Summary
Det beskrivna protokollet ger en optimerad kvantitativ proteomikanalys av vävnadsprover med hjälp av två metoder: etikettbaserad och etikettfri kvantifiering. Etikettbaserade metoder har fördelen av mer exakt kvantifiering av proteiner, medan ett etikettfritt tillvägagångssätt är mer kostnadseffektivt och används för att analysera hundratals prover av en kohort.
Abstract
De senaste framstegen inom masspektrometri har resulterat i djup proteomisk analys tillsammans med generering av robusta och reproducerbara datamängder. Men trots de betydande tekniska framstegen, prov förberedelse från biospecimens såsom patientens blod, CSF och vävnad fortfarande utgör betydande utmaningar. För att identifiera biomarkörer ger vävnadsproteomik ofta en attraktiv provkälla för att översätta forskningsresultat från bänken till kliniken. Det kan avslöja potentiella kandidatbiomarkörer för tidig diagnos av cancer och neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom etc. Vävnadsproteomik ger också en mängd systemisk information baserad på överflöd av proteiner och hjälper till att ta itu med intressanta biologiska frågor.
Kvantitativ proteomikanalys kan grupperas i två breda kategorier: ett etikettbaserat och ett etikettfritt tillvägagångssätt. I det etikettbaserade tillvägagångssättet är proteiner eller peptider märkta med stabila isotoper som SILAC (stabil isotopmärkning med aminosyror i cellkulturen) eller med kemiska taggar som ICAT (isotopkodade affinitetstaggar), TMT (tandemmassetikett) eller iTRAQ (isobarisk tagg för relativ och absolut kvantifiering). Etikettbaserade metoder har fördelen av mer exakt kvantifiering av proteiner och med hjälp av isobariska etiketter kan flera prover analyseras i ett enda experiment. Den etikettfria metoden är ett kostnadseffektivt alternativ till etikettbaserade metoder. Hundratals patientprover som tillhör en viss kohort kan analyseras och jämföras med andra kohorter baserade på kliniska egenskaper. Här har vi beskrivit ett optimerat kvantitativt proteomikarbetsflöde för vävnadsprover med hjälp av etikettfria och etikettbaserade proteomeprofileringsmetoder, vilket är avgörande för tillämpningar inom biovetenskap, särskilt biomarkörupptäcktsbaserade projekt.
Introduction
Proteomikteknik har potential att göra det möjligt att identifiera och kvantifiera potentiella kandidatmarkörer som kan bidra till att upptäcka och prognostifiera sjukdomen1. De senaste framstegen inom masspektrometri har påskyndat klinisk forskning på proteinnivå. Forskare försöker ta itu med utmaningen med komplicerad patobiologi av flera sjukdomar med hjälp av masspektrometribaserad proteomik, som nu erbjuder ökad känslighet för proteinidentifiering och kvantifiering2. Noggrann kvantitativ mätning av proteiner är avgörande för att förstå det dynamiska och rumsliga samarbetet mellan proteiner hos friska och sjuka individer3. En sådan analys i proteomomfattande skala är dock inte lätt.
En stor begränsning av proteomisk profilering av kliniska prover är komplexiteten hos biologiska prover. Många olika typer av prover har undersökts för att studera sjukdomen proteome, såsom cellinjer, plasma ochvävnader 4,5. Cellinjer används ofta som modeller i in vitro-experiment för att efterlikna olika stadier av sjukdomsprogression. En stor begränsning med cellinjer är dock att de enkelt förvärvar genotypiska och fenotypiska förändringar under cellkulturens process6. Kroppsvätskor som plasma kan vara en attraktiv källa för biomarkörupptäckt; Men på grund av de mycket rikliga proteinerna och det dynamiska intervallet av proteinkoncentration är plasmaproteomik lite mer utmanande7. Här kan peptider som härstammar från de mest rikliga proteinerna undertrycka de som härrör från de låga rikliga proteinerna även om massa / laddningsförhållandet är detsamma6. Även om det har gjorts framsteg i utarmnings- och fraktioneringstekniken under de senaste åren, är det fortfarande en stor begränsning av plasmaproteomics8,9. Användningen av vävnader för proteomisk undersökning av sjukdomsbiologi föredras eftersom vävnadsprover är mest proximala för sjukdomsplatserna och erbjuder hög fysiologisk och patologisk information för att ge bättre insikter isjukdomsbiologin 10,11.
I detta manuskript har vi tillhandahållit ett förenklat protokoll för kvantitativ proteomik av vävnadsprover. Vi har använt en buffert som innehåller 8 M urea för vävnad lysat beredning eftersom denna buffert är kompatibel med masspektrometri-baserade undersökningar. Det är dock obligatoriskt att rengöra peptiderna för att ta bort salter innan du injicerar dem i masspektrometern. En viktig punkt att komma ihåg är att minska ureakoncentrationen till mindre än 1 M innan trypsin tillsätts för proteinsammanfattning eftersom trypsin uppvisar låg aktivitet vid 8 M ureakoncentration. Vi har förklarat två metoder för kvantitativ global proteomik: etikettbaserad kvantifiering med iTRAQ (isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering) och etikettfri kvantifiering (LFQ). Den iTRAQ-baserade kvantitativa proteomiken används främst för att jämföra flera prover som varierar i deras biologiska tillstånd (t.ex. normal kontra sjukdom eller behandlade prover). Metoden använder isobaric reagenser för att märka N-terminal primära aminer av peptider12. ITRAQ-reagenserna innehåller en N-metyl piperazin reportergrupp, en balansgrupp och en N-hydroxy succinimide ester grupp som reagerar med N-terminal primära aminer av peptider13. Smälta peptider från varje villkor är märkta med ett visst iTRAQ-reagens. Efter märkningen stoppas reaktionen och märkta peptider från olika förhållanden slås samman till ett enda rör. Denna kombinerade provblandning analyseras med masspektrometer för identifiering och kvantifiering. Efter MS/MS-analysen genereras reporterjonfragment med låga molekylära massor och jonintensiteterna hos dessa reporterjoner används för kvantifiering av proteinerna.
Ett annat tillvägagångssätt, etikettfri kvantifiering används för att bestämma det relativa antalet proteiner i komplexa prover utan att märka peptider med stabila isotoper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie granskades och godkändes av institutionella granskningsnämnder och etikkommittén vid Indian Institute of Technology Bombay (IITB-IEC/2016/026). Patienterna/deltagarna gav sitt skriftliga samtycke till att delta i denna studie.
1. Beredning av vävnadslyat
OBS: Utför alla följande steg på isen för att hålla proteaserna inaktiva. Se till att skalpellerna och eventuella rör som används är sterila för att undvika korskontaminering.
- Ta ~ 30 mg vävnad i ett pärlslagrör, tillsätt 200 μL 1x fosfatbuffert saltlösning (PBS) och virvel det.
OBS: I denna studie togs färska frysta mänskliga hjärntumörvävnader för lysatpreparatet. Protokollet kan användas för färsk fryst vävnad med vissa förändringar beroende på typen av vävnader (mjuka eller hårda vävnader) och cellulär komplexitet hos vävnaderna. - Därefter snurrar du röret för att lösa vävnaden och ta försiktigt bort PBS med en pipett. Utför en annan PBS-tvätt om det fortfarande finns spår av blod kvar i vävnaden.
- Tillsätt 300 μL urea lysisbuffert (8 M urea, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2)och proteashämmarcocktail (PIC) enligt tillverkarens protokoll.
OBS: Volymen av lysbufferten bör vara tillräcklig för att mala vävnaden under ultraljudsbehandlingsprocessen och för att avbryta det som extraheras. För lite lysbuffert kan resultera i ineffektiv vävnadslys, medan för mycket lysbuffert späder ut proteinlyset. - Placera röret på is och ultraljudsa vävnaden med en amplitud på 40% i 2,5 min med pulscykler på 5 s (ON/OFF respektive).
- Tillsätt zirkoniumpärlor i rören och homogenisera vävnaden med en pärlvisk i 90 s med 5 min inkubation på is. Upprepa det här steget två gånger.
- När vävnaden är tillräckligt homogeniserad, inkubera röret på is i 10 minuter.
- Efter inkubationen centrifugerar du provet vid 6 018 x g i 15 min vid 4 °C för att separera cellskräpet från supernatanten.
- Samla supernatanten i det färska märkta röret och förvara vid -80 °C som alikvoter tills vidare användning.
2. Proteink kvantifiering och kvalitetskontroll av vävnadslysenat
- Kvantifiera proteinkoncentrationen i vävnadslysatet med Hjälp av Bradfords reagens enligt beskrivningen i tilläggsfilen 1.
- Efter proteink kvantifieringen, kör 10 μg vävnad lysat på en 12% SDS-PAGE gel för att kontrollera lysatets kvalitet.
OBS: Vidare bearbetning nedströms får endast utföras för lysater som rensar kvalitetskontrollerna.
3. Enzymatisk matsmältning av proteiner
OBS: Stegen för enzymatisk matsmältning visas i figur 1a.
- För matsmältning, ta 50 μg proteiner och tillsätt ddH2O för att göra upp volymen till 20 μL.
- Förbered nu 20 mM Tris (2-karboxyetyl) fosfin (TCEP) från beståndet (0,5 M TCEP) genom att tillsätta 0,8 μL från lagret till proteinlyatet för att minska disulfidbindningarna i proteinerna och inkubera provet vid 37 °C i 60 minuter.
- Förbered 40 mM joddjodamid (IAA) i ddH2O och tillsätt 1,6 μL för att alkylera de reducerade cysteinresterna. Inkubera i mörkret i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt utspädningsbuffert som innehåller 25 mM Tris pH 8,0 och 1 mM CaCl2 i ett 1:8-förhållande för att späda ut ureakoncentrationen till mindre än 1 M i provet. Kontrollera nu pH-läget.
OBS: Om trypsin används som matsmältningsenzym, se till att koncentrationen av urea är mindre än 1 M. - För att utföra matsmältningen, tillsätt trypsin vid ett enzym/ substratförhållande på 1:50. Inkubera rören vid 37 °C i ett skakigt torrt bad i 16 timmar för nattsmälta.
OBS: Trypsin enzymet är en mycket reaktiv proteas som är benägen för självsmälta. Var extra försiktig och utför tillsats av trypsin snabbt över isen. - Efter 16 h inkubation, torka de smälta peptiderna i en vakuumkoncentrator.
4. Avsaltning av smälta peptider
OBS: För att utföra avsaltning av peptider, använd C18 stegspetsar.
- Aktivera C18-stegspetsen genom att tillsätta 50 μL metanol. Centrifugera spetsen vid 1 000 x g i 2 min vid RT. Kassera filtratet som samlats i botten av röret. Upprepa två gånger.
- Tillsätt 50 μL acetonitril i 0,1% myrsyra för att tvätta scenspetsen. Centrifugera röret vid 1 000 x g i 2 min vid RT. Kassera filtratet som samlats upp i botten av röret. Upprepa det här steget två gånger.
- Tillsätt 50 μL 0,1 % (v/v) FA för att balansera kolumnen. Återigen, utför centrifugering vid 1000 x g i 2 min på RT och kassera filtratet.
- Rekonstruera de torkade smälta peptiderna i 50 μL 0,1% myrsyra.
OBS: Undvik luftbubblabildning inuti scenspetsarna när du passerar provet. Scenspetsarna bör inte torkas helt under centrifugeringssteget, eftersom torkning kan leda till peptidförlust. - Tillsätt de rekonstituerade peptiderna i den aktiverade scenspetsen och för provet genom scenspetsen genom centrifugering vid 1 000 x g i 2 minuter. Upprepa det här steget minst fyra gånger. Förvara genomflödet vid 4 °C.
- För att tvätta provet, tillsätt 50 μL 0,1% (v/v) myrsyra. Upprepa centrifugeringssteget och kassera filtratet.
- För eluering av peptider, tillsätt 50 μL 40% (v/v) ACN i 0,1% myrsyra (v/v) och passera den genom scenspetsen genom centrifugation. Samla filtratet i ett nytt rör. Upprepa steget med 50% och 60% ACN i 0,1% myrsyra och samla filtratet i samma färska rör.
- Torka de avsaltade peptiderna som samlas i det färska röret med hjälp av en vakuumkoncentrator.
OBS: De torkade avsaltade peptiderna är redo att injiceras, eller så kan de förvaras vid -20 °C i 6 månader. För långtidslagring (>6 månader), lagra peptiderna vid -80 °C.
5. Kvantifiering av avsaltade peptider
- Reconstitute de torkade desaltade peptiderna i 0,1% FA.
- Torka av den fotometriska mätplattan med luddfri vävnad med 70 % etanol.
- Använd 2 μL 0,1 % FA för att ställa in blindprovet.
- Tillsätt 2 μL rekonstituerade prover på plattan i replikat.
- Placera plattan i spektrofotometern och mät absorbansen vid 205 nm och 280 nm.
- Beräkna molarabsorptivitet (ε) med hjälp av följande formel:
ε = 27 / [1 - 3,85 * A280 / A205]
OBS: Molar absorptivity (ε) är ett mått på sannolikheten för den elektroniska övergången eller hur väl en art absorberar den specifika våglängden av strålning som är incident på den. Värdet av ε bör ligga i intervallet 31 ml mg-1cm-1 till 33 ml mg-1cm-1. Om värdet inte faller i intervallet indikerar detta att proverna inte smälts korrekt. - Beräkna peptidkoncentrationen i μg/μL med hjälp av följande formel:
Koncentration av peptid = Netto OD (205) / 0,051 * ε
6. Etikettfri kvantifiering (LFQ) av de smälta peptiderna
OBS: För etikettfri kvantifiering, använd de LC- och MS-parametrar som nämns i tilläggsfilen 2. En hög täckning data erhölls när tre biologiska replikat av samma typ av provet körts i masspektrometern.
- Installation av flytande kromatografi
- Efter kvantifiering av avsaltade peptider, ta 2 μg peptider i en flaska och gör upp volymen till 10 μL med 0,1% FA. Koncentrationen av desaltade peptider kommer att vara 200 ng/μL.
- Öppna autoprovtagaren i vätskekromatografisystemet (se Materialförteckningen)och placera injektionsflaskan inuti autosamplern.
- Använd 0,1 % (v/v) AN för att balansera kolumnen före kolumn och analys.
- Ta 1 μg avsaltad smält peptid från injektionsflaskan och ladda den på kolonnen.
- Ställ in LC-övertoningen enligt exemplets komplexitet. I detta experiment användes LC-gradient i 120 minuter för etikettfri kvantifiering av vävnadsproverna.
- MS-inställning: Innan du optimerar några proteomikanalyser, utför en kvalitetskontrollkontroll av instrumentet genom att övervaka vissa peptider av bovint serumalbumin (BSA) med hjälp av någon programvara för system lämplighet och analysera täckning av BSA (Figur 2A, B). Förvärvsparametrarna fastställdes i instrumentet med hjälp av programvaran för datainsamling av ms (se Materialförteckning ).
- Öppna programvaran, dubbelklicka på Instrument Konfigurera och välj mallen från peptid-ID med standardparametrar.
- Ange MS-parametrarna med hjälp av Kompletterande fil 2 och Spara den som en ny metod.
- Öppna nu programvaran för att fylla exempelinformationen; dubbelklicka på sekvensinställningarnaoch fyll i information som exempeltyp, exempelnamn, filsparplats, instrumentmetodfil, injektionsvolym och provexemplad position.
- När all information har fyllts i markerar du raden och startar körningen.
7. Etikettbaserad kvantifiering (iTRAQ) av smälta peptider
OBS: Etikettbaserad kvantifiering kan utföras med olika isobariska etiketter som iTRAQ- eller TMT-reagenser etc. Här användes iTRAQ 4-plex för märkning av smälta peptider från tre vävnadsprover. Förfarandet för iTRAQ 4-plex märkning nämns nedan.
- Märkning av smälta peptider med hjälp av iTRAQ reagenser.
OBS: I detta experiment används peptider från tre vävnadsprover. Från varje vävnadsprov tas 80 μg smälta peptider i fyra rör för märkning med iTRAQ-reagenser (114, 115, 116 och 117) (se kompletterande fil 3 för detaljerade experimentella parametrar).- Innan du använder iTRAQ-reagenset, ta varje injektionsflaska med reagenset till rumstemperatur (ca 5 min). Ge en kort snurr på cirka 30 s för att få lösningen längst ner på varje flaska.
OBS: Se till att det i varje injektionsflaska finns 10-15 μL-lösning. - För iTRAQ-märkning, rekonstruera de torkade peptiderna i 20 μL upplösningsbuffert som anges i iTRAQ-märkningssatsen.
- Rekonstruera etiketterna genom att tillsätta 70 μL etanol från injektionsflaskan som medföljer satsen och blanda lösningen i 30 s och snurra den i 10 s.
OBS: Det är tillrådligt att alla steg utförs enligt tillverkarens instruktioner. - Tillsätt de homogent blandade iTRAQ-etiketterna (114, 115, 116 och 117) till sina respektive rör som innehåller peptidprover och låt märkningsreaktionen äga rum.
- Blanda komponenterna i varje rör genom att virvelröra i 30 s och snurra sedan röret i 10 s för att få blandningen tillbaka till botten av röret.
OBS: Kontrollera lösningens pH-dokument med pH-papper. pH bör vara större än 8; Om inte, tillsätt upp till 10 μL av upplösningsbufferten för att justera pH-talet. - Inkubera varje rör i rumstemperatur i 90 min. I slutet av reaktionen, släcka eventuell överflödig obunden etikett i röret genom att tillsätta MS-vatten.
- Inkubera rören vid rumstemperatur i 30 min till 1 timme.
- När inkubationen är över överför du allt märkt innehåll till ett enda rör och torkar de märkta peptiderna i en vakuumkoncentrator.
OBS: En liknande märkningsprocedur kan följas för TMT-märkning.
- Innan du använder iTRAQ-reagenset, ta varje injektionsflaska med reagenset till rumstemperatur (ca 5 min). Ge en kort snurr på cirka 30 s för att få lösningen längst ner på varje flaska.
- Installation av flytande kromatografi
- Rekonstruera proverna i 0,1% myrsyra, öppna autosamplern av nano LC och placera proverna inuti autosamplern. Använd parametrarna som nämns i kompletterande fil 2 för LC-installation.
- Ställ in LC-övertoningen beroende på provet. LC-gradient på 180 min användes i detta experiment för etikettbaserad kvantifiering (iTRAQ) av vävnadsproverna.
OBS: För mindre komplexa prover kan kort lutning effektivt separera de flesta peptider. Men om provet är mycket komplext, använd en längre gradient för bättre separation av peptider.
- MS-installation för iTRAQ-teknik
- Ställ in alla MS-parametrar för etikettbaserad kvantifiering på samma sätt som används för den etikettfria kvantifieringen, med undantag för kollisionsenergin, som fastställdes till 35 % för MS/MS-fragmentering i den etikettbaserade kvantifieringen.
8. Dataanalys
- Analysera de råa (MS/MS-spektrum)filer som erhållits från LC-masspektrometer med hjälp av en kommersiellt tillgänglig analysprogramvara (se Materialförteckning).
OBS: Human Reference Proteome-databasen från Uniprot (UP000005640) bestående av 71 785 proteinsekvenser användes för att erhålla proteinidentiteter med hjälp av Sequest HT och Mascot (v2.6.0) sökmotorer. Parametrarna för etikettfri kvantifiering och etikettbaserad kvantifiering beskrivs i kompletterande fil 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har använt två olika metoder för upptäcktsproteomik: etikettfria och etikettbaserade proteomikmetoder. Proteinprofilen för vävnadsprover på SDS-PAGE visade de intakta proteinerna och kunde övervägas för proteomisk analys (figur 2A). Instrumentets kvalitetskontroll övervakades via programvara för system lämplighet och visade den dagliga variationen i instrumentets prestanda (figur 2B). Vi observerade 91% sekvenstäckning av BSA-provet i 30 min LC-gradient(figur 2C). LC-gradienten optimerades med 500 ng kommersiell HeLa-cellsammanfattning och vi observerade 2425 proteiner i en 2 h gradient jämfört med 1488 proteiner i en 1 h gradient (Figur 2D). Vi kunde i genomsnitt identifiera 2428 proteiner i alla tre tekniska replikat av ett poolvävnadsprov(figur 2E).
De optimerade parametrarna för LC och MS tillämpades på tre olika biologiska vävnadsprover(figur 3 och kompletterande akt 2). Kromatogrammet visade god reproducerbarhet mellan tre olika biologiska vävnad prover. Vi identifierade 2725, 2748 och 2718 kvantifierbara proteiner från vävnad prover 1, 2 och 3, respektive, med hjälp av en etikettfri baserad strategi. Vi observerade att 151 proteiner var vanliga i det första och andra LFQ-experimentet, 163 proteiner delades mellan det andra och tredje LFQ-experimentet och 187 proteiner delades mellan det första och tredje experimentet, medan 2190 proteiner var vanliga i alla tre vävnadsproverna (figur 4A).
Vi inspekterade kromatogrammet och kontrollerade iTRAQ-etiketterna och fann att det fanns i nästan alla MS / MS-spektrum. De tre uppsättningarna har körts för iTRAQ-experimentet. Proteiner som erhölls från varje uppsättning var 2455, 2285 respektive 2307. 287 proteiner konstaterades vara vanliga i prov 1 och prov 2, 183 proteiner var vanliga i prov 2 och prov 3, och 195 proteiner var vanliga i prov 1 och prov 3. Det totala antalet proteiner som var vanliga i alla tre proverna var 1557 (figur 4B).
Vi jämförde totala peptidspektrala matchningar (PSM), peptidgrupper, totala proteiner, proteingrupper och antalet proteiner som erhållits efter 1% FDR från LFQ- och iTRAQ-experimentet (Figur 4C).
Figur 1:Arbetsflöde för vävnadsproteomik. (A) Provbearbetningsstegen för att förbereda prover från vävnadslyssnat för MS-analysen. b)Steg för etikettfri kvantifiering. (C)Steg för etikettbaserad kvantifiering. (D) Steg för dataanalys med hjälp av en proteome discoverer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Kvalitetskontroll av vävnadsprover och instrumentets reproducerbarhet. (A) Kvalitetskontroll av vävnadslysen på 12 % SDS-PAGE (B) Övervakning av vissa peptider av BSA med Panorama för att kontrollera instrumentvariationerna under de olika dagarna. C)BSA:s sekvenstäckning i tre tekniska replikat. (D) Optimering av LC-parametrar för vävnadsprover. (E) Antalet peptidspektrala matchningar, peptider och proteiner i tre olika biologiska prover. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Parametrar för LC ochMS för proteomikanalys av vävnadsprov. (A,B) Den vätskekromatografigradient som används för att separera peptiderna för etikettfri kvantifiering(A)och etikettbaserad kvantifiering (B) av vävnadsprovet. C)Medlemsstaternas parametrar för etikettfri kvantifiering och etikettbaserad kvantifiering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Etikettfri och etikettbaserad kvantifiering av vävnadsprov. (A) Venndiagrammet representerar de gemensamma och exklusiva proteinerna i vävnadsproverna 1, 2 och 3 i det etikettfria experimentet. B)Venndiagrammet representerar de gemensamma och exklusiva proteinerna i vävnadsproverna 1, 2 och 3 i det etikettbaserade experimentet. (C) Den jämförande analysen av antalet peptidspektrala matchningar (PSM), peptidgrupper, totala proteiner, proteingrupper och proteinnummer efter 1% FDR vid etikettfri kvantifiering (LFQ) och etikettbaserat experiment (iTRAQ). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande filer. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vävnadsproteomik av biologiska prover gör det möjligt för oss att utforska nya potentiella biomarkörer associerade med olika stadier av sjukdomsprogression. Det förklarar också mekanismen för signalering och vägar i samband med sjukdomsprogression. Det beskrivna protokollet för vävnad kvantitativ proteomics analys ger reproducerbara bra täckning data. De flesta stegen har anpassats från tillverkarens instruktioner. För att få data av hög kvalitet är följande steg mest avgörande. Därför bör extra försiktighet ges när du utför dessa steg.
Den ofullständiga matsmältningen av proteiner och kontaminering av keratin kan ge mindre täckning av proteiner (n < 1000), vilket påverkar det övergripande experimentet. PH-talet för prover (pH 8) och koncentrationen av karbamid i proverna (mindre än 1 M) säkerställer en effektiv matsmältning av proteiner. Användning av färsk buffert och hantering av prover med försiktighet minskar risken för keratinförorening. iTRAQ-reagenser är extremt kostsamma och det kräver en sofistikerad MS-plattform för att utföra MS / MS och programvara för att analysera data. Proteomikexperimenten är känsliga för kontaminering från salter, peptidk kvantifiering och märkning effektivitet av iTRAQ/TMT reagenser. Innan MS/MS-analysen, se till att smälta peptider avsaltas ordentligt för att minska bakgrundsljudet i data. När det gäller iTRAQ-tekniken genererar fragmentering av den bifogade taggen en lågmolekylär massreporterjon som kan användas för att relativt kvantifiera peptiderna och de proteiner från vilka de har sitt ursprung, medan området under kurvan anses vara kvantifiering för etikettfri inflygning. För att öka förtroendet för kvantifiering av proteiner bör oberoende valideringsexperiment framför allt MRM/PRM utföras.
Analysen av vävnadsprover med hjälp av två kvantifieringsmetoder (etikettfri och etikettbaserad proteomik) har beskrivits för att få en god täckning av proteiner. Den etikettfria kvantitativa proteomikmetoden erbjuder flera fördelar för dess användning i kliniska studier. Proverna körs självständigt, och detta är särskilt viktigt för studier som genomförs för en patientkohort eftersom det finns ett stort antal prover som ska analyseras via masspektrometer. Med hjälp av en teknisk replikat som en pool av optimerade peptider kan man säkerställa god reproducerbarhet även om proverna körs vid olika tidpunkter. Detta tillvägagångssätt har använts i stora kohortstudier som CPTAC, som är en insats av många internationella samhällen14.
De potentiella mål som framkommer i studien kan övervägas för validering med hjälp av riktade proteomikmetoder. Vi drar slutsatsen att de projekt som bygger på analys av vävnadsprover i hög grad skulle kunna dra nytta av de detaljerade arbetsflöden för kvantitativa proteomik som tillhandahålls i denna studie. De nämnda stegen hjälper till att optimera metoden och kartlägga proteomen för vävnadsprover. Valet av kvantitativ proteomisk teknik kan bero på antalet prover, tillgången till plattformar för medlemsstaterna och den biologiska fråga som ska tas upp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi bekräftar MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projekt #34_IITB till SS och MASSFIITB Facility vid IIT Bombay med stöd av institutionen för bioteknik (BT/PR13114/INF/22/206/2015) för att utföra alla MS-relaterade experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
