Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Published: September 15, 2020 doi: 10.3791/61648
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Bireysel çeviri olaylarını izlemek, kap bağımlı çeviri mekanizmalarının yüksek çözünürlüklü kinetik çalışmalarına izin verir. Burada floresan etiketli antikorlar ve epitop etiketli nascent peptitler arasındaki görüntüleme etkileşimlerine dayanan bir in vitro tek moleküllü test gösteriyoruz. Bu yöntem, aktif in vitro kap bağımlı çeviri sırasında başlatma ve peptit uzama kinetiğinin tek moleküllü karakterizasyonunu sağlar.

Abstract

Kap bağımlı protein sentezi ökaryotik hücrelerde baskın çeviri yoludur. Çeşitli biyokimyasal ve genetik yaklaşımlar, kap bağımlı çeviri ve düzenlemesinin kapsamlı çalışmalarına izin vermiş olsa da, bu çeviri yolunun yüksek çözünürlüklü kinetik karakterizasyonu hala eksiktir. Son zamanlarda, kap bağımlı çeviri kinetiğini tek molekül çözünürlüğü ile ölçmek için bir in vitro test geliştirdik. Test, floresan etiketli antikorun nascent epitop etiketli polipeptide bağlanmasına dayanmaktadır. Antikorların nascent peptid–ribozom-mRNA komplekslerine bağlanması ve ayrışması görüntülenerek, bireysel mRNA'lardaki çeviri ilerlemesi izlenebilir. Burada, mRNA ve PEGylated slayt preparatları, çevirinin gerçek zamanlı görüntülenmesi ve tek molekül yörüngelerinin analizi de dahil olmak üzere bu tahlilin oluşturulması için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, kapak bağımlı çeviri olaylarının izlenmesini sağlar ve başlatma ve uzama oranları gibi anahtar çeviri kinetiğini çözümler. Test, farklı çeviri sistemlerine yaygın olarak uygulanabilir ve kap bağımlı çeviri kinetiği ve çeviri kontrol mekanizmalarının in vitro çalışmalarına geniş ölçüde fayda sağlamalıdır.

Introduction

Ökaryotik sistemlerde çeviri ağırlıklı olarak 7-metilguanosin (m7G) kap bağımlı yollar1yoluyla gerçekleşir. Çalışmalar, ökaryotik çevirinin başlangıç adımının hız sınırlayıcı ve yönetmelik2, 3,4için ortak bir hedef olduğunu göstermektedir. Kapak bağımlı çeviri mekanizmaları genetik5, biyokimyasal6, 7 ,8,yapısal9ve genomik10 toplu yaklaşımlar kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu yöntemler kap bağımlı başlatmayı düzenleyen çeşitli mekanizmalar tanımlamış olsa da, çözünürlükleri onları heterojen ve zaman uyumsuz başlatma olaylarından gelen sinyallerin ortalamasıyla sınırlar. Daha yakın zamanda, bireysel in vivo çeviri olayları, nascent polipeptidleri 11 , 12 , 13,14üzerindeki epitoplara floresan antikor bağlanmasını ölçen yöntemlerle görselleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yeni yaklaşımların bireysel başlatma olaylarını çözme yetenekleri de sınırlıdır, çünkü çoklu floresan antikorların, tek çeviri olaylarının yüksek hücre içi floresan arka plandan çözülmesine izin vermek için bir nascent peptid bağlaması gerekir. Birçok biyolojik etkileşimde, çözülen bireysel kinetik olaylar, moleküler düzeyde senkronize olması mümkün olmayan karmaşık çok noktalı ve tekrarlayan biyolojik süreçleri anlamak için kritik içgörüler sağlamıştır. Kap'a bağımlı başlatma ve düzenlemenin daha iyi anlaşılması için bireysel çeviri olaylarının dinamiklerini izleyebilecek yeni yöntemlere ihtiyaç vardır.

Yakın zamanda tek moleküllü çözünürlük15ile kap bağımlı başlatma kinetiğini ölçen bir in vitro test geliştirdik. Bu başlangıç yolu3,16'da yer alan çok sayıda bilinen ve bilinmeyen protein faktörü göz önünealındığında,tek moleküllü test, hücresel faktörlerin korunmasından ve sağlam çeviri aktivitesinden yararlanmak için mevcut in vitro hücresiz çeviri sistemleriyle uyumlu olacak şekilde geliştirilmiştir17,18,19,20,21,22,23,24,25. Ayrıca, hücresiz çeviri sistemlerinin kullanımı, tek moleküllü gözlemler ve önceki toplu sonuçlar arasında daha uyumlu karşılaştırmalar sağlar. Bu yaklaşım, yeni tek moleküllü kinetik içgörülerin, kap bağımlı başlatmanın mevcut mekanistik çerçevesine doğrudan entegrasyonunu sağlar. Tek moleküllü tahlil oluşturmak için, geleneksel hücresiz çeviri sistemi üç şekilde değiştirilir: bir muhabir mRNA'nın açık okuma çerçevesinin (ORF) başına bir epitop kodlama dizisi eklenir; muhabir mRNA'nın 3′ ucu, mRNA'nın tek moleküllü algılama yüzeyine uç bağlamasını kolaylaştırmak için biyotinillenmiştir; ve floresan etiketli antikorlar çeviri özüne desteklenir. Bu değişiklikler sadece temel moleküler biyoloji tekniklerini ve yaygın olarak bulunan reaktifleri gerektirir. Ayrıca, bu değişiklikler ve tek moleküllü görüntüleme koşulları, toplu hücre içermeyen çeviri reaksiyonlarının çeviri kinetiğini korur15.

Bu tahlilde (Şekil 1), 5′-end kapaklı ve 3′-uç biyotiniled muhabir mRNA bir akış odasında streptavidin kaplı bir algılama yüzeyine hareketsiz hale getirilir. Akış odası daha sonra floresan etiketli antikorlarla desteklenmiş hücresiz bir çeviri karışımı ile doldurulur. MRNA çevirisi epitop dizisi 26 , 27'nin aşağı akışında yaklaşık30-40kodon meydana geldiktensonra,epitop ribozom çıkış tünelinden çıkar ve floresan etiketli antikorla etkileşime girmek için erişilebilir hale gelir. Bu etkileşim hızlıdır ve tek moleküllü floresan görüntüleme teknikleri ile algılanmasını, aktif hücresiz çeviri sırasında tek moleküllü çözünürlükle çeviri kinetiğinin izlenmesini sağlar. Bu tahlil, özellikle çalışan toplu in vitro teste sahip sistemler için, kap bağımlı çeviri kinetiğinin in vitro çalışmalarına ve düzenlenmesine geniş ölçüde fayda sağlamalıdır.

Bu tek moleküllü tahlilin kurulmasının bir ön koşulu, ticari olarak mevcut olan veya daha önce açıklanan yöntemleri izleyerek hazırlanan çeviri özü kullanılarak elde edilebilen çalışan bir toplu hücre içermeyen çeviri tahlilidir28. Ökaryotik çeviri özü mantar, memeli ve bitki28dahil olmak üzere çeşitli hücrelerden elde edilebilir. Görüntüleme için, bu test ayarlanabilir lazer yoğunluğu ve olay açısı ile donatılmış bir TIRF mikroskobu, motorlu bir numune aşaması, motorlu akışkanlar sistemi ve numune sıcaklık kontrol cihazı gerektirir. Bu gereksinimler modern in vitro tek moleküllü TIRF deneyleri için geneldir ve farklı şekilde elde edilebilir. Burada sunulan deney, malzeme tablosundalistelenen ticari olarak kullanılabilen mikroskop, yazılım ve aksesuarlardan oluşan objektif tip bir TIRF sistemi kullanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Muhabir mRNA'nın nesli

  1. "Etiketli" bir muhabir mRNA için DNA transkripsiyon şablonu oluşturmak için bir N-terminus epitope etiket kodlama dizisi ekleyerek toplu test "etiketsiz" muhabir mRNA'yı kodlayan bir DNA transkripsiyon şablonunu değiştirin (Şekil 2A).
    NOT: Üstün hassasiyeti ve kısa 3xFLAG etiket uzunluğu nedeniyle bu test için 3xFLAG/bayrak karşıtı etkileşim önerilir. Bununla birlikte, test diğer epitop /antikor çiftleri ile uyumludur.
  2. Doğrusallaştırılmış DNA şablonları ve in vitro transkripsiyon kiti kullanarak etiketlenmemiş ve etiketli RNA'ları sentezleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Tipik olarak, 10-20 pmol in vitro transkript RNA, sistematik bir tek moleküllü çalışmaya izin vermek için sonraki RNA işleme için yeterlidir.
  3. Üreticinin tavsiyesine uyarak RNA 5′ ucini (Şekil 2B) bir m7G kapak kiti (bkz. Malzeme Tablosu)ile kapla.
  4. RNA 3′ ucu (Şekil 2B) ile sağlanan protokole göre bir biyotinilasyon kiti kullanarak biyotinilasyon kiti (bkz. Malzeme Tablosu). RNA'ları fenol-kloroform ekstraksiyonu ile saflaştırın ve ardından bir spin sütunu ile saflaştırın. 10-20 μL RNase içermeyen suda Elute RNA. Kırılmamış giriş RNA'sının yaklaşık %40-50'si kurtarılır.
  5. Daha önce açıklandığı gibi akrilamid jel elektroforezi ve RNA boyama denatüre ederek RNA bütünlüğünü ve konsantrasyonu değerlendirin29.
  6. Modifiye mRNA'nın ilgi çekici çeviri özelliklerini koruduğunu onaylamak için 3′-end-biotinylated etiketli muhabir mRNA ile toplu hücresiz çeviri30 gerçekleştirin. Örnek olarak, kapak bağımlı çeviri, toplu hücresiz çeviri tepkilerindeki muhabir faaliyetlerinin uncapped ve capped reporter mRNA'ları ile ölçülüp karşılaştırılarak doğrulanabilir (bkz. Temsili Sonuçlar).

2. Akış odası hazırlığı

  1. Mikroskop nesnel belirtimi sayfasında belirtildiği gibi uygun bir kapak kılıf kalınlığı seçin. Sırasıyla objektif veya prizma tipi toplam iç yansıma floresan (TIRF) görüntüleme sistemleri31için bir cam veya kuvars slayt seçin.
  2. Aşağıdaki değişikliklerle Chandradoss ve ark.32 tarafından açıklanan protokolü izleyerek kapak ve slaytın temizlik, tuzlulaştırma, pegylation ve oda montajını gerçekleştirin.
    1. %10 alkali sıvı deterjanda (v/v) delinmiş delikler içeren slaytları sonikasyonla 20 dakika boyunca yıkayın. Kalan tüm temizleme adımları için slaytları ve kapakları birleştirin.
    2. Aseton yıkama adımını atlayın. Piranha gravür inkübasyon süresini 20 dakikadan 1 saate uzatın. İlk tur PEGylation'ı 3 saat kuluçkaya yatırın. İkinci tur PEGylation'ı MS(PEG)4 ile 3 saat kuluçkaya yatırın.

3. Ekipman hazırlama

  1. Tek moleküllü bir deney yapmadan önce en az 3 saat, mikroskop inkübatörüyü açın ve deneylerin aşırı akustik bozulmasını önlemek için hava akışını düşük bir hıza düşürün. İnkübatör sıcaklığını hücresiz çeviri sistemi için en uygun sıcaklığa ayarlayın.
    NOT: Çeviri sıcaklığa karşı son derece hassastır. En uygun reaksiyon sıcaklığı her hücre ekstrakt sistemi için özeldir. Reaksiyon sıcaklığı karakterizasyonu, toplu hücresiz çeviri sisteminin geliştirilmesinde hayati bir adımdır. Bu tek moleküllü test, ilgili toplu çeviri koşuluyla aynı optimum sıcaklıkta yapılmalıdır.
  2. Tek moleküllü bir deney yapmadan önce en az 1 saat önce lazer kutusunun arkasındaki lazer güç düğmesine basarak lazeri açın, lazer güvenlik tuşunu çevirin ve başlat düğmesine basın; mikroskobu açın ve görüntüleme modunu, hedef ve filtre kümesini seçmek için dokunmatik ekran kontrol paneline dokunun.
  3. EMCCD kamerayı, Önceki sahne kumandasını ve şırınna pompasını güç düğmelerine basarak açın. EMCCD kamerayı kontrol etmek için bilgisayarı açın andor Solis (yazılım 1), lazeri kontrol etmek için TirfCtrl (yazılım 2), motorlu sahneyi kontrol etmek için PriorTest (yazılım 3) ve şırıngar pompasını kontrol etmek için Coolterm. Veri toplama başlamadan önce kameranın kendi belirlediği çalışma sıcaklığına soğumasını ve stabilize olmasını bekleyin.
  4. Yazılım 2'de, lazer dalga boyu, nesnel tip ve kırılma indeksi cam ve numune için doğru parametrelerin ayarlı olduğunu onaylayın. Bağlan düğmesini tıklatın. Lazer yoğunluğunu ayarlamak için lazer dalga boylarının yanındaki Kontrol düğmesini tıklatın, sonra lazer kontrolü açılır penceresinde yoğunluk slayt çubuğunu sürükleyin. Fiber konum slayt çubuğunu sürükleyerek veya ilgili penetrasyon derinliğini girerek lazeri istediğiniz açıya ayarlayın. Görüntüleme olmadığında lazeri Kapalı modda tutmak için Deklanşör kutusunun işaretlendiğinden emin olun.
    NOT: Deklanşör kutusunu işaretleyerek lazer deklanşörü açın ve kapatın. Test başlangıçta kurulurken, optimum tek molekül tespiti için farklı lazer yoğunlukları ve olay açıları test edilmelidir. Optimum lazer yoğunluğu, parlak tek moleküllü floresan ve floroforların hızlı fotobleachingini dengeler. Olay açısı, mRNA'ya bağlı antikorlar net bir şekilde çözülene kadar difüzör etiketli antikorlardan yüksek floresan arka planı azaltmak için kritik açının ötesine artırılmalıdır. Referans olarak, 532 nm lazer, antikor başına 2-7 boya etiketleme oranına sahip Cy3 etiketli anti-FLAG kullanılarak yapılan bir çalışmada71,5° olarak ayarlanmış lazer olay açısı ile hedefte 10 μW'a ayarlandı.
  5. Yazılım 1'de, Alma Modualtında Kinetik 'i seçin, pozlama süresi, kinetik seri uzunluğu ve EM kazanç değeri parametrelerini girin. Dizini seçin ve veri yansıma dosyasını kaydetmek için dosya adları atayın.
  6. Şırınna pompasını, sonraki boru yıkama adımı için mütevazı ve hızlı debiye ayarlayın.
    Pipet bir mikrofuge tüpüne% 70 etanol bir aliquot, etanol çözeltisine şırınga pompası boru ucunu yerleştirin ve boruyu yıkamak için şırınga pompasını çekme ve dağıtma modları arasında üç kez geçirmek için Coolterm'i kullanın. RNase içermeyen su kullanarak tekrarlayın.
    NOT: Boru uzunluğu, çeviri karışımının şırınna değil, sadece boruya temas etmesi için 5. Buradaki durulama hacmi, adım 5'teki çeviri karışımının sterilize edilmiş borularla temas halinde kalmasını sağlamak için dağıtılmış çeviri karışımının hacminden daha büyük olmalıdır.
  7. Son su durulama yapıldıktan sonra, boru ucunu temiz bir doku silme işlemine dabbing yaparak borunun içinden kalan suyu çıkarın. Boru ucunu temiz bir mikroyakıt tüpüne ayarlayarak kurutun.

4. 3′-end biyotinillenmiş mRNA'nın hareketsizleştirilmesi

  1. Hücre özü ve çeviri karışımını kuru buz üzerinde kullanımdan hemen önceye kadar saklayın. Kalan donmuş reaktifleri çözün ve buzda muhafaza edin.
  2. Akış odasını kapak tarafı aşağı bakacak şekilde mikroskop numune tutucusuna yerleştirin ve bantla yerine sabitleyin. Kullanılmayan akış kanallarının giriş ve çıkışlarını kapatmak için teyp kullanın.
  3. Pipet 1,5x hacim (kanal hacmine göre; adım 4 ve adım 5'teki diğer adımlar için de geçerlidir) 0,2 mg/ mL streptavidin akış kanalına ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yaslayın.
  4. İlişkisiz streptavidin çıkarmak için, kanalı yıkama başına 3x hacimli T50 yıkama tamponunda (20 mM Tris HCl, pH 7.0, 50 mM NaCl, 0.2 U/μL RNaz inhibitör reaktifi) pipetleme ile üç kez yıkayın.
    NOT: Sıvı atıkların kanala geri akmasını önlemek önemlidir. Akış kanalının çıkışı bir atık toplama tüpüne bağlı değilse, kanaldan akan sıvıyı emmek için çıkışın yanına katlanmış bir kağıt mendil yerleştirin.
  5. Çeviri ekstresini aktarın ve kuru buzdan buza karıştırın ve çözülmelerine izin verin.
  6. Hedefe bir damla daldırma yağı koyun. Akış odası ile mikroskop numune tutucusuna mikroskop aşamasına yerleştirin. Nesnel bağlantılarda daldırma yağı kapak kapağına temas edene kadar hedefi kapak kapağına yaklaştırın. Akış kanalının konumu doğrudan objektif lensin üzerinde olacak şekilde örnek aşamayı hareket ettinin.
  7. Yazılım 2'de lazer deklanşörini açın ve lazer yoğunluk seviyesini ayarlayın.
  8. Mikroskop kontrolü dokunmatik ekranında, Netleme sekmesini seçin ve Odak Arama ve Başlat düğmesini tıklatın. Bir odak düzlemi başarıyla elde edildiğinde bir bip sesi duyulur.
  9. Yazılım 1'de akış kanalı yüzeyini Canlı modda görüntüleyin. Dokunmatik ekrandaki ince adım kontrolüyle objektif konumu ayarlayarak odağı daha keskin bir görüntü için optimize edin.
  10. Yazılım 3'te, akış kanalı algılama yüzeyinin çeşitli alanlarında floresan arka plan düzeyini değerlendirmek için sahne alanını hareket ettinin. Floresan düşükse, deneye devam edin. Floresan arka planı aşırı yüksekse, akış kanalını atmayı düşünün.
  11. Yazılım 2'de lazer deklanşöre kapatın.
  12. T50 yıkama tamponu akış kanalından pipet ve hemen pipet akış kanalına biyotinillenmiş mRNA çözeltisinin 2x hacminde. 15 dakika kuluçkaya yaslanın.
    NOT: Her bir mRNA hazırlama grubu için, tek moleküllü algılama için gerekli mRNA yüzey yoğunluğunu elde etmek için mRNA konsantrasyonları ve kuluçka süreleri test edilmelidir. Uygun mRNA yüzey yoğunluğu, ~%5'ten fazla örtüş olmayan floresan lekeler gösteren antikor bağlamasına aracılık eder (bkz. Temsili Sonuçlar). Başlangıç noktası olarak, 2-20 nM konsantrasyonda biyotinillenmiş mRNA önerilir.
  13. Yıkama başına 3x hacimli çeviri uyumlu arabellek pipetleme yaparak kanalı üç kez yıkayın.

5. Tek molekül tespiti için çeviri karışımı montajı ve bir akış kanalına teslimi

  1. Buzda, mRNA'yı atlamak ve floresan etiketli antikorların optimize edilmiş konsantrasyonu ile takviye dışında, 1.7 adımından toplu çeviri protokolünü izleyerek çeviri karışımının3x hacmini bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. Çeviri karışımını tüpün dibinde toplamak için mikrosantrifüj tüpünü kısaca döndürün.
    NOT: Tahlil kurulurken farklı antikor konsantrasyonları test edilir. Optimal konsantrasyon, algılama yüzeyine düşük miktarda nonspesifik antikor bağlama ve nascent peptide hızlı antikor bağlama gösterir (tahlil kalibrasyon ayrıntıları için sırasıyla 7.1. ve 7.2. adımlara bakın).
  2. Çeviri karışımını 0,7 mL mikrobuge tüp kapağının içine aktarın. Şırınd pompasını çekme moduna ayarlayın. Pompa boru ucunu çeviri karışımına yerleştirin. Çeviri karışımını pompa tüpüne toplamak için şırınna çekmeyi başlatın. Şırınd pompası ayarını dağıtım moduna ters çevirin ve akışı çeviri karışımı teslimatı için en uygun fiyata ayarlayın.
    NOT: Pompa tüpüne aktarırken çeviri karışımında kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Çeviri karışımını borunun 3.6 adımında sterilize edilmemiş ve durulamamış kısmına çok derine çekmekten kaçının. Testi kurarken, en uygun oranı belirlemek için farklı teslimat akış hızları test edilir (tahlil kalibrasyonu ile ilgili ayrıntılar için adım 6.2'ye bakın).
  3. Boru ucu ve çeviri karışımı arasında bir boşluk varsa, şırınna pompasını başlatın ve çeviri karışımının boru ucuna ulaşmasına izin verin, ardından şırınna pompasını durdurun.
  4. Pompa boru ucunu akış kanalının girişine yerleştirin. Bağlantıyı gerçekleştirirken çeviri karışımına hava kabarcıkları sokmaktan kaçının. Özel yapım metal braketi mikroskop numune tutucu plakasına vidalayarak bağlantıyı stabilize edin. Mikroskop odağını ve görüntüleme alanı floresanını değerlendirin.
    NOT: Boru, daha önce açıklandığı gibi özel bir parça ile akış odasına sıkıştırılabilir33. Bu test için diğer akışkan sistemleri de kullanılabilir34. Görüş alanı, boruyu bağlamadan önce ve bağladıktan sonra benzer görünmelidir. Bağlantıdan sonra daha fazla floresan leke ortaya çıkarsa, çeviri karışımı muhtemelen teslimat tüpünden sızıyor olabilir. Uygulamaya bağlı olarak, sızan çeviri karışımına sahip kanalın atılması gerekebilir.
  5. Film alma parametrelerinin doğru olduğunu ve dosyaları kaydetmek için uygun dosya adının ve dizininin girildiğini onaylayın.
  6. Akış kanalı algılama yüzeyinin ortasındaki bir alanı görüntüleyemek için sahne alanını hareket ettinin. Mikroskop kontrolü dokunmatik ekranında, Sürekli AF sekmesini seçin ve deneme sırasında odak konumunu korumak için Odak Arama ve Başlat düğmesini tıklatın. Bir odak düzlemi başarıyla elde edildiğinde bir bip sesi duyulur.
  7. Yazılım 2'de lazer deklanşöre açın. Yazılım 1'de, kaydetmeye başlamak için Sinyal Al düğmesini tıklatın. Yaklaşık 5 s kayıt olduktan sonra, çeviri karışımını akış kanalına teslim etmek için Coolterm'deki Çalıştır komutunu girin. 0,5–2 s/kare zaman çözünürlüğü ile 2 saate kadar kayıt.
    NOT: Veri toplamanın maksimum süresi, çeviri ekstresinin zaman içinde aktiviteyi ne kadar hızlı kaybettiğine bağlıdır, bu da luciferaz reporter mRNA ile toplu hücre içermeyen çeviri yapmak ve farklı zaman noktalarındaki çeviri reaksiyonlarında luciferaz aktivitesini ölçmekle rahatça karakterize edilebilir35.
  8. Veri toplama tamamlandığında, lazeri kapatın, mikroskop kontrol dokunmatik ekranındaki Sürekli AF'yi kapatın ve boruyu akış odasından sökün.
  9. Çeviri karışımını akış kanalı girişinden pipetleyin, bir mikrofuge tüpüne aktarın ve tüpü sıvı nitrojene yerleştirerek çözeltiyi çıtlatın. Daha sonra -80 °C'de saklayın.
  10. Şırınna pompası borularını RNase içermeyen suyla üç kez, ardından% 70 etanol ile üç kez yıkayın. Depolama için şırınna pompası tüpüne% 70 etanol çekin.
  11. Mikroskobu ve tüm aksesuarları kapatın. Temizlemek.

6. Veri analizi

NOT: Bu test için veri analizi, tek moleküllü biyofiziksel çalışmalarda yaygın yöntemler gerektirir. Hesaplama açısından yoğun tüm adımlar mevcut algoritmalar ve yazılımlar kullanılarak elde edilebilir (referanslar aşağıda ilgili adımlarında yer almaktadır).

  1. İsteğe bağlı: Varsa, alınan görüntü serisi dosyasını seçilen görüntü işleme yazılımı veya programlama diliyle uyumlu bir biçime dönüştürün.
  2. Çeviri reaksiyon başlangıç noktasını ve reaktif değişim süresini belirleyin.
    NOT: Çeviri karışımındaki floresan antikorların yayılması nedeniyle, çeviri uyumlu tampondan çeviri karışımına kanal içi reaktif değişimi sırasında görüntülenmiş bir alanın arka plan floresan yoğunluğu artacaktır. Çeviri reaksiyon başlangıç noktası, reaktif değişiminin tamamlanmış olduğu zaman noktası olarak ayarlanır. Bu tamamlama noktası, çeviri karışımı teslimatı sırasında arka plan floresan yoğunluğunun ölçülmesi ve artan floresan yoğunluğu platolarının15, aşağıda açıklandığı gibi zaman noktasını belirleyerek bulunur.
    1. Görüntü çerçevesi başına toplam floresan sayısını hesaplayın ve ilgili zaman profilini çizin. Zaman profili çiziminde toplam floresandaki ani artışı tanımlayın.
      NOT: Toplam floresan artışı, reaktif değişimi sırasında floresan etiketli antikor konsantrasyonunun artmasından kaynaklanmaktadır.
    2. Toplam floresan artış aşamasının bitiş noktasını tanımlayın ve bu zaman noktasını çeviri reaksiyonunun başlangıç noktası (yani zaman 0) olarak ayarlayın. Toplam floresan artış aşamasının hem başlangıç hem de bitiş noktalarını tanımlayın ve zaman farkını reaktif değişim süresi olarak ayarlayın.
      NOT: Reaktif değişiminin toplam zaman aralığı akış kanalı boyutlarına ve seçilen akış hızına bağlıdır. Reaktif değişimi tamamlanmadan önce bazı çeviri faktörlerinin mRNA'ya bağlanmaya başlaması mümkündür, bu da belirlenen ilk tur başlatma süresinin çözünürlüğünü azaltabilir. Bu nedenle, 0,5–2 s/kare veri toplama hızları için 3–4 s içinde reaktif değişiminin tamamlanmasına izin veren test ve akış hızlarını seçerken farklı akış hızlarının test etmesi önerilir.
  3. İsteğe bağlı: Film sürüklenme düzeltmesi gerçekleştirin.
    NOT: Mikroskop parçalarının ve aksesuarlarının sürüklenmesi nedeniyle veri görüntüsündeki bağlı antikorların konumları zamanla değişebilir. Bir filmde görsel olarak fark edilen sürüklenme, veri analizine devam etmeden önce düzeltme gerektirir. Çeşitli uzamsal sürüklenme düzeltme algoritmaları ve komut dosyaları mevcuttur36,37,38.
    1. Her görüntüde, her karedeki bağlı antikorların konumlarını piksel düzeyinde doğrulukla belirlemek için piksel sayılarındaki yerel maxima'yı bulun. Piksel sayısı için yalnızca arka plan gürültüsünün üzerinde açıkça görünen noktalar seçilecek şekilde bir eşik ayarlayın.
    2. Ardışık iki görüntü çerçevesi arasındaki her yöndeki bireysel antikor konumlarının değişikliklerini hesaplayın.
    3. Ardışık iki kare arasında antikor konum değişiklikleri histogramını çizin ve bunu her yön için ayrı ayrı yapın. Gauss her histograma uyar ve tepelerin merkez konumunu ardışık iki kare arasında yön kayması olarak ayarlar.
    4. Gözlemlenen sürüklenmeyi önlemek için, her görüntü karesini hesaplanan sürüklenme miktarına göre ters yönde kaydırın.
  4. Tek moleküllü yörüngeler oluşturun.
    NOT: Parlak noktaları tanımlamak ve yoğunluklarını veri görüntü serisi39,40'tançıkarmak için algılama / izleme yazılımı mevcuttur.
    1. Adım 6.3.1'de açıklandığı gibi antikor pozisyonlarını tanımlayın.
      NOT: Seçilen eşiğin parçacıkların aşırı aşırı veya az toplanmasına yol açmamasını sağlamak için görsel inceleme önerilir. Görsel inceleme, tanımlanan centroid konumlarının her görüntü çerçevesinin üzerine bindirilmesi ve sözleşmelerinin görsel olarak değerlendirilmesi ile elde edilebilir (bkz. Temsili Sonuçlar).
    2. Tüm çerçevelerden toplanan parçacıkları birleştirin ve gereksiz parçacık konumlarını çıkarın.
    3. Bağlı antikorların görüntülerini görsel olarak inceleyin ve pikselleri arka planın üzerinde ve ayrı ayrı bağlı antikorun temsilcisi olan sayımlarla kaplayan kare bir alan seçin.
      NOT: Nokta yayma işlevi (yani, tek bir molekül için karenin boyutu) optik kurulum ve dedektör piksel boyutu ile belirlenir.
    4. Her parçacık konumu için, parçacık konumunun etrafındaki kare alandaki tüm piksellerin toplam yoğunluğunu hesaplayarak tek moleküllü bir yörünge oluşturun. Yörüngeler her konum, kare kare ve tüm veri filmi için oluşturulur.
  5. İsteğe bağlı: Tek moleküllü yörüngelerde arka plan gürültüsünü azaltmak için doğrusal olmayan bir ileri-geri filtresi41 uygulayın.
  6. İsteğe bağlı: Mevcut adım algılama algoritmaları42 , 43,44,45ile yörüngeleri dijitalleştirin.
    NOT: Adım algılama algoritmasının seçimi, tek moleküllü dinamiklerin karmaşıklığına bağlıdır. Sadece izole ribozom çevirisinin en basit senaryosu (yani polisome oluşumu yok) ve gürültü oranına iyi sinyal için, tek moleküllü yörüngelerde antikor bağlama ve ayrışma olaylarının zamanlamasını belirlemek için floresan sayılarına bir eşik uygulaması yeterlidir. Yörünge adımlarının bir adım algılama stratejisi tarafından uygun şekilde seçildiğinden emin olmak için her koşul için en az 100 yörüngenin görsel olarak incelenmesi önerilir.
  7. Dijitalleştirilmiş yörüngeler kullanarak veya düzensiz yörüngelere bir eşik uygulayarak, her yörünge için ilk antikor bağlama olayının zamanını belirleyin (yani, ilk varış saati, t1).
    NOT: İlk varış saati dağılımının ortanca değeri farklı çeviri koşulları arasında karşılaştırılabilir. Alternatif olarak, ilk varış saati dağılımı, ortalama değer 15 <t1>belirlemek için kaydırılmış(3 parametreli) günlük normal işlevine takılabilir. İlk varış saati dağılımı genellikle eğriltilmiş ve uzun bir kuyruğa sahip olduğundan, gözlemlenen ilk varış zamanları üzerinden doğrudan ortalama alarak ortalamayı hesaplamayın.
  8. İsteğe bağlı: Ortalama peptit sentez oranının süresi analizi ve hesaplanması.
    1. Her yörüngede monozomlu (tek ribozom) çeviri olaylarını tanımlamak ve tek bağlama olay bekleme sürelerini karşılık gelen antikor bağlama ve ayrışma olayları arasındaki zaman farkı olarak hesaplamak için dijitalleştirilmiş yörüngeleri kullanın.
      NOT: Yörüngeleri dijitalleştirmek için adım algılama algoritmaları, birden fazla moleküler olay zamanla çakıştığında genellikle daha az güvenilirdir. Bu nedenle, polizom olaylarının durma süresi analizinden hariç tutulması önerilir. Polizom olaylarla zenginleştirilmiş ve nadiren monozomlu olaylar gösteren son derece aktif çeviri sistemleri için, tek moleküllü yörüngelerde izole çeviri olaylarını gözlemleme şansını artırmak için etiketli ve etiketsiz antikorların bir karışımı kullanılabilir.
    2. Dağılımı günlük normal işlevine sığdırın ve ortalama oturma süresini hesaplamak için takılı işlevi kullanın.
      NOT: Bekleme süresi dağılımları genellikle uzun kuyruklarla eğriltildiği için, ortalamanın doğrudan gözlemlenen bekleme sürelerinin ortalamasını alarak hesaplanması önerilmez.
    3. Toplam ORF kodon sayısından epitop amino asit uzunluğunun toplamını ve 35'ini (ribozom çıkış tüneli içindeki nascent peptidin ortalama amino asit uzunluğu) çıkararak antikor bağlama uzunluk süresi boyunca çevrilen amino asitlerin sayısını belirleyin.
    4. Ortalama peptit sentez oranını belirlemek için, çevrilen amino asitlerin sayısını ortalama durma süresine bölün.
  9. İsteğe bağlı: Ortalama ilk tur başlatma süresinin hesaplanması (<t1_I>).
    NOT: Başlatma yeri sırası bağlamı ve kodlama sırası gibi başlatma ve uzama koşulları, başlatma kinetiği çalışmaları için genellikle kasıtlı olarak korunur. Bu nedenle, adım6.7'denitibaren ortalama ilk varış saati <t1 > . farklı koşullar arasındaki ilk tur başlatma kinetiğindeki değişimi hesaplamak için doğrudan kullanılabilir. Aşağıdaki düzeltme yalnızca ilk tur başlatma süresinin gerçek değerini belirlemek için gereklidir.
    1. Bu N-terminal bölgesinin ortalama peptit uzama süresini hesaplamak için epitop uzunluğunun toplamını ve 35'i (ribozom çıkış tüneli içindeki nascent peptid'in ortalama amino asit uzunluğu) ortalama peptit sentez hızına (adım 6.8.4.) bölün (<t1_tag>).
    2. İlk varış saati ilk tur başlatma süresi ve t1_tagtoplamı olduğundan, ortalama ilk varış saatinden <t1_tag> çıkarın <t1> ortalama ilk tur başlatma süresini hesaplamak için <t1_I>: <t1_I> = <t1> - <t1_tag> >

7. Tahlil kalibrasyonu

NOT: Tahlil ilk kurulurken aşağıdaki kalibrasyon adımlarını uygulayın.

  1. Antikor bağlama özgüllüğünü incelemek için, etiketlenmemiş ve etiketli mRNA'lar için 4 ve 5 bölümlerindeki protokol adımlarını ayrı ayrı gerçekleştirin (Şekil 2). Bu ilgili mRNA'lara sahip kanallardaki antikor bağlama düzeyleri, algılama yüzeyine spesifik olmayan antikor bağlanmasının ve nascent peptide özgül antikor bağlanmasının kapsamını temsil eder.
    NOT: Spesifik olmayan bağlama oranının >10 olması önerilir ve farklı yüzey pasivasyon stratejileri, daha düşük antikor konsantrasyonu veya daha yüksek mRNA yüzey yoğunluğu ile arttırılabilir.
  2. Antikor bağlama oranını ölçmek için, protokolü adım 4 ile adım 5 arasında ekstra bir adımla gerçekleştirin.
    1. 4. adımdan sonra, kanalı önceden mRNA/ribozom/peptit kompleksleri oluşturmak için antikordan yoksun çeviri karışımı ile kuluçkaya yatırın.
    2. Ardından 5.
    3. önceden oluşturulmuş nascent peptide karşı ortalama antikor bağlama oranını ilk varış zamanı histogramına üstel montaj ile ölçün.
      NOT: Önceden oluşturulmuş peptide antikor bağlanması saniyeler sırasına göre hızlı olmalı ve çeviri kinetiğinden daha hızlı olmalıdır. Antikor bağlama oranını artırmak için daha yüksek bir antikor konsantrasyonu kullanılabilir.
  3. Florofor etiketli antikorun fotostability.
    1. Adım 2'deki protokole göre bir slayt hazırlayın, ancak PEGylation adımını atlayın. Salinizasyon adımından sonra akış odasını birleştirin. Silane kaplama, algılama yüzeyine verimli spesifik olmayan antikor bağlanmasına izin verir.
    2. Algılama yüzeyine spesifik olmayan antikor bağlamanın tek moleküllü yoğunluğunu elde etmek için floresan etiketli antikorları kanala ekleyin. T50 yıkama tamponunda yüksek oranda seyreltilmiş floresan etiketli antikor ekleyerek başlayın ve istenen tek molekül yoğunluğu elde edilene kadar antikor konsantrasyonu kademeli olarak artırın.
    3. Antikor floresanının çoğu artık tespit edilemeyene kadar algılama yüzeyini görüntüleyin.
    4. Florofor fotobleachinge bağlı antikor floresan kaybı oranını değerlendirmek için zaman içinde toplam görünür antikor sayısını çizin.
      NOT: Antikor etiketlemesi tipik olarak antikor başına birden fazla florofor verir. Tüm konjuge floroforlar fotobleach olana kadar bireysel antikorlar tespit edilebilir kalır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Açıklanan protokolün ardından, 3' son bağlı muhabir mRNA'nın aktif hücresiz çevirisi sırasında tek molekül çözünürlüğü ile nascent N-terminal etiketli polipeptitlerle bireysel antikor etkileşimlerinin görüntülenmesini sağlar (Şekil 1). Üç sentetik mRNA'nın kullanımıyla minimum bir gösteri deneyi rapor edilir: LUC (etiketlenmemiş lucifeaz kodlama), LUCFLAG (3xFLAG etiketli lucifease kodlaması) ve hp-LUCFLAG (5' lider bölgesinde kararlı bir kök döngüye sahipLUCFLAG) ( Şekil2C). Luciferaz kodlayıcı mRNA kullanımı, tek moleküllü gözlemler ve dökme lüminesans ölçümleri arasında karşılaştırmalar sağlar. 3' biyotinilasyonlu mRNA'nın bütünlüğü poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ve RNA boyama denatürasyonu ile değerlendirildi. Kaliteli mRNA tek bir temiz bant gösterir ve ek daha hızlı geçiş sinyalleri göstermemelidir (Şekil 3A). Saccharomyces cerevisiae çeviri özü burada kullanıldı ve daha önce30 olarak tanımlanan ve15değiştirilmiş bir protokolden sonra hazırlandı. Maya özü ve biyotinillenmiş LUCFLAG mRNA ile hücresiz çeviri reaksiyonlarında luciferaz aktivitesinin toplu ölçümleri, m7G kapağından yoksun veya içeren LUCFLAG mRNA çevirisinin kapak uyarılmasını gösterir ( Şekil3B).

Tek moleküllü görüntüleme için çeviri özü 67 nM Cy3 etiketli anti-FLAG antikor (Cy3-αFLAG) ile desteklenmiştir. Bu antikorun antikor başına 2-7 boya yüksek etiketleme oranı vardı. 532 nm lazer hedefte 10 μW olarak ayarlandı. Lazer olay açısı 71,5° olarak ayarlandı, bu da kurulumuz için 63,8° kritik açıdan daha büyüktü. mRNA içeren ancak çeviri karışımı olmayan algılama yüzeylerinden düşük bir floresan seviyesi görüntülenmiştir (Şekil 4A). Yaklaşık 2 mm (genişlik) x 50 μm (derinlik) x 24 mm (uzunluk) kanal boyutları için, 150 μl/dk akış iletim hızı 3 – 4 sn reaktif değişim süresi sağladı. Çeviri karışımı teslimatından 5 s içinde, difüzör floresan antikorlar nedeniyle arka plan floresan seviyesi artar. LUCFLAG mRNA içeren kanallara çeviri karışımı teslim edildikten yaklaşık 2 dakika sonra, Cy3 noktaları bir görüş alanında görünmeye başladı ve ~30 dakika boyunca birikmeye devam etti (Şekil 4B). 3xFLAG eksikliği LUC mRNA (Şekil 2C) kullanılarak ölçülen yüzeye spesifik olmayan antikor bağlanması çok düşük bir seviyede kaldı15. mRNA/ribozom/peptide bağlı Cy3- αFLAG sinyalleri optimize edilmiş lazer olay açısı ile açıkça görülebiliyordu, ancak daha düşük lazer olay açılarına sahip yüksek floresan arka plan ile maskelenebilirdi (Şekil 4C).

Cy3-αFLAG bağlama olaylarını analiz etmek için, seçilen Cy3-αFLAG noktalarının floresan yoğunlukları (Şekil 5A) tüm film için kare kare hesaplandı ve daha sonra bir yoğunluk yörüngesi oluşturmak için bağlandı (Şekil 5B). Ham yörüngeler gürültülü görünebilir ve arka plan gürültüsünü azaltmak için doğrusal olmayan ileri-geri filtre ile iyileştirme gerektirebilir41. Yörüngeleri dijitalleştirmek için adım algılama algoritmaları kullanılarak daha fazla iyileştirme elde edilebilir42. Tüm yörüngeler için, çeviri karışımındaki dağınık floresan antikorlar nedeniyle reaktif değişimi sırasında evrensel bir arka plan floresan seviyesi artışı ortaya çıkar (Şekil 5B). Nascent polipeptide antikor bağlanması floresanda anlık bir artışa neden olurken, mRNA'dan antikor/polipeptid ayrışması anlık bir floresan azalmasına neden olur (Şekil 5B).

Antikor bağlamanın durma süresi, açık bir okuma çerçevesinin toplam dekodlama süresini ölçmek için kullanılabilir. LUCFLAG mRNA için bekleme süresi histogramı bir log-normal dağılımına (Şekil 6A) uyar ve saniyede 2,5 ± 0,1 amino asit peptit sentez oranı15verir. İlk varış saati histogramı kaydırılmış (3 parametreli) günlük normal işlevine(Şekil 6B)uyar. İlk varış zamanı histogramının geniş yayılımı, tek mRNA çeviri aktivitesinde yüksek heterojenlik derecesini gösterir. Histogram, tek LUCFLAG mRNA moleküllerindeki ilk peptit sentezi olayının çeviri karışımı teslimi(Şekil 6B)sonrasında 2 dk kadar erken ve 20 dk kadar geç başlayabileceğini belirtmiştir. LUCFLAG mRNA ile yapılan çeviri ile karşılaştırıldığında, hp-LUCFLAG mRNA çevirili ilk varış zamanı histogramı daha yavaş antikor bağlaması göstermiştir ( Şekil7A). Bununla birlikte, aynı mRNA'larla hücresiz çeviri reaksiyonlarından toplu lüminesans ölçümleri kullanmak, çeviri kinetiğindeki farklılıkları çözmez (Şekil 7B,C). Bu sonuçlar, başlatma kinetiğindeki küçük değişiklikleri tespit etmek için toplu kinetik luciferaz aktivite ölçümlerine kıyasla yöntemimizin daha yüksek çözünürlüğünü göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Protokol akış şeması. Kapak ve slayt hazırlama, tek moleküllü oda montajı, TIRF görüntüleme ve veri toplama ve veri analizi adımlarının şematik gösterimleri gösterilmiştir. TIRF görüntüleme adımı, bir akış kanalında mRNA hareketsizleştirme ve çevirinin şematik tasvirlerini içerir. Algılama yüzey bileşenleri, floresan etiketli antikor ve hücre özü bileşenleri belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Tek moleküllü test için mRNA tasarımları. (A) Toplu çeviri testini tek moleküllü teste uyarlamak için, toplu muhabir ORF'nin DNA şablonu, etiketli bir muhabir kodlama ORF'si oluşturmak için bir N-terminal epitope etiket dizisi eklemesi ile değiştirildi. ORF ve N-terminal etiket kodlama bölgeleri belirtilir. (B) mRNA'lar kapağa bağımlı çeviriye izin vermek için 5′-m7G kapladı ve tek moleküllü algılama yüzeyine hareketsiz hale getirilmesi için 3′-biyotinylated. Etiketsiz ve etiketli ORF RNA'larda 5′-m7G kapak ve 3′-biotin belirtilir. (C) Tek moleküllü tahlilleri göstermek için luciferaz kodlayıcı mRNA'lar kullanıldı. LUC ve LUCFLAG mRNA'lar, sırasıyla N-terminal 3xFLAG etiketinden yoksun ve içeren luciferase kodlar. hp-LUCFLAG mRNA, LUCFLAG mRNA 5′-liderinde bir saç tokası ikincil yapısını tanıtan ek bir ekleme içerir. Saç tokası termositliği, 3′-poli(A) kuyruk ve 3′-biotin belirtilir. Her üç mRNA daha verimli kapak bağımlı çeviri için bir 30 nt 3′-poly(A) kuyruk içeriyordu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Tek moleküllü muhabir mRNA bütünlüğü ve toplu çeviri. (A) Tek moleküllü muhabir mRNA'nın PAGE görüntülemesini temsil eden denatüre. 5′-m7G kapaklı ve 3′-biyotinillenmiş LUCFLAG mRNA, bir RNA merdiveninin yanındaki denatüre% 10 poliakrilamid jel üzerine yüklendi. (B) Tek moleküllü muhabir mRNA, toplu hücre içermeyen çeviri reaksiyonlarında 5' kapak bağımlılığını korudu. 3′-biyotiniled LUCFLAG mRNA eksik (–cap) ya da içeren (+ kapak) 5′-m7G kapak S. cerevisiae çeviri özü 30 dakika 25 °C çevrilmiştir. Luciferaz aktivitesi iki bağımsız reaksiyondan ölçüldü ve keyfi olarak 1.0 olarak ayarlanan –cap mRNA ile aktiviteye normalleştirildi. Ortalama değerlerden standart sapmalar hata çubuklarıyla gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Hareketsiz mRNA içeren algılama yüzeylerinin görüntülenmesi. (A) Çeviri karışımının yokluğunda arka plan floresan. (B) Çeviri karışımı teslimden 30 dakika sonra ve optimize edilmiş lazer olay açısı ile görüş alanında Cy3 floresan noktalar. (C) Çeviri karışımı teslimden 30 dakika sonra ve düşük lazer olay açısı ile görüntülenmiş görüş alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Görüntü analizi. (A) (sol panel) veya (sağ panel) nokta seçimi olmayan bir görüş alanındaki Cy3 noktaları. (B) Seçilen bir Cy3 noktası için örnek tek moleküllü yörünge. Siyah ok, çeviri karışımı iletimi sırasında antikorun yayılması nedeniyle arka plan floresanındaki artışı gösterir. Yeşil ok, Cy3-αFLAG bağlaması nedeniyle floresan yoğunluğundaki ani artışı gösterir. Kırmızı ok, mRNA'dan Cy3-αFLAG/nascent peptit ayrışması nedeniyle floresan yoğunluğundaki ani azalmayı gösterir. Cy3-αFLAG bağlama olayının durma süresi çift başlı bir okla gösterilir. Ham, filtre uygulanmış ve dijitalleştirilmiş veriler belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: LUCFLAG mRNA çevirisi ile Cy3-αFLAG bağlamasının kinetik analizi. (A) Cy3-αFLAG bağlama tutma süresi histogramı günlük normal dağılımına uyar. (B) Cy3-αFLAG bağlama ilk varış saati histogramı kaydırılmış (3 parametreli) günlük normal işlevine uyar. Wang ve ark.15'ten izin alınarak uyarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Tek moleküllü test, başlatma kinetiği için dökme lüminesans testinden daha yüksek bir çözünürlüğe sahiptir. (A) LUC FLAG ve hp- LUCFLAG mRNA'ların çevirisi ile Cy3-αFLAG bağlama için ilk varış zamanı histogramları, mRNA 5′-leader'daki küçük bir saç tokası yapısının neden olduğu daha yavaş başlatmayı ortaya koydu. N = 10650 yörüngeleri (LUCFLAG), 3 veri kümesinden ve N = 4079 yörüngelerinden (hp-LUCFLAG), 2 veri kümesinden birleştirilir. (B,C) Toplu luciferaz aktivitesi tahlil kinetik ölçümleri LUCFLAG (N = 9 veri kümeleri) ve hp-LUCFLAG (N = 6 veri kümeleri) mRNA çevirisi için başlatma kinetiğindeki farklılıkları çözmedi. (B) Dökme lüminesans kinetiği. (C) Vassilenko ve ark. 46. (C) deki kırmızı daireler ve çubuklar, hesaplanan ilk tur çeviri süresinin ortalama değerini ve standart sapmasıdır. Wang ve ark.15'ten izin alınarak uyarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tipik in vitro TIRF tek moleküllü deneylere kıyasla, burada açıklanan test ile tek moleküllü görüntüleme, hücre ekstresi ve floresan etiketli antikorun yüksek konsantrasyonu nedeniyle ek olarak karmaşıktır. Bir tur yüzey PEGylation'ın daha yaygın uygulaması ile karşılaştırıldığında, ikinci bir PEGylation turu (adım 2), algılama yüzeyine spesifik olmayan antikor bağlanmasını büyük ölçüde azaltır15. Difüzör floresan antikorların yüksek konsantrasyonu, antikor bağlamanın tek moleküllü algılanmasını maskeleyen son derece yüksek bir floresan arka plana neden olur. Bu floresan arka planı azaltmak için lazer olay açısı kritik açının çok üzerinde artırılmıştır (adım 3.4.). Antikor tespiti ayrıca aşırı florofor instabilitesi ile azalır, bu da durma süresini ölçme yeteneğini sınırlayabilir. Bu sorunla karşılaştığınızda, floroforu, üçlü durum quencher47'yekonjuge edilenler gibi daha fotoğraflanabilir bir floroforla değiştirin veya lazer aydınlatma yoğunluğunu düşürün. Oksijen atma sistemleri in vitro tek moleküllü deneylerde yaygın olarak 48,49,burada açıklanan test, herhangi bir oksijen atma sistemi uygulamadan çok cömert bir algılama penceresi sağlayabilir15. Ayrıca, oksijen atma sistemleri ökaryotik hücresiz çeviri verimliliğini büyük ölçüde azaltabilir. Bu nedenle, oksijen atma sistemleri bu test ile kullanılmadan önce dikkatlice değerlendirilmelidir.

Reaktif preparatındaki küçük varyasyonların, tek molekül çözünürlüğü nedeniyle test tarafından tespit edildiğini belirtmek önemlidir. Örneğin, çoğaltma çeviri özü preparatları toplu yöntemlerle algılanabilecek veya algılanamayan farklı etkinlikler görüntüleyebilir. Ayrıca, çeviri özü ve diğer reaktiflerin dondurarak çözme döngüleri çeviri aktivitesini hızla bozabilir. Sistematik bir çalışma planlamadan önce koşulları test etmek için kolayca erişilebilen materyallerle küçük ölçekli pilot deneyler yapmanızı öneririz. Sistematik bir çalışma için, çeviri reaktiflerinin büyük ölçekli preparatları, donma/çözülmeye duyarlı reaktifler için tek kullanımlık aliquotlar ve protokol adımlarının gerçekleştirilmesinde tutarlılık önerilir. Sıvı nitrojende dondurulan ve -80 °C'de depolanan çeviri özü en az iki yıl boyunca minimum aktivite kaybı gösterir. Bu önlemlerin uygulanması deneysel varyasyonları etkili bir şekilde bastırabilir ve tek moleküllü testlerin sağlamlığını artırabilir.

Bu yöntem mevcut toplu hücresiz çeviri sistemlerini ve in vitro tek moleküllü görüntüleme tekniklerini birleştirdiğinden, bu iki alandaki genel sorunların giderilmesi burada tartışılmamaktadır. Bu tür genel sorunlara örnek olarak muhabir mRNA veya PEGylated coverlip'in düşük kaliteli preparatları ve hücre ekstresinin düşük çeviri aktivitesi verilebilir. Burada, bu yönteme özgü konulara odaklanacağız. Protokolde tartışılan birkaç teknik konuya ek olarak, iyi aktiviteye sahip olması beklenen bir çeviri durumu için akış kanalında başka bir potansiyel sorun düşük veya antikor bağlama olmayabilir. Sorun gidermek için çeşitli olasılıklar vardır. Biyotinilasyonlu mRNA immobilizasyonunun algılama yüzeyine verimliliği, tamamlayıcı ve florofor konjuge DNA oligomerlerinin hareketsiz mRNA'ya tavlanması ve floresan DNA:RNA dublekslerinin görüntülenmesi ile değerlendirilebilir. Çeviri karışımının ve biyotinillenmiş muhabir mRNA'larının kalitesi toplu çeviri tahlili çalıştırılarak kontrol edilebilir. Ayrıca, mRNA-hareketsiz bir akış kanalında çeviri reaksiyonı gerçekleştirdikten sonra, çeviri reaksiyon çözümü kanal dışına borulanabilir ve kanal içi çevirinin oluşumunu doğrulamak için bir muhabir etkinliği testinde kullanılabilir. Gerekirse, muhabir aktivitesi tahlili ile daha kolay tespit edilmesine izin vermek için kanal içi çeviri reaksiyonunda aşırı yüksek bir mRNA yüzey yoğunluğu kullanılabilir.

Bu tahlilin en büyük sınırlaması, başlatma kinetiği için çözünürlüğüdür. Bu testte, doğrudan deneysel çıktı, ilk varış zamanı, hem ilk tur başlatma süresini hem de epitopun çevrilmesi için peptit uzama süresini ve 35 ek kodonu içerir. Peptit uzama süresinin katkısı düzeltilebilmesine rağmen (adım 6.9.), sonuç olarak bu test, kap'a bağımlı başlatmanın genel bir özelliği gibi görünen dakika sırasına göre meydana gelen başlatma kinetiğini ölçmek için en hassastır15. Deneysel olarak, bu tahlilleri diğer başlatma mekanizmalarını incelemek için uyarlamak kolaydır. Ancak, bir başlatma mekanizması saniyeler sırasına göre önemli ölçüde hızlı gerçekleşirse, bu tahlilin başlatma kinetiğini çözmesi olası değildir.

Burada açıklanan tek moleküllü yaklaşım, tek moleküllü görüntüleme ve ekstrakt tabanlı çeviriyi birleştirerek tek tek kapak bağımlı çeviri olaylarının gerçek zamanlı ve aktif hücresiz çeviri sırasında ölçümlerini sağlar. Test, toplu çeviri kinetiğini korurken, toplu çeviri testinden tek moleküllü bir teste kolay geçiş sağlar. Bu nedenle, tek moleküllü kinetik gözlemler, ilgili toplu sonuçlara doğrudan atıfta bulunularak yorumlanabilir. Yakın zamanda geliştirilen in vivo yaklaşımlar da dahil olmak üzere önceki yöntemler11,12,13,14, bireysel çeviri başlatma olaylarının kinetik ölçümleri için çözünürlükten yoksun ve deneysel gözlemlenebilirlerden başlatma süresi ortalamalarını çıkarmak için çeviri mekanizmalarının varsayımlarını gerektirir. Burada sunulan tek moleküllü yöntem, aktif kap bağımlı çevirinin ortalama başlangıç süresini ölçmek için ilk hipotezsiz yaklaşımı sağlar. Ayrıca, lüminesans tahlili ile toplu kinetik ölçümler, bugüne kadar kap bağımlı çeviri kinetiğinin en nicel ve sistematik toplu karakterizasyonlarını sağlamak için kullanılmıştır46,50, burada açıklanan tek moleküllü tahlil, ortalama başlatma kinetik değişikliklerini toplu testten daha fazla hassasiyetle ölçer(Şekil 7). Ek olarak, tek moleküllü veriler, toplu ölçümlerde ortalama alınan özellikler olan tek mRNA çeviri stokastisitesini ve heterojenliğini korur. Çeviri kinetiğinin tek moleküllü çözünürlüğü, diğer yöntemlerle ulaşılamayan çeviri mekanizmalarının içgörülerini ortaya çıkarmak için sistematik kinetik analizler için kullanılabilir.

Bu tahlil, çeviri çalışmaları için yaygın olarak kullanılan mevcut biyokimyasal ve genetik yaklaşımlarla uyumludur. Örneğin, belirli bir faktörün çeviri işlevi, faktör tükenmiş özü üreterek ve vahşi tip veya mutant faktörü ile destekleyerek incelenebilir. Ek olarak, floresan etiketli faktörü destekleyerek, çalışmalar potansiyel olarak faktör bağlama ve çevirinin ilerlemesi arasındaki kinetik ilişkiyi araştırabilir. İki farklı epitop/antikor çiftinin kullanılmasıyla, bu protokol potansiyel olarak tek renkli bir testten iki farklı kodlama dizisinin aynı anda algılanmasını sağlayan iki renkli bir teste genişletilebilir. Bu uyarlama, farklı okuma çerçevelerinin çevirisinin izlenmesine izin verir ve çerçeve değiştirme ve site seçim çalışmalarına başlayabilir. Alternatif olarak, iki renkli bir sistem, tek tek mRNA'larda hem yukarı hem de aşağı akış çeviri olaylarını izlemek için yukarı ve aşağı akış açık okuma çerçeveleri tarafından kodlanmış etiketli polipeptitlerle antikor etkileşimlerini tespit etmek için kullanılabilir. Bu genişlemeler, kap bağımlı çeviriyi ve düzenlemesini araştıran çok çeşitli mekanistik çalışmalara olanak sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [R01GM121847] tarafından desteklendi; Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi (MSKCC) Destek Hibesi/Çekirdek Hibesi (P30 CA008748); ve MSKCC Fonksiyonel Genomik İnisiyatifi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
  3. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
  4. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
  5. Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
  6. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
  8. Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
  9. Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
  10. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  11. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  12. Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
  13. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  14. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  15. Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6 (2020).
  16. Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
  17. Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
  18. Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
  19. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
  20. Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
  21. Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
  22. Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
  23. Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
  24. Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
  25. Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
  26. Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
  27. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
  28. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24 (2019).
  29. Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
  30. Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
  31. Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
  32. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  33. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  34. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  35. Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
  36. Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
  37. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
  38. Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
  39. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
  40. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  41. Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
  42. Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
  43. Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
  44. Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
  45. White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357 (2020).
  46. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
  47. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
  48. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  49. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
  50. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).

Tags

Biyokimya Sayı 163 hücresiz ökaryotik çeviri tek moleküllü çeviri kinetiği in vitro floresan görüntüleme kap bağımlı başlatma çeviri kontrolü in vitro tahlil
Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir <em>In Vitro</em> Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In … More

Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter