Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Published: September 20, 2020 doi: 10.3791/61680
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

Summary

פלואורסצנטיות RNA מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH) היא שיטה לכימות מדויק של רמות ולוקליזציה של RNAs ספציפיים ברמת התא הבודד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקולי המעבדה המאומתים שלנו לעיבוד ספסל רטוב, הדמיה וניתוח תמונה לכימות תאים בודדים של RNAs ספציפיים.

Abstract

שעתוק גנים הוא תהליך חיוני בביולוגיה של התא, ומאפשר לתאים לפרש ולהגיב לרמזים פנימיים וחיצוניים. שיטות אוכלוסיה בתפזורת מסורתיות (כתם צפוני, PCR ו- RNAseq) המודדות רמות mRNA חסרות את היכולת לספק מידע על שונות בין תאים לתא בתגובות. הדמיה וכימות מדויקים של תא בודד ואלילי אפשריים באמצעות פלואורסצנטיות RNA של מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH). RNA-FISH מבוצע על ידי הכלאת RNAs היעד עם תוויות אוליגונוקלאוטיד בדיקות. אלה יכולים להיות התמונה באומדים תפוקה בינונית / גבוהה, ובאמצעות צינורות ניתוח תמונה, לספק נתונים כמותיים על RNAs בוגרים ומתהווים, כל ברמת תא יחיד. שלבי הקיבעון, ההכלאה, ההכלאה וההדמיה עברו אופטימיזציה במעבדה במשך שנים רבות באמצעות מערכת המודל המתוארת כאן, אשר גורמת לניתוח מוצלח וחזק של תיוג smFISH. המטרה העיקרית עם הכנה ועיבוד מדגם היא לייצר תמונות באיכות גבוהה המאופיינת ביחס אות לרעש גבוה כדי להפחית תוצאות חיוביות שגויות ולספק נתונים מדויקים יותר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר את הצינור מהכנה לדוגמה לניתוח נתונים בשילוב עם הצעות ושלבי מיטוב להתאמה לדגימות ספציפיות.

Introduction

שעתוק ותרגום גנים הם שני התהליכים העיקריים המעורבים בדוגמה המרכזית של הביולוגיה, עוברים מרצף ה- DNA ל- RNA לחלבון1. במחקר זה, אנו מתמקדים בייצור של RNA שליח (mRNA) במהלך שעתוק. מולקולת הרנ"א המתהווה כוללת הן אינטרונים שאינם קידוד והן אקסונים קידוד. אינטרונים הם שותפים תמלול החוצה לפני mRNA עובר לתוך הציטופלסמה לתרגום על ריבוזומים2,3.

באופן מסורתי, המדידה של mRNA מבוצעת באוכלוסיות בתפזורת של תאים (מאות עד מיליונים) עם התקפות קלאסיות כגון RT-qPCR או סופג צפוני. בעוד חזק מאוד, שיטות אלה מוגבלות כפי שהם אינם מספקים תובנות על וריאציה תא לתא (הטרוגניות פנוטיפית), זיהוי של מספר אללים פעילים תמלול, ואולי חשוב מכך, חסר מידע מרחבי. לאחרונה, טכנולוגיות גנום רחב המאפשר ריצוף RNA תא יחיד (RNAseq) החלו לגשר על הפער בין שיטות הדמיה רצף4. עם זאת, RNAseq סובלת מיעילות זיהוי נמוכה יחסית ושלבי העיבוד גורמים לאובדן מוחלט של מידע מרחבי5. למרות שתא יחיד RNAseq יכול לספק תובנות על הטרוגניות פנוטיפית בקרב אוכלוסייה של תאים איזוגניים, פלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (RNA-FISH) יכולה להקל על חקירה מלאה יותר של ביטוי גן היעד ברמה המרחבית, ועל בסיס אלל-על-אלל6,7.

RNA FISH היא טכניקה המאפשרת זיהוי ולוקליזציה של מולקולות RNA היעד בתאים קבועים. שלא כמו שיטות קודמות, מייגעות, RNA-FISH החדיש הנוכחי משתמש בבדיקות חומצת גרעין זמינות מסחרית המשלימות את רצפי הרנ"א היעד, וגשושיות אלה הכלאה ליעדים שלהם על ידי ווטסון-קריק בסיס זיווג8. טכניקות ההכלאה המוקדמות של מקום כללו פרוטוקול דומה שנקבע על ידי גאל ופרדו בשנת 1969, כאשר מדגם עובד עם בדיקות חומצת גרעין שהיברידיות במיוחד ליעד RNA9. במקור, ההסתה בוצעה באמצעות זיהוי רדיואקטיבי או צבעוני; עם זאת, בשנות השמונים, התפתחות הפלואורסצנטיות בפרוטוקולי הכלאה במקום (FISH) לדגי DNA ומאוחר יותר RNA FISH פתחו את המסלול לגילוי רגיש יותר, ואת הפוטנציאל למולטיפלקס10,11.

התפתחויות נוספות ב- RNA FISH הובילו ליכולת לזהות ולכומת מולקולות RNA בודדות (smFISH)12,13. זיהוי ישיר הוא שיטה שבה הבדיקות עצמן מסומנות בפלואורופורים. אתגר עם smFISH הוא שיש צורך מספיק הכלאה בדיקות / יעד כדי להקל על זיהוי של אותות פלואורסצנטיים כנקודות ברורות, עקיפה מוגבלת. כדי לטפל בבעיה זו, ניתן להשתמש בערכת בדיקה של אוליגונוקלאוטידים קצרים חד-גדיליים של DNA המשלימים לאזורים שונים של היעד RNA8,12,14. כריכת בדיקות מרובות מגבירה את צפיפות הפלורופור המקומית, מה שהופך את ה- RNA לגלוי כנקודה נפרדת בעוצמה גבוהה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו היא יתרון כי כריכת מחוץ למטרה של אוליגונוקלאוטידים במאגר ערכת הבדיקה ניתן להבחין בין אות נקודת RNA האמיתי על ידי ניתוח כמותי של גודל הנקודה ואת עוצמתו כדי להבדיל בין אות אמיתי כריכה אוליגונוקלאוטיד מזויף, ובכך להקל על ניתוח מדויק יותר על ידי הפחתת חיובי שווא12.

שיטות חלופיות לזיהוי mRNA הן שיטת תרגום ניק המבוססת על שיבוט BAC ומערכת ה- DNA המסתעפת שפותחה לאחרונה. בשיטת BAC משובטת, ניק-תרגום, ה- DNA שיש לתייג הוא חתך אנזימטי ונוקלאוטיד חדש מתווסף לקצה 3 'חשוף. הפעילות של DNA פולימראז אני מוסיף נוקלאוטיד שכותרתו וכתוצאה מכך הבדיקה הרצויה15,16. טכניקת הדנ"א המסועפת כוללת בדיקות אוליגונוקלאוטידים המות לאיברידיות בזוגות ליעדי RNA והגשושיות הללו מוגברות תוך שימוש במולקולות הגברה מרובות של אותות. שיטה זו יכולה לשפר באופן משמעותי את יחס האות לרעש, אך ההגברה יכולה מוטה כמות מדויקת מכיוון שנקודות פלואורסצנטיות יכולות להיות שונות לחלוטין בגודל ובעוצמה17.

כמערכת מודל לפרוטוקול זה, אשר מועסק באופן מלא כחלק מתוכנית המחקר Superfund NIEHS כדי לכמת את ההשפעות של כימיקלים שיבוש אנדוקריני במפרץ גלווסטון / ערוץ הספינה יוסטון, השתמשנו קולטן אסטרוגן (ER) קו תא סרטן שד חיובי MCF-7 שטופלו בן לילה עם אגוניסט ER, 17β-אסטרדיול (E2)7,18,19. E2 מווסת גנים רבים יעד ER, כולל הגן אב טיפוס יעד ER, GREB17,20,21,22. פרוטוקול SmFISH המתואר כאן משתמש קבוצה של שתי ערכות בדיקה מופרדות ספקטרלית המתמקדות GREB1; אחד כי הכלאה אקסונס והשני introns, המאפשר את המדידה של RNA בוגר ומתהווה7. לאחר מכן אנו משתמשים במיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית בשילוב עם דה-אבולציה לדגימות עם תווית SmFISH תמונה, ולאחר מכן מיישמים שגרות ניתוח תמונה כדי לכמת את מספר אללים פעילים ו- RNAs בוגרים לתא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כדי להבטיח תוצאות מיטביות, חלק המעבדה הרטוב של פרוטוקול זה דורש אמצעי זהירות סטנדרטיים ללא RNase בכל השלבים. לדוגמה, השימוש בטיפים מסוננים של פיפטה, כלי שיט סטריליים ומאגרים נטולי RNase מעודד מאוד. באמצעות מעכבי RNase כגון מתחמי ונדיל ריבונוקלאוזיד מוצע גם, במיוחד עבור RNAs היעד שפע נמוך.

1. תרבות התאים וההגדרה הניסיונית

  1. לשמור על תאי סרטן השד MCF-7 דבקים (ATCC #HTB-22) בבקבוקון תרבית רקמות T75 עם פנול אדום חינם (נדרש רק לניסויי גירוי הורמונלי) בינוני (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 2 mM L-גלוטמין, 1 ננומטר נתרן pyruvate, 50 I.U./mL פניצילין ו 50 מיקרוגרם / mL סטרפטומיצין.
  2. מניחים כיסויים עגולים מצופים חומצה מצופים פולי-D-ליסין (בעובי 0.16 עד 0.19 מ"מ, קוטר 12 מ"מ) לתוך צלחת תרבית רקמות רב-וולית 24.
    הערה: השתמש 1 M HCl כדי לחרוט חומצה כיסויים ומעיל עם פתרון 1 מ"ג / מ"ל של פולי-D-ליסין מחדש PBS סטרילי (תמיסת מלח חוצץ פוספט ללא Ca++ ו Mg++) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
  3. הסר את מדיה הצמיחה מהתאים לשטוף פעם אחת עם 5 מ"ל של PBS סטרילי (תמיסת מלח חוצץ פוספט ללא Ca++ ו Mg++). נתק תאי MCF-7 באמצעות 2-3 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA 0.25%. לאחר ניתוק התאים, נטרל את פתרון טריפסין-EDTA 0.25% עם נפח שווה של מדיה צמיחה.
  4. העבר את התאים במתלה התקשורת לצינור חרוט 15 מ"ל, להסתובב למטה ב 391 x g במשך 1 דקה כדי pellet את התאים. הסר בזהירות את המדיה מן הצינור חרוטי מבלי להפריע גלולה התא resuspend התאים בכמות מתאימה של מדיה טיפול.
    הערה: מדיה טיפול הוא פנול אדום חינם DMEM בתוספת 5% פחם-dextran מופשט ודיאליג FBS, 2 mM L-גלוטמין, 1 nM נתרן פירובט, 50 I.U./mL פניצילין ו 50 מיקרוגרם / mL סטרפטומיצין. מדיה זו חיונית לניסויים גירוי הורמון סטרואידים כמו רכיב הסרום הוא מרוקן במידה רבה של סטרואידים על ידי פחם הפשטת המדיה, יש גורמי גדילה מופחתת באמצעות דיאליזה.
  5. זרע את התאים על כיסויים בצלחת multiwell 24 ב 60,000 עד 70,000 תאים לבאר ב 500 μL של מדיה טיפול. לניסוי זה, זיהום התא צריך להיות סביב 70-80% בייזום הטיפול. מטב את צפיפות זריעת התא בהתאם לסוג התא, קצב הצמיחה ואורך הניסוי כדי למנוע השפעה, מה שמסבך את ניתוח התמונה.
    הערה: לקבלת ניתוח הדמיה ותמונה מיטבי, הימנע מגוש תאים. לשם כך, לערבב את aliquot של תאים ביסודיות על ידי pipetting (או מערבולת קצרה) את התאים כמה פעמים לפני חלוקה לתוך בארות. לפני החזרת התאים המצולת לאינקובטור, מתן התאים להתיישב במכסה המנוע של תרבית הרקמות במשך כ -20 דקות מסייע להפחית את גושי התאים.
  6. דגירה תאים לפחות יומיים לפני הטיפולים כדי להבטיח סנכרון מחזור התא והפחתת רקע עקב כל מולקולות איתות שנותרו בסרום המופשט / דיאליזה של מדיה צמיחה.
  7. לאחר דגירה של 48 שעות במדיה הטיפולית, לטפל בתאי MCF-7 עם 10 nM 17β-אסטרדיול (E2) ובקרת רכב (DMSO), מדולל במדיה הטיפול במשך 24 שעות. טיפול זה משתמש במינון רווי של E2 כדי לגרום לתגובה מקסימלית. בצע קורס זמן וניסויים בתגובה במינון כדי לקבוע באופן אמפירי תנאים עבור גנים יעד שונים, מודלים תאים וסוג של טיפולים. לדוגמה, ראה את הפרסום האחרון שלנו7.

2. הכנת מאגרים

  1. כדי להכין את מאגר הקיבעון, לדלל מטוהר, פורמולדהיד מונומרי (נמכר על ידי ספקי אלקטרון מיקרוסקופיה כמו 16% paraformaldehyde) כדי 4% ב- PBS Ca סטרילי++/ Mg++ (תמיסת מלח חוצץ פוספט בתוספת Ca++ ו- Mg++). הוסף מתחמי ונדיל ריבונוקלאוזיד (VRC) למאגר הקיבעון לריכוז סופי של 2 מ"מ כדי לעכב את השפלת הרנ"א.
    1. חשב את הכמות הכוללת של מאגר קיבוע בהתבסס על דרישת 300-500 μL של קיבוע לכל באר של צלחת multiwell 24. לאחסן את פורמלדהיד 4% על קרח עד הנדרש בשלב הקיבעון.
      הערה: הפוך את מאגר הקיבעון לרענן עבור כל ניסוי.
      זהירות: פורמלדהיד הוא טרטוגן הנספג דרך העור. השתמש בכימיקל זה במכסה אדים יחד עם PPE מתאים בהתאם לתקנות המוסדיות שלך.
  2. עבור שלב permeabilization, להכין 70% אתנול במים ללא נוקלאז. אפשרות חלופית היא 0.5% טריטון-X100 ב- PBS Ca סטרילי++/ Mg++ בתוספת 2 mM של VRC. חשב את הכמות הכוללת של מאגר permeabilization הדרוש על-ידי ניצול 500 μL של מאגר לכל באר.
  3. כדי להכין 9 מ"ל של מאגר הכלאה, להוסיף 2 מ"ל של מלאי 50% dextran סולפט, ו 1 מ"ל של 20x SSC (תמיסת מלח נתרן סיטראט) חוצץ 6 מ"ל של מים ללא נוקלאז. מערבולת לערבב ביסודיות את חיץ ההיברידיזציה. מאגר זה יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (5 °F) עד שבוע אחד.
  4. ישנם חמישה שלבי שטיפה נפרדים הדורשים חיץ נתרן סיטראט (SSC) 2x מלוחים. חשב את אמצעי האחסון הסופי של מאגר SSC 2x הדרוש על-ידי צפי ל- 500 μL של מאגר לכל כיסוי לכל שלב כביסה. לדלל את הכמות הנדרשת של מלאי 20x SSC חוצץ במים ללא נוקלאז. ניתן להוסיף 2 מ"מ VRC לשטיפת צעדים כאמצעי זהירות נוסף. ניתן לאחסן מאגר זה בטמפרטורת החדר למשך שלבי העיבוד.

3. קיבעון לדגי RNA

  1. לאחר הטיפול, להסיר את המדיה מן הבארות לשטוף פעם אחת עם סטרילי, PBS Caקר ++/ Mg++. אם מודל תא הדבקה נמוך מנוצל, אין להשתמש בוואקום כדי לשאוף לנוזל; השתמש בהקטרה ידנית כדי להסיר בזהירות את המדיה מצד הבאר ולהשמיט את שלב הכביסה הראשוני. הוסף 500 מאגר קיבוע μL במשך 30 דקות על קרח.
    הערה: אם המדגם נוטה השפלת RNA, להשתמש PBS סטרילי עם 2 mM VRC עבור שלב לשטוף בשלב זה.
  2. הסר קיבוע ולהיפטר ממנו בפסולת כימית על פי תקנות מוסדיות. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS סטרילי קר Ca++/ Mg++ במשך 3 דקות.
  3. הסר PBS ולהוסיף 500 μL של 70% אתנול לכל באר. אוטמים את צלחת 24 הבאר עם סרט פלסטיק פרפין. מניחים על סיבוב ב 4 °C (5 °F) לפחות ארבע שעות. עדיף להשאיר את הדגימות ב 70% אתנול לילה. הפרוטוקול יכול להיות מושהה בשלב זה ואת הדגימות ניתן לאחסן עד שבוע ב 70% אתנול.
    הערה: טריטון-X100 0.5% ב- PBS עם פתרון VRC של 2 מ"מ עשוי לשמש כחלופה. לדגור את הדגימות ב 500 μL של חיץ permeabilization זה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על סיבוב. אם אתה משתמש במאגר permeabilization זה, אין אפשרות להשהות את הפרוטוקול בשלב זה ועליך להמשיך בשלב ההכלאה.

4. הכלאה לדגי RNA

  1. הסר את מאגר permeabilization ולשטוף פעם אחת ב 500 μL של 2x חוצץ SSC בתוספת 10% פורממיד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על סיבוב.
  2. הכן את מאגר ההיברידיות המלא. חשב כ- 30 μL של מאגר הכלאה מלא לכל כיסוי. הוסף formamide למאגר ההיברידיות כדי להגיע לאחוז הדרוש. לדוגמה, אם יש צורך ב- 500 μL של מאגר הכלאה מלא, הוא יכלול 450 μL של חיץ ההיברידיות שנעשה בעבר בתוספת 50 μL של פורממיד מולקולרי כדי להגיע ל- 10% vol/ vol. מערבולת בקצרה לערבב.
    זהירות: פורממיד הוא טרטוגן שנספג דרך העור. השתמש בכימיקל זה במכסה אדים יחד עם PPE מתאים על פי תקנות מוסדיות.
  3. לדלל את ה- GREB1 intron (המסומן עם Atto 647N) ו- GREB1 exon (המסומן עם קוואזר 570) בדיקות 1:300 במאגר הכלאה. מערבבים באמצעות צנרת. הגן על מאגר זה מפני אור והשתמש בו באופן מיידי.
    הערה: הבדיקות תוכננו ויוצרו כמפורט ב Stossi ואח'7. הבדיקות מסופקות בדרך כלל כמאגר בדיקה אוליגונוקלאוטיד מיובש שיש להחיות במאגר TE ללא RNAse בהתאם לפרוטוקול היצרן14. פתרון המלאי עבור בדיקות אלה היה 12.5 μM, ולכן; ריכוז העבודה של הבדיקות הוא 42 ננומטר.
  4. הכן תא לחות לשלב ההכלאה בן הלילה. הניחו חתיכת סרט פלסטיק פרפין, צד לא חשוף למעלה, לתוך צלחת פטרי ניקה עם מחטא משטח כדי להסיר RNases. הרווה שתי מגבות נייר עם מים סטריליים ומניחים אותם לאורך הקצוות של צלחת פטרי כדי לספק לחות, כמו ייבוש יכול להרוס תיוג ספציפי.
  5. Aliquot הבדיקות על ידי dotting 30 μL של בדיקות חוצץ הכלאה על הצד הנקי של סרט הפלסטיק פרפין. להפיץ aliquots של בדיקות, כך כיסויים לא באים במגע אחד עם השני.
  6. בעזרת מלקחיים מעוקרים, הופכים בעדינות את צד תא הכיסוי כלפי מטה אל הגשושיות בצלחת הפטרי מזכוכית. הימנע בועות אוויר ולא להפעיל לחץ על כיסויים.
    הערה: אין להשליך את צלחת תרבית הרקמה עם חיץ 2x SSC, כפי שיהיה צורך עבור השלבים הבאים.
  7. אוטמים את צלחת הפטרי מזכוכית עם סרט פלסטיק פרפין ומכסים את הצלחת בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור של הפלורופורים. דגירה לילה, עד 16 שעות, ב 37 °C (5 °F) על משטח שטוח שאינו מסתובב. זמן הדגירה יכול להיות מגוון אמפירית, אולם מומלץ מינימום של 4 שעות.
    הערה: כיסויים רגישים להחליק סביב בעת דגירה במאגר הכלאה, אשר יכול להוביל כתמים יבשים על כיסוי ולפגוע במדגם.

5. הכנת דגימות להדמיה

  1. למחרת, להסיר את כיסויים מן החדר לחות באמצעות מלקחיים ולהחזיר אותם צלחת 24 היטב עם הצד התא למעלה. הוסף 500 μL של חיץ SSC 2x טרי בתוספת 10% פורממיד כדי לשטוף את בדיקה עודפת והיברידיות לא ספציפיות.
    הערה: הגן על הדגימות מפני אור מנקודה זו ואילך.
  2. לשטוף את התאים פעמיים עם 500 μL של 2x חוצץ SSC בתוספת 10% פורממיד במשך 15 דקות כל אחד ב 37 °C על סיבוב מחומם.
  3. דנ"א נגדית עם DAPI ב-1 מיקרוגרם/מ"ל ב-2x חוצץ SSC למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בסיבוב.
  4. יש לשטוף פעם אחת עם חיץ 2X SSC למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הר את כיסויים על מגלשות זכוכית באמצעות מדיה הרכבה ללא התקשות לאחר הסרת כל עודף 2x חוצץ SSC עם מגבת נייר ושטיפה מהירה במים חינם נוקלאז כדי למנוע מלחים עודפים. לבסוף, לאטום את כיסויים עם לק ברור.

6. מיקרוסקופיה ועיבוד תמונה ברזולוציה גבוהה

  1. צלם את הדגימות על מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי רחב באמצעות יעד שמן 60x או 100x ומצלמת sCMOS. עיין בטבלת החומרים עבור המיקרוסקופ והמטרה הספציפיים המשמשים לניסוי זה.
    1. הדמיה מלאה ברגע שהדגימות מעובדות במלואן כדי למנוע הידרדרות תלוית זמן של האות.
      הערה: שמן טבילה עם אינדקס שבירה (RI) של 1.516 משמש בניסוי זה. בדיקות אמפיריות צריך להתבצע כדי להתאים את RI שמן לדגימות ספציפיות, כמו אי התאמות RI יגרום סטיות של פונקציית התפשטות הנקודה שתשפיע על דה-אבון התמונה.
  2. התמונות נלכדות בגודל פיקסל רוחבי של 0.10827 מיקרומטר.
  3. מטב את כמות התאורה ממקור האור (כלומר, אחוז שידור) ואת זמני החשיפה עבור כל ערוץ (מסנני DAPI, TRITC, CY5 בדוגמה מסוימת זו) באמצעות המדגם שצפוי להיות בעל העוצמה הגבוהה ביותר (כלומר, פקדים חיוביים). בניסוי זה, המדגם שטופל E2 צפוי להיות בעוצמה גבוהה יותר עבור שתי ערכות הבדיקה GREB1. בדרך כלל, אחוז השידור עבור GREB1 אינטרון ו exon בדיקות הוא 50 – 100%, ואת זמני החשיפה נעים בין 0.25 - 0.60 שניות.
  4. בנוסף, רכשו תמונות בתנאים שנמנעים מהלבנת תמונות ו/או כל רוויה של פיקסלים במצלמה. מניסיוננו, צריך להיות הבדל מינימלי של פי עשרה בין הרקע לעוצמת האות. רוויה של כמה פיקסלים/שדה יכולה להתרחש עקב אותות לא ספציפיים במדגם (כלומר, לכלוך על כיסוי, צבירה של בדיקה מחוץ לתא), אשר יכול להיות מקובל, אבל רק אם אזורים רוויים אינם כלולים בכמות.
  5. כדי להגדיר רכישה של מחסנית z, התמקד בדוגמה בערוץ DAPI. בחר את החלק העליון והתחתון של מחסנית z במרחקים שבהם הגרעינים המוכתמים של DAPI הופכים מחוץ לפוקוס. גודל שלב z-stack בו השתמשנו הוא 0.25 מיקרומטר לפרוסה ואת מחסנית z הכוללת צריך להתפרס על התא כולו (כ 10 מיקרומטר בתאי MCF-7). עם זאת, גודל שלב z-stack ישתנה בהתאם למטרה המשמשת צריך לעקוב אחר קריטריון הדגימה Nyquist.
    הערה: אינטרונים נמצאים בדרך כלל רק בגרעין; עם זאת, אקסונים הם גם בגרעין וגם בציטופלסמה. לכן, הגדרת מחסנית z כמתואר לעיל תצלם את רוב התוויות האינטרונית והאקספון כאשר מחסנית z מקיפה את התא כולו.
  6. בדרך כלל, תמונה של מינימום של 200 תאים לניתוח כמותי בניסויים ראשוניים כדי ללכוד תמונה של גודל התגובה והשונות בין תאים.
  7. תאים מסוימים בתמונה אינם נכללים בניתוח הסופי (כלומר, קצב הנשירה) מכיוון שהם יסוננו על ידי צינור הניתוח (כלומר, תאים הנוגעים בגבול התמונה, תאים אפופוטוטיים/מיטוטיים).
    הערה: בעת בחירת אזורי תמונה, יש לזכור כמה גורמים. בחר אזורים עם תאים שאינם חופפים באופן שווה כפי שהוגדרו על-ידי פלואורסצנטיות גרעינית בעלת תווית DAPI. בנוסף, נסה לבחור אזורים עם המספר הנמוך ביותר של גרעינים לאורך הקצוות של אזור התמונה כדי להימנע מספירת תאים חלקיים. הדמיה אוטומטית ובלתי משוחדת עדיפה תמיד על ניסויים הדורשים ניתוח סטטיסטי.
  8. לאחר הרכישה, פירוק תמונות באמצעות אלגוריתם משקם אגרסיבי באמצעות 10 מחזורים (כלומר, מספר איטרציות). צור תחזיות בעוצמה מרבית לניתוח תמונה (השמט שלב זה אם נדרש ניתוח תלת-ממדי ספציפי). שמור את כל תמונות ההקרנה בהתאם לעומק הסיביות של המצלמה שבה נעשה שימוש; במקרה שלנו תמונות גווני אפור של TIFF של 16 סיביות נשמרו. לתמונות RGB יש עומק סיביות מופחת וכתוצאה מכך אובדן מידע; לכן, תמונות RGB אינן מתאימות לניתוח תמונה.

7. ניתוח תמונה

  1. קרא את ההוראות והורד את מחברת jupyter מגיתוב(https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. התקן הפצת פייתון אנקונדה (https://www.anaconda.com/distribution/) גירסה 3.6 ומעלה.
  3. פתח את בקשת אנקונדה והקלד את פקודת ההתקנה כדי להתקין ITK פשוט עבור אנקונדה (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. פתח את נווט אנקונדה והפעל מחברת jupyter. הוא יפתח דפדפן אינטרנט המציג ספריות וקבצים. דפדף בין מבני הספריות כדי להגיע לספריה המכילה את מחברת jupyter שהורדה מגיתוב.
  5. פתח את המחברת והפעל כל תא על-ידי הקשה על Shift ו- Enter בו-זמנית.
  6. בצע את הפרטים של כל פונקציה ושלל המסופקים במחברת. עבור קבוצה אחרת של תמונות, ייתכן שיהיה צורך לשנות ערכי פרמטר מסוימים.
    הערה: בקצרה, גרעינים מפולחים מערוץ DAPI באמצעות סף מקומי בגודל בלוק של 251 פיקסלים, חורים מולאו ואובייקטים קטנים מ- 100 פיקסלים הוסרו. גרעינים נוגעים ללב חולקו באמצעות אלגוריתם קו פרשת מים. לאחר מכן הופרדה המסכה הגרעינית ב-100 פיקסלים וקו פרשת המים שימש להפרדת עצמים נוגעים ללב באמצעות גרעינים כאגנים. כדי לזהות מצב יציב RNA (אקסונים), סף Otsu שימש; עבור אללים פעילים של תמלול (intron), תחילה הוחל טשטוש גאוסי (סיגמא= 1) ולאחר מכן נעשה שימוש בסף אנטרופיה מרבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לנתח תגובות הורמונליות באמצעות smFISH, כדוגמה, בחרנו במודל קולטן האסטרוגן (ER) המשמש בהתקפות תפוקה גבוהות כדי לקבוע את נוכחותם של כימיקלים משבשים אנדוקריניים באסונות סביבתיים בהקשר של השתתפות בתוכנית המחקר של NIEHS Superfund7. בניסוי זה, תאי סרטן השד MCF-7 חסידים טופלו עם אגוניסט ER 17β-אסטרדיול (E2, 10 ננומטר) או רכב (DMSO) במשך 24 שעות. ערכות בדיקה מופרדות ספקטרלית נגד GREB1 נטוניק (Atto 647N, אדום באיור 1)ואקסוניק (קוואזר 570, ירוק באיור 1) רצפים מאפשרים הדמיה וכימות סימולטניים של mRNA המתהווה ובוגר; חשוב לציין, סימון מספר אללים פעילים תמלול בכל תא שהוכח להיות חלק קורס זמן התגובה אסטרוגן7.

הפרוטוקול שהושלם יוצר תחזיות עוצמה מרבית של 16 סיביות (TIFF) עבור כל אזור עניין. פילוח גרעיני מתבצע באמצעות גרעינים מוכתמים DAPI, וגבולות התא מוערכים על ידי הרחבת המסכה הגרעינית. אותות אינטרטרון ואקסון GREB1 מפולחים ומוקצים לכל תא בודד. איור 1 מציג תמונות מוקרנות במהירות מרבית ואת הפילוח שלהן עבור מדגם המטופל ב- DMSO וב- E2.

Figure 1
איור 1: תמונות לדוגמה של smFISH ופלט של פילוח תמונות. (A)תאי MCF-7, שטופלו ב- DMSO (פאנל שמאלי) ו- 17β-אסטרדיול (E2, פאנל ימני) למשך 24 שעות, הוכלאו כדי למקד את הטרונים GREB1 (Atto 647N, mRNA המתהווה, אדום) ו- GREB1 אקסונים (Quasar 570, mRNA בוגר, ירוק). התמונות נרכשות ב 60x/ 1.42NA, מפורק ועוצמה מקסימלית מוקרן. (B)תמונות מ- (A) מעובדות באמצעות צינור ניתוח התמונה המתואר המגדיר את המסכה הגרעינית, מעריך את המסכה התאית, מזהה mRNA בוגר בודד ואללים פעילים בתעתיק. GREB1 אינטרון ונקודות אקסון מוקצים לאחר מכן לתאים בודדים. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר צינור ניתוח התמונה, השגנו את מספר התאים שלא נגעו בגבולות התמונה בהתבסס על הדמיה של עשרה שדות אקראיים לטיפול, ונקבע כי ישנם 150 תאים שטופלו ב- DMSO ו- 149 תאים שטופלו ב- E2. מאז תאי MCF-7 aneuploid יש ארבעה עותקים של הגן GREB1, ועם חקירות intron ו exon, אותות חופפים יקבעו את מספר אללים ותאים העוסקים שעתוק פעיל24. קבענו את החלק החלקיק של אוכלוסיית התאים עבור כל טיפול שהיה לו אללים GREB1 פעילים אפס עד ארבעה על ידי ספירת כתמי אינטרון ואקספון חופפים. כמו במחקר הקודם שלנו, אנו מגדירים תאים פעילים בתעתיק כמו אלה שהציגו שני אללים GREB1 פעילים או יותר7. כפי שניתן לראות באיור 2A-2B, בתאים שטופלו ב-E2 יש חלק גדול פי 4 של תאים המציגים שני אללים פעילים או יותר של GREB1 בהשוואה לתאים שטופלו ברכב7.

Figure 2
איור 2: כמות GREB1 המושרה E2 ברמת תא אחר תא ואלל-אחר-אלל. (A)התפלגות מספר אללי GREB1 הפעילים לתא המשווה תאים שטופלו ברכב (פסים כחולים) ו- E2 (פסים אדומים). (B)שבריר של תאים הנחשבים פעילים בתעתיק, המוגדרים כאן כתאים עם שני אללים7פעילים או יותר של GREB1 . (ג)התפלגות מספר ה- mRNA הבוגר GREB1 לתא עבור כל טיפול. (D)המספר הממוצע של RNA/תא בוגר GREB1 המיוצג כערך ממוצע עבור האוכלוסייה. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אינטרונים נצרבים מתוך mRNA המתהווה כדי לייצר mRNA בוגר המורכב רק רצפי אקסון. לכן, ניתן גם לספור את מספר mRNA בוגר לתא על ידי כימות מספר כתמים ירוקים. איור 2C-2D מראה את השינוי בהתפלגות של GREB1 mRNA/cell בוגר ואת השינוי הקיפול המצרפי (20x) באוכלוסיית התאים לאחר טיפול E2.

בהתאם לתצפיות המקוריות במשך 24 שעות של טיפול E2, לא כל התאים מגיבים באותו אופן (כלומר, התגובות הן הטרוגניות באוכלוסיית MCF-7)7. לדוגמה, מספר ה- GREB1 mRNAs הבוגרים לתא מציג טווח עצום של ביטוי (בערך פי 15) אפילו בתאים שטופלו ב- E2 24 שעות ביממה; שיטות כמות RNA בצובר אינן מצליחות להבחין ברמות הנרחבות של שעתוק בתאים על-ידי ממוצע סטטיסטי. זה מדגיש את כוחו של smFISH לחקור תגובות הטרוגניות מתא לתא ואלל על ידי allele באוכלוסייה של תאים איזוגניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מתודולוגיית smFISH המתוארת מבוססת על פרוטוקולים שפורסמו בעבר7,12,14. בפרוטוקול זה, אנו מסבירים את הצעדים הקריטיים שהותאמו מהמעבדה הרטובה (כולל צפיפות זריעה, זמן קיבעון, חדור וריכוז בדיקה), להדמיה וניתוח תמונה, ומספקים צינור ניסיוני מלא למעבדות המעוניינות לבצע ניתוח תאים בודדים של תמלול גנים.

כדי להקל על ניתוח תאים בודדים, חשוב שהתאים ית-קרקעיים ולא יחפפו כך שגבולות התא מוערכים ללא צורך בגבול תא. אנו מציעים להשלים תיעוב התפשטות תאים המשתרע על פני מגוון רחב של צפיפות זריעה למשך הניסוי כדי לייעל את צפיפות התאים.

קביעת זמן הקיבעון האופטימלי היא קריטית לניסוי SmFISH מוצלח. מצאנו כי תיקון הדגימות עם פורמלדהיד מטוהר 4%, מדולל PBS סטרילי המכיל VRC במשך 30 דקות על קרח, משפר באופן משמעותי את העקביות של תמונות smFISH באיכות גבוהה, במיוחד אם ניתוח מבני נדרש באמצעות שילוב של נוגדנים נגד גורמים מעניינים. פורמלדהיד מתקן דגימות על ידי מקרומולקולים מקשרים ויכולים לשמור טוב יותר על מבנים תאיים מאשר שיטות קיבוע אחרות כגון אלה המעסיקים ממיסים אורגניים25. עם זאת, התאמת זמן קיבעון וטמפרטורה יש צורך במדגם הספציפי כדי למנוע over- או under-תיקון המדגם26. VRC שימושי מכיוון שהוא מפחית השפלת RNA ומועיל במיוחד עבור RNA27בשפע נמוך . ישנן שתי אפשרויות שיש לנו הצלחה עם לשלב permeabilization. הראשון הוא דגירה של 70% אתנול בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשני הוא דגירה של טריטון-X100 0.5% בטמפרטורת החדר7,14. ניתן לבצע את אותו פרוטוקול בתפוקה גבוהה באמצעות לוחות מולטיוול מזכוכית תואמי הדמיה (96 ו -384 בארות). הצלחה עקבית בביצוע smFISH תלויה בשימוש בלוחות זכוכית multiwell באמצעות VRC קבוע המכיל, ו 0.5% Triton-X 100 עם VRC עבור שלב permeabilization. למרות לוחות תחתוניים פלסטיק אופטי הם אופציה, איכות התמונה וההצלחה כבר נמוך משמעותית.

נדרש יחס אות לרעש גבוה לניתוח תא בודד כדי לסנן אות רקע וחיוביים כוזבים ולזהות נכון כתמים מוגבלי עקיפה. אות רקע מוסיף לערכי האינטנסיביות של אות העניין. רקע גבוה נובע לעתים קרובות מעיצוב ניסיוני תת אופטימלי, ולמרות שהוא מופחת ממדידות עוצמה פלואורסצנטית, עדיף לדמיין בתחילה את אזורי העניין עם כמה שפחות אות רקע ככל האפשר28. טווח דינמי גבוה, עם הפרש מינימלי של פי 10, נדרש כדי לקבוע בהצלחה אם האות נחשב רקע או אות עניין29. כתמים חיוביים כוזבים מתייחסים לאות השוכנות מחוץ לגבולות התא, לעתים קרובות עקב כיסויים מנוקים בצורה גרועה, כביסה לא מספקת לאחר הכלאה, או צבירה של בדיקה המתרחשת כאשר בדיקות מקשרות אתעצמה 30. אם אותות לא ספציפיים עקב כריכה מזויפת של אוליגו להגדיר RNAs כי הם שונים מן היעד קורה (כלומר, עקב פסאודוגנים או קווי דמיון רצף), אלה ניתן להעריך על ידי בדיקת ערכות הבדיקה במודל שאינו מבטא את גן העניין (כלומר, דפיקות MEFs, CRISPR / Cas9 נוק אאוט)31. בנוסף, כמו בכל ניסוי מיקרוסקופי פלואורסצנטי, יש להפריד בין גשושיות האינטרון והאקסון. בניסוי לדוגמה שלנו, בחרנו בצבעי Atto 647N ו- Quasar 570 עבור ערכת הבדיקות GREB1 מכיוון שהם תואמים למפרטים של ערכות המסננים על המיקרוסקופ המשמש, עמידים להלבנה פוטו ויש להם תשואה קוונטית גבוהה יחסית8,14,32. בהתאם לדגימה, אנו ממליצים לבצע סדרת דילול של גשושית המניות (בדרך כלל דילול של 1:200 עד 1:1000, או 12.5 nM עד 62.5 ננומטר) כדי לזהות את יחס האות לרעש הטוב ביותר עבור כל ערכת בדיקה ספציפית. ספקים מסוימים מספקים בדיקות עם תווית מותאמת אישית עם פלואורופורים שנבחרו על ידי המשתמש כדי להגביר את הבהירות, להפחית את ההלבנה, ובמידת הצורך להוסיף 1-2 ערוצים נוספים הזמינים בדרך כלל ברוב המיקרוסקופים הפלואורסצנטיים המודרניים7,8,14. למרות של-SmFISH יש את היכולת למדוד RNA בעל שפע נמוך, בעיה מרכזית מגבירה את הרגישות והיכולת שלה לזהות RNA מושפל חלקית, במיוחד עבור דגימות רקמה. השגת יחס אות לרעש גבוה יותר אפשרית באמצעות בדיקות DNA מסועפות שנועדו להגביר את האות, אם כי לא מצאנו שגישה זו מועילה במחקרים שלנו33. מיקרוסקופים קונפוקליים משתמשים במקור אור ממוקד כדי להאיר את הדגימה תוך חסימת אור מחוץ למיקוד מלהגיע לגלאים עם חור סיכה אחד או יותר. מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת נקודות מיואשת בדרך כלל להדמיית RNA-FISH מכיוון שמבחנים יצלמו מהר יותר מהארת לייזר. עם זאת, בהתאם לדגימה ועוצמת האות, מיקרוסקופים קונפוקליים יכולים ליצור תמונות עם אובדן אות קטן עד ללא אות8. כאן, השתמשנו במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי רחב עם הגדלה גבוהה ומטרת צמצם מספרי גבוה כדי לאסוף את המספר המרבי של פוטונים הנפלטים על ידי בדיקות FISH34. למרות שניתן לטשטש תמונות על ידי אור מחוץ למיקוד ממישורים סמוכים של ערימת z, אלגוריתמים של דה-קונבולוציה משקמת מוחלים על אור מפוזר "הקצאה מחדש" חישובית בין ערימות z שנרכשו לנקודת המוצא שלו34. פעולה זו מפיקה תמונות סופיות ברזולוציה גבוהה לניתוח תמונה. במידת האפשר, עדיף להשוות אמפירית שיטות הדמיה שונות כדי לקבוע את המערכת הטובה ביותר לניסוישלך 28.

ישנם הרחבות אפשריות רבות ויישומים של smFISH. בניסוי המודל שלנו, השלמנו סבב אחד של הכלאה עם קבוצה אחת של בדיקות לגן GREB1. עם זאת, ניתן להשלים מספר סיבובים של smFISH באופן רציף (seqFISH)13,35. בשיטה זו, mRNAs בתא מסומנים על ידי סיבובים רציפים של הכלאה, הדמיה, פשיטת בדיקה ו rehybridization. על מנת להגדיל באופן מאסיבי מולטיפלקסינג עד לרמת שעתוק שלם, טכניקות barcoding פותחו (למשל, MER-FISH)36,37,38. זה משתמש באסטרטגיית ברקוד פלואורסצנטית כדי לזהות באופן ייחודי כל mRNA37,39. טכניקות אלה הותאמו לרקמות, וכאשר יחד עם מיקרוסקופיה הרחבה, שיטה המרחיבה פיזית מדגם עם רשת פולימר, יכול לספק גישה מוגברת של בדיקות RNAs אנדוגני36,40,41. MER-FISH מאפשר גם להגדיל את בהירות האות של מולקולות בודדות על ידי טכניקות הגברת אותות38. הפרוטוקול שתיארנו הוא תהליך של יומיים, עם זאת, ניתן לקצר את פרוטוקול smFISH כך שההכלאה של הבדיקות ליעד RNA מתרחשת בתוך ~ 5 דקות (טורבו-FISH)26. אימונופלואורסצנטיות יכולה להיות משולבת עם smFISH (IF-FISH) כדי לזהות בו זמנית חלבונים ו- mRNA בדגימה אחת42. הפרוטוקול חייב להיות מותאם לבדיקות FISH ונוגדנים המשמשים לכל ניסוי כדי להפחית השפלה של חלבון ו / או השפלת RNA במדגם, כמו חומרים מסוימים (כלומר, חוצצים ואביזרים) אינם תואמים לעיבוד הן חלבון ו mRNA43. עיין במספר פרסומים מהמעבדה שלנו כדוגמאות לניסויים מוצלחים של IF-FISH בנוסף לפרוטוקולי IF-FISH ממוטבים7,18.

לסיכום, אנו מציגים פלואורסצנטיות מולקולה אחת בשיטת הכלאה במקום (smFISH) המספקת תובנה על הטרוגניות של תאים בודדים וריאציה אלל-אחר-אלל בתגובה לגירוי. בעוד פרוטוקול זה ממוטב עבור מערכת המודל שתוארה בעבר, אנו מספקים סדרה של התאמות אפשריות שיכולות לשפר מודלים אחרים של גן יעד7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

MAM, FS ו- MGM ממומנים על ידי NIEHS (פרויקט 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM ו- PKS נתמכים על ידי מרכז GCC במימון CPRIT למיקרוסקופיה מתקדמת ו- Image Informatics (RP170719). הדמיה נתמכת גם על ידי הליבה מיקרוסקופית משולבת במכללת ביילור לרפואה במימון NIH (DK56338, ו CA125123), CPRIT (RP150578), מרכז הסרטן המקיף דן ל דאנקן, וקונסורציום חוף המפרץ ג'ון ס דאן לגנומיקה כימית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β Estradiol Sigma-Aldrich E2257 CAS Number 50-28-2
Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free ThermoFisher Scientific AM9770
Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose Fisher Scientific MT10017CV Manufactured by Invitrogen
DAPI Sigma-Aldrich D8417 Without sodium pyruvate
Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile Sigma-Aldrich 3730-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ Corning 21030CV Manufactured by Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%) Fisher Scientific 07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Corning 353047 Manufactured by Decon Laboratories
Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL Fisher Scientific 50-753-2978 Manufactured by Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope GE Healthcare
Hyclone Water, Molecular Biology Grade Fisher Scientific SH3053802
Immersion Oil 1.516 GE Healthcare Life Sciences 29162940 Manufactured by GE Healthcare Bio-Science
L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005Cl Manufactured by Corning
MCF-7 cells ATCC HTB-22
Molecular Grade Formamide Promega PAH5051
Olympus 60x/1.42 NA Objective Olympus
Parafilm Bemis Company, Inc. 52858-076 Distributed by VWR
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
Penicilin-Streptomycin Solution Fisher Scientific MT3001Cl Manufactured by Corning
Ribonucleoside Vanadyl Complex VWR 101229-716 Manufactured by New England Biosciences
RNase Away Ambion 9780
Sodium pyruvate, 100 mM Fisher Scientific 11-360-070 Manufactured by Gibco
Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 Fisher Scientific 12-545-81P
Triton X-100, 100 mL Fisher Scientific BP151-100 Manufactured by Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Solution 0.25% Sigma-Aldrich T4049-500ML
Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL Fisher Scientific NC9265087 Manufactured by Vector Laboratories

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
  4. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
  5. Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  6. Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
  7. Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
  8. Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
  9. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
  10. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
  11. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
  12. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  13. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  14. Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
  15. Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
  16. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  18. Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
  19. Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
  20. Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
  21. Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
  22. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
  23. Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
  24. Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
  25. Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
  26. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
  27. Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  28. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  29. Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
  30. Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
  31. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
  32. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  33. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
  34. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  35. Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
  36. Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
  37. Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
  38. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  39. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
  40. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
  41. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  42. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
  43. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).

Tags

ביוכימיה גיליון 163 מולקולה בודדת FISH הדמיה ניתוח תמונה שעתוק גנים
ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mistry, R. M., Singh, P. K.,… More

Mistry, R. M., Singh, P. K., Mancini, M. G., Stossi, F., Mancini, M. A. Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH. J. Vis. Exp. (163), e61680, doi:10.3791/61680 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter