Summary
Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.
Abstract
Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie hebben geresulteerd in diepe proteomische analyse samen met het genereren van robuuste en reproduceerbare datasets. Ondanks de aanzienlijke technische vooruitgang vormt de monstervoorbereiding van biospecimens zoals patiëntenbloed, csf en weefsel echter nog steeds aanzienlijke uitdagingen. Voor het identificeren van biomarkers biedt weefselproteomics vaak een aantrekkelijke monsterbron om de onderzoeksresultaten van de bank naar de kliniek te vertalen. Het kan potentiële kandidaat-biomarkers onthullen voor vroege diagnose van kanker en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, enz. Weefselproteomics levert ook een schat aan systemische informatie op basis van de overvloed aan eiwitten en helpt om interessante biologische vragen aan te pakken.
Kwantitatieve proteomics-analyse kan worden gegroepeerd in twee brede categorieën: een labelgebaseerde en een labelvrije aanpak. In de labelgebaseerde benadering worden eiwitten of peptiden gelabeld met behulp van stabiele isotopen zoals SILAC (stabiele isotoopetikettering met aminozuren in celkweek) of door chemische tags zoals ICAT (isotoopgecodeerde affiniteitstags), TMT (tandem mass tag) of iTRAQ (isobare tag voor relatieve en absolute kwantificering). Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten en met behulp van isobare labels kunnen meerdere monsters in één experiment worden geanalyseerd. De labelvrije aanpak biedt een kosteneffectief alternatief voor labelgebaseerde benaderingen. Honderden patiëntmonsters die tot een bepaald cohort behoren, kunnen worden geanalyseerd en vergeleken met andere cohorten op basis van klinische kenmerken. Hier hebben we een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-workflow beschreven voor weefselmonsters met behulp van labelvrije en labelgebaseerde proteoomprofileringsmethoden, wat cruciaal is voor toepassingen in de biowetenschappen, met name op biomarkerontdekking gebaseerde projecten.
Introduction
Proteomics-technologieën hebben het potentieel om de identificatie en kwantificering van potentiële kandidaat-markers mogelijk te maken die kunnen helpen bij de detectie en voorspelling van de ziekte1. Recente ontwikkelingen op het gebied van massaspectrometrie hebben het klinisch onderzoek op eiwitniveau versneld. Onderzoekers proberen de uitdaging van gecompliceerde pathobiologie van verschillende ziekten aan te pakken met behulp van op massaspectrometrie gebaseerde proteomica, die nu een verhoogde gevoeligheid biedt voor eiwitidentificatie en kwantificering2. Nauwkeurige kwantitatieve meting van eiwitten is cruciaal om de dynamische en ruimtelijke samenwerking tussen eiwitten bij gezonde en zieke individuen tebegrijpen 3; een dergelijke analyse op proteoombrede schaal is echter niet eenvoudig.
Een belangrijke beperking van proteomische profilering van klinische monsters is de complexiteit van biologische monsters. Veel verschillende soorten monsters zijn onderzocht om de ziekte proteoom te bestuderen, zoals cellijnen, plasma en weefsels4,5. Cellijnen worden veel gebruikt als modellen in in vitro experimenten om verschillende stadia van ziekteprogressie na te bootsen. Een belangrijke beperking met cellijnen is echter dat ze gemakkelijk genotypische en fenotypische veranderingen krijgen tijdens het proces van celkweek6. Lichaamsvloeistoffen zoals plasma kunnen een aantrekkelijke bron zijn voor de ontdekking van biomarkers; vanwege de zeer overvloedige eiwitten en het dynamische bereik van eiwitconcentratie is plasmaproteomics echter een beetje uitdagender7. Hier kunnen peptiden afkomstig van de meest voorkomende eiwitten die zijn afgeleid van de weinig voorkomende eiwitten onderdrukken, zelfs als de massa / ladingsverhouding hetzelfde is6. Hoewel er de afgelopen jaren vooruitgang is geboekt in de uitputtings- en fractioneringstechnologieën, blijft het verkrijgen van een goede dekking nog steeds een belangrijke beperking van plasmaproteomics8,9. Het gebruik van weefsels voor proteomisch onderzoek van ziektebiologie heeft de voorkeur omdat weefselmonsters het meest proximaal zijn voor de ziekteplaatsen en hoge fysiologische en pathologische informatie bieden om betere inzichten in de ziektebiologie te bieden10,11.
In dit manuscript hebben we een vereenvoudigd protocol gegeven voor de kwantitatieve proteomics van weefselmonsters. We hebben een buffer met 8 M ureum gebruikt voor het weefsellysaatpreparaat, omdat deze buffer compatibel is met op massaspectrometrie gebaseerd onderzoek. Het is echter verplicht om de peptiden te reinigen om zouten te verwijderen voordat ze in de massaspectrometer worden geïnjecteerd. Een belangrijk punt om te onthouden is om de ureumconcentratie te verlagen tot minder dan 1 M voordat trypsine wordt toegevoegd voor eiwitvertering, omdat trypsine een lage activiteit vertoont bij een ureumconcentratie van 8 M. We hebben twee benaderingen van kwantitatieve wereldwijde proteomics uitgelegd: labelgebaseerde kwantificering met behulp van iTRAQ (isobare tags voor relatieve en absolute kwantificering) en labelvrije kwantificering (LFQ). De op iTRAQ gebaseerde kwantitatieve proteomics wordt voornamelijk gebruikt voor het vergelijken van meerdere monsters die variëren in hun biologische toestand (bijv. Normale versus ziekte of behandelde monsters). De aanpak maakt gebruik van isobare reagentia om de N-terminale primaire amines van peptiden te labelen12. De iTRAQ-reagentia bevatten één N-methyl piperazine reportergroep, een balancergroep en één N-hydroxy succinimide-estergroep die reageert met N-terminale primaire amines van peptiden13. Verteerde peptiden van elke aandoening worden gelabeld met een bepaald iTRAQ-reagens. Na de etikettering wordt de reactie gestopt en worden gelabelde peptiden uit verschillende omstandigheden samengevoegd in een enkele buis. Dit gecombineerde monstermengsel wordt geanalyseerd met een massaspectrometer voor identificatie en kwantificering. Na de MS/MS-analyse worden reporter-ionfragmenten met lage moleculaire massa's gegenereerd en worden de ionenintensiteiten van deze reporterionen gebruikt voor de kwantificering van de eiwitten.
Een andere benadering, labelvrije kwantificering, wordt gebruikt om het relatieve aantal eiwitten in complexe monsters te bepalen zonder peptiden te labelen met stabiele isotopen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd beoordeeld en goedgekeurd door institutionele review boards en de ethische commissie van het Indian Institute of Technology Bombay (IITB-IEC/2016/026). De patiënten/deelnemers hebben hun schriftelijke toestemming gegeven om deel te nemen aan dit onderzoek.
1. Weefsellysaatpreparaat
OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit op het ijs om de proteasen inactief te houden. Zorg ervoor dat de scalpels en eventuele gebruikte buizen steriel zijn om kruisbesmetting te voorkomen.
- Neem ~30 mg weefsel in een kraalklu, voeg 200 μL 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) toe en vortex het.
OPMERKING: In deze studie werden vers ingevroren menselijke hersentumorweefsels genomen voor het lysaatpreparaat. Het protocol kan worden gebruikt voor elk vers ingevroren weefsel met enkele veranderingen, afhankelijk van het type weefsels (zachte of harde weefsels) en de cellulaire complexiteit van de weefsels. - Draai daarna aan de buis om het weefsel te laten bezinken en verwijder de PBS voorzichtig met een pipet. Voer nog een PBS-wasbeurt uit als er nog bloedsporen in het weefsel achterblijven.
- Voeg 300 μL ureumlysisbuffer (8 M ureum, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2) en proteaseremmercocktail (PIC) toe volgens het protocol van de fabrikant.
OPMERKING: Het volume van de lysisbuffer moet voldoende zijn om het weefsel tijdens het ultrasoonapparaatproces te malen en om op te schorten wat wordt geëxtraheerd. Te weinig lysisbuffer kan resulteren in inefficiënte weefsellysis, terwijl te veel lysisbuffer het eiwit lysaat zal verdunnen. - Plaats de buis op ijs en soniceer het weefsel met een amplitude van 40% gedurende 2,5 minuten met pulscycli van 5 s (respectievelijk AAN / UIT).
- Voeg zirkoniumparels toe aan de buizen en homogeniseer het weefsel met behulp van een kralenklopper gedurende 90 s met 5 minuten incubatie op ijs. Herhaal deze stap twee keer.
- Zodra het weefsel voldoende is gehomogeniseerd, incubeer je de buis gedurende 10 minuten op ijs.
- Centrifugeer het monster na incubatie gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 6,018 x g om het celresten van het supernatant te scheiden.
- Verzamel het supernatant in de vers gelabelde tube en bewaar bij -80 °C als aliquots tot verder gebruik.
2. Eiwitkwantificering en kwaliteitscontrole van weefsellysaten
- Kwantificeer de eiwitconcentratie in het weefsellysaat met behulp van Bradford's reagens zoals beschreven in het aanvullend dossier 1.
- Voer na de eiwitkwantificering 10 μg weefsellysaat uit op een 12% SDS-PAGE-gel om de kwaliteit van het lysaat te controleren.
OPMERKING: Verdere downstream-verwerking mag alleen worden uitgevoerd voor de lysaten die de kwaliteitscontroles uitvoeren.
3. Enzymatische vertering van eiwitten
OPMERKING: De stappen voor enzymatische spijsvertering zijn weergegeven in figuur 1a.
- Neem voor de spijsvertering 50 μg eiwitten en voeg ddH2O toe om het volume op 20 μL te brengen.
- Bereid nu 20 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) uit de bouillon (0,5 M TCEP) door 0,8 μL uit voorraad toe te voegen aan het eiwit lysaat om de disulfidebindingen in de eiwitten te verminderen en het monster gedurende 60 minuten bij 37 °C te incuberen.
- Bereid 40 mM jodoacetamide (IAZ) in ddH2O en voeg 1,6 μL toe om de gereduceerde cysteïneresiduen te alkylaat. Incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg een verdunningsbuffer met 25 mM Tris pH 8,0 en 1 mM CaCl2 toe in een verhouding van 1:8 om de ureumconcentratie in het monster te verdunnen tot minder dan 1 M. Controleer op dit punt de pH.
OPMERKING: Als u trypsine als spijsverteringsenzym gebruikt, zorg er dan voor dat de concentratie ureum lager is dan 1 M. - Om de spijsvertering uit te voeren, voegt u trypsine toe in een enzym/substraatverhouding van 1:50. Incubeer de buizen bij 37 °C in een schuddend droog bad gedurende 16 uur voor een nachtelijke vertering.
OPMERKING: Het trypsine-enzym is een zeer reactief protease dat gevoelig is voor zelfvertering. Wees extra voorzichtig en voer de toevoeging van trypsine snel uit over het ijs. - Droog na 16 uur incubatie de verteerde peptiden in een vacuümconcentrator.
4. Ontsalting van verteerde peptiden
OPMERKING: Om het ontsalden van peptiden uit te voeren, gebruikt u C18-fasetips.
- Activeer de C18-trappunt door 50 μL methanol toe te voegen. Centrifugeer de punt bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij RT. Gooi het filtraat dat op de bodem van de buis is verzameld weg. Herhaal dit twee keer.
- Voeg 50 μL acetonitril toe in 0,1% mierenzuur om de podiumpunt te wassen. Centrifugeer de buis bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij RT. Gooi het filtraat dat op de bodem van de buis is opgevangen weg. Herhaal deze stap twee keer.
- Voeg 50 μL van 0,1% (v/v) FA toe om de kolom in evenwicht te brengen. Nogmaals, voer de centrifugatie uit bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij RT en gooi het filtraat weg.
- Reconstitueer de gedroogde verteerde peptiden in 50 μL van 0,1% mierenzuur.
OPMERKING: Vermijd luchtbelvorming in de podiumpunten tijdens het passeren van het monster. De fasepunten mogen niet volledig worden gedroogd tijdens de centrifugatiestap, omdat drogen kan leiden tot peptideverlies. - Voeg de gereconstitueerde peptiden toe aan de geactiveerde fasepunt en passeer het monster door de fasepunt door centrifugatie bij 1.000 x g gedurende 2 minuten. Herhaal deze stap minstens vier keer. Bewaar de doorstroom bij 4 °C.
- Voeg om het monster te wassen 50 μL mierenzuur van 0,1% (v/v) toe. Herhaal de centrifugatiestap en gooi het filtraat weg.
- Voeg voor de elutie van peptiden 50 μL van 40% (v/v) ACN toe in 0,1% mierenzuur (v/v) en passeer het door de punt van het stadium door centrifugatie. Verzamel het filtraat in een verse tube. Herhaal de stap met 50% en 60% ACN in 0,1% mierenzuur en vangt het filtraat op in dezelfde verse buis.
- Droog de ontsalde peptiden verzameld in de verse buis met behulp van een vacuümconcentrator.
OPMERKING: De gedroogde ontsalfde peptiden zijn klaar om te worden geïnjecteerd, of het kan worden bewaard bij -20 °C gedurende 6 maanden. Voor langdurige opslag (>6 maanden), bewaar de peptiden bij -80 °C.
5. Kwantificering van ontsalde peptiden
- Reconstitueer de gedroogde ontsalfde peptiden in 0,1% FA.
- Veeg de fotometrische meetplaat af met pluisvrij weefsel met 70% ethanol.
- Gebruik 2 μL van 0,1% FA om de blanco in te stellen.
- Voeg 2 μL gereconstitueerde monsters in replicaties toe aan de plaat.
- Plaats de plaat in de spectrofotometer en meet de absorptie bij 205 nm en 280 nm.
- Bereken molaire absorptiviteit (ε) met behulp van de volgende formule:
ε = 27 / [1 - 3,85 * A280 / A205]
OPMERKING: Molaire absorptie (ε) is een maat voor de waarschijnlijkheid van de elektronische overgang of hoe goed een soort de specifieke golflengte van straling absorbeert die erop wordt invallen. De waarde van ε moet in het bereik liggen van 31 ml mg-1cm-1 tot 33 ml mg-1cm-1. Als de waarde niet in het bereik valt, geeft dit aan dat de monsters niet goed worden verteerd. - Bereken de peptideconcentratie in μg/μL met behulp van de volgende formule:
Concentratie van peptide = Netto OD (205) / 0,051 * ε
6. Labelvrije kwantificering (LFQ) van de verteerde peptiden
OPMERKING: Gebruik voor labelvrije kwantificering de parameters LC en MS die worden vermeld in het aanvullend bestand 2. Een hoge dekkingsgegevens werden verkregen wanneer drie biologische replicaties van hetzelfde type monster werden uitgevoerd in de massaspectrometer.
- Opstelling van vloeistofchromatografie
- Na de kwantificering van ontsalde peptiden, neem 2 μg peptiden in een injectieflacon en maak het volume aan tot 10 μL met behulp van 0,1% FA. De concentratie van ontzalfde peptiden zal 200 ng/μL zijn.
- Open de auto-sampler van het vloeistofchromatografiesysteem (zie Materiaaltabel)en plaats de injectieflacon in de autosampler.
- Gebruik 0,1% (v/v) FA om de voorkolom en de analytische kolom in evenwicht te brengen.
- Neem 1 μg ontspit verteerd peptide uit de injectieflacon en laad het op de kolom.
- Stel het LC-verloop in op basis van de complexiteit van het monster. In dit experiment werd LC-gradiënt gedurende 120 minuten gebruikt voor labelvrije kwantificering van de weefselmonsters.
- MS-opstelling: Voordat u proteomics-assays optimaliseert, voert u een kwaliteitscontrole van het instrument uit door enkele peptiden van Bovine Serum Albumin (BSA) te controleren met behulp van software voor systeemgeschiktheid en het analyseren van de dekking van BSA(Figuur 2A,B). De acquisitieparameters werden in het instrument ingesteld met behulp van de MS-software voor gegevensverzameling (zie tabel met materialen).
- Open de software, dubbelklik op Instrument Set Up en selecteer de sjabloon van peptides-ID met standaardparameters.
- Stel de MS-parameters in met aanvullend bestand 2 en sla het op als een nieuwe methode.
- Open nu de software om de voorbeelddetails in te vullen; dubbelklik op de Sequence Setupen vul de details in zoals sampletype, samplenaam, locatie voor het opslaan van bestanden, instrumentmethodebestand, het injectievolume en de positie van het sample.
- Zodra alle informatie is ingevuld, selecteert u de rij en start u de knop Uitvoeren.
7. Label-gebaseerde kwantificering (iTRAQ) van verteerde peptiden
OPMERKING: Labelgebaseerde kwantificering kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende isobare labels zoals iTRAQ- of TMT-reagentia, enz. Hier werd iTRAQ 4-plex gebruikt voor het labelen van verteerde peptiden uit drie weefselmonsters. De procedure van iTRAQ 4-plex etikettering wordt hieronder vermeld.
- Etikettering van verteerde peptiden met behulp van iTRAQ-reagentia.
OPMERKING: In dit experiment worden peptiden uit drie weefselmonsters gebruikt. Van elk weefselmonster wordt 80 μg verteerde peptiden in vier buizen genomen voor etikettering met iTRAQ-reagentia (114, 115, 116 en 117) (zie aanvullend dossier 3 voor de gedetailleerde experimentele parameters).- Breng voordat u het iTRAQ-reagens gebruikt elke injectieflacon met het reagens op kamertemperatuur (ongeveer 5 minuten). Geef een korte draai van ongeveer 30 s om de oplossing op de bodem van elke injectieflacon te brengen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat in elke injectieflacon 10-15 μL oplossing aanwezig moet zijn. - Voor iTRAQ-etikettering reconstitueer je de gedroogde peptiden in 20 μL oplossingsbuffer in de iTRAQ-etiketteringskit.
- Reconstitueer de etiketten door 70 μL ethanol uit de injectieflacon in de kit toe te voegen en meng de oplossing gedurende 30 s en draai deze gedurende 10 s.
OPMERKING: Het is raadzaam dat alle stappen worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. - Voeg de homogeen gemengde iTRAQ-labels (114, 115, 116 en 117) toe aan hun respectievelijke buizen met peptidemonsters en laat de etiketteringsreactie plaatsvinden.
- Meng de componenten van elke buis door de buis gedurende 30 s te vortexen en draai vervolgens de buis gedurende 10 s om het mengsel terug naar de bodem van de buis te brengen.
OPMERKING: Controleer de pH van de oplossing met pH-papier. de pH moet hoger zijn dan 8; zo niet, voeg dan tot 10 μL van de oplossingsbuffer toe om de pH aan te passen. - Incubeer elke buis bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Doof aan het einde van de reactie overtollig ongebonden label in de buis door water van MS-kwaliteit toe te voegen.
- Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 min tot 1 uur.
- Zodra de incubatie voorbij is, breng je alle gelabelde inhoud over in een enkele buis en droog je de gelabelde peptiden in een vacuümconcentrator.
OPMERKING: Een vergelijkbare etiketteringsprocedure kan worden gevolgd voor TMT-etikettering.
- Breng voordat u het iTRAQ-reagens gebruikt elke injectieflacon met het reagens op kamertemperatuur (ongeveer 5 minuten). Geef een korte draai van ongeveer 30 s om de oplossing op de bodem van elke injectieflacon te brengen.
- Opstelling van vloeistofchromatografie
- Reconstitueer de monsters in 0,1% mierenzuur, open de autosampler van nano-LC en plaats de monsters in de autosampler. Gebruik de parameters die worden vermeld in Aanvullend bestand 2 voor het instellen van LC.
- Stel het LC-verloop in op basis van de complexiteit van het monster. In dit experiment werd een LC-gradiënt van 180 minuten gebruikt voor labelgebaseerde kwantificering (iTRAQ) van de weefselmonsters.
OPMERKING: Voor minder complexe monsters kan een korte gradiënt de meeste peptiden efficiënt scheiden. Als het monster echter erg complex is, gebruik dan een langere gradiënt voor een betere scheiding van peptiden.
- MS setup voor iTRAQ techniek
- Stel alle MS-parameters voor op etiketten gebaseerde kwantificering op dezelfde manier in als gebruikt voor de labelvrije kwantificering, behalve voor de botsingsenergie, die was ingesteld op 35 % voor MS/MS-fragmentatie in de op etiketten gebaseerde kwantificering.
8. Data-analyse
- Analyseer de ruwe (MS /MS spectrum) bestanden verkregen van LC-massaspectrometer met behulp van een commercieel beschikbare analysesoftware (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: De Human Reference Proteome-database van Uniprot (UP000005640) bestaande uit 71.785 eiwitsequenties werd gebruikt om eiwitidentiteiten te verkrijgen met behulp van Sequest HT en Mascot (v2.6.0) zoekmachines. De parameters voor labelvrije kwantificering en labelgebaseerde kwantificering worden beschreven in aanvullend dossier 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben twee verschillende benaderingen gebruikt voor ontdekkingsproteomics: labelvrije en labelgebaseerde proteomics-benaderingen. Het eiwitprofiel van weefselmonsters op SDS-PAGE toonde de intacte eiwitten en kon in aanmerking komen voor proteomische analyse(figuur 2A). De kwaliteitscontrole van het instrument werd gemonitord via systeemgeschiktheidssoftware en toonde de dagelijkse variatie in de instrumentprestaties(figuur 2B). We zagen 91% sequentiedekking van het BSA-monster in 30 minuten LC-gradiënt(figuur 2C). De LC-gradiënt werd geoptimaliseerd met behulp van 500 ng commerciële HeLa-celvertering en we observeerden 2425 eiwitten in een gradiënt van 2 uur in vergelijking met 1488 eiwitten in een gradiënt van 1 uur(figuur 2D). We waren in staat om gemiddeld 2428 eiwitten te identificeren in alle drie de technische replicaties van een poolweefselmonster(figuur 2E).
De geoptimaliseerde LC- en MS-parameters werden toegepast op drie verschillende biologische weefselmonsters(figuur 3 en aanvullend dossier 2). Het chromatogram toonde een goede reproduceerbaarheid tussen drie verschillende biologische weefselmonsters. We identificeerden 2725, 2748 en 2718 kwantificeerbare eiwitten uit weefselmonsters 1, 2 en 3, respectievelijk, met behulp van een labelvrije benadering. We zagen dat 151 eiwitten gemeenschappelijk waren in de eerste en tweede LFQ-experimenten, 163 eiwitten werden gedeeld tussen de tweede en derde LFQ-experimenten en 187 eiwitten werden gedeeld tussen de eerste en derde experimenten, terwijl 2190 eiwitten gemeenschappelijk waren in alle drie weefselmonsters (Figuur 4A).
We inspecteerden het chromatogram en controleerden de iTRAQ-labels en ontdekten dat het in bijna alle MS / MS-spectrums aanwezig was. De drie sets zijn uitgevoerd voor het iTRAQ-experiment. Het aantal eiwitten verkregen uit elke set was respectievelijk 2455, 2285 en 2307. 287 eiwitten bleken vaak voor te komen in monster 1 en monster 2, 183 eiwitten kwamen vaak voor in monster 2 en monster 3 en 195 eiwitten kwamen vaak voor in monster 1 en monster 3. Het totale aantal eiwitten dat in alle drie de monsters voorkwam, was 1557(figuur 4B).
We vergeleken de totale peptide spectrale matches (PSM's), peptidegroepen, totale eiwitten, eiwitgroepen en het aantal eiwitten verkregen na 1% FDR van het LFQ- en iTRAQ-experiment(figuur 4C).
Figuur 1: Workflow voor weefselproteomica. (A) De monsterverwerkingsstappen om monsters van weefsellysaat voor te bereiden voor de MS-analyse. (B) Stappen voor etiketvrije kwantificering. (C) Stappen voor op etiketten gebaseerde kwantificering. (D) Stappen voor data-analyse met behulp van een proteoomontdeklinker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwaliteitscontrole van weefselmonsters en reproduceerbaarheid van het instrument. (A) Kwaliteitscontrole van weefsellysaten op 12% SDS-PAGE (B) Monitoring van sommige peptiden van BSA met behulp van Panorama om de variabiliteit van het instrument over de verschillende dagen te controleren. (C) De sequentiedekking van BSA in drie technische replicaties. (D) Optimalisatie van LC-parameters voor weefselmonsters. (E) Het aantal peptide spectrale matches, peptiden en eiwitten in drie verschillende biologische monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: LC- en MS-parameters voor proteomics-analyse van weefselmonster. (A, B) De vloeistofchromatografiegradiënt die wordt gebruikt om de peptiden te scheiden voor labelvrije kwantificering (A) en labelgebaseerde kwantificering (B) van het weefselmonster. (C) De MS-parameters voor labelvrije kwantificering en labelgebaseerde kwantificering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Labelvrije en labelgebaseerde kwantificering van weefselmonster. (A) Venn-diagram vertegenwoordigt de gemeenschappelijke en exclusieve eiwitten in weefselmonsters 1, 2 en 3 van het labelvrije experiment. (B) Venn diagram vertegenwoordigt de gemeenschappelijke en exclusieve eiwitten in weefselmonsters 1, 2 en 3 van het label-gebaseerde experiment. (C) De vergelijkende analyse van het aantal peptide spectrale matches (PSM's), peptidegroepen, totale eiwitten, eiwitgroepen en eiwitaantal na 1% FDR in labelvrije kwantificering (LFQ) en label-based experiment (iTRAQ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende bestanden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Weefselproteomica van biologische monsters stelt ons in staat om nieuwe potentiële biomarkers te verkennen die verband houden met verschillende stadia van ziekteprogressie. Het verklaart ook het mechanisme van signalering en routes geassocieerd met ziekteprogressie. Het beschreven protocol voor weefsel kwantitatieve proteomics analyse biedt reproduceerbare goede dekkingsgegevens. De meeste stappen zijn aangepast aan de instructies van de fabrikant. Om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen, zijn de volgende stappen het meest cruciaal. Daarom moet extra zorg worden gegeven tijdens het uitvoeren van deze stappen.
De onvolledige vertering van eiwitten en verontreiniging van keratine kan zorgen voor minder dekking van eiwitten (n < 1000), waardoor het algehele experiment wordt beïnvloed. De pH van de monsters (pH 8) en de concentratie van ureum in de monsters (minder dan 1 M) zorgen voor een efficiënte vertering van eiwitten. Het gebruik van verse buffer en het met zorg behandelen van monsters zal de kans op keratinebesmetting verminderen. iTRAQ-reagentia zijn extreem duur en het vereist een geavanceerd MS-platform om de MS / MS uit te voeren en software om de gegevens te analyseren. De proteomics-experimenten zijn gevoelig voor verontreiniging door zouten, peptidekwantificering en etiketteringsefficiëntie van iTRAQ / TMT-reagentia. Zorg er vóór de MS/MS-analyse voor dat verteerde peptiden goed worden ontsald om de achtergrondruis in de gegevens te verminderen. In het geval van de iTRAQ-techniek genereert fragmentatie van de bijgevoegde tag een rapportion met een lage moleculaire massa dat kan worden gebruikt om de peptiden en de eiwitten waaruit ze zijn ontstaan relatief te kwantificeren, terwijl voor een labelvrije benadering het gebied onder de curve wordt overwogen voor kwantificering. Om het vertrouwen in de kwantificering van eiwitten te vergroten, moeten met name onafhankelijke validatie-experimenten, MRM / PRM worden uitgevoerd.
De analyse van weefselmonsters met behulp van twee kwantificeringsmethoden (labelvrije en labelgebaseerde proteomics) is beschreven om een goede dekking van eiwitten te verkrijgen. De labelvrije kwantitatieve proteomics-benadering biedt verschillende voordelen voor het gebruik ervan in klinische studies. De monsters worden onafhankelijk uitgevoerd, en dit is vooral belangrijk voor studies die worden uitgevoerd voor een patiëntencohort, omdat er een groot aantal monsters moet worden geanalyseerd via massaspectrometer. Met behulp van een technische replicatie zoals een pool van geoptimaliseerde peptiden, kan men een goede reproduceerbaarheid garanderen, zelfs als de monsters op verschillende tijdstippen worden uitgevoerd. Deze aanpak is gebruikt in grote cohortstudies zoals de CPTAC, die een inspanning is van veel internationale gemeenschappen14.
De potentiële doelen die uit de studie naar voren komen, kunnen worden overwogen voor validatie met behulp van gerichte proteomics-benaderingen. We concluderen dat de projecten op basis van weefselmonsteranalyses sterk kunnen profiteren van de gedetailleerde workflows van kwantitatieve proteomics die in deze studie worden aangeboden. De genoemde stappen zullen helpen om de methode te optimaliseren en het proteoom van weefselmonsters in kaart te brengen. De selectie van kwantitatieve proteomische technieken kan afhangen van het aantal monsters, de beschikbaarheid van MS-platforms en de biologische kwestie die moet worden aangepakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We erkennen MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), project #34_IITB SS en MASSFIITB Facility in IIT Bombay ondersteund door het Department of Biotechnology (BT / PR13114 / INF / 22/206/2015) om alle MS-gerelateerde experimenten uit te voeren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
