Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Published: September 20, 2020 doi: 10.3791/61680
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

Summary

جزيء واحد RNA مضان في التهجين الموقعي (smFISH) هو وسيلة لتحديد مستويات بدقة وتوطين الحمض النووي الريبي محددة على مستوى الخلية الواحدة. هنا، نقوم بالإبلاغ عن بروتوكولات المختبر المعتمدة لدينا لمعالجة مقاعد البدلاء الرطبة والتصوير وتحليل الصور للقياس الكمي لخلايا واحدة من RNAs محددة.

Abstract

النسخ الجيني هو عملية أساسية في بيولوجيا الخلايا، ويسمح للخلايا بتفسير الإشارات الداخلية والخارجية والاستجابة لها. تفتقر الطرق السكانية السائبة التقليدية (البقعة الشمالية، PCR، وRNAseq) التي تقيس مستويات الحمض النووي الريبي إلى القدرة على توفير معلومات عن الاختلاف بين الخلايا في الاستجابات. خلية واحدة دقيقة والتصور allelic والتحديد الكمي ممكن عن طريق جزيء واحد RNA مضان في التهجين الموقعي (smFISH). يتم تنفيذ RNA-FISH عن طريق تهجين الحمض النووي الريبي المستهدف مع مسابير أوليغونوكليوتيد المسماة. ويمكن تصوير هذه الأساليب في طرائق متوسطة/عالية الإنتاجية، ومن خلال خطوط أنابيب تحليل الصور، توفر بيانات كمية عن كل من الرنانات الناضجة والناضجة، وكلها على مستوى الخلية الواحدة. وقد تم تحسين التثبيت، permeabilization، التهجين وخطوات التصوير في المختبر على مدى سنوات عديدة باستخدام نظام النموذج الموصوف هنا، مما يؤدي إلى تحليل خلية واحدة ناجحة وقوية من وسم سمك البحر المتوسط. الهدف الرئيسي مع إعداد العينات ومعالجتها هو إنتاج صور عالية الجودة تتميز بنسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء للحد من الإيجابيات الكاذبة وتوفير بيانات أكثر دقة. هنا، نقدم بروتوكول يصف خط الأنابيب من إعداد العينات إلى تحليل البيانات بالتزامن مع الاقتراحات وخطوات التحسين لتكييفها مع عينات محددة.

Introduction

النسخ الجيني والترجمة هما عمليتان رئيسيتان تشاركان في العقيدة المركزية لعلم الأحياء ، من تسلسل الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي إلى البروتين1. في هذه الدراسة، ونحن نركز على إنتاج الحمض النووي الريبي رسول (مرنا) أثناء النسخ. جزيء الحمض النووي الريبي الوليدة يتضمن كل من introns غير الترميز وإكسونات الترميز. Introns هي مقسمة نسخا قبل أن ينتقل إلى الخلايا مرنا للترجمة على ريبوسوم2,3.

تقليديا، يتم إجراء قياس الحمض النووي الريبي في مجموعات كبيرة من الخلايا (مئات إلى ملايين) مع المقايسات الكلاسيكية مثل RT-qPCR أو النشاف الشمالي. في حين قوية جدا، وهذه الأساليب محدودة لأنها لا توفر رؤى في الاختلاف من خلية إلى خلية (التغايرية الظاهري)، وتحديد عدد الأليل النشطة نسخيا، وربما الأهم من ذلك، تفتقر إلى المعلومات المكانية. وفي الآونة الأخيرة، بدأت تقنيات الجينوم واسعة تسمح لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة (RNAseq) لسد الفجوة بين أساليب التصوير والتسلسل4. ومع ذلك، يعاني RNAseq من كفاءات الكشف منخفضة نسبيا وخطوات المعالجة تؤدي إلى فقدان كامل للمعلومات المكانية5. على الرغم من أن RNAseq خلية واحدة يمكن أن توفر رؤى في التغايرية phenotypic بين مجموعة من الخلايا متساوية المنشأ، RNA مضان في التهجين الموقعي (RNA-FISH) يمكن أن تسهل استكشاف أكثر اكتمالا للتعبير الجيني الهدف على المستوى المكاني، وعلى أساس أليل من قبل أليل6،7.

RNA FISH هي تقنية تسمح باكتشاف وتوطين جزيئات الحمض النووي الريبي المستهدفة في الخلايا الثابتة. وخلافا لأساليب سابقة شاقة، الحالية للدولة من بين الفن الجيش الملكي النيبالي-FISH يستخدم مسابير الحمض النووي المتاحة تجاريا التي هي مكملة لتسلسل الحمض النووي الريبي الهدف، وهذه المسابير تهجين لأهدافها من قبل قاعدة واتسون كريك الاقتران8. وشملت تقنيات التهجين في وقت مبكر في الموقع بروتوكول مماثل أنشأته غال وPardue في عام 1969، كما تم تجهيز عينة مع مسابير الحمض النووي التي هجينت على وجه التحديد إلى هدف الجيش الملكي النيبالي9. في الأصل تم إجراء الفحص باستخدام الكشف الإشعاعي أو colorimetric; ومع ذلك ، في 1980s ، وتطوير الفلورسينس في الموقع بروتوكولات التهجين (FISH) لسمك الحمض النووي والحمض النووي الريبي في وقت لاحق الأسماك فتحت الطريق نحو الكشف أكثر حساسية ، واحتمال تعدد10،11.

وقد أدت التطورات الأخرى في RNA FISH إلى القدرة على الكشف عن وقياس جزيئات الحمض النووي الريبي واحد (smFISH)12،13. الكشف المباشر هو الطريقة التي يتم تسمية المسابير نفسها مع الفلوروفوريس. ويتمثل أحد التحديات التي تواجهها هذه الأسماك في أن هناك حاجة إلى ما يكفي من المسابير/الأهداف المهجنة لتيسير الكشف عن الإشارات الفلورية باعتبارها بقعا متميزة محدودة الحيود. لمعالجة هذه المسألة، يمكن للمرء استخدام مجموعة من التحقيق قصيرة وحيدة تقطعت بهم السبل Oligonucleotides الحمض النووي التكميلية لمختلف المناطق من RNA الهدف8،12،14. الربط بين مسابير متعددة يزيد من كثافة الفلوروفور المحلية، مما يجعل الحمض النووي الريبي مرئية كقعة متميزة، وكثافة عالية عن طريق المجهر الفلوري. هذه الطريقة مفيدة لأن الربط خارج الهدف من oligonucleotides في مجموعة التحقيق تجمع يمكن تمييزها عن إشارة بقعة الحمض النووي الريبي الحقيقي عن طريق تحليل كمي حجم بقعة وكثافة للتمييز بين إشارة حقيقية وملزمة oligonucleotide زائفة، وبالتالي تسهيل تحليل أكثر دقة عن طريق الحد من الإيجابيات كاذبة12.

طرق بديلة للكشف عن مرنا هي الكلاسيكية BAC استنساخ القائم على طريقة الترجمة ونظام الحمض النووي المتفرعة التي تم تطويرها مؤخرا. في BAC المستنسخة، طريقة الترجمة، والحمض النووي أن يكون المسمى هو انزيميا ويتم إضافة نيوكليوتيد جديدة إلى نهاية 3 'المكشوفة. نشاط بوليمرات الحمض النووي أضيف النيوكليوتيدات المسمى مما أدى إلى التحقيق المطلوب15،16. تقنية الحمض النووي المتفرعة ينطوي على مسابير أوليغونوكليوتيد التي تهجين في أزواج لأهداف الجيش الملكي النيبالي ويتم تضخيم هذه المسابير باستخدام جزيئات تضخيم إشارة متعددة. هذه الطريقة يمكن أن تحسن بشكل كبير نسبة الإشارة إلى الضوضاء ولكن التضخيم يمكن أن ينحرف كمية دقيقة منذ البقع الفلورية يمكن أن تكون مختلفة بعنف في الحجم والكثافة17.

كنظام نموذجي لهذا البروتوكول، الذي يعمل بكامل العاملين كجزء من مشاركة برنامج أبحاث NIEHS Superfund لتحديد آثار المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء في خليج غالفستون / قناة هيوستن للسفن، استخدمنا مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) خط خلايا سرطان الثدي الإيجابي MCF-7 المعالجة بين عشية وضحاها مع ناهض ER، 17β-استراديول (E2)7،18،19. E2 ينظم العديد من الجينات المستهدفة ER، بما في ذلك الجين الأولي ER الهدف، GREB17،20،21،22. يستخدم بروتوكول smFISH الموصوف هنا مجموعة من مجموعتين مسابير مفصولتين طيفيا تستهدفان GREB1؛ واحد أن تهجين إلى exons والآخر إلى introns، مما يسمح لقياس كل من الجيش الملكي النيبالي ناضجة والناضجة7. ثم نستخدم المجهر epifluorescence مقرونة deconvolution لصورة smFISH المسمى عينات، ومن ثم تطبيق إجراءات تحليل الصور لتحديد عدد الأليل النشطة ورنا ناضجة لكل خلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

لضمان أفضل النتائج، يتطلب جزء المعمل الرطب من هذا البروتوكول احتياطات قياسية خالية من RNase في جميع الخطوات. على سبيل المثال، يتم تشجيع استخدام نصائح ماصة المصفاة والأوعية العقيمة والمخازن المؤقتة الخالية من RNase. كما يقترح استخدام مثبطات RNase مثل مجمعات فاناديل ريبونوكليوسيد، وخاصة بالنسبة لرناس منخفضة الوفرة المستهدفة.

1. ثقافة الخلية والإعداد التجريبي

  1. الحفاظ على الخلايا السرطانية الثدي MCF-7 (ATCC #HTB-22) في قارورة زراعة الأنسجة T75 مع فينول الأحمر مجانا (مطلوب فقط لتجارب التحفيز الهرموني) دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 2 MM L-الجلوتامين، 1 nM بيروفات الصوديوم، 50 I.U./mL البنسلين و 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين.
  2. ضع أغطية مستديرة مطلية بالأحماض ومتعددة الدهون والليوزين (سمكها من 0.16 إلى 0.19 مم وقطرها 12 مم) في لوحة زراعة أنسجة متعددة 24 مل.
    ملاحظة: استخدام 1 M HCl لحمض حفر الأغطية ومعطف مع محلول 1 ملغ / مل من بولي-د-ليسين إعادة تشكيلها في برنامج تلفزيوني معقم (ملحي الفوسفات المخزنة مؤقتا دون Ca++ ومغ++) وفقا للبروتوكولات القياسية.
  3. إزالة وسائل الإعلام النمو من الخلايا ويغسل مرة واحدة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني معقم (الفوسفات العازلة المالحة دون Ca++ و Mg++). فصل خلايا MCF-7 باستخدام 2-3 مل من حل تريبسين-EDTA 0.25٪. بمجرد فصل الخلايا، قم بتحييد حل Trypsin-EDTA 0.25٪ مع حجم متساو من وسائط النمو.
  4. نقل الخلايا في تعليق وسائل الإعلام إلى أنبوب مخروطي 15 مل, تدور أسفل في 391 × ز لمدة 1 دقيقة بيليه خارج الخلايا. إزالة وسائل الإعلام بعناية من أنبوب مخروطي دون إزعاج بيليه الخلية وإعادة إنفاق الخلايا في كمية مناسبة من وسائل الإعلام العلاج.
    ملاحظة: وسائل الإعلام العلاج هو phenol الأحمر خالية DMEM تستكمل مع 5٪ الفحم dextran جردت وDFBS dialyzed، 2 MM L-الجلوتامين، 1 nM بيروفات الصوديوم، 50 I.U./mL البنسلين و 50 ميكروغرام / مل streptomycin. هذه الوسائط ضرورية لتجارب تحفيز هرمون الستيرويد كما هو استنفدت إلى حد كبير مكون المصل من المنشطات عن طريق الفحم تجريد وسائل الإعلام, وخفضت عوامل النمو عن طريق غسيل الكلى.
  5. بذور الخلايا على coverlips في لوحة متعددة الآبار 24 في 60،000 إلى 70،000 خلية لكل بئر في 500 ميكروغرام من وسائل الإعلام العلاج. لهذه التجربة، ينبغي أن يكون التقاء الخلايا حوالي 70-80٪ عند بدء العلاج. تحسين كثافة بذر الخلايا اعتمادا على نوع الخلية ومعدل النمو وطول التجربة لتجنب الالتقاء ، مما يعقد تحليل الصورة.
    ملاحظة: للحصول على أفضل تصوير وتحليل للصور، تجنب تكتل الخلايا. لهذا الغرض، مزيج aliquot من الخلايا بدقة عن طريق pipetting (أو دوامة لفترة وجيزة) الخلايا عدة مرات قبل الاستغناء في الآبار. قبل وضع الخلايا المطلية مرة أخرى في الحاضنة، والسماح للخلايا يستقر في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة لمدة 20 دقيقة يساعد على الحد من تكتل الخلايا.
  6. احتضان الخلايا لمدة يومين على الأقل قبل العلاجات لضمان تزامن دورة الخلية والحد من الخلفية بسبب أي جزيئات الإشارات التي تبقى في مصل تجريد / dialyzed من وسائل الإعلام النمو.
  7. بعد حضانة لمدة 48 ساعة في وسائل الإعلام العلاج، وعلاج خلايا MCF-7 مع 10 nM 17β استراديول (E2) والتحكم في السيارة (DMSO)، المخفف في وسائل الإعلام العلاج لمدة 24 ساعة. يستخدم هذا العلاج جرعة مشبعة من E2 للحث على استجابة قصوى. إجراء دورات زمنية وتجارب الاستجابة للجرعة لتحديد تجريبيا للظروف لمختلف الجينات المستهدفة ونماذج الخلايا ونوع العلاجات. كمثال، انظر منشورنا الأخير7.

2. إعداد المخازن المؤقتة

  1. لإعداد العازلة التثبيت، تمييع تنقية، الفورمالديهايد أحادية (تباع من قبل الموردين المجهر الإلكتروني كما 16٪ بارافورمالديهايد) إلى 4٪ في برنامج تلفزيوني عقيم Ca++/ ملغ++ (الفوسفات المخزنة المالحة بالإضافة إلى Ca++ ومغ++). إضافة مجمعات فاناديل ريبونوكليوسيد (VRC) إلى حاجز التثبيت لتركيز نهائي قدره 2 mM لتأخير تدهور الحمض النووي الريبي.
    1. حساب المبلغ الإجمالي للتثبيت العازلة على أساس تتطلب 300-500 ميكرولتر من التثبيت لكل بئر من لوحة متعددة 24. تخزين 4٪ الفورمالديهايد على الجليد حتى المطلوبة في خطوة التثبيت.
      ملاحظة: جعل المخزن المؤقت التثبيت جديدة لكل تجربة.
      تنبيه: الفورمالديهايد هو المسخ الذي يمتص من خلال الجلد. استخدام هذه المادة الكيميائية في غطاء الدخان جنبا إلى جنب مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة وفقا للوائح المؤسسية الخاصة بك.
  2. لخطوة permeabilization، وإعداد الإيثانول 70٪ في المياه الخالية من النيوكليز. خيار بديل هو 0.5٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني عقيم Ca++/ ملغ++ بالإضافة إلى 2 mM من VRC. حساب المبلغ الإجمالي للحاجز permeabilization اللازمة باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل بئر.
  3. لإعداد 9 مل من العازلة التهجين، إضافة 2 مل من المخزون 50٪ كبريتات ديكتران، و 1 مل من 20x SSC (سترات الصوديوم المالحة) العازلة إلى 6 مل من المياه الخالية من النيوكليز. دوامة لخلط تماما المخزن المؤقت التهجين. يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  4. هناك خمس خطوات غسيل منفصلة تتطلب 2x الصوديوم المالحة سيترات (SSC) العازلة. حساب الحجم النهائي لل2x SSC العازلة اللازمة من خلال توقع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل غطاء لكل خطوة غسل. تمييع الكمية المطلوبة من المخزون 20x SSC العازلة في المياه الخالية من النيوكليز. يمكن إضافة 2 mM VRC لغسل الخطوات كإجراء وقائي إضافي. يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة طوال مدة خطوات المعالجة.

3. تثبيت لسمك الحمض النووي الريبي

  1. بعد العلاج، وإزالة وسائل الإعلام من الآبار ويغسل مرة واحدة مع عقيمة، باردة PBS Ca++/ مغ++. إذا تم استخدام نموذج خلية الالتزام منخفضة، لا تستخدم فراغ لتنشق السائل. استخدام pipetting اليدوي لإزالة وسائل الإعلام بعناية من جانب البئر وحذف خطوة غسل الأولية. أضف 500 ميكرولتر تثبيت العازلة لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    ملاحظة: إذا كانت العينة عرضة لتدهور الحمض النووي الريبي، استخدم برنامج تلفزيوني معقم مع 2 mM VRC لخطوة الغسيل في هذه المرحلة.
  2. إزالة المثبت والتخلص منه في النفايات الكيميائية وفقا للوائح المؤسسية. غسل الخلايا مرتين مع البرد العقيمة PBS Ca++/ مغ++ لمدة 3 دقائق.
  3. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ إلى كل بئر. ختم لوحة بئر 24 مع فيلم من البلاستيك البارافين. ضعه على دوار عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن أربع ساعات. فمن الأفضل أن تترك العينات في الإيثانول 70٪ بين عشية وضحاها. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا عند هذه النقطة ويمكن تخزين العينات لمدة تصل إلى أسبوع في الإيثانول بنسبة 70٪.
    ملاحظة: يمكن استخدام 0.5٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني مع 2 MM VRC الحل كبديل. احتضان العينات في 500 ميكرولتر من هذا العازلة permeabilization لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الدوار. إذا كان استخدام هذا المخزن المؤقت permeabilization لا يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا عند هذه النقطة ثم يجب متابعة خلال خطوة التهجين.

4. التهجين لسمك الجيش الملكي النيبالي

  1. إزالة المخزن المؤقت permeabilization وغسل مرة واحدة في 500 ميكرولتر من العازلة 2X SSC بالإضافة إلى 10٪ formamide لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الدوار.
  2. قم بإعداد المخزن المؤقت للتهجين الكامل. حساب ما يقرب من 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت التهجين الكامل لكل غطاء. إضافة formamide إلى المخزن المؤقت التهجين للوصول إلى النسبة المئوية المطلوبة. على سبيل المثال، إذا كانت هناك حاجة إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الكامل للتهجين، فإنها ستتألف من 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين الذي تم صنعه سابقا بالإضافة إلى 50 ميكرولتر من الفورماميد الجزيئي للوصول إلى 10٪ فول/فول. دوامة لفترة وجيزة لخلط.
    تنبيه: الفورماميد هو المسخ الذي يمتص من خلال الجلد. استخدام هذه المادة الكيميائية في غطاء الدخان جنبا إلى جنب مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة وفقا للوائح المؤسسية.
  3. تمييع intron GREB1 (المسمى مع Atto 647N) و GREB1 exon (المسمى مع Quasar 570) تحقيقات 1:300 في المخزن المؤقت التهجين. مزيج عن طريق pipetting. حماية هذا المخزن المؤقت من الضوء واستخدامها على الفور.
    ملاحظة: تم تصميم وتصنيع المسابير كما هو مفصل في ستوسي وآخرون7. وعادة ما يتم توفير المسابير كما بركة التحقيق oligonucleotide المجففة التي يجب إعادة تشكيلها في العازلة TE خالية من RNAse وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة14. ولذلك، كان حل المخزون لهذه المسابير 12.5 ميكرومتر؛ تركيز العمل للمسابير هو 42 nM.
  4. إعداد غرفة الترطيب لخطوة التهجين بين عشية وضحاها. وضع قطعة من فيلم من البلاستيك البارافين، الجانب غير المكشوفة حتى، في طبق بيتري الزجاج تنظيفها مع إزالة التلوث السطحي لإزالة RNases. تشبع اثنين من المناشف الورقية مع الماء العقيم ووضعها على طول حواف طبق بيتري لتوفير الرطوبة، والتجفيف يمكن أن تدمر وضع العلامات محددة.
  5. Aliquot المسابير عن طريق التنقيط 30 ميكروغرام من المسابير في العازلة التهجين على الجانب النظيف من الفيلم البلاستيك البارافين. توزيع aliquots من المسابير بحيث coverslips لا تتلامس مع بعضها البعض.
  6. باستخدام ملقط معقم، الوجه بلطف الجانب خلية coverslips وصولا الى المسابير في طبق بيتري الزجاج. تجنب فقاعات الهواء ولا تضغط على الأغطية.
    ملاحظة: لا تتخلص من لوحة زراعة الأنسجة مع المخزن المؤقت SSC 2x، حيث ستكون هناك حاجة إليه للخطوات اللاحقة.
  7. ختم طبق بيتري الزجاج مع فيلم من البلاستيك البارافين وتغطية لوحة مع احباط لمنع التعرض للضوء إلى الفلوروفوريس. حضانة بين عشية وضحاها، تصل إلى 16 ساعة، في 37 درجة مئوية على سطح مسطح غير الدورية. يمكن أن يختلف وقت الحضانة تجريبيا ، ولكن يوصى ب 4 ساعات على الأقل.
    ملاحظة: تكون الأغطية عرضة للانزلاق عند احتضانها في المخزن المؤقت للتهجين ، مما قد يؤدي إلى بقع جافة على الغطاء وتلف العينة.

5. إعداد عينات للتصوير

  1. في اليوم التالي، قم بإزالة الأغطية من غرفة الترطيب باستخدام ملقط وإعادتها إلى لوحة البئر ال 24 مع جانب الخلية لأعلى. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة SSC 2x الطازجة بالإضافة إلى 10٪ formamide لغسل المسبار الزائد والتهجين غير محددة.
    ملاحظة: حماية العينات من الضوء من هذه النقطة فصاعدا.
  2. غسل الخلايا مرتين مع 500 ميكرولتر من العازلة 2X SSC بالإضافة إلى 10٪ formamide لمدة 15 دقيقة لكل منهما في 37 درجة مئوية على الدوار ساخنة.
  3. مضادةالحمض النووي مع DAPI في 1 ميكروغرام / مل في 2x SSC العازلة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الدوار.
  4. اغسل مرة واحدة مع 2x SSC العازلة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بتركيب الأغطية على الشرائح الزجاجية باستخدام وسائط التركيب غير المتصلبة بعد إزالة أي حاجز SSC 2x زائد بمنشفة ورقية وغسل سريع في ماء خالي من النيوكليز للقضاء على الأملاح الزائدة. وأخيرا، ختم الأغطية مع طلاء الأظافر واضحة.

6. عالية الدقة المجهرية ومعالجة الصور

  1. صورة العينات على المجهر epifluorescence واسعة المجال باستخدام هدف النفط 60x أو 100x وكاميرا sCMOS. انظر جدول المواد للمجهر المحدد والهدف المستخدم لهذه التجربة.
    1. التصوير الكامل بمجرد معالجة العينات بالكامل لتجنب تدهور الإشارة المعتمد على الوقت.
      ملاحظة: يتم استخدام زيت الغمر مع مؤشر الانكسار (RI) من 1.516 في هذه التجربة. يجب إجراء الاختبار التجريبي لمطابقة RI الزيت إلى عينات معينة، كما سوف يؤدي عدم تطابق RI في انحرافات وظيفة انتشار نقطة التي ستؤثر على deconvolution الصورة.
  2. يتم التقاط الصور بحجم بكسل الجانبية من 0.10827 ميكرومتر.
  3. تحسين مقدار الإضاءة من مصدر الضوء (أي الإرسال في المائة) وأوقات التعرض لكل قناة (مرشحات DAPI و TRITC و CY5 في هذا المثال بالذات) باستخدام العينة التي من المتوقع أن يكون لها أعلى كثافة (أي الضوابط الإيجابية). في هذه التجربة، من المتوقع أن يكون للعينة المعالجة E2 كثافة أعلى لكل من مجموعات مسبار GREB1. عموما، فإن الإرسال في المئة للمسابير GREB1 intron و exon هو 50 - 100٪، وأوقات التعرض تتراوح بين 0.25 - 0.60 ثانية.
  4. بالإضافة إلى ذلك، الحصول على الصور في ظل الظروف التي تجنب photobleaching و / أو أي تشبع بكسل الكاميرا. في تجربتنا، يجب أن يكون هناك فرق ~ عشرة أضعاف الحد الأدنى بين الخلفية وكثافة الإشارة. يمكن أن يحدث تشبع عدد قليل من وحدات البكسل / الحقل بسبب إشارات غير محددة في العينة (أي الأوساخ على الغطاء ، وتجميعات المسبار خارج الخلية) ، والتي يمكن أن تكون مقبولة ، ولكن فقط إذا لم يتم تضمين المناطق المشبعة في الكمية.
  5. لتعيين اقتناء مكدس z، ركز على العينة في قناة DAPI. حدد الجزء العلوي والسفلي من المكدس z عند المسافات حيث تصبح نواة DAPI الملطخة خارج التركيز. حجم خطوة z-stack الذي استخدمناه هو 0.25 ميكرومتر لكل شريحة وينبغي أن يمتد إجمالي z-stack على الخلية بأكملها (حوالي 10 ميكرومتر في خلايا MCF-7). ومع ذلك، فإن حجم الخطوة z-كومة تغيير وفقا للهدف المستخدم، وينبغي اتباع معيار أخذ العينات Nyquist.
    ملاحظة: Introns عادة ما تكون موجودة فقط في النواة; ومع ذلك ، exons على حد سواء في النواة والسيتوبلازم. لذلك، تعيين المكدس z كما هو موضح أعلاه سوف التقاط معظم التسمية إينترون exon كما يشمل المكدس z الخلية بأكملها.
  6. عادة، صورة ما لا يقل عن 200 خلية للتحليل الكمي في التجارب الأولية لالتقاط لقطة لحجم الاستجابة والاختلاف بين الخلايا.
  7. يتم استبعاد بعض الخلايا المصورة من التحليل النهائي (أي معدل التسرب) لأنه سيتم تصفيتها بواسطة خط أنابيب التحليل (أي الخلايا التي تلمس حدود الصورة ، الخلايا المبرمجة / الميتوتيكية).
    ملاحظة: عند تحديد مناطق الصورة، هناك بعض العوامل التي يجب وضعها في الاعتبار. اختر المناطق ذات الخلايا المنتشرة بالتساوي وغير المتداخلة على النحو المحدد من قبل DAPI المسمى، مضان النووية. بالإضافة إلى ذلك، حاول تحديد المناطق التي تحتوي على أقل عدد من النوى على طول حواف منطقة الصورة لتجنب عد الخلايا الجزئية. يفضل التصوير الآلي غير المتحيز دائما للتجارب التي تتطلب تحليلا إحصائيا.
  8. بعد الحصول على الصور التفكيكية باستخدام خوارزمية التصالحية العدوانية باستخدام 10 دورات (أي عدد التكرارات). إنشاء إسقاطات ذات كثافة قصوى لتحليل الصور (احذف هذه الخطوة إذا كان هناك حاجة إلى تحليل ثلاثي الأبعاد محدد). حفظ جميع الصور الإسقاط وفقا لعمق بت من الكاميرا المستخدمة؛ في حالتنا تم حفظ الصور الرمادي TIFF 16 بت. تحتوي صور RGB على عمق بت منخفض مما يؤدي إلى فقدان المعلومات؛ لذلك، صور RGB غير مناسبة لتحليل الصور.

7. تحليل الصور

  1. قراءة التعليمات وتحميل دفتر jupyter من github (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. تثبيت بيثون أناكوندا التوزيع (https://www.anaconda.com/distribution/) الإصدار 3.6 أو أعلى.
  3. فتح أناكوندا موجه واكتب في الأمر التثبيت لتثبيت ITK بسيطة أناكوندا (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. فتح الملاح أناكوندا وإطلاق دفتر jupyter. وسوف تفتح متصفح ويب تظهر الدلائل والملفات. تصفح من خلال هياكل الدليل للوصول إلى الدليل الذي يحتوي على دفتر jupyter تحميلها من github.
  5. افتح دفتر الملاحظات وافتح كل خلية بالضغط على Shift و Enter في نفس الوقت.
  6. اتبع تفاصيل كل وظيفة وخطوة مقدمة في دفتر الملاحظات. لمجموعة مختلفة من الصور، قد يتعين على المرء تغيير بعض قيم المعلمات.
    ملاحظة: باختصار، يتم تقسيم النوى من قناة DAPI باستخدام العتبات المحلية بحجم كتلة 251 بكسل، تم تعبئة الثقوب وإزالة الكائنات التي تقل عن 100 بكسل. تم تقسيم لمس النوى باستخدام خوارزمية مستجمعات المياه. ثم تم توسيع القناع النووي بمقدار 100 بكسل وتم استخدام مستجمعات المياه لفصل الأجسام المؤثرة باستخدام النوى كأحواض. لتحديد حالة ثابتة الجيش الملكي النيبالي (exons)، تم استخدام عتبة أوتسو؛ للنسخ الأليل النشط (intron) ، أولا طمس الغاوسية (سيغما = 1) تم تطبيقها ثم تم استخدام عتبة الانتروبيا القصوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتحليل الاستجابات الهرمونية عبر smFISH ، على سبيل المثال ، اخترنا نموذج مستقبلات الإستروجين (ER) المستخدم في فحوصات الإنتاجية العالية لتحديد وجود مواد كيميائية معطلة للغدد الصماء في الكوارث البيئية في سياق المشاركة في برنامج أبحاث NIEHS Superfund7. في هذه التجربة، عولجت خلايا سرطان الثدي MCF-7 الملتصقة بناهض الرضة 17β-استراديول (E2، 10 nM) أو السيارة (DMSO) لمدة 24 ساعة. مجموعات التحقيق المنفصلة أطيافا ضد GREB1 intronic (Atto 647N، الأحمر في الشكل 1)و exonic (Quasar 570، الأخضر في الشكل 1) تسلسل تسمح للتصور في وقت واحد وتكميم من ميرنا الوليدة والناضجة؛ الأهم من ذلك، بمناسبة عدد الأليل النسخ النشطة في كل خلية التي ثبت أن تكون جزءا من دورة وقت الاستجابة الإستروجين7.

ينتج البروتوكول المكتمل إسقاطات كثافة قصوى 16 بت لكل منطقة من المناطق ذات الاهتمام. يتم إجراء التقسيم النووي باستخدام نواة ملطخة DAPI، وتقدر حدود الخلية عن طريق توسيع القناع النووي. ثم يتم تقسيم إشارات GREB1 intron و exon وتعيينها إلى كل خلية على حدة. يعرض الشكل 1 الصور المفككة ذات الحد الأقصى المتوقعة وتقسيمها لعينة عولجت ب DMSO و E2.

Figure 1
الشكل 1: صور عينة smFISH وإخراج تجزئة الصورة. (أ)خلايا MCF-7، تعامل مع DMSO (اللوحة اليسرى) و 17β-استراديول (E2، لوحة اليمنى) لمدة 24h، تم تهجين لاستهداف GREB1 introns (أتو 647N، ميرنا الوليدة، الأحمر)، وGREB1 exons (كواسار 570، ميرنا ناضجة، الأخضر). يتم الحصول على الصور في 60x/1.42NA، deconvolved والحد الأقصى للكثافة المتوقعة. (ب)تتم معالجة الصور من (A) من خلال خط أنابيب تحليل الصورة الموصوفة التي تحدد القناع النووي، ويقدر القناع الخلوي، ويحدد الجيش الملكي النيبالي ناضجة الفردية والاليلات النشطة نسخيا. ثم يتم تعيين بقع INTRON و exon من GREB1 إلى خلايا فردية. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد خط أنابيب تحليل الصور، حصلنا على عدد الخلايا التي لم تكن تلمس حدود الصورة على أساس تصوير عشرة حقول عشوائية لكل علاج، وتقرر أن هناك 150 خلية معالجة DMSO و 149 خلية معالجة E2. منذ خلايا ANEUPLOID MCF-7 لديها أربع نسخ من الجين GREB1، ومع تحقيقات إينترون وإكسون، إشارات متداخلة ستحدد عدد الأليل والخلايا التي تشارك في النسخ النشط24. حددنا جزء من مجموعة الخلايا لكل علاج يحتوي على صفر إلى أربعة أليلات GREB1 نشطة عن طريق عد البقع المتداخلة intron و exons. كما هو الحال مع دراستنا السابقة، ونحن نعرف الخلايا النشطة نسخيا وتلك التي عرضت اثنين أو أكثر من السيليات GREB1النشطة 7. كما رأينا في الشكل 2A-2B، تحتوي الخلايا المعالجة E2 على جزء متزايد من الخلايا بمقدار 4 أضعاف تظهر أليلات GREB1 النشطة أو أكثر مقارنة بالخلايا المعالجة بالمركبات7.

Figure 2
الشكل 2: كمية GREB1 الناجم عن E2 على مستوى كل خلية على حدة وعلى مستوى الأليل حسب الأليل. (أ) توزيع عدد الأليل GREB1 النشطة لكل خلية مقارنة مركبة (أشرطة زرقاء) وE2 (القضبان الحمراء) تعامل الخلايا. (ب) جزء من الخلايا التي تعتبر نشطة نسخيا، ويعرف هنا على أنها خلايا مع اثنين أو أكثر من الأليل GREB1النشطة 7. (ج) توزيع عدد رنا GREB1 الناضج لكل خلية لكل علاج. (د)متوسط عدد GREB1 ناضجة الجيش الملكي النيبالي / الخلية ممثلة في القيمة المتوسطة للسكان. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يتم تقسيم Introns من مرنا الوليدة لإنتاج مرنا ناضجة التي تتكون من تسلسل exon فقط. لذلك، فمن الممكن أيضا لحساب عدد من مرنا ناضجة لكل خلية عن طريق تحديد عدد البقع الخضراء. الشكل 2C-2D تظهر التحول في توزيع ناضجة GREB1 ميرنا / الخلية والتغيير أضعاف الكلي (20x) في مجموعة الخلايا بعد العلاج E2.

تمشيا مع الملاحظات الأصلية على مدى 24 ساعة من العلاج E2، ليست كل الخلايا تستجيب بنفس الطريقة (أي، الاستجابات غير متجانسة في السكان MCF-7)7. على سبيل المثال، يظهر عدد ال MRNAs GREB1 الناضجة لكل خلية مجموعة واسعة من التعبير (~ 15 ضعفا) حتى في الخلايا المعالجة E2 على مدار 24 ساعة؛ تفشل أساليب الكمية الرنا السائبة في تمييز المستويات الواسعة النطاق للنسخ في الخلايا عن طريق المتوسط الإحصائي. وهذا يؤكد على قوة smFISH لاستكشاف الاستجابات غير المتجانسة من خلية إلى خلية والأيل حسب أليل في مجموعة من الخلايا متساوية المنشأ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تستند منهجية smFISH الموصوفة إلى البروتوكولات المنشورة سابقا7و12و14. في هذا البروتوكول، نشرح الخطوات الحرجة التي تم تحسينها من المختبر الرطب (بما في ذلك كثافة البذر، ووقت التثبيت، والبيرمابيلية، وتركيز المسبار)، إلى التصوير وتحليل الصور، وتوفير خط أنابيب تجريبي كامل للمختبرات المهتمة بإجراء تحليل خلية واحدة للنسخ الجيني.

لتسهيل تحليل الخلية الواحدة، من المهم أن تكون الخلايا تحت السائل ولا تتداخل بحيث يتم تقدير حدود الخلية دون الحاجة إلى حدود الخلية. نقترح إكمال فحص انتشار الخلايا الذي يمتد على مجموعة واسعة من كثافات البذر طوال مدة التجربة لتحسين كثافة الخلية.

تحديد وقت التثبيت الأمثل أمر بالغ الأهمية لتجربة smFISH ناجحة. لقد وجدنا أن إصلاح العينات مع 4٪ الفورمالديهايد المنقى، المخفف في برنامج تلفزيوني معقم يحتوي على VRC لمدة 30 دقيقة على الجليد، يحسن بشكل كبير من اتساق صور smFISH عالية الجودة، خاصة إذا كان التحليل الهيكلي مطلوبا عن طريق الجمع بين الأجسام المضادة ضد عوامل الاهتمام. الفورمالديهايد بإصلاح العينات عن طريق ربط الجزيئات الكلية ويمكن الحفاظ على أفضل الهياكل الخلوية من أساليب التثبيت الأخرى مثل تلك التي تستخدم المذيبات العضوية25. ومع ذلك، ضبط وقت التثبيت ودرجة الحرارة ضروري لعينة معينة لتجنب الإفراط أو تحت تحديد العينة26. VRC مفيد لأنه يقلل من تدهور الحمض النووي الريبي ومفيد خاصة بالنسبة لرنا27منخفضة وفيرة . هناك خياران نجحنا فيهما بالنسبة لخطوة الإعادة التأهيلية. الأول هو حضانة الإيثانول بنسبة 70٪ عند 4 درجات مئوية والثاني هو حضانة تريتون-X100 بنسبة 0.5٪ في درجة حرارة الغرفة7،14. من الممكن تنفيذ نفس البروتوكول في الإنتاجية العالية باستخدام لوحات متعددة الآبار المتوافقة مع التصوير في قاع الزجاج (96 و 384 بئرا). وقد اعتمد النجاح المستمر في أداء smFISH على استخدام لوحات زجاجية متعددة بويل باستخدام مثبت يحتوي على VRC، و 0.5٪ تريتون-X 100 مع VRC لخطوة permeabilization. على الرغم من أن لوحات القاع البلاستيكية البصرية هي خيار ، فقد كانت جودة الصورة ونجاحها أقل بشكل ملحوظ.

مطلوب نسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء لتحليل الخلية الواحدة لتصفية إشارة الخلفية والإيجابيات الكاذبة وتحديد البقع المحدودة الحيود بشكل صحيح. إشارة خلفية يضيف إلى قيم كثافة إشارة الاهتمام. غالبا ما تنشأ الخلفية العالية من التصميم التجريبي دون المستوى الأمثل ، وعلى الرغم من طرحها من قياسات كثافة الفلورسنت ، فمن الأفضل في البداية تصوير المناطق ذات الاهتمام بأقل إشارة خلفيةممكنة 28. وهناك حاجة إلى نطاق ديناميكي عالية، مع فارق ~ 10 أضعاف الحد الأدنى، لتحديد بنجاح ما إذا كان يعتبر إشارة الخلفية أو إشارة منالفائدة 29. تشير البقع الإيجابية الخاطئة إلى الإشارة المقيمة خارج حدود الخلية ، غالبا بسبب الأغطية سيئة التنظيف ، أو عدم كفاية الغسيل بعد التهجين ، أو تجميع المسبار الذي يحدث عندما تحقق ذاتيا30. إذا حدثت إشارات غير محددة بسبب الربط الزائف لمجموعة أوليغو إلى الحمض النووي الريبي التي تختلف عن الهدف (أي بسبب التشابهات الزائفة أو تسلسل) ، يمكن تقييم هذه عن طريق اختبار مجموعات المسبار في نموذج لا يعبر عن جين الاهتمام (أي ملفات MEFs المغلوبة ، CRISPR / Cas9)31. بالإضافة إلى ذلك ، كما هو الحال مع أي تجربة المجهر الفلوري ، يجب فصل مسباري intron و exon بشكل طيفي. في تجربتنا مثال، اخترنا أتو 647N وQuasar 570 الأصباغ للمسبار GREB1 مجموعة لأنها متوافقة مع مواصفات مجموعات مرشح على المجهر المستخدمة، ومقاومة لphotobleaching ولها عائد الكم عالية نسبيا8،14،32. اعتمادا على العينة، نوصي بإجراء سلسلة تخفيف من مسبار الأسهم (عادة ما يكون تخفيف 1:200 إلى 1:1000، أو 12.5 nM إلى 62.5 nM) لتحديد أفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء لكل مجموعة مسبار محددة. بعض البائعين توريد مسابير مخصصة المسمى مع الفلوروفوريس التي اختارها المستخدم لزيادة السطوع، والحد من photobleaching، وإذا لزم الأمر، إضافة قنوات إضافية 1-2 المتاحة عموما على معظم المجاهر الفلورية الحديثة7،8،14. على الرغم من أن smFISH لديها القدرة على قياس الحمض النووي الريبي منخفض الوفرة ، فإن القضية الرئيسية هي زيادة حساسيته وقدرته على اكتشاف الحمض النووي الريبي المتدهور جزئيا ، خاصة بالنسبة لعينات الأنسجة. تحقيق نسبة أعلى من الإشارة إلى الضوضاء ممكن باستخدام مسابير الحمض النووي المتفرعة المصممة لتضخيم الإشارة ، على الرغم من أننا لم نجد هذا النهج مفيد في دراساتنا33. تستخدم المجاهر البؤرية مصدر ضوء مركز لإلقاء الضوء على العينة مع منع الضوء الخارج عن التركيز من الوصول إلى أجهزة الكشف باستخدام ثقب واحد أو أكثر. يتم تثبيط المجهر confocal نقطة المسح عموما للتصوير الجيش الملكي النيبالي السمك لأن المسابير سوف photobleach أسرع من إضاءة الليزر. ومع ذلك ، اعتمادا على العينة وكثافة الإشارة ، يمكن للمجاهر confocal توليد الصور مع فقدان إشارة قليلة أو معدومة8. هنا ، استخدمنا مجهر epifluorescence واسع المجال مع تكبير عالي وهدف فتحة رقمية عالية لجمع أكبر عدد ممكن من الفوتونات المنبعثة من تحقيقات FISH34. على الرغم من أن الصور يمكن أن تكون غير واضحة من قبل الضوء خارج التركيز من الطائرات المجاورة للكومة z، يتم تطبيق خوارزميات deconvolution التصالحية على حسابيا "إعادة تعيين" ضوء diffracted بين المداخن z المكتسبة إلى نقطة المنشأ34. ينتج عن ذلك صور نهائية عالية الدقة لتحليل الصور. إذا كان ذلك ممكنا، سيكون من الأفضل لمقارنة تجريبيا طرائق التصوير المختلفة لتحديد النظام الذي هو الأفضل لتجربتك28.

هناك العديد من التمديدات والتطبيقات الممكنة من smFISH. في تجربتنا النموذجية، أكملنا جولة واحدة من التهجين مع مجموعة واحدة من المسابير لجين GREB1. ومع ذلك، فمن الممكن لإكمال عدة جولات من smFISH بطريقة متتابعة (seqFISH)13،35. في هذه الطريقة، يتم تسمية mRNAs في الخلية من قبل جولات متسلسلة من التهجين والتصوير وتجريد المسبار وإعادة الترطيب. من أجل زيادة كبيرة في تعدد تصل إلى مستوى النسخ الكامل، وقد وضعت تقنيات الباركودينج (على سبيل المثال، مير فيش)36،37،38. هذا يستخدم استراتيجية الباركود مضان لتحديد فريد كل مرنا37،39. وقد تم تكييف هذه التقنيات إلى الأنسجة، وعندما يقترن المجهر التوسع، وهي الطريقة التي توسع جسديا عينة مع شبكة البوليمر، يمكن أن توفر زيادة الوصول إلى مسابير لRNAs الذاتية36،40،41. MER-FISH يسمح أيضا لزيادة سطوع إشارة من الجزيئات الفردية عن طريق تقنيات تضخيمالإشارة 38. البروتوكول الذي وصفناه هو عملية لمدة يومين ، ومع ذلك ، فمن الممكن تقصير بروتوكول smFISH بحيث يمكن أن يحدث تهجين المسابير إلى الجيش الملكي النيبالي المستهدف في أقل من ~ 5 دقائق (Turbo-FISH)26. Immunofluorescence يمكن الجمع بين smFISH (IF-FISH) للكشف في وقت واحد البروتينات ورنا في عينة واحدة42. يجب تحسين البروتوكول لمسبارات FISH والأجسام المضادة المستخدمة في كل تجربة للحد من تدهور البروتين و / أو تدهور الحمض النووي الريبي في العينة ، لأن بعض المواد (أي المخازن المؤقتة والمثبتات) غير متوافقة لمعالجة كل من البروتين و mRNA43. الرجوع إلى العديد من المنشورات من مختبرنا كأمثلة على التجارب IF-FISH الناجحة بالإضافة إلى بروتوكولات IF-FISH المحسنة7و18.

في الختام، نقدم مضان جزيء واحد في طريقة التهجين الموقعي (smFISH) التي توفر نظرة ثاقبة في تغايرية الخلية الواحدة والاختلاف أليل حسب أليل استجابة للتحفيز. في حين تم تحسين هذا البروتوكول لنظام النموذج الموصوف سابقا، ونحن نقدم سلسلة من التعديلات الممكنة التي يمكن أن تعزز نماذج الجينات المستهدفة الأخرى7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

يتم تمويل MAM و FS و MGM من قبل NIEHS (المشروع 4 ، P42ES027704 ، PI ، Rusyn). يتم دعم MAM و FS و RMM و MGM و PKS من قبل مركز دول مجلس التعاون الخليجي الممول من CPRIT للتنظير المتقدم والمعلوماتية بالصور (RP170719). كما يدعم التصوير من قبل الأساسية المجهر المتكاملة في كلية بايلور للطب بتمويل من المعاهد القومية للصحة (DK56338، وCA125123)، CPRIT (RP150578)، ومركز دان ل. دنكان الشامل للسرطان، واتحاد جون س. دان ساحل الخليج لعلم الجينوم الكيميائي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β Estradiol Sigma-Aldrich E2257 CAS Number 50-28-2
Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free ThermoFisher Scientific AM9770
Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose Fisher Scientific MT10017CV Manufactured by Invitrogen
DAPI Sigma-Aldrich D8417 Without sodium pyruvate
Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile Sigma-Aldrich 3730-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ Corning 21030CV Manufactured by Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%) Fisher Scientific 07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Corning 353047 Manufactured by Decon Laboratories
Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL Fisher Scientific 50-753-2978 Manufactured by Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope GE Healthcare
Hyclone Water, Molecular Biology Grade Fisher Scientific SH3053802
Immersion Oil 1.516 GE Healthcare Life Sciences 29162940 Manufactured by GE Healthcare Bio-Science
L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005Cl Manufactured by Corning
MCF-7 cells ATCC HTB-22
Molecular Grade Formamide Promega PAH5051
Olympus 60x/1.42 NA Objective Olympus
Parafilm Bemis Company, Inc. 52858-076 Distributed by VWR
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
Penicilin-Streptomycin Solution Fisher Scientific MT3001Cl Manufactured by Corning
Ribonucleoside Vanadyl Complex VWR 101229-716 Manufactured by New England Biosciences
RNase Away Ambion 9780
Sodium pyruvate, 100 mM Fisher Scientific 11-360-070 Manufactured by Gibco
Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 Fisher Scientific 12-545-81P
Triton X-100, 100 mL Fisher Scientific BP151-100 Manufactured by Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Solution 0.25% Sigma-Aldrich T4049-500ML
Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL Fisher Scientific NC9265087 Manufactured by Vector Laboratories

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
  4. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
  5. Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  6. Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
  7. Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
  8. Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
  9. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
  10. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
  11. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
  12. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  13. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  14. Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
  15. Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
  16. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  18. Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
  19. Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
  20. Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
  21. Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
  22. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
  23. Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
  24. Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
  25. Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
  26. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
  27. Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  28. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  29. Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
  30. Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
  31. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
  32. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  33. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
  34. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  35. Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
  36. Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
  37. Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
  38. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  39. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
  40. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
  41. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  42. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
  43. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 163، جزيء واحد FISH، التصوير، تحليل الصور، نسخ الجينات
تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mistry, R. M., Singh, P. K.,… More

Mistry, R. M., Singh, P. K., Mancini, M. G., Stossi, F., Mancini, M. A. Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH. J. Vis. Exp. (163), e61680, doi:10.3791/61680 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter