Summary
يوفر البروتوكول الموصوف تحليلا كميا محسنا لعينات الأنسجة باستخدام نهجين: الكمية الخالية من التسميات والملصقات. وتستند النهج القائمة على التسمية إلى ميزة كمية أكثر دقة من البروتينات، في حين أن النهج الخالي من الملصقات أكثر فعالية من حيث التكلفة ويستخدم لتحليل مئات العينات من الفوج.
Abstract
وقد أدت التطورات الأخيرة في قياس الطيف الكتلي إلى تحليل بروتيومي عميق إلى جانب توليد مجموعات بيانات قوية وقابلة للاستنساخ. ومع ذلك ، على الرغم من التقدم التقني الكبير ، فإن إعداد العينة من البكبيمنات الحيوية مثل دم المريض ، CSF ، والأنسجة لا يزال يشكل تحديات كبيرة. لتحديد المؤشرات الحيوية، غالبا ما يوفر بروتيوم الأنسجة مصدر عينة جذاب لترجمة نتائج البحث من مقاعد البدلاء إلى العيادة. يمكن أن تكشف عن المؤشرات الحيوية المرشح المحتملة للتشخيص المبكر للسرطان والأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر، ومرض باركنسون، الخ. تنتج بروتينات الأنسجة أيضا ثروة من المعلومات النظامية استنادا إلى وفرة البروتينات وتساعد على معالجة الأسئلة البيولوجية المثيرة للاهتمام.
يمكن تجميع التحليل الكمي للبروتيوميات في فئتين واسعتين: نهج قائم على التسمية ونهج خال من التسميات. في النهج القائم على التسمية، يتم تسمية البروتينات أو الببتيدات باستخدام نظائر مستقرة مثل SILAC (وضع علامات النظائر المستقرة مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا) أو عن طريق العلامات الكيميائية مثل ICAT (علامات التقارب المرمزة بالنظائر)، TMT (علامة الكتلة جنبا إلى جنب) أو iTRAQ (علامة النظائر للكمية النسبية والمطلقة). النهج القائمة على التسمية لديها ميزة كمية أكثر دقة من البروتينات واستخدام تسميات isobaric، يمكن تحليل عينات متعددة في تجربة واحدة. ويوفر النهج الخالي من الملصقات بديلا فعالا من حيث التكلفة للنهج القائمة على الملصقات. يمكن تحليل مئات عينات المرضى المنتمين إلى مجموعة معينة ومقارنتها بالأفواج الأخرى استنادا إلى الميزات السريرية. هنا ، وصفنا سير عمل البروتيوم الكمي الأمثل لعينات الأنسجة باستخدام طرق التنميط البروتيوم الخالية من الملصقات والقائمة على التسمية ، وهو أمر بالغ الأهمية للتطبيقات في علوم الحياة ، وخاصة المشاريع القائمة على اكتشاف العلامات الحيوية.
Introduction
تقنيات البروتيوميات لديها القدرة على تمكين تحديد وتحديد كمي من علامات المرشح المحتملة التي يمكن أن تساعد في الكشف عن المرضوتكهناته 1. وقد عجلت التطورات الأخيرة في مجال قياس الطيف الكتلي البحوث السريرية على مستوى البروتين. يحاول الباحثون التصدي لتحدي علم الأحياء المرضية المعقد للعديد من الأمراض باستخدام البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي ، والتي توفر الآن حساسية متزايدة لتحديد البروتين وتحديد كميته2. قياس دقيق كمي للبروتينات أمر بالغ الأهمية لفهم التعاون الديناميكي والمكاني بين البروتينات في الأفراد الأصحاء والمرضى3; ومع ذلك ، فإن مثل هذا التحليل على نطاق واسع البروتيوم ليس سهلا.
أحد القيود الرئيسية للتنميط البروتيني للعينات السريرية هو تعقيد العينات البيولوجية. وقد تم التحقيق في العديد من أنواع مختلفة من العينات لدراسة البروتيوم المرض، مثل خطوط الخلايا والبلازما والأنسجة4،5. وتستخدم خطوط الخلايا على نطاق واسع كنماذج في التجارب المختبرية لمحاكاة مراحل مختلفة من تطور المرض. ومع ذلك, أحد القيود الرئيسية مع خطوط الخلية هو أنها تكتسب بسهولة genotypic والتغيرات phenotypic أثناء عملية زراعة الخلايا6. يمكن أن تكون سوائل الجسم مثل البلازما مصدرا جذابا لاكتشاف العلامات الحيوية؛ ومع ذلك ، نظرا للبروتينات وفيرة للغاية ومجموعة ديناميكية من تركيز البروتين ، البلازما بروتيوميات قليلا أكثر تحديا7. هنا، الببتيدات نشأت من البروتينات الأكثر وفرة يمكن قمع تلك المستمدة من البروتينات وفيرة منخفضة حتى لو كانت نسبة الكتلة / تهمة هو نفسه6. على الرغم من أن هناك تقدما في تقنيات الاستنفاد والتفكك في السنوات القليلة الماضية ، والحصول على تغطية جيدة لا يزال قيدا رئيسيا من بروتيوم البلازما8،9. ويفضل استخدام الأنسجة للتحقيق proteomic من بيولوجيا المرض وعينات الأنسجة هي الأكثر قريبة من مواقع المرض وتقديم معلومات فسيولوجية ومرضية عالية لتوفير رؤى أفضل في بيولوجيا المرض10،11.
في هذه المخطوطة، قدمنا بروتوكولا مبسطا لعلم البروتينات الكمي لعينات الأنسجة. لقد استخدمنا عازلة تحتوي على 8 M اليوريا لإعداد الأنسجة lysate كما هذا العازلة متوافقة مع التحقيقات القائمة على قياس الطيف الكتلي. ومع ذلك ، فإنه إلزامي لتنظيف الببتيدات لإزالة الأملاح قبل حقنها في مطياف الكتلة. نقطة واحدة مهمة أن نتذكر هو تقليل تركيز اليوريا إلى أقل من 1 M قبل إضافة التريبسين لهضم البروتين كما يظهر تريبسين نشاط منخفض في تركيز اليوريا 8 M. لقد شرحنا نهجين من البروتيات العالمية الكمية: القياس الكمي القائم على التسمية باستخدام iTRAQ (علامات إيسوباك للقياس الكمي النسبي والمطلق) والتحديد الكمي الخالي من الملصقات (LFQ). يستخدم البروتيوم الكمي القائم على iTRAQ بشكل رئيسي لمقارنة عينات متعددة تختلف في حالتها البيولوجية (على سبيل المثال ، طبيعي مقابل المرض أو عينات المعالجة). يستخدم هذا النهج الكواشف الإسوباريك لتسمية الأمينات الأولية N-المحطة من الببتيدات12. تحتوي كاشفات iTRAQ على مجموعة مراسل N-methyl piperazine ، ومجموعة موازنة ، ومجموعة إستر N-hydroxy succinimide التي تتفاعل مع الأمينات الأولية N-terminal من الببتيدات13. يتم تسمية الببتيدات المهضومة من كل حالة مع كاشف iTRAQ معين. بعد وضع العلامات ، يتم إيقاف رد الفعل ويتم تجميع الببتيدات المسماة من ظروف مختلفة في أنبوب واحد. يتم تحليل خليط العينة المشترك هذا بواسطة مطياف الكتلة لتحديده وتحديد كمي. بعد تحليل MS / MS ، يتم إنشاء شظايا أيون المراسل ذات الكتل الجزيئية المنخفضة وتستخدم كثافة أيونات المراسل هذه للقياس الكمي للبروتينات.
وثمة نهج آخر، وهو القياس الكمي الخالي من الملصقات، يستخدم لتحديد العدد النسبي للبروتينات في العينات المعقدة دون وضع علامات على الببتيدات ذات النظائر المستقرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد استعرضت هذه الدراسة ووافقت عليها مجالس المراجعة المؤسسية ولجنة الأخلاقيات التابعة للمعهد الهندي للتكنولوجيا بومباي (IITB-IEC/2016/026). قدم المرضى / المشاركون موافقتهم الخطية للمشاركة في هذه الدراسة.
1. إعداد lysate الأنسجة
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التالية على الجليد للحفاظ على proteases غير نشط. تأكد من أن المشرط وأي أنابيب تستخدم معقمة لتجنب أي تلوث متقاطع.
- اتخاذ ~ 30 ملغ من الأنسجة في أنبوب الضرب حبة، إضافة 200 ميكرولتر من 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) ودوامة ذلك.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم أخذ أنسجة ورم الدماغ البشري المجمدة الطازجة لإعداد اليستات. يمكن استخدام البروتوكول لأي أنسجة مجمدة طازجة مع بعض التغييرات اعتمادا على نوع الأنسجة (الأنسجة الرخوة أو الصلبة) والتعقيد الخلوي للأنسجة. - بعد ذلك، تدور أنبوب لتسوية الأنسجة وإزالة بعناية برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة. إجراء آخر يغسل برنامج تلفزيوني إذا كان لا يزال هناك آثار الدم اليسار في الأنسجة.
- إضافة 300 ميكرولتر من العازلة تحلل اليوريا (8 M اليوريا، 50 mM تريس درجة الحموضة 8.0، 75 mM NaCl، 1 mM MgCl2)و كوكتيل مثبطات البروتيز (PIC) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظة: حجم العازلة تحلل ينبغي أن تكون كافية لطحن الأنسجة أثناء عملية سونيكيشن وتعليق ما يتم استخراجه. قد يؤدي القليل جدا من عازل التحلل إلى تحلل غير فعال للأنسجة ، في حين أن الكثير من احتياطي التحلل سيضعف تحلل البروتين. - ضع الأنبوب على الثلج وصوتيت الأنسجة على سعة 40٪ لمدة 2.5 دقيقة مع دورات نبض 5 ثوان (ON / OFF، على التوالي).
- إضافة حبات الزركونيوم إلى الأنابيب وتجانس الأنسجة باستخدام الخافق حبة لمدة 90 ق مع حضانة 5 دقائق على الجليد. كرر هذه الخطوة مرتين.
- بمجرد تجانس الأنسجة بشكل كاف ، احتضن الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق.
- بعد الحضانة، طارد مركزي العينة في 6،018 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لفصل حطام الخلية من supernatant.
- جمع supernatant في أنبوب جديد المسمى وتخزينها في -80 درجة مئوية كما aliquots حتى مزيد من الاستخدام.
2. تحديد كمية البروتين وفحص جودة الأنسجة lysates
- تحديد تركيز البروتين في الأنسجة lysate باستخدام كاشف برادفورد على النحو المبين في الملف التكميلي 1.
- بعد تحديد كمية البروتين، قم بتشغيل 10 ميكروغرام من lysate الأنسجة على هلام SDS-PAGE 12٪ للتحقق من جودة اللحواف.
ملاحظة: يجب إجراء معالجة المتلقين للمعلومات إضافية فقط ل lysates مسح تدقيقات الجودة.
3. الهضم الأنزيمي للبروتينات
ملاحظة: تظهر خطوات الهضم الأنزيمي في الشكل 1أ.
- للهضم، خذ 50 ميكروغرام من البروتينات وأضف ddH2O لتعويض الحجم إلى 20 ميكرولتر.
- الآن، وإعداد 20 mM تريس (2-carboxyethyl) فوسفين (TCEP) من المخزون (0.5 M TCEP) عن طريق إضافة 0.8 ميكرولتر من المخزون إلى ليسات البروتين للحد من الروابط ثاني كبريتيد في البروتينات واحتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- إعداد 40 mM iodoacetamide (IAA) في DDH2O وإضافة 1.6 ميكرولتر إلى الألكيلات بقايا السيستين انخفاض. احتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة تخفيف العازلة التي تحتوي على 25 mM تريس pH 8.0 و 1 MM CaCl2 في نسبة 1:8 لتخفيف تركيز اليوريا إلى أقل من 1 M في العينة. عند هذه النقطة، تحقق من درجة الحموضة.
ملاحظة: إذا كنت تستخدم التريبسين كأنزيم الهضم، تأكد من تركيز اليوريا أقل من 1 M. - لإجراء عملية الهضم، أضف التريبسين بنسبة إنزيم/ركيزة 1:50. احتضان الأنابيب في 37 درجة مئوية في حمام جاف تهتز لمدة 16 ساعة للهضم بين عشية وضحاها.
ملاحظة: إنزيم التريبسين هو بروتياز تفاعلي للغاية عرضة للهضم الذاتي. اتخاذ مزيد من الحذر وأداء إضافة تريبسين بسرعة على الجليد. - بعد 16 ساعة من الحضانة، وتجفيف الببتيدات المهضومة في تركيز فراغ.
4. إزالة الببتيدات المهضومة
ملاحظة: لتنفيذ تحلية الببتيدات، استخدم نصائح المرحلة C18.
- قم بتنشيط طرف المرحلة C18 بإضافة 50 ميكرولتر من الميثانول. الطرد المركزي الطرف في 1000 × ز لمدة 2 دقيقة في RT. تجاهل filtrate التي تم جمعها في الجزء السفلي من الأنبوب. كرر مرتين.
- إضافة 50 ميكرولتر من أسيتونيتريل في 0.1٪ حمض الفورميك لغسل طرف المرحلة. طرد مركزي الأنبوب في 1000 × غرام لمدة 2 دقيقة في RT. تجاهل filtrate التي تم جمعها في الجزء السفلي من الأنبوب. كرر هذه الخطوة مرتين.
- إضافة 50 ميكرولتر من 0.1٪ (v/v) FA لتوازن العمود. مرة أخرى، قم بإجراء الطرد المركزي عند 1000 × غرام لمدة دقيقتين في RT وتجاهل الفيلترات.
- إعادة تشكيل الببتيدات المجففة المهضومة في 50 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪.
ملاحظة: تجنب تشكيل فقاعة الهواء داخل نصائح المرحلة أثناء تمرير العينة. يجب عدم تجفيف نصائح المرحلة تماما أثناء خطوة الطرد المركزي ، حيث يمكن أن يؤدي التجفيف إلى فقدان الببتيد. - أضف الببتيدات المعاد تشكيلها إلى طرف المرحلة المنشط ومرر العينة عبر طرف المرحلة عن طريق الطرد المركزي عند 1000 × غرام لمدة دقيقتين. كرر هذه الخطوة أربع مرات على الأقل. تخزين التدفق من خلال في 4 °C.
- لغسل العينة، أضف 50 ميكرولتر من 0.1٪ (v/v) حمض الفورميك. كرر خطوة الطرد المركزي وتجاهل الخيوط.
- ل elution من الببتيدات، إضافة 50 ميكرولتر من 40٪ (v/v) ACN في حمض الفورميك 0.1٪ (v/v) وتمريره من خلال طرف المرحلة عن طريق الطرد المركزي. جمع filtrate في أنبوب جديد. كرر الخطوة مع 50٪ و 60٪ ACN في حمض الفورميك 0.1٪ وجمع الفيلترات في نفس الأنبوب الطازج.
- جفف الببتيدات المجففة التي تم جمعها في الأنبوب الطازج باستخدام مكثف فراغ.
ملاحظة: الببتيدات المجففة المجففة جاهزة للحقن، أو يمكن تخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر. للتخزين على المدى الطويل (>6 أشهر)، تخزين الببتيدات في -80 درجة مئوية.
5. تحديد كمي للببتيدات المجففة
- إعادة تشكيل الببتيدات المجففة المجففة في 0.1٪ الاتحاد الإنجليزي.
- مسح لوحة قياس قياس قياس الوبر مع الأنسجة الخالية باستخدام الإيثانول 70٪.
- استخدم 2 ميكرولتر من 0.1٪ FA لتعيين الفراغ.
- إضافة 2 ميكرولتر من عينات المعاد تشكيلها على لوحة في النسخ المتماثلة.
- ضع اللوحة في مطياف وقياس الامتصاص عند 205 نانومتر و280 نانومتر.
- حساب الأفراط المولار (ε) باستخدام الصيغة التالية:
ε = 27 / [1 - 3.85 * A280 / A205]
ملاحظة: مبتهل المولار (ε) هو مقياس لاحتمال الانتقال الإلكتروني أو مدى امتصاص الأنواع للطول الموجي الخاص للإشعاع الذي يحدث عليه. يجب أن تكون قيمة ε في نطاق 31 مل ملغ-1سم-1 إلى 33 مل ملغ-1سم-1. إذا لم تقع القيمة في النطاق، فهذا يشير إلى أن العينات لا يتم هضمها بشكل صحيح. - احسب تركيز الببتيد في μg/μL باستخدام الصيغة التالية:
تركيز الببتيد = صافي OD (205) / 0.051 * ε
6. الكمية الخالية من الملصقات (LFQ) للببتيدات المهضومة
ملاحظة: للحصول على الكمية الخالية من التسمية، استخدم معلمات LC وMS المذكورة في الملف التكميلي 2. وتم الحصول على بيانات تغطية عالية عندما تم تشغيل ثلاث نسخ بيولوجية من نفس النوع من العينة في مطياف الكتلة.
- إعداد الكروماتوغرافيا السائلة
- بعد القياس الكمي للببتيدات المجففة ، خذ 2 ميكروغرام من الببتيدات في قارورة واجعل الحجم يصل إلى 10 ميكرولتر باستخدام 0.1٪ FA. وسيكون تركيز الببتيدات المجففة 200 نانوغرام/ميكرولتر.
- افتح العينات التلقائية لنظام الكروماتوغرافيا السائلة (انظر جدول المواد)وضع القارورة داخل autosampler.
- استخدم 0.1٪ (v/v) FA لتكميل العمود السابق والعمود التحليلي.
- خذ 1 ميكروغرام من الببتيد المهضوم من القارورة وحمله على العمود.
- تعيين تدرج LC وفقا تعقيد العينة. في هذه التجربة، تم استخدام تدرج LC لمدة 120 دقيقة لكمية خالية من التسمية من عينات الأنسجة.
- MS الإعداد: قبل تحسين أي المقايسات بروتيوميكس، إجراء فحص مراقبة الجودة من الصك من خلال رصد بعض الببتيدات من المصل البقري الألبومين (BSA) باستخدام أي برنامج لملاءمة النظام وتحليل تغطية BSA (الشكل 2A،B). تم تعيين معلمات الاستحواذ في الأداة باستخدام برنامج اكتساب بيانات MS (انظر جدول المواد).
- فتح البرنامج، انقر نقرا مزدوجا على إعداد الصك وحدد القالب من الببتيدات معرف مع المعلمات الافتراضية.
- تعيين المعلمات MS باستخدام ملف التكميلية 2 وحفظه كطريقة جديدة.
- الآن، افتح البرنامج لملء تفاصيل العينة؛ انقر نقرا مزدوجا فوق إعداد التسلسل، وملء تفاصيل مثل نوع العينة واسم العينة وموقع حفظ الملف وملف طريقة الأداة وحجم الحقن وموضع العينة.
- بمجرد تعبئة كافة المعلومات، حدد الصف وابدأ تشغيل.
7. الكمية القائمة على التسمية (iTRAQ) من الببتيدات المهضومة
ملاحظة: يمكن إجراء القياس الكمي المستند إلى التسمية باستخدام تسميات إيزوباريك مختلفة مثل كاشفات iTRAQ أو TMT، إلخ. هنا، تم استخدام iTRAQ 4-plex لتسمية الببتيدات المهضومة من ثلاث عينات من الأنسجة. يتم ذكر إجراء وضع العلامات iTRAQ 4-plex أدناه.
- وضع العلامات على الببتيدات المهضومة باستخدام كاشفات iTRAQ.
ملاحظة: في هذه التجربة، يتم استخدام الببتيدات من ثلاث عينات من الأنسجة. من كل عينة نسيج، يتم أخذ 80 ميكروغرام من الببتيدات المهضومة في أربعة أنابيب للوسم بكواشف iTRAQ (114 و115 و116 و117) (انظر الملف التكميلي 3 للاطلاع على المعلمات التجريبية التفصيلية).- قبل استخدام كاشف iTRAQ، أحضر كل قارورة من الكاشف إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 5 دقائق). إعطاء تدور قصيرة من حوالي 30 ق لجلب الحل في الجزء السفلي من كل قارورة.
ملاحظة: تأكد من أنه في كل قارورة، يجب أن يكون حل 10-15 ميكرولتر موجودا. - بالنسبة إلى وضع العلامات على iTRAQ، إعادة تشكيل الببتيدات المجففة في 20 ميكرولتر من العازلة للحل المتوفرة في مجموعة وضع العلامات iTRAQ.
- إعادة تشكيل التسميات بإضافة 70 ميكرولتر من الإيثانول من القارورة المقدمة في المجموعة وخلط الحل لمدة 30 ثانية وتدور لمدة 10 ثانية.
ملاحظة: من المستحسن أن يتم تنفيذ كافة الخطوات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. - أضف ملصقات iTRAQ المختلطة بشكل متجانس (114 و115 و116 و117) إلى أنابيبها التي تحتوي على عينات الببتيد والسماح بتفاعل وضع العلامات.
- خلط مكونات كل أنبوب عن طريق دوامة أنبوب لمدة 30 ق، ومن ثم تدور أنبوب لمدة 10 ق لجلب الخليط مرة أخرى إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
ملاحظة: تحقق من رقم الحموضة للحل باستخدام ورق pH. يجب أن يكون pH أكبر من 8; إذا لم يكن كذلك، أضف ما يصل إلى 10 ميكرولتر من العازلة حل لضبط درجة الحموضة. - احتضان كل أنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. في نهاية رد الفعل، إرواء أي تسمية غير منضمة الزائدة في الأنبوب عن طريق إضافة MS درجة المياه.
- احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
- بمجرد انتهاء الحضانة ، قم بنقل جميع المحتويات المسماة إلى أنبوب واحد وجفف الببتيدات المسماة في مكثف فراغ.
ملاحظة: يمكن اتباع إجراء وضع العلامات مشابهة للتسمية TMT.
- قبل استخدام كاشف iTRAQ، أحضر كل قارورة من الكاشف إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 5 دقائق). إعطاء تدور قصيرة من حوالي 30 ق لجلب الحل في الجزء السفلي من كل قارورة.
- إعداد الكروماتوغرافيا السائلة
- إعادة تشكيل العينات في حمض الفورميك 0.1٪، وفتح autosampler من LC نانو، ووضع العينات داخل autosampler. استخدم المعلمات المذكورة في الملف التكميلي 2 لإعداد LC.
- تعيين التدرج LC وفقا لتعقيد العينة. تم استخدام تدرج LC البالغ 180 دقيقة في هذه التجربة للكمية القائمة على التسمية (iTRAQ) لعينات الأنسجة.
ملاحظة: بالنسبة للعينات الأقل تعقيدا، يمكن للتدرج القصير فصل معظم الببتيدات بكفاءة. ومع ذلك، إذا كانت العينة معقدة جدا، استخدم تدرجا أطول لفصل أفضل للببتيدات.
- إعداد MS لتقنية iTRAQ
- قم بإعداد كافة معلمات MS للكمية المستندة إلى التسمية بنفس الطريقة المستخدمة للكمية الخالية من التسمية باستثناء طاقة الاصطدام، والتي تم تعيينها إلى 35٪ لتجزئة MS/MS في الكمية المستندة إلى التسمية.
8. تحليل البيانات
- تحليل ملفات RAW (طيف MS/MS) التي تم الحصول عليها من مطياف كتلة LC باستخدام برنامج تحليل متاح تجاريا (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تم استخدام قاعدة بيانات Proteome مرجع الإنسان من Uniprot (UP000005640) التي تضم تسلسلات البروتينات 71,785 للحصول على هويات البروتين باستخدام Sequest HT والتميمة (v2.6.0) محركات البحث. يتم وصف معلمات الكمية الخالية من التسمية والكمية المستندة إلى التسمية في الملف التكميلي 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد استخدمنا نهجين مختلفين لاكتشاف بروتيوميات: نهج البروتيوميات الخالية من الملصقات والقائمة على التسمية. وأظهرت ملامح البروتين من عينات الأنسجة على SDS-PAGE البروتينات سليمة ويمكن النظر للتحليل بروتيوميك(الشكل 2A). مراقبة الجودة فحص الصك تم رصدها عن طريق نظام ملاءمة البرمجيات وأظهر التغير يوما بعد يوم في أداء الصك(الشكل 2B). لاحظنا تغطية تسلسل 91٪ من عينة BSA في 30 دقيقة من تدرج LC(الشكل 2C). تم تحسين تدرج LC باستخدام 500 نانوغرام من هضم خلايا HeLa التجارية ولاحظنا 2425 بروتينا في تدرج 2 ساعة مقارنة ب 1488 بروتينا في تدرج 1 ساعة (الشكل 2D). تمكنا من تحديد، في المتوسط، 2428 البروتينات عبر جميع النسخ المتماثلة التقنية الثلاثة لعينة من أنسجة حمام السباحة(الشكل 2E).
تم تطبيق معلمات LC وMS المحسنة على ثلاث عينات مختلفة من الأنسجة البيولوجية(الشكل 3 والملف التكميلي 2). أظهر الرسم اللوني قابلية جيدة للاستنساخ بين ثلاث عينات مختلفة من الأنسجة البيولوجية. حددنا 2725 و2748 و2718 بروتينا قابلا للقياس الكمي من عينات الأنسجة 1 و2 و3 على التوالي، باستخدام نهج قائم على التسمية. لاحظنا أن 151 بروتينا كانت شائعة في تجربتي LFQ الأولى والثانية ، وتم تقاسم 163 بروتينا بين تجربتي LFQ الثانية والثالثة ، وتم مشاركة 187 بروتينا بين التجارب الأولى والثالثة ، في حين كان 2190 بروتينا شائعا في جميع عينات الأنسجة الثلاث(الشكل 4A).
فحصنا اللوني وتحققنا من ملصقات iTRAQ ووجدناها موجودة في جميع أطياف MS/MS تقريبا. تم تشغيل المجموعات الثلاث لتجربة iTRAQ. وكان عدد البروتينات التي تم الحصول عليها من كل مجموعة 2455 و 2285 و 2307 على التوالي. ووجد أن 287 بروتينا شائعة في العينة 1 والعينة 2، وكان 183 بروتينا شائعا في العينة 2 والعينة 3، وكان 195 بروتينا شائعا في العينة 1 والعينة 3. وكان العدد الإجمالي للبروتينات الشائعة في جميع العينات الثلاث 1557(الشكل 4B).
قارنا مجموع المباريات الببتيد الطيفية (PSMs), مجموعات الببتيد, مجموع البروتينات, مجموعات البروتين, وعدد من البروتينات التي تم الحصول عليها بعد 1٪ FDR من تجربة LFQ و iTRAQ (الشكل 4C).
الشكل 1:سير العمل لبروتيوم الأنسجة. (أ) خطوات معالجة العينة لإعداد عينات من الأنسجة lysate لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. (ب) خطوات للحصول على الكمية الخالية من الملصقات. (C) خطوات الكمية المستندة إلى التسمية. (D) خطوات لتحليل البيانات باستخدام مكتشف البروتيوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مراقبة الجودة فحص عينات الأنسجة وإعادة إنتاج الصك. (أ) فحص جودة الأنسجة lysates على 12٪ SDS-PAGE(ب)رصد بعض الببتيدات من جيش الشعب البواتي باستخدام بانوراما للتحقق من تقلب الصك عبر أيام مختلفة. (ج)تغطية تسلسل جيش بزنا في ثلاث نسخ متماثلة تقنية. (د) تحسين معلمات LC لعينات الأنسجة. عددالنظائر الطيفية الببتيد والببتيدات والبروتينات في ثلاث عينات بيولوجية مختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: LC و MS المعلمات لتحليل بروتيوميوم من عينة الأنسجة. (A, B) تدرج اللوني السائل المستخدمة لفصل الببتيدات لكمية خالية من التسمية (A) والكمية القائمة على التسمية (ب) من عينة الأنسجة. (C) معلمات MS للكمية الخالية من التسمية والكمية المستندة إلى التسمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تسمية خالية والقائمة على التسمية كمية عينة الأنسجة. (أ) فين الرسم البياني يمثل البروتينات المشتركة والحصرية في عينات الأنسجة 1, 2, و 3 من تجربة خالية من التسمية. (ب) الرسم البياني فين يمثل البروتينات المشتركة والحصرية في عينات الأنسجة 1 و 2 و 3 من التجربة القائمة على التسمية. (ج)التحليل المقارن لعدد المباريات الطيفية الببتيد (PSMs)، ومجموعات الببتيد، ومجموع البروتينات، ومجموعات البروتين، وعدد البروتين بعد 1٪ FDR في الكمية الخالية من التسمية (LFQ) والتجربة القائمة على التسمية (iTRAQ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملفات تكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتيوم الأنسجة من العينات البيولوجية تمكننا من استكشاف المؤشرات الحيوية المحتملة الجديدة المرتبطة بمراحل مختلفة من تطور المرض. كما يشرح آلية الإشارات والمسارات المرتبطة بتطور المرض. يوفر البروتوكول الموصوف لتحليل البروتيوم الكمي للأنسجة بيانات تغطية جيدة قابلة للاستنساخ. وقد تم تكييف معظم الخطوات من تعليمات الشركة المصنعة. من أجل الحصول على بيانات عالية الجودة، الخطوات التالية هي الأكثر أهمية. وبالتالي، ينبغي إيلاء مزيد من الحذر أثناء تنفيذ هذه الخطوات.
قد يوفر الهضم غير الكامل للبروتينات وتلوث الكيراتين تغطية أقل للبروتينات (n < 1000) ، مما يؤثر على التجربة الشاملة. إن نسبة الحموضة للعينات (pH 8) وتركيز اليوريا في العينات (أقل من 1 م) ستضمن الهضم الفعال للبروتينات. استخدام العازلة الطازجة والتعامل مع العينات بعناية سوف يقلل من فرص تلوث الكيراتين. الكواشف iTRAQ مكلفة للغاية ويتطلب منصة MS متطورة لأداء MS / MS والبرامج لتحليل البيانات. تجارب البروتيوميات حساسة للتلوث من الأملاح، وتحديد كمي الببتيد، ووضع العلامات على كفاءة الكواشف iTRAQ/TMT. قبل تحليل MS/MS، تأكد من تحلية الببتيدات المهضومة بشكل صحيح لتقليل ضوضاء الخلفية في البيانات. في حالة تقنية iTRAQ ، يولد تجزؤ العلامة المرفقة أيون مراسل كتلة جزيئية منخفضة يمكن استخدامها لتحديد الببتيدات والبروتينات التي نشأت منها نسبيا ، في حين أنه بالنسبة للنهج الخالي من التسمية ، تعتبر المنطقة تحت المنحنى للكمية. لزيادة الثقة في كمية البروتينات، والتجارب التحقق المستقلة خاصة، ينبغي أن يتم MRM / PRM.
وقد وصف تحليل عينات الأنسجة باستخدام طريقتين للكمية (البروتيوميات الخالية من الملصقات والقائمة على التسمية) للحصول على تغطية جيدة للبروتينات. يوفر نهج البروتيوم الكمي الخالي من الملصقات العديد من المزايا لاستخدامه في الدراسات السريرية. يتم تشغيل العينات بشكل مستقل ، وهذا مهم بشكل خاص للدراسات التي يتم إجراؤها لفوج المريض حيث أن هناك عددا كبيرا من العينات التي سيتم تحليلها عن طريق مطياف الكتلة. باستخدام تكرار تقني مثل مجموعة من الببتيدات المحسنة ، يمكن للمرء ضمان استنساخ جيد حتى لو تم تشغيل العينات في نقاط زمنية مختلفة. وقد استخدم هذا النهج في الدراسات الأترابية الكبيرة مثل CPTAC، وهو جهد من العديد من المجتمعات الدولية14.
ويمكن النظر في الأهداف المحتملة الناشئة عن الدراسة للتحقق من صحتها باستخدام نهج البروتيوميات المستهدفة. نستنتج أن المشاريع القائمة على تحليل عينات الأنسجة يمكن أن تستفيد بشكل كبير من سير العمل التفصيلي للبروتيوميات الكمية المقدمة في هذه الدراسة. ستساعد الخطوات المذكورة على تحسين الطريقة وخريطة بروتيوم عينات الأنسجة. وقد يعتمد اختيار التقنيات البروتيوميكية الكمية على عدد العينات وتوافر منصات التصلب المتعدد والمسألة البيولوجية التي يتعين معالجتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نعترف بمشروع MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA)، #34_IITB المشروع إلى مرفق SS و MASSFIITB في IIT Bombay بدعم من إدارة التكنولوجيا الحيوية (BT/PR13114/INF/22/206/2015) لإجراء جميع التجارب المتعلقة بالتصلب المتعدد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
