Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltcelleanalyse av transkripsjonsaktive alleler av enkeltmolekyl fisk

Published: September 20, 2020 doi: 10.3791/61680
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

Summary

Enkeltmolekyl RNA fluorescens in situ hybridisering (smFISH) er en metode for å nøyaktig kvantifisere nivåer og lokalisering av spesifikke RNAer på enkeltcellenivå. Her rapporterer vi våre validerte laboratorieprotokoller for behandling, avbildning og bildeanalyse av våtbenker for encellet kvantifisering av spesifikke RNAer.

Abstract

Gentranskripsjon er en viktig prosess i cellebiologi, og gjør det mulig for celler å tolke og reagere på interne og eksterne signaler. Tradisjonelle bulkpopulasjonsmetoder (Northern blot, PCR og RNAseq) som måler mRNA-nivåer, mangler evnen til å gi informasjon om celle-til-celle variasjon i svar. Presis enkeltcellet og allelisk visualisering og kvantifisering er mulig via enkeltmolekyl RNA fluorescens in situ hybridisering (smFISH). RNA-FISH utføres ved hybridisering av mål-RNAer med merkede oligonukleotidprober. Disse kan avbildes i middels/høy gjennomstrømningsmodaliteter, og gjennom bildeanalyserørledninger gir kvantitative data om både modne og gryende RNAer, alt på enkeltcellenivå. Fikserings-, permeabiliserings-, hybridiserings- og bildetrinnene er optimalisert i laboratoriet over mange år ved hjelp av modellsystemet som er beskrevet her, noe som resulterer i vellykket og robust enkeltcelleanalyse av smFISH-merking. Hovedmålet med prøveforberedelse og -behandling er å produsere bilder av høy kvalitet preget av et høyt signal-til-støy-forhold for å redusere falske positiver og gi data som er mer nøyaktige. Her presenterer vi en protokoll som beskriver rørledningen fra prøveforberedelse til dataanalyse i forbindelse med forslag og optimaliseringstrinn for å skreddersy til spesifikke prøver.

Introduction

Gentranskripsjon og oversettelse er de to store prosessene som er involvert i biologiens sentrale dogme, fra DNA-sekvensen til RNA til protein1. I denne studien fokuserer vi på produksjon av messenger RNA (mRNA) under transkripsjon. Det gryende RNA-molekylet inneholder både ikke-kodingsdroner og kodingseksoner. Introner er co-transkripsjonelt spleiset ut før mRNA beveger seg inn i cytoplasma for oversettelse på ribosomer2,3.

Tradisjonelt utføres målingen av mRNA i bulkpopulasjoner av celler (hundrevis til millioner) med klassiske analyser som RT-qPCR eller Northern blotting. Selv om de er svært kraftige, er disse metodene begrenset, da de ikke gir innsikt i celle-til-celle-variasjon (fenotypisk heterogenitet), identifisering av antall transkripsjonsaktive alleler, og kanskje enda viktigere, mangler romlig informasjon. Mer nylig begynte genom brede teknologier som tillater enkeltcellet RNA-sekvensering (RNAseq) å bygge bro mellom avbildningsmetoder og sekvensering4. RNAseq lider imidlertid av relativt lav deteksjonseffektivitet, og behandlingstrinnene resulterer i fullstendig tap av romlig informasjon5. Selv om enkeltcellet RNAseq kan gi innsikt i fenotypisk heterogenitet blant en populasjon av isogene celler, kan RNA fluorescens in situ hybridisering (RNA-FISH) legge til rette for en mer fullstendig utforskning av målgenuttrykk på romlig nivå, og på allel-by-allele basis6,7.

RNA FISH er en teknikk som gjør det mulig å oppdage og lokalisere mål RNA-molekyler i faste celler. I motsetning til tidligere, arbeidskrevende metoder, bruker dagens toppmoderne RNA-FISH kommersielt tilgjengelige nukleinsyresonder som er komplementære til målet RNA-sekvenser, og disse sondene hybridiserer til sine mål av Watson-Crick base parring8. De tidlige in situ hybridiseringsteknikkene involverte en lignende protokoll etablert av Gall og Pardue i 1969, da en prøve ble behandlet med nukleinsyresonder som spesielt hybridiserte til et mål RNA9. Opprinnelig ble analysen utført ved hjelp av radioaktiv eller kolorimetrisk deteksjon; Men på 1980-tallet åpnet utviklingen av fluorescens in situ hybridisering (FISH) protokoller til DNA FISH og senere RNA FISH ruten mot mer sensitiv deteksjon, og potensialet for multipleksing10,11.

Videre utvikling i RNA FISH har ført til evnen til å oppdage og kvantifisere enkle RNA-molekyler (smFISH)12,13. Direkte deteksjon er en metode der sondene selv er merket med fluoroforer. En utfordring med smFISH er at det er behov for nok hybridiserende sonder/mål til å lette påvisning av fluorescerende signaler som distinkte, diffraksjonsbegrensede flekker. For å løse dette problemet kan man bruke et sondesett med korte enkeltstrengede DNA-oligonukleotider komplementære til ulike områder av målet RNA8,12,14. Bindingen av flere sonder øker den lokale fluorofortettheten, noe som gjør RNA synlig som et tydelig, høyintensitetspunkt ved fluorescensmikroskopi. Denne metoden er fordelaktig fordi off-target binding av oligonukleotider i sondesettbassenget kan skilles fra det sanne RNA-spotsignalet ved kvantitativt å analysere spotstørrelsen og intensiteten for å skille mellom sant signal og falske oligonukleotidbinding, og dermed legge til rette for mer nøyaktig analyse ved å redusere falske positiver12.

Alternative metoder for å oppdage mRNA er den klassiske BAC klonebaserte nick oversettelsesmetoden og det mer nylig utviklede forgrenede DNA-systemet. I den BAC-klonede nick-oversettelsesmetoden er DNA-et som skal merkes enzymatisk nicked og et nytt nukleotid legges til den eksponerte 3' enden. Aktiviteten til DNA-polymerase Jeg legger til et merket nukleotid som resulterer i ønsket sonde15,16. Den forgrenede DNA-teknikken involverer oligonukleotidprober som hybridiserer i par til RNA-mål, og disse sondene forsterkes ved hjelp av flere signalforsterkningsmolekyler. Denne metoden kan forbedre signal-til-støy-forholdet betydelig, men forsterkningen kan forskyve nøyaktig kvantifisering siden fluorescerende flekker kan være vilt forskjellige i størrelse og intensitet17.

Som et modellsystem for denne protokollen, som er fullt ansatt som en del av NIEHS Superfund Research Program deltakelse for å kvantifisere effekten av endokrine forstyrrende kjemikalier i Galveston Bay / Houston Ship Channel, brukte vi østrogen reseptoren (ER) positiv brystkreft celle linje MCF-7 behandlet over natten med en ER agonist, 17β-estradiol (E2)7,18,19. E2 regulerer mange ER-målgener, inkludert det prototypiske ER-målgenet, GREB17,20,21,22. SmFISH-protokollen som er beskrevet her, bruker et sett med to spektralt separerte sondesett rettet mot GREB1; en som hybridiserer til exons og den andre til introns, noe som muliggjør måling av både moden og nascent RNA7. Vi bruker deretter epifluorescence mikroskopi kombinert med dekonvolusjon til bilde smFISH-merkede prøver, og bruker deretter bildeanalyserutiner for å kvantifisere antall aktive alleler og modne RNAer per celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For å sikre optimale resultater krever den våte labdelen av denne protokollen standard RNase-frie forholdsregler i alle trinn. For eksempel er bruk av filtrerte pipettespisser, sterile kar og RNase-frie buffere sterkt oppmuntret. Bruk av RNase-hemmere som vanadyl ribonucleoside-komplekser foreslås også, spesielt for RNAer med lavt overflodsmål.

1. Cellekultur og eksperimentelt oppsett

  1. Opprettholde tilhenger MCF-7 brystkreftceller (ATCC #HTB-22) i en T75 vev kultur kolbe med fenol-rød fri (bare nødvendig for hormon stimulering eksperimenter) Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM) supplert med 10% foster bovin serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 nM natriumpyrominitt, 50 I.U./ml penicillin og 50 μg/ml streptomycin.
  2. Legg syre-etsede, poly-D-lysinbelagte runde deksler (0,16 til 0,19 mm tykk, 12 mm diameter) i en 24 multiwell vev kulturplate.
    MERK: Bruk 1 M HCl til å syrets deksler og pels med en 1 mg/ml oppløsning av poly-D-lysin rekonstituert i steril PBS (fosfatbufret saltvann uten Ca++ og Mg++) i henhold til standardprotokoller.
  3. Fjern vekstmediet fra cellene og vask en gang med 5 ml steril PBS (fosfatbufret saltvann uten Ca++ og Mg++). Koble fra MCF-7-celler ved hjelp av 2-3 ml Trypsin-EDTA 0,25 % løsning. Når cellene er koblet fra, nøytraliserer du Trypsin-EDTA 0,25% løsningen med et likt volum vekstmedier.
  4. Overfør cellene i medieopphenget til et 15 ml konisk rør, spinn ned på 391 x g i 1 minutt for å pellet ut cellene. Fjern forsiktig mediet fra det koniske røret uten å forstyrre cellepellet og resuspender cellene i en passende mengde behandlingsmedier.
    MERK: Behandlingsmedier er fenolrødt fri DMEM supplert med 5% kull-dextran strippet og dialyzed FBS, 2 mM L-glutamin, 1 nM natriumpyruvat, 50 I.U./ml penicillin og 50 μg/ml streptomycin. Dette mediet er avgjørende for steroid hormon stimulering eksperimenter som serum komponent er i stor grad utarmet av steroider ved trekull stripping media, og har redusert vekstfaktorer via dialyse.
  5. Frø cellene på coverlips i 24 multiwell plate på 60,000 til 70,000 celler per brønn i 500 μL behandlingsmedier. For dette eksperimentet bør cellesamstrømningen være rundt 70-80% ved behandlingsstart. Optimaliser cellesåingstettheten avhengig av celletype, vekstrate og lengden på eksperimentet for å unngå sammenløp, noe som kompliserer bildeanalysen.
    MERK: For best mulig bilde- og bildeanalyse bør du unngå cellekumping. Til dette formål blander du aliquot av celler grundig ved pipettering (eller kort virvel) cellene noen ganger før de dispenserer inn i brønnene. Før du plasserer de belagte cellene tilbake i inkubatoren, la cellene bosette seg i vevskulturhetten i ca 20 minutter bidrar til å redusere cellekumping.
  6. Inkuber celler i minst to dager før behandlinger for å sikre cellesyklussynkronisering og bakgrunnsreduksjon på grunn av eventuelle signalmolekyler som forblir i strippet / dialysert serum av vekstmedier.
  7. Etter en 48 timers inkubasjon i behandlingsmedier, behandle MCF-7 celler med 10 nM 17β-østradiol (E2) og kjøretøykontroll (DMSO), fortynnet i behandlingsmedier i 24 timer. Denne behandlingen bruker en mettende dose på E2 for å indusere en maksimal respons. Utfør tidsforløp og doseresponseksperimenter for empirisk å bestemme forhold for ulike målgener, cellemodeller og type behandlinger. Som et eksempel, se vår nylige publikasjon7.

2. Utarbeidelse av buffere

  1. For å forberede fikseringsbufferen, fortynn renset, monomerisk formaldehyd (solgt av elektronmikroskopileverandører som 16% paraformaldehyd) til 4% i steril PBS Ca++/ Mg++ (fosfatbufret saltvann pluss Ca++ og Mg++). Tilsett vanadyl ribonukleosidekomplekser (VRC) i fikseringsbufferen for en endelig konsentrasjon på 2 mM for å forsinke RNA-nedbrytning.
    1. Beregn den totale mengden fikseringsbuffer basert på krav om 300-500 μL fikseringsmiddel per brønn på en 24 multiwell plate. Oppbevar 4% formaldehyd på is til det er nødvendig i fikseringstrinnet.
      MERK: Gjør fikseringsbufferen frisk for hvert eksperiment.
      FORSIKTIG: Formaldehyd er et teratogen som absorberes gjennom huden. Bruk dette kjemikaliet i en avtrekkshette sammen med passende personlig verneutstyr i henhold til dine institusjonelle forskrifter.
  2. For permeabiliseringstrinnet, lag 70% etanol i nukleasefritt vann. Et alternativt alternativ er 0,5% Triton-X100 i sterile PBS Ca++/ Mg++ pluss 2 mM VRC. Beregn den totale mengden permeabiliseringsbuffer som trengs ved å bruke 500 μL buffer per brønn.
  3. For å forberede 9 ml hybridiseringsbuffer, tilsett 2 ml lager 50% dekstransulfat og 1 ml 20x SSC (saltvannsnatriumsitrat) buffer til 6 ml nukleasefritt vann. Vortex for å blande hybridiseringsbufferen grundig. Denne bufferen kan oppbevares ved 4 °C i opptil én uke.
  4. Det er fem separate vasketrinn som krever 2x saltvanns natriumsitrat (SSC) buffer. Beregn det endelige volumet av 2x SSC-buffer som trengs ved å forutse 500 μL buffer per dekslelip per vasketrinn. Fortynn den nødvendige mengden lager 20x SSC-buffer i nukleasefritt vann. 2 mM VRC kan legges til vasketrinn som en ekstra forholdsregel. Denne bufferen kan lagres ved romtemperatur så lenge behandlingstrinnene varer.

3. Fiksering for RNA FISH

  1. Etter behandling, fjern mediet fra brønnene og vask en gang med steril, kald PBS Ca++/ Mg++. Hvis en cellemodell med lav overholdelse brukes, må du ikke bruke et vakuum til å aspirere væske; bruk manuell pipettering for å fjerne medier forsiktig fra siden av brønnen og utelate det første vasketrinnet. Tilsett 500 μL fikseringsbuffer i 30 minutter på is.
    MERK: Hvis prøven er utsatt for RNA-nedbrytning, bruk steril PBS med 2 mM VRC til vasketrinnet på dette tidspunktet.
  2. Fjern fikseringsmiddelet og kast det i kjemisk avfall i henhold til institusjonelle forskrifter. Vask cellene to ganger med kaldsteril PBS Ca++/Mg++ i 3 minutter.
  3. Fjern PBS og tilsett 500 μL 70% etanol til hver brønn. Forsegle 24 brønnplaten med en parafin plastfilm. Plasser på en rotator ved 4 °C i minst fire timer. Det er best å forlate prøvene i 70% etanol over natten. Protokollen kan settes på pause på dette tidspunktet, og prøvene kan lagres i opptil en uke i 70% etanol.
    MERK: En 0,5% Triton-X100 i PBS med 2 mM VRC-løsning kan brukes som alternativ. Inkuber prøvene i 500 μL av denne permeabiliseringsbufferen i 20 minutter ved romtemperatur på en rotator. Hvis du bruker denne permeabiliseringsbufferen, kan ikke protokollen stanses midlertidig på dette tidspunktet og må fortsette gjennom hybridiseringstrinnet.

4. Hybridisering for RNA FISH

  1. Fjern permeabiliseringsbufferen og vask en gang i 500 μL 2x SSC-buffer pluss 10% formamid i 5 minutter ved romtemperatur på en rotator.
  2. Klargjør hele hybridiseringsbufferen. Beregn ca. 30 μL fullstendig hybridiseringsbuffer per deksler. Legg til formamid i hybridiseringsbufferen for å nå den nødvendige prosenten. For eksempel, hvis 500 μL komplett hybridiseringsbuffer er nødvendig, vil den bestå av 450 μL av den tidligere laget hybridiseringsbufferen pluss 50 μL molekylær klasse formamid for å nå 10% vol / vol. Virvel kort å blande.
    FORSIKTIG: Formamid er et teratogen som absorberes gjennom huden. Bruk dette kjemikaliet i en avtrekkshette sammen med passende verneutstyr i henhold til institusjonelle forskrifter.
  3. Fortynn GREB1-intronen (merket med Atto 647N) og GREB1 exon-sonder (merket med Quasar 570) 1:300 i hybridiseringsbuffer. Bland via pipettering. Beskytt denne bufferen mot lys og bruk umiddelbart.
    MERK: Sondene ble designet og produsert som beskrevet i Stossi et al7. Sondene leveres vanligvis som et tørket oligonukleotidsondebasseng som må rekonstitueres i RNAse-fri TE-buffer i henhold til produsentprotokollen14. Lagerløsningen for disse sondene var 12,5 μM, derfor; Sondens arbeidskonsentrasjon er 42 nM.
  4. Forbered et fuktig kammer for hybridiseringstrinnet over natten. Legg ned et stykke parafin plastfilm, ueksponert side opp, i en glass Petri-tallerken rengjort med en overflatedekontaminant for å fjerne RNases. Mette to papirhåndklær med sterilt vann og legg dem langs kantene på Petri-parabolen for å gi fuktighet, da tørking kan ødelegge spesifikk merking.
  5. Aliquot sondene ved å prikke 30 μL sonder i hybridisering buffer på den rene siden av parafin plastfilmen. Fordel aliquots av sonder slik at dekslene ikke kommer i kontakt med hverandre.
  6. Bruk steriliserte tang, vend forsiktig dekslene cellesiden ned på sondene i glass petriskålen. Unngå luftbobler og ikke legg trykk på dekslene.
    MERK: Ikke kast vevskulturplaten med 2x SSC-bufferen, da det vil være nødvendig for etterfølgende trinn.
  7. Forsegle glasset Petri parabolen med parafin plastfilm og dekk platen med folie for å forhindre lyseksponering for fluoroforene. Inkuber over natten, opptil 16 timer, ved 37 °C på en flat, ikke-roterende overflate. Inkubasjonstid kan varieres empirisk, men minst 4 timer anbefales.
    MERK: Dekslene er utsatt for å gli rundt når du inkuberer i hybridiseringsbufferen, noe som kan føre til tørre flekker på dekslene og skade prøven.

5. Forbereder prøver for avbildning

  1. Neste dag fjerner du dekslene fra det fuktende kammeret ved hjelp av tang og returnerer dem til 24 brønnplaten med cellesiden opp. Tilsett 500 μL fersk 2x SSC-buffer pluss 10% formamid for å vaske ut overflødig sonde og ikke-spesifikk hybridisering.
    MERK: Beskytt prøvene mot lys fra dette punktet og utover.
  2. Vask cellene to ganger med 500 μL 2x SSC buffer pluss 10% formamid i 15 minutter hver ved 37 °C på en oppvarmet rotator.
  3. Motvirke DNA med DAPI ved 1 μg/ml i 2x SSC-buffer i 10 minutter ved romtemperatur på en rotator.
  4. Vask en gang med 2x SSC buffer i 5 minutter ved romtemperatur.
  5. Monter dekslene på glasssklier ved hjelp av ikke-herdende monteringsmedier etter at du har fjernet overflødig 2x SSC-buffer med et papirhåndkle og en rask vask i nukleasefritt vann for å eliminere overflødige salter. Til slutt forsegler du dekslene med klar neglelakk.

6. Mikroskopi og bildebehandling med høy oppløsning

  1. Se for deg prøvene på et bredfelts epifluorescensmikroskop ved hjelp av et 60x eller 100x oljemål og et sCMOS-kamera. Se tabellen over materialer for det spesifikke mikroskopet og målet som brukes for dette eksperimentet.
    1. Fullstendig avbildning så snart prøvene er ferdigbehandlet for å unngå tidsavhengig nedbrytning av signalet.
      MERK: Nedsenkningsolje med en brytningsindeks (RI) på 1,516 brukes i dette eksperimentet. Empirisk testing bør utføres for å matche oljen RI med spesifikke prøver, da RI-uoverensstemmelser vil resultere i avvik av punktspredningsfunksjonen som vil påvirke bildets dekonvolusjon.
  2. Bilder er tatt med en sidepikselstørrelse på 0,10827 μm.
  3. Optimaliser mengden belysning fra lyskilden (dvs. prosent overføring) og eksponeringstider for hver kanal (DAPI, TRITC, CY5-filtre i dette eksemplet) ved hjelp av prøven som forventes å ha den høyeste intensiteten (dvs. positive kontroller). I dette eksperimentet forventes den E2-behandlede prøven å ha høyere intensitet for begge GREB1-sondesettene. Vanligvis er prosentoverføringen for GREB1 intron- og exon-sonder 50 – 100 %, og eksponeringstidene varierer fra 0,25 – 0,60 sekunder.
  4. I tillegg kan du skaffe bilder under forhold som unngår fotobleaching og/eller metning av kamerapiksler. Etter vår erfaring bør det være en minimum ~ ti ganger forskjell mellom bakgrunnen og signalintensiteten. Metning av få piksler/felt kan oppstå på grunn av ikke-spesifikke signaler i prøven (dvs. smuss på dekslene, sondemengder utenfor cellen), noe som kan være akseptabelt, men bare hvis mettede områder ikke er inkludert i kvantum.
  5. Hvis du vil angi anskaffelse av en z-stakk, fokuserer du på eksemplet i DAPI-kanalen. Velg toppen og bunnen av z-stabelen i avstandene der DAPI-fargede kjerner blir ute av fokus. Z-stack trinnstørrelsen vi brukte er 0,25 μm per stykke, og den totale z-stakken skal strekke seg over hele cellen (ca. 10 μm i MCF-7-celler). Z-stack-trinnstørrelsen endres imidlertid i henhold til målet som brukes, og bør følge nyquist-utvalgskriteriet.
    MERK: Introner er vanligvis bare til stede i kjernen; Eksoner er imidlertid både i kjernen og cytoplasma. Derfor vil det å sette z-stabelen som beskrevet ovenfor fange opp det meste av intron- og exon-merkingen, da z-stabelen omfatter hele cellen.
  6. Bilde vanligvis minst 200 celler for kvantitativ analyse i foreløpige eksperimenter for å fange opp et øyeblikksbilde av størrelsen på respons og variasjon mellom celler.
  7. Noen avbildede celler er ekskludert fra den endelige analysen (dvs. frafallsfrekvens) fordi de vil bli filtrert ut av analysepipeline (dvs. celler som berører kanten av bildet, apoptotiske / mitotiske celler).
    MERK: Når du velger bildeområder, er det noen faktorer du må huske på. Velg områder med jevnt spredt, ikke-overlappende celler som definert av DAPI-merket, kjernefysisk fluorescens. I tillegg kan du prøve å merke områder som har minst antall kjerner langs kantene av bildeområdet, for å unngå å telle delceller. Automatisert, objektiv avbildning er alltid foretrukket for eksperimenter som krever statistisk analyse.
  8. Etter oppkjøpet, dekonvolvere bilder ved hjelp av en aggressiv gjenopprettende algoritme ved hjelp av 10 sykluser (dvs. antall iterasjoner). Generer prognoser med maksimal intensitet for bildeanalyse (utelat dette trinnet hvis spesifikk 3D-analyse kreves). Lagre alle projeksjonsbilder i henhold til bitdybden til kameraet som brukes; i vårt tilfelle ble 16-biters TIFF gråtonebilder lagret. RGB-bilder har redusert bitdybde, noe som fører til tap av informasjon. RGB-bilder er derfor ikke egnet for bildeanalyse.

7. Bildeanalyse

  1. Les instruksjonene og last ned jupyter notatboken fra github (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. Installer Python anaconda-distribusjon (https://www.anaconda.com/distribution/) versjon 3.6 eller nyere.
  3. Åpne anaconda-ledeteksten, og skriv inn installasjonskommandoen for å Installere Simple ITK for anaconda (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. Åpne anaconda navigator og start jupyter notatbok. Det vil åpne en nettleser som viser kataloger og filer. Bla gjennom katalogstrukturene for å nå katalogen som inneholder den nedlastede jupyter-notatboken fra github.
  5. Åpne notatblokken, og kjør hver celle ved å trykke SKIFT og ENTER samtidig.
  6. Følg detaljene for hver funksjon og hvert trinn i notatblokken. For et annet sett med bilder kan det hende man må endre noen parameterverdier.
    MERK: Kort sagt, kjerner segmenteres fra DAPI-kanalen ved hjelp av lokal tersklering med en blokkstørrelse på 251 piksler, hull ble fylt og objekter mindre enn 100 piksler fjernet. Rørende kjerner ble delt ved hjelp av en vannskillealgoritme. Atommasken ble deretter utvidet med 100 piksler, og vannskillet ble brukt til å skille berøringsobjekter ved hjelp av kjerner som bassenger. For å identifisere steady state RNA (exons) ble Otsu-terskelverdi brukt; for transkripsjonelle aktive smug (intron), først ble en gaussisk uskarphet (sigma = 1) brukt og deretter ble maks entropiterskel brukt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å analysere hormonelle responser via smFISH, valgte vi for eksempel østrogenreseptormodellen (ER) som brukes i analyser med høy gjennomstrømning for å bestemme tilstedeværelsen av endokrine forstyrrende kjemikalier i miljøkatastrofer i sammenheng med deltakelse i NIEHS Superfund Research Program7. I dette eksperimentet ble tilhenger MCF-7 brystkreftceller behandlet med ER-agonisten 17β-østradiol (E2, 10 nM) eller kjøretøyet (DMSO) i 24 timer. Spektralt separerte sondesett mot GREB1 intronic (Atto 647N, rød i figur 1) og eksonisk (Quasar 570, grønn i figur 1) sekvenser tillater samtidig visualisering og kvantifisering av nascent og moden mRNA; viktigst, markere antall transkripsjonelt aktive alleler i hver celle som har vist seg å være en del av østrogen responstid kurset7.

Den fullførte protokollen genererer 16-biters tiff-projeksjoner (maximum intensity projections) for hvert interesseområde. Kjernefysisk segmentering utføres ved hjelp av DAPI-fargede kjerner, og cellegrenser estimeres ved å utvide atommasken. GREB1 intron- og exon-signaler segmentes deretter og tilordnes hver enkelt celle. Figur 1 viser dekonvolverte maks projiserte bilder og deres segmentering for en prøve behandlet med DMSO og E2.

Figure 1
Figur 1: smFISH-eksempelbilder og -utdata for bildesegmentering. (A) MCF-7 celler, behandlet med DMSO (venstre panel) og 17β-østradiol (E2, høyre panel) i 24t, ble hybridisert for å målrette GREB1 introner (Atto 647N, nascent mRNA, rød) og GREB1 exons (Quasar 570, moden mRNA, grønn). Bilder er anskaffet ved 60x/1.42NA, dekonvolvert og maksimal intensitet projisert. (B) Bilder fra (A) behandles gjennom den beskrevne bildeanalysepipeline som definerer atommasken, estimerer mobilmasken, identifiserer individuelle modne mRNA og transkripsjonelt aktive alleler. GREB1 intron og exon flekker blir deretter tildelt individuelle celler. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Etter bildeanalyserørledningen fikk vi antall celler som ikke rørte bildegrensene basert på bildebehandling av ti tilfeldige felt per behandling, og det ble fastslått at det var 150 DMSO-behandlede celler og 149 E2-behandlede celler. Siden aneuploid MCF-7-cellene har fire kopier av GREB1-genet, og med intron- og exon-sonder, vil overlappende signaler bestemme antall alleler og celler som er engasjert i aktiv transkripsjon24. Vi bestemte brøkdelen av cellepopulasjonen for hver behandling som hadde null-til-fire aktive GREB1-alleler ved å telle overlappende intron- og eksonflekker. Som i vår forrige studie definerer vi transkripsjonsaktive celler som de som viste to eller flere aktive GREB1 alleler7. Som vist i figur 2A-2Bhar E2-behandlede celler en 4 ganger økt brøkdel av celler som viser to eller flere aktive GREB1-alleler sammenlignet med kjøretøybehandlede celler7.

Figure 2
Figur 2: Kvantering av E2-indusert GREB1 på celle-for-celle- og allele-for-allele-nivå. (A) Fordelingen av antall aktive GREB1-alleler per celle som sammenligner kjøretøy (blå stolper) og E2 (røde stolper) behandlede celler. (B) Brøkdel av celler som anses som transkripsjonelt aktive, definert her som celler med to eller flere aktive GREB1 alleler7. (C) Fordeling av antall GREB1 modne mRNA per celle for hver behandling. (D) Gjennomsnittlig antall GREB1 modne RNA/celle representert som gjennomsnittsverdi for populasjonen. Feilfelt angir standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Introner er spleiset ut av nascent mRNA for å produsere modne mRNA som består av bare exon sekvenser. Derfor er det også mulig å telle antall modne mRNA per celle ved å kvantifisere antall grønne flekker. Figur 2C-2D viser endringen i fordelingen av moden GREB1 mRNA/celle og den samlede foldeendringen (20x) i cellepopulasjonen etter E2-behandling.

I tråd med de opprinnelige observasjonene over 24 timer med E2-behandling, svarer ikke alle celler på samme måte (dvs. svarene er heterogene i MCF-7-populasjonen)7. For eksempel viser antall modne GREB1 mRNAer per celle et stort uttrykksområde (~ 15 ganger) selv i de 24-timers E2-behandlede cellene; bulk RNA-kvantitetsmetoder klarer ikke å skjelne de vidtrekkende nivåene av transkripsjon i celler ved statistisk gjennomsnitt. Dette understreker kraften i smFISH å utforske heterogene celle-til-celle og allele-by-allele svar i en populasjon av isogene celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SmFISH-metoden som er beskrevet, er basert på tidligere publiserte protokoller7,12,14. I denne protokollen forklarer vi de kritiske trinnene som ble optimalisert fra våtlaboratoriet (inkludert såingstetthet, fikseringstid, permeabilisering og sondekonsentrasjon), til avbildning og bildeanalyse, og gir en full eksperimentell rørledning for laboratorier som er interessert i å utføre enkeltcelleanalyse av gentranskripsjon.

For å lette enkeltcelleanalyse er det viktig at cellene er underkonfluente og ikke overlapper slik at cellekantlinjer estimeres uten behov for en cellegrense. Vi foreslår at du fullfører en celleproliferasjonsanalyse som spenner over et bredt spekter av såtettheter så lenge eksperimentet varer, for å optimalisere celletettheten.

Å bestemme den optimale fikseringstiden er avgjørende for et vellykket smFISH-eksperiment. Vi har funnet ut at å fikse prøvene med 4% renset formaldehyd, fortynnet i steril PBS som inneholder VRC i 30 minutter på is, forbedrer konsistensen av høykvalitets smFISH-bilder betydelig, spesielt hvis strukturell analyse er nødvendig via kombinasjon av antistoffer mot interessefaktorer. Formaldehyd løser prøver ved krysskobling av makromolekyler og kan bedre opprettholde cellulære strukturer enn andre fikseringsmetoder som de som bruker organiske løsningsmidler25. Det er imidlertid nødvendig å justere fikseringstid og temperatur for den spesifikke prøven for å unngå over- eller underfiksing avprøven 26. VRC er nyttig fordi det reduserer RNA-nedbrytning og er nyttig spesielt for lav rikelig RNA27. Det er to alternativer som vi har hatt suksess med for permeabiliseringstrinnet. Den første er en 70% etanolinkubasjon ved 4 °C og den andre er en 0,5% Triton-X100 inkubasjon ved romtemperatur7,14. Det er mulig å utføre samme protokoll i høy gjennomstrømning ved hjelp av bildebehandlingskompatible multiwellplater i glassbunn (96 og 384 brønner). Konsekvent suksess med å utføre smFISH har vært avhengig av bruk av multiwell-plater i glass ved hjelp av fikseringsmiddel som inneholder VRC, og 0,5% Triton-X 100 med VRC for permeabiliseringstrinnet. Selv om optiske bunnplater i plast er et alternativ, har bildekvaliteten og suksessen vært markert lavere.

Et høyt signal-til-støy-forhold er nødvendig for enkeltcelleanalyse for å filtrere ut bakgrunnssignal og falske positiver og korrekt identifisere diffraksjonsbegrensede flekker. Bakgrunnssignal legger til intensitetsverdiene til interessesignalet. Høy bakgrunn oppstår ofte fra sub-optimal eksperimentell design, og selv om den er trukket fra fluorescerende intensitetsmålinger, er det best å først bilde regionene av interesse med så lite bakgrunnssignal som mulig28. Et høyt dynamisk område, med en minimumsforskjell på ~ 10 ganger, er nødvendig for å avgjøre om signal anses som bakgrunn eller signal av interesse29. Falske positive flekker refererer til signal som ligger utenfor cellegrensene, ofte på grunn av dårlig rengjorte deksler, utilstrekkelig vasking etter hybridisering eller sondeaggregering som oppstår når sonderer selvtilknyttet30. Hvis ikke-spesifikke signaler på grunn av falske bindinger av oligo satt til RNAer som er forskjellige fra målet skjer (dvs. på grunn av pseudogenes eller sekvens likheter), kan disse evalueres ved å teste sondesettene i en modell som ikke uttrykker genet av interesse (dvs. knock-out MEFs, CRISPR / Cas9 knock-out)31. I tillegg, som med alle fluorescensmikroskopieksperimenter, må intron- og eksonsondene skilles spektralt. I vårt eksempeleksperiment valgte vi Atto 647N- og Quasar 570-fargestoffer for GREB1-sondesettet fordi de er kompatible med spesifikasjonene til filtersettene på mikroskopet som brukes, motstandsdyktig mot fotobleaching og har et relativt høyt kvanteutbytte8,14,32. Avhengig av prøven anbefaler vi at du lager en fortynningsserie av lagersonden (vanligvis en fortynning på 1:200 til 1:1000, eller 12,5 nM til 62,5 nM) for å identifisere det beste signal-til-støy-forholdet for hvert enkelt sondesett. Noen leverandører leverer spesialmerkede sonder med brukervalgte fluoroforer for å øke lysstyrken, redusere fotobleaching og om nødvendig legge til ytterligere 1-2 kanaler som vanligvis er tilgjengelige på de fleste moderne fluorescerende mikroskoper7,8,14. Selv om smFISH har evnen til å måle lav-overflod RNA, er et sentralt problem å øke følsomheten og evnen til å oppdage delvis degradert RNA, spesielt for vevsprøver. Å oppnå et høyere signal-til-støy-forhold er mulig ved å bruke forgrenede DNA-sonder designet for å forsterke signalet, selv om vi ikke har funnet at denne tilnærmingen er nyttig i studiene våre33. Konfokale mikroskoper bruker en fokusert lyskilde for å belyse prøven mens de blokkerer lyset utenfor fokus fra å nå detektorene med ett eller flere hull. Punktskanning av konfektmikroskopi frarådes vanligvis for RNA-FISH-avbildning fordi sonder vil fotobleach raskere fra laserbelysning. Avhengig av prøve- og signalintensiteten kan imidlertid konfiskeringsmikroskop generere bilder med lite eller ingen signaltap8. Her benyttet vi et bredfelts epifluorescensmikroskop med høy forstørrelse og høyt numerisk blenderåpningsmål om å samle maksimalt antall fotoner som sendes ut av FISH-sondene34. Selv om bilder kan gjøres uskarpe av lyset utenfor fokus fra tilstøtende plan i z-stabelen, brukes restorative dekonvolusjonsalgoritmer på beregningsmessig "omdisponering" diffracted lys blant de oppkjøpte z-stakkene til utgangspunktet34. Dette gir endelige bilder med høy oppløsning for bildeanalyse. Hvis det er mulig, er det best å sammenligne forskjellige bildemodaliteter empirisk for å finne ut hvilket system som passer best for eksperimentet28.

Det er mange mulige utvidelser og anvendelser av smFISH. I vårt modelleksperiment fullførte vi en runde hybridisering med ett sett med sonder for GREB1-genet. Det er imidlertid mulig å fullføre flere runder med smFISH på en sekvensiell måte (seqFISH)13,35. I denne metoden er mRNAene i cellen merket med sekvensielle runder med hybridisering, avbildning, sonde-stripping og rehybridization. For å øke multipleksing massivt opp til hele transkripsjonsnivå, er det utviklet barkodingsteknikker (f.eks. MER-FISH)36,37,38. Dette bruker en fluorescens strekkode strategi for å unikt identifisere hver mRNA37,39. Disse teknikkene har blitt tilpasset vev, og når de kombineres med ekspansjonsmikroskopi, kan en metode som fysisk utvider en prøve med et polymernettverk, gi økt tilgang til sonder til endogene RNAer36,40,41. MER-FISH gjør det også mulig å øke signallysstyrken til individuelle molekyler ved hjelp av signalforsterkningsteknikker38. Protokollen vi beskrev er en to-dagers prosess, men det er mulig å forkorte smFISH-protokollen slik at hybridiseringen av sondene til målet RNA oppstår på så lite som ~ 5 minutter (Turbo-FISH)26. Immunfluorescens kan kombineres med smFISH (IF-FISH) for samtidig å oppdage proteiner og mRNA i en enkelt prøve42. Protokollen må optimaliseres for FISH-sondene og antistoffene som brukes til hvert eksperiment for å redusere nedbrytning av protein og/eller RNA-nedbrytning i prøven, da noen materialer (dvs. buffere og fikseringer) ikke er kompatible for behandling av både protein og mRNA43. Se flere publikasjoner fra laboratoriet vårt som eksempler på vellykkede IF-FISH-eksperimenter i tillegg til optimaliserte IF-FISH-protokoller7,18.

Til slutt presenterer vi en enkelt molekyl fluorescens in situ hybridisering (smFISH) metode som gir innsikt i encellet heterogenitet og allele-by-allele variasjon som svar på stimulans. Selv om denne protokollen er optimalisert for modellsystemet som tidligere er beskrevet, gir vi en rekke mulige justeringer som kan forbedre andre målgenmodeller7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

MAM, FS og MGM er finansiert av NIEHS (Prosjekt 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM og PKS støttes av CPRIT-finansiert GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719). Imaging støttes også av Integrated Microscopy Core ved Baylor College of Medicine med finansiering fra NIH (DK56338 og CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center og John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β Estradiol Sigma-Aldrich E2257 CAS Number 50-28-2
Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free ThermoFisher Scientific AM9770
Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose Fisher Scientific MT10017CV Manufactured by Invitrogen
DAPI Sigma-Aldrich D8417 Without sodium pyruvate
Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile Sigma-Aldrich 3730-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ Corning 21030CV Manufactured by Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%) Fisher Scientific 07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Corning 353047 Manufactured by Decon Laboratories
Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL Fisher Scientific 50-753-2978 Manufactured by Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope GE Healthcare
Hyclone Water, Molecular Biology Grade Fisher Scientific SH3053802
Immersion Oil 1.516 GE Healthcare Life Sciences 29162940 Manufactured by GE Healthcare Bio-Science
L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005Cl Manufactured by Corning
MCF-7 cells ATCC HTB-22
Molecular Grade Formamide Promega PAH5051
Olympus 60x/1.42 NA Objective Olympus
Parafilm Bemis Company, Inc. 52858-076 Distributed by VWR
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
Penicilin-Streptomycin Solution Fisher Scientific MT3001Cl Manufactured by Corning
Ribonucleoside Vanadyl Complex VWR 101229-716 Manufactured by New England Biosciences
RNase Away Ambion 9780
Sodium pyruvate, 100 mM Fisher Scientific 11-360-070 Manufactured by Gibco
Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 Fisher Scientific 12-545-81P
Triton X-100, 100 mL Fisher Scientific BP151-100 Manufactured by Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Solution 0.25% Sigma-Aldrich T4049-500ML
Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL Fisher Scientific NC9265087 Manufactured by Vector Laboratories

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
  4. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
  5. Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  6. Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
  7. Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
  8. Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
  9. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
  10. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
  11. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
  12. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  13. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  14. Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
  15. Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
  16. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  18. Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
  19. Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
  20. Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
  21. Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
  22. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
  23. Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
  24. Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
  25. Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
  26. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
  27. Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  28. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  29. Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
  30. Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
  31. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
  32. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  33. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
  34. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  35. Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
  36. Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
  37. Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
  38. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  39. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
  40. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
  41. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  42. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
  43. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).

Tags

Biokjemi Utgave 163 Enkeltmolekyl FISK avbildning bildeanalyse gentranskripsjon
Enkeltcelleanalyse av transkripsjonsaktive alleler av enkeltmolekyl fisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mistry, R. M., Singh, P. K.,… More

Mistry, R. M., Singh, P. K., Mancini, M. G., Stossi, F., Mancini, M. A. Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH. J. Vis. Exp. (163), e61680, doi:10.3791/61680 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter