחיד כהפרש הזמן בין איגוד הנוגדנים המתאים לבין אירועי ניתוק.
- אופציונלי: חישוב זמן האתחול הממוצע בסיבוב הראשון (<t1_I>).
הערה: תנאי חניכה והתארכות, כגון הקשר רצף אתר החניכה ורצף הקידוד, נשמרים בדרך כלל במכוון למחקרים של קינטיקה חניכה. לכן, זמן ההגעה הראשון הממוצע <t1> משלב 6.7. ניתן להשתמש ישירות כדי לחשב את השינוי בקינטיקה של התחלת הסיבוב הראשון בין תנאים שונים. התיקון הבא נחוץ רק לקביעת הערך הממשי של זמן אתחול בסיבוב הראשון.- לחלק את הסכום של אורך האפיטופ ו 35 (אורך חומצת האמינו הממוצע של פפטיד המתהווה בתוך מנהרת היציאה ריבוזום) על ידי שיעור סינתזת פפטיד הממוצע (משלב 6.8.4.) כדי לחשב את זמן התארכות פפטיד הממוצע של אזור זה N-מסוף (<t1_tag>).
- מכיוון שזמן ההגעה הראשון הוא סכום זמן האתחול בסיבוב הראשון ו- t1_tag, הפחת את <t1_tag> מזמן ההגעה הראשון הממוצע <t1> כדי לחשב את זמן האתחול הממוצע בסיבוב הראשון <t1_I>: <t1_I> = <t1> - <t1_tag>
7. כיול אסאי
הערה: בצע את שלבי הכיול הבאים בעת קביעת ההסמכה הראשונית.
- כדי לבחון את הספציפיות של איגוד הנוגדנים, בצע את שלבי הפרוטוקול בסעיפים 4 ו- 5 בנפרד עבור mRNAs לא מתויגים ולא מתויגים (איור 2). רמות איגוד הנוגדנים בתעלות עם mRNAs אלה מייצגות את היקף הנוגדנים הלא ספציפיים המחייבים את משטח הגילוי ונוגדנים ספציפיים המחייבים פפטיד המתהווה.
הערה: יחס מחייב ספציפי לא ספציפי מומלץ להיות >10 וניתן להגדיל אותו עם אסטרטגיות שונות של פסיבציה על פני השטח, ריכוז נוגדנים נמוך יותר או צפיפות משטח mRNA גבוהה יותר. - כדי למדוד את קצב איגוד הנוגדנים, בצע את הפרוטוקול בצעד נוסף בין שלב 4 לשלב 5.
- לאחר שלב 4, דגירה את הערוץ עם תערובת תרגום חסר נוגדן ליצור מראש mRNA / ריבוזום / פפטיד קומפלקסים.
- ואז להמשיך לשלב 5 ולזרום תערובת תרגום בתוספת נוגדנים לתוך הערוץ.
- לכמת את קצב איגוד הנוגדנים הממוצע לפפטיד שנוצר מראש עם התאמה אקספוננציאלית להיסטוגרמה של זמן ההגעה הראשון.
הערה: איגוד נוגדנים לפפטיד שנוצר מראש צריך להיות מהיר, בסדר השניות, וצריך להיות מהיר יותר מהקינטיקה התרגום. ריכוז נוגדנים גבוה יותר עשוי לשמש להגברת קצב איגוד הנוגדנים.
- פוטו היציבות של נוגדן שכותרתו פלואורופור.
- הכן שקופית בהתאם לפרוטוקול בשלב 2 אך דלג על שלב PEGylation. להרכיב את תא הזרימה לאחר שלב המליחות. ציפוי הסילאן מאפשר קשירת נוגדנים יעילים ולא ספציפיים למשטח הגילוי.
- הוסיפו את הנוגדנים בעלי התווית הפלואורסצנטית לתעלה כדי להשיג צפיפות של מולקולה אחת של נוגדנים לא ספציפיים המחייבים את משטח הגילוי. התחל על ידי הוספת נוגדן בעל תווית פלואורסצנטית מדולל מאוד במאגר כביסה T50 ולהגדיל בהדרגה את ריכוז הנוגדנים עד להשגת צפיפות המולקולה הבודדת הרצויה.
- תדמיינו את משטח הגילוי עד שרוב פלואורסצנטיות הנוגדנים כבר לא ניתנת לגילוי.
- התווה את המספר הכולל של נוגדנים גלויים לאורך זמן כדי להעריך את שיעור אובדן פלואורסצנטיות נוגדנים עקב פוטובלאצ'ינג פלואורופור.
הערה: תיוג נוגדנים מניב בדרך כלל פלואורופורים מרובים לכל נוגדן. נוגדנים בודדים נשארים ניתנים לגילוי עד שכל הפלואורופורים המצומדים פוטובלך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הפרוטוקול המתואר מאפשר הדמיה של אינטראקציות נוגדנים בודדות עם פוליפפטידים המתהווים של N-terminal עם רזולוציה של מולקולה אחת במהלך תרגום פעיל ללא תאים של mRNA כתב קצה קשור 3 (איור 1). ניסוי הדגמה מינימלי מדווח על שימוש בשלושה mRNAs סינתטיים: LUC (קידוד לוציפראז לא מתויג), LUCFLAG (קידוד 3xFLAG מתויג לוציפראז), ו- HP-LUCFLAG (LUCFLAG עם לולאת גזע יציבה באזור המנהיג של 5 אינץ ') ( איור2C). השימוש ב- mRNA בקידוד לוציפראז מאפשר השוואות בין תצפיות של מולקולה אחת ומדידות זוהר בתפזורת. שלמות של 3 ' biotinylated mRNA הוערך על ידי אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide denaturing (דף) וכתמים RNA. mRNA באיכות טובה מראה רצועה נקייה אחת ולא אמורה להציג אותות נודדים מהירים יותר(איור 3A). Saccharomyces cerevisiae תרגום תמצית שימש כאן והוכן בעקבות פרוטוקול שתואר בעבר30 ושונה15. מדידות בתפזורת של פעילות לוציפראז בתגובות תרגום ללא תאים עם תמצית שמרים ו mRNA LUCFLAG biotinylated כי גם חסר או מכיל כובע m 7 G מראהגירויכובע של תרגום MRNA דגל לוק (איור 3B).
להדמיה של מולקולה אחת, תמצית התרגום נוספה עם 67 ננומטר של נוגדן נגד דגל Cy3 (Cy3-αFLAG). לנוגדן זה היה יחס תיוג גבוה של 2-7 צבעים לנוגדן. לייזר 532 ננומטר הוגדר 10 μW במטרה. זווית תקרית הלייזר הוגדרה ל-71.5°, שהייתה גדולה מהזווית הקריטית של 63.8° עבור ההקמת שלנו. רמה נמוכה של פלואורסצנטיות תדמיינה ממשטחי זיהוי המכילים mRNA אך חסרים תמהיל תרגום(איור 4A). עבור מידות ערוץ של כ 2 מ"מ (רוחב) x 50 מיקרומטר (עומק) x 24 מ"מ (אורך), קצב מסירת זרימה של 150 μl / min הניב זמן החלפה ריאגנט של 3 – 4 s. בתוך 5 s של משלוח לערבב תרגום, רמת פלואורסצנטיות הרקע עולה עקב נוגדנים פלואורסצנטיים מפוזרים. כ-2 דקות לאחר מסירת מיקס התרגום לערוצים המכילים את LUCFLAG, כתמי Cy3 החלו להופיע בשדה ראייה והמשיכו להצטבר במשך כ-30 דקות(איור 4B). נוגדן לא ספציפי המחייב את פני השטח, נמדד באמצעות 3xFLAG חסר LUC mRNA(איור 2C),נשאר ברמה נמוכה מאוד15. האותות מ- mRNA / ריבוזום / פפטיד קשור Cy3- αFLAG היו גלויים בבירור עם זווית אירוע לייזר אופטימיזציה אבל יכול להיות רעול פנים על ידי רקע פלואורסצנטי גבוה עם זוויות אירוע לייזר נמוך יותר (איור 4C).
כדי לנתח אירועי קשירה של Cy3-αFLAG, עוצמות הפלואורסצנטיות של נקודות Cy3-αFLAG נבחרות (איור 5A)חושבו פריים אחר פריים עבור הסרט כולו ולאחר מכן חוברו ליצירת מסלול אינטנסיביות (איור 5B). מסלולים גולמיים יכולים להיראות רועשים ועשויים לדרוש עידון עם מסנן לא ליניארי קדימה ואחורה כדי להפחית את רעשי הרקע41. עידון נוסף יכול להיות מושגת באמצעות אלגוריתמים לזיהוי צעדים כדי דיגיטציה מסלולים42. עבור כל המסלולים, עלייה אוניברסלית ברמת הפלואורסצנטיות ברקע מופיעה במהלך חילופי ריאגנטים בשל הנוגדנים הפלואורסצנטיים המפזרים בתמהיל התרגום (איור 5B). קשירת נוגדנים לפוליפפטיד המתהווה גרמה לעלייה מיידית בפלואורסצנטיות ואילו דיסוציאציה של נוגדנים/פוליפפטיד מ-mRNA גורמת לירידה מיידית בפלואורסצנטיות(איור 5B).
ניתן להשתמש בזמן ההשבתה של כריכת הנוגדנים כדי למדוד את זמן הפענוח הכולל של מסגרת קריאה פתוחה. היסטוגרמה זמן השכון עבור LUCFLAG mRNA מתאימה להתפלגות לוג-נורמלית(איור 6A)והניבה קצב סינתזת פפטיד של 2.5 ± 0.1 חומצות אמינו לשנייה15. ההיסטוגרמה של זמן ההגעה הראשונה מתאימה לפונקציית יומן רישום רגילה מוזזת (3 פרמטרים) (איור 6B). ההתפשטות הרחבה של היסטוגרמה זמן ההגעה הראשונה מראה את רמה גבוהה של הטרוגניות בפעילות תרגום mRNA יחיד. ההיסטוגרמה הצביעה על כך שאירוע סינתזת הפפטיד הראשון במולקולות MRNA של LUCFLAG יחיד יכול להתחיל כבר ב-2 דקות, ועד 20 דקות, לאחר מסירת מיקס תרגום(איור 6B). בהשוואה לתרגום עם LUCFLAG mRNA, היסטוגרמה הפעם הראשונה עם תרגום HP-LUCFLAG mRNA הראתה כריכת נוגדנים איטית יותר(איור 7A). עם זאת, שימוש במדידות זוהר בצובר מתגובות תרגום ללא תאים עם אותם mRNAs, אינו פותר הבדלים בקינטיקה של תרגום(איור 7B,C). תוצאות אלו ממחישות את הרזולוציה הגבוהה יותר של השיטה שלנו בהשוואה למדידות פעילות לוציפראז קינטית בתפזורת לגילוי שינויים קטנים בקינטיקה של חניכה.
איור 1: תרשים זרימת פרוטוקול. מוצגים ייצוגים סכמטיים של הכנת כריכות ושקופיות, הרכבה של תא מולקולה אחת, הדמיה ורכישת נתונים של TIRF ושלבי ניתוח נתונים. שלב ההדמיה של TIRF כולל תיאורים סכמטיים של קיבוע ותרגום mRNA בערוץ זרימה. רכיבי משטח זיהוי, נוגדן שכותרתו פלואורסצנטית, ורכיבי תמצית תאים מסומנים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עיצובי mRNA עבור מבחני המולקולות הבודדות. (A) כדי להתאים בדיקת תרגום בתפזורת לפקודת המולקולות הבודדות, תבנית הדנ"א של הכתב בתפזורת ORF שונתה עם הכנסה של רצף תג אפיטופ N-terminal כדי ליצור ORF מתויג בקידוד כתב. אזורי קידוד תגים של ORF ו- N-מסוף מסומנים. (B)mRNAs היו 5′-m7G כתרים כדי לאפשר תרגום תלוי כובע ו 3′-biotinylated עבור קיבוע שלהם משטח זיהוי מולקולה אחת. 5′-m7G כובע ו 3′-ביוטין מסומנים על ORF RNAs מתויגים ולא מתויגים. (C)נעשה שימוש ב- mRNAs בקידוד לוציפראז כדי להדגים את מבחני המולקולות הבודדות. LUC ו- LUCFLAG mRNAs מקודדים לוציפראז שחסר ומכיל תג N-מסוף 3xFLAG, בהתאמה. hp-LUCFLAG mRNA מכיל הכנסה נוספת המציגה מבנה משני סיכת ראש ב mRNAדגל לוק5′-מנהיג. תרמוביות סיכת הראש, 3′-פולי(A) זנב, ו 3′-ביוטין מסומנים. כל שלושת mRNAs כללו זנב 30 nt 3′-poly(A) לתרגום יעיל יותר תלוי כובע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שלמות mRNA של כתב מולקולה אחת ותרגום בצובר. (A)נציג הדמיית PAGE של כתב מולקולה אחת mRNA. 5′-m7G כתרים ו 3′-biotinylated LUCFLAG mRNA היה טעון על ג'ל 10% polyacrylamide דנאטורי ליד סולם RNA. (B)mRNA כתב מולקולה אחת שמרה על תלות בכובע 5' בתגובות תרגום ללא תאים בתפזורת. 3′-biotinylated LUCFLAG mRNA כי גם חסר (-כובע) או הכיל (+ כובע) כובע 5′-m7G תורגם S. cerevisiae תרגום תמצית במשך 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. פעילות לוציפראז נמדדה משתי תגובות עצמאיות ומנורמלת לפעילות עם –cap mRNA, אשר מוגדר באופן שרירותי 1.0. סטיות תקן מערכים ממוצעים מסומנות על-ידי קווי שגיאה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיה של משטחי זיהוי המכילים mRNA משותק. (A) פלואורסצנטיות רקע בהיעדר תמהיל תרגום. (B)כתמי פלואורסצנט Cy3 בשדה תצוגה 30 דקות לאחר מסירת תערובת התרגום ועם זווית אירוע לייזר ממוטבת. (C) שדה תמונה של תצוגה 30 דקות לאחר משלוח לערבב תרגום עם זווית אירוע לייזר נמוכה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח תמונה. (A) נקודות Cy3 בשדה תצוגה ללא (חלונית שמאלית) או עם בחירת ספוט (חלונית ימין). (B) דוגמה למסלול של מולקולה אחת עבור נקודה Cy3 שנבחרה. החץ השחור מציין את העלייה בפלואורסצנטיות הרקע עקב פיזור נוגדנים במהלך מסירת תערובת התרגום. החץ הירוק מציין את העלייה הפתאומית בעוצמת הפלואורסצנטיות עקב כריכת Cy3-αFLAG. החץ האדום מציין את הירידה הפתאומית בעוצמת הפלואורסצנטיות עקב ניתוק Cy3-αFLAG/פפטיד המתהווה מ- mRNA. זמן ההתעכבות של אירוע איגוד Cy3-αFLAG מצוין עם חץ דו-ראשי. נתונים גולמיים, מסוננים ודיגיטציה מצוינים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניתוח קינטי של כריכת Cy3-αFLAG עם תרגום MRNA של LUCFLAG. (A) היסטוגרמה זמן ההיסטוגרמה של איגוד Cy3-αFLAG מתאימה להתפלגות רגילה. (B) איגוד Cy3-αFLAG זמן ההגעה הראשון היסטוגרמה מתאימה לפונקציה עברה (3-פרמטר) יומן נורמלי. הותאם מוונג ואח '15 באישור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: לבדיקת המולקולה הבודדת יש רזולוציה גבוהה יותר לקינטיקה של חניכה מאשר לבדיקת הזוהר בצובר. (A) היסטוגרמות זמן ההגעה הראשונה עבור Cy3-αFLAG מחייב עם תרגום של דגל לוק ו hp-LUCFLAG mRNAs גילה חניכה איטית יותר הנגרמת על ידי מבנה סיכת ראש קטן mRNA 5′-מנהיג. N = 10650 מסלולים (LUCFLAG), בשילוב מ- 3 ערכות נתונים ו- N = 4079 מסלולים ( hp-LUCFLAG), בשילובמ-2 ערכות נתונים. (B,C) מדידות קינטיות של פעילות לוציפראז בצובר לא פתרו הבדלים בקינטיקה של חניכה עבור LUCFLAG (N = 9 ערכות נתונים) ו- hp-LUCFLAG (N = 6 ערכות נתונים) תרגום mRNA. (B)קינטיקה זוהרת בתפזורת. (C)פיזור עלילות של זמני תרגום בסיבוב הראשון שנקבעו על ידי גאוסיאן בהתאם לנגזרת השנייה של עקומות קינטיקה זוהר ב -B), כפי שתואר על ידי ואסילנקו ואח '. 46. העיגולים האדומים והסרגלים ב-( C) מייצגים את הערך הממוצע ואת סטיית התקן של זמן התרגום המחושב בסיבוב הראשון, בהתאמה. הותאם מוונג ואח '15 באישור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהשוואה לניסויים טיפוסיים במבחנה TIRF מולקולה אחת, הדמיה של מולקולה אחת עם ההסתייגות המתוארת כאן מורכבת בנוסף בשל השימוש בתמצית תאים וריכוז גבוה של נוגדן שכותרתו פלואורסצנטית. בהשוואה לנוהג הנפוץ יותר של סיבוב אחד של PEGylation משטח, סיבוב שני של PEGylation (שלב 2) מפחית מאוד נוגדן לא ספציפי מחייב משטח זיהוי15. הריכוז הגבוה של נוגדנים פלואורסצנטיים מפוזרים גורם לרקע פלואורסצנטי גבוה ביותר שמסווה גילוי מולקולה אחת של כריכת נוגדנים. כדי להפחית רקע פלואורסצנטי זה, זווית אירוע הלייזר גדלה הרבה מעל הזווית הקריטית (שלב 3.4.). גילוי נוגדנים מצטמצם גם על ידי חוסר יציבות פלואורופור מוגזם, אשר יכול להגביל את היכולת לכמת את זמן השהות. כאשר נתקלים בבעיה זו, להחליף את הפלואורופור עם פלואורופור פוטושופ יותר, כגון אלה מצומדים quencher המדינה שלישייה47, או להנמיך את עוצמת תאורת הלייזר. למרות שמערכות ניקוי חמצן משמשות בדרך כלל בניסויים במבחנה של מולקולה אחת כדי לדכא פוטובלאצ'ינג פלואורופור48,49, ההסתעפות המתוארת כאן יכולה לספק חלון גילוי נדיב מאוד מבלי ליישם מערכות ניקויחמצן 15. יתר על כן, מערכות ניקוי חמצן יכול להפחית מאוד יעילות תרגום ללא תאים eukaryotic. לכן, מערכות ניקוי חמצן צריך להיות מוערך בקפידה לפני השימוש בהם עם בדיקה זו.
חשוב לציין כי וריאציות קטנות בהכנה ריאגנטית מזוהות על ידי ההסתעפות בשל רזולוציית המולקולה הבודדת שלה. לדוגמה, לשכפל הכנות תמצית תרגום יכול להציג פעילויות שונות שעשויות או לא ניתן לזהות בשיטות בצובר. יתר על כן, הקפאת-להפשיר מחזורים של תמצית תרגום ריאגנטים אחרים יכולים לפגוע במהירות בפעילות התרגום. אנו ממליצים לבצע ניסויי פיילוט בקנה מידה קטן עם חומר נגיש בקלות כדי לבדוק את התנאים לפני תכנון למחקר שיטתי. למחקר שיטתי, מומלץ לבצע תכשירים בקנה מידה גדול של ריאגנטים לתרגום, אליגוטים חד-פעמיים לריאגנטים רגישים להקפאה/הפשרה, ועקביות בביצוע שלבי פרוטוקול. תמצית תרגום כי הוא פלאש קפוא חנקן נוזלי ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס מראה אובדן פעילות מינימלי לפחות שנתיים. יישום של אמצעים אלה יכול לדכא ביעילות וריאציות ניסיוניות ולהגדיל את החוסן של מבחני המולקולות הבודדות.
מכיוון ששיטה זו משלבת מערכות תרגום קיימות ללא תאים בתפזורת וטכניקות הדמיה של מולקולה אחת במבחנה, פתרון בעיות גנריות בשני תחומים אלה אינו נדון כאן. דוגמאות לבעיות גנריות כאלה כוללות הכנות באיכות נמוכה של כתב mRNA או כיסוי PEGylated ופעילות תרגום נמוכה של תמצית תאים. כאן נתמקד בנושאים ספציפיים לשיטה זו. בנוסף למספר הבעיות הטכניות שנדונו בפרוטוקול, בעיה פוטנציאלית נוספת עשויה להיות נמוכה או ללא מחייב נוגדנים בערוץ הזרימה למצב תרגום שצפוי להיות בעל פעילות טובה. קיימות מספר אפשרויות לפתרון בעיות. את היעילות של קיבוע mRNA biotinylated למשטח הגילוי ניתן להעריך על ידי חישול אוליגומרים משלימים פלואורופור מצומדים ל- mRNA משותק והדמיה DNA פלואורסצנטי:דופלקסים RNA. ניתן לבדוק את איכות תערובת התרגום ואת mRNAs כתב biotinylated על ידי הפעלת בדיקה תרגום בתפזורת. יתר על כן, לאחר ביצוע תגובת תרגום בערוץ זרימה משותק mRNA, פתרון תגובת התרגום יכול להיות pipetted מתוך הערוץ ולהשתמש בהסתעפות פעילות כתב כדי לאשר את התרחשות התרגום בערוץ. במידת הצורך, ניתן להשתמש בצפיפות משטח mRNA גבוהה מדי לתגובת התרגום בערוץ כדי לאפשר זיהוי קל יותר על ידי בדיקה של פעילות הכתב.
המגבלה העיקרית של חקירה זו היא ההחלטה שלה לקינטיקה חניכה. במהלך מבחנים אלה, התפוקה הניסיונית הישירה, זמן ההגעה הראשון, מכילה הן את זמן החניכה של הסיבוב הראשון והן את זמן התארכות הפפטיד לתרגום האפיטופ ו-35 קודונים נוספים. למרות התרומה של זמן התארכות פפטיד ניתן לתקן (שלב 6.9.), זה assay וכתוצאה מכך הוא רגיש ביותר למדידת קינטיקה חניכה המתרחשים על סדר הדקות, אשר נראה תכונה כללית של ייזום תלוי כובע15. מבחינה ניסיונית, קל להתאים את ההסתעפות הזו לחקר מנגנוני חניכה אחרים. עם זאת, אם מנגנון החניכה מתרחש באופן משמעותי מהר על סדר השניות, זה assay לא סביר לפתור את קינטיקה החניכה.
גישת המולקולה הבודדת המתוארת כאן משלבת הדמיה של מולקולה אחת ותרגום מבוסס תמצית כדי לאפשר מדידות של אירועי תרגום תלויי כובע בודדים בזמן אמת ובמהלך תרגום פעיל ללא תאים. ההסתעפות מאפשרת מעבר קל ממסיעת תרגום בתפזורת למעבורת של מולקולה אחת, תוך שמירה על קינטיקה של תרגום בתפזורת. לכן, תצפיות קינטיות מולקולה אחת ניתן לפרש בהתייחסות ישירה לתוצאות בתפזורת המתאימות. שיטות קודמות, כולל שפותחו לאחרונה ב vivo מתקרב11,12,13,14, חסר את הרזולוציה עבור מדידות קינטיות של אירועי חניכה תרגום בודדים ודורשים הנחות של מנגנוני תרגום כדי לחלץ ממוצעי זמן חניכה מן הנצפים ניסיוני. שיטת המולקולה הבודדת המוצגת כאן מספקת את הגישה הראשונה נטולת השערות לכימות זמן החניכה הממוצע של תרגום פעיל תלוי כובע. יתר על כן, למרות מדידות קינטיות בתפזורת עם מבחני זוהר נוצלו כדי לספק את האפיונים הכמותיים והשיטתיים ביותר בתפזורת של קינטיקה תרגום תלוי כובע עד כה46,50, בדיקה מולקולה אחת המתוארת כאן מודד שינויים קינטיים חניכה ממוצעת עם רגישות רבה יותר מאשר בדיקה בתפזורת ( איור7). בנוסף, הנתונים של מולקולה אחת משמרים סטוכסטיות והטרוגניות של תרגום mRNA יחיד, תכונות ממוצעות במדידות בצובר. ניתן להשתמש ברזולוציה של מולקולה אחת של קינטיקה תרגום לניתוחים קינטיים שיטתיים כדי לחשוף תובנות של מנגנוני תרגום בלתי ניתנים להשגה בשיטות אחרות.
בדיקה זו תואמת לגישות ביוכימיות וגנטיות קיימות המשמשות בדרך כלל למחקרי תרגום. לדוגמה, הפונקציה התרגום של גורם מסוים ניתן ללמוד על ידי יצירת תמצית מרוקנת גורם ותוספת אותו עם סוג פראי או גורם מוטנט. בנוסף, על ידי השלמת גורם שכותרתו פלואורסצנטית, מחקרים יכולים לחקור את הקשר הקינטי בין מחייב גורם והתקדמות התרגום. עם השימוש בשני זוגות אפיטופים/נוגדנים נפרדים, פרוטוקול זה עשוי להתרחב ממבחנת צבע אחד לבדיקה בשני צבעים המאפשרת זיהוי בו-זמני של שני רצפי קידוד נפרדים. התאמה זו תאפשר מעקב אחר תרגום של מסגרות קריאה שונות וניתן להחיל על frameshifting ולהתחיל מחקרים בחירת האתר. לחלופין, ניתן להשתמש במערכת דו-צבעית כדי לזהות אינטראקציות נוגדנים עם פוליפפטידים מתויגים המקודדים על-ידי מסגרות קריאה פתוחות במעלה הזרם ובמורד הזרם כדי לפקח הן על אירועי תרגום במעלה הזרם והן במורד הזרם ב- mRNAs בודדים. הרחבות אלה יכולות לאפשר מגוון רחב של מחקרים מכניסטיים החוקרים תרגום תלוי כובע והרגולציה שלו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [R01GM121847]; מרכז הסרטן סלואן קטרינג הזיכרון (MSKCC) מענק תמיכה / מענק ליבה (P30 CA008748); ויוזמת הגנומיקה הפונקציונלית של MSKCC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X oil objective, N.A. 1.49 | Olympus | UAPON 100XOTIRF | |
| Acryamide/bis (40%, 19:1) | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Alkaline liquid detergent | Decon | 5332 | |
| Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) | UCT Specialties, LLC | A0700 | |
| Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD | Andor | DU-897U-CSO-#BV | |
| Andor Solis software | Andor | For controlling the Andor EMCCD | |
| Band-pass filter | Chroma | 532/640/25 | |
| Band-pass filter | Chroma | NF03-405/488/532/635E-25 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio Inc | Biotin-PEG-SVA | |
| Coenzyme A free acid | Prolume | 309-250 | |
| Coolterm software | For controlling the syringe pump | ||
| Desktop computer | Dell | For controlling the microscope, camera, stage, and pump. | |
| Dichroic mirror | Semrock | R405/488/532/635 | |
| Direct-zol RNA microprep 50RNX | Fisher Scientific | NC1139450 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Epoxy | Devcon | 14250 | |
| Firefly luciferin D-Luciferin free acid | Prolume | 306-250 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP1185500 | |
| Hydrogen perioxide | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | |
| Immersion oil | Olympus | Z-81226A | Low auto-fluorescence |
| Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
| MEGASCRIPT T7 Transcription Kit | Thermo fisher | AM1334 | |
| Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope slide | Thermo Scientific | 3048 | |
| Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 | Sigma-Aldrich | A9594 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio Inc | mPEG-SVA-5000 | |
| MS(PEG)4 | Thermo Scientific | 22341 | |
| NaCl (5M) | Thermo Scientific | AM9760G | |
| No 1.5 microscope Cover glass | Fisherband | 12-544-C | |
| Olympus Laser, 532nm 100mM | Olympus digital Laser system | CMR-LAS 532nm 100mW | |
| Olympus TirfCtrl software | Olympus | For controlling the laser intensity and incident angle | |
| Optical table | TMC vibration control | 63-563 | With vibration isolation |
| Phenol chloroform isoamyl alcohol mix | Sigma-Aldrich | 77617-100ml | |
| Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit | Thermo Scientific | 20160 | |
| Potassium hydroxide pellets | Sigma-Aldrich | P1767-500G | |
| Prior motorized XY translation stage | Prior | PS3J100 | |
| Prior PriorTest software | Prior | For controlling the Prior motorized stage | |
| Recombinant RNasin RNase Inhibitor | Promega | N2515 | |
| Stage top Incubator | In vivo scientific (world precision Instruments) | 98710-1 | With a custom built acrylic cage |
| Staining jar | Fisher Scientific | 08-817 | |
| Streptavidin | Thermo Scientific | 43-4301 | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300212 | |
| SYBR green II | Fisher Scientific | S7564 | |
| Syringe | Hamilton | 1725RN | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | 55-3333 | |
| Tris (1M), pH = 7.0 | Thermo Scientific | AM9850G | |
| Ultrasonic Bath | Branson | CPX1800H | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Vaccinia Capping system | New England Biolabs | M2080S | |
| Zymo-Spin IC Columns | Zymo Research | C1004 |
References
- Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
- Gebauer, F., Hentze, M. W.
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J.
- Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
- Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
- Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
- Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6 (2020).
- Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
- Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
- Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
- Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
- Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
- Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
- Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
- Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
- Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
- Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
- Fedyukina, D. V., Cavagnero, S.
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24 (2019).
- Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
- Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
- Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
- Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
- Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
- Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
- Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
- Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
- Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
- Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
- White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357 (2020).
- Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
- Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
- Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).
