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Bioengineering

एंडोथेलियल नेटवर्क पर 3 डी मल्टीसेलुलर ब्रेस्ट स्फेरॉइड की डायरेक्ट बायोप्रिंटिंग

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61791
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biology, Drexel University, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य सीधे स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं को पूर्व-गठित एंडोथेलियल नेटवर्क पर बहुकोशिकीय स्फेरॉइड के रूप में बायोप्रिंट करना है ताकि तेजी से 3 डी स्तन-एंडोथेलियल सह-संस्कृति मॉडल बनाए जा सकें जिसका उपयोग दवा स्क्रीनिंग अध्ययन के लिए किया जा सकता है।

Abstract

बायोप्रिंटिंग 3 डी मानव कैंसर मॉडल बनाने के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप में उभर रहा है जो वीवो ऊतक वास्तुकला में महत्वपूर्ण पहचान को बेहतर रीकैपिटल करता है। वर्तमान परत-दर-परत एक्सट्रूशन बायोप्रिंटिंग में, पदानुक्रमित ऊतक आत्म-असेंबली को बढ़ावा देने के लिए जटिल स्थानिक और लौकिक संकेतों के साथ एक बायोइंक में व्यक्तिगत कोशिकाओं को बाहर निकाला जाता है। हालांकि, यह बायोफैब्रिकेशन तकनीक कोशिकाओं, बायोइंक और बायोकेमिकल और बायोफिजिकल संकेतों के बीच जटिल बातचीत पर निर्भर करती है। इस प्रकार, आत्म-असेंबली में दिन या सप्ताह भी लग सकते हैं, विशिष्ट बायोनिंक की आवश्यकता हो सकती है, और हमेशा तब नहीं हो सकती है जब एक से अधिक सेल प्रकार शामिल होते हैं। इसलिए हमने विभिन्न प्रकार के बायोइंक में सीधे बायोप्रिंट पूर्व-निर्मित 3डी स्तन एपिथेलियल स्फेरॉइड के लिए एक तकनीक विकसित की है। बायोप्रिंटेड पूर्व-निर्मित 3 डी स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड्स ने मुद्रण के बाद अपनी व्यवहार्यता और ध्रुवीकृत वास्तुकला को बनाए रखा। हमने सह-संस्कृति मॉडल बनाने के लिए इसके अतिरिक्त वैस्कुलर एंडोथेलियल सेल नेटवर्क पर 3डी स्फेरॉइड मुद्रित किए। इस प्रकार, उपन्यास बायोप्रिंटिंग तकनीक तेजी से कम लागत पर और पारंपरिक बायोप्रिंटिंग तकनीकों की तुलना में अधिक लचीलेपन के साथ एक अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी मानव स्तन मॉडल बनाती है। अतिरिक्त बायोइंक में अन्य ऊतकों के 3डी मॉडल बनाने के लिए इस बहुमुखी बायोप्रिंटिंग तकनीक को एक्सपेरिमेंट किया जा सकता है।

Introduction

3डी इन विट्रो वैस्कुलराइज्ड ट्यूमर मॉडल कैंसर ग्रोथ और मेटास्टेसिस के मशीनी अध्ययन के लिए जरूरी उपकरण हैं। विशेष रूप से स्तन कैंसर के लिए, मैट्रिगेल में सुसंस्कृत स्तन एपिथेलियल कोशिकाएं ध्रुवीकृत स्फेरॉइड में व्यवस्थित होती हैं जो वीवो मैमेरी एसिनस आर्किटेक्चर1,2,3,4,5,6,7,8में अधिक निकटता से मिलती -जुलती हैं। 3 डी स्तन एपिथेलियल सेल संस्कृति कोशिका कार्य को भी प्रभावित करती है, जिसमें 3 डी संस्कृतियों में एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) रिसेप्टर मॉड्यूलेशन8,9 में अंतर दिखाईदेताहै; ErbB210सहित ऑन्कोजीन फ़ंक्शन; विकास और एपोप्टोसिस सिग्नलिंग11,12; और कीमोथेरेपी प्रतिरोध13,14. वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं इसी प्रकार 3 डी बनाम पारंपरिक 2डी संस्कृति 15 ,16 , 17,18में पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के लिए अलगतरहसे प्रतिक्रिया देती हैं । हालांकि, संवहनी एंडोथेलियल और स्तन एपिथेलियल इंटरैक्शन की अधिकांश समझ वातानुकूलित माध्यम या ट्रांसवेल आवेषण, या 3 डी मॉडल का उपयोग करके 2डी संस्कृति से आती है जिसमें दो सेल प्रकार शारीरिक रूप से अलग होते हैं19,20,21,22,23। ये सह-संस्कृति मॉडल सीमित शारीरिक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, क्योंकि 3 डी संस्कृति और सेल-सेल संपर्क दोनों संवहनी एंडोथेलियल के लिए महत्वपूर्ण हैं - स्तन एपिथेलियल सेल इंटरैक्शन24,25,26।

3 डी कैंसर मॉडल को विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके तैयार किया गया है, जिसमें हाइड्रोगेलके भीतर या इंजीनियर मचान5,27, 28,29पर हैंगिंग ड्रॉप स्पेरोइडफॉर्मेशन,बायोप्रिंटिंग, मैग्नेटिक असेंबली और संस्कृति शामिल हैं। हाल ही में, 3 डी ट्यूमर मॉडल को उनके संबंधित 3 डी संरचनाओं में व्यवस्थित कई सेल प्रकारों के साथ बनाया गया था। ट्यूमर-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म के एक उदाहरण में, कैंसर, एंडोथेलियल और स्ट्रोमल कोशिकाओं को मैट्रिक्स में मिलाया गया और फिर पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) डिवाइस में तीन केंद्रीय ऊतक कक्षों में इंजेक्ट किया गया। ऊतक कक्षों की सीमा दो बाहरी चैनलों से थी जो एक धमनी और वेन्यूल का प्रतिनिधित्व करते थे। संस्कृति के 5-7 दिनों के बाद, एंडोथेलियल कोशिकाओं ने एक माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क का गठन किया और कैंसर कोशिकाओं को वैक्यूलेचर के पास छोटे ट्यूमर बनाने के लिए पैदा किया गया। तब इस मंच का उपयोग दवाओं और दवा संयोजनों को स्क्रीन करने के लिए किया जाता था30. विशिष्ट यांत्रिक उत्तेजनाओं (जैसे, फेफड़ों में यांत्रिक तनाव)31, 32के साथ मेटास्टेसिस और कैंसर प्रकारों का अध्ययन करने के लिए अतिरिक्त ट्यूमर-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म बनाए गए हैं। हालांकि, इन प्लेटफार्मों में आम तौर पर अपने संबंधित 3 डी संरचनाओं में वैक्यूलेचर और कैंसर दोनों शामिल नहीं होते हैं।

बायोफैब्रिकेशन विट्रो वैस्कुलराइज्ड ट्यूमर मॉडल में 3डी को आगे बढ़ाने में महान वादा दिखाता है, क्योंकि यह सेल स्थान पर तंग स्थानिक नियंत्रण को सक्षम बनाता है। पिछले एक दशक में बायोप्रिंटिंग के विकास के बावजूद, कुछ अध्ययन विशेष रूप से ट्यूमर33,34पर ध्यान केंद्रित करते हैं। एक उदाहरण में, एक जिलेटिन/एल्गिनेट/फिब्रिनोजेन हाइड्रोजेल में हेला कोशिकाओं की 3डी प्रिंटिंग का उपयोग इन विट्रो सर्वाइकल कैंसर मॉडल बनाने के लिए किया गया था । ट्यूमर कोशिकाओं को व्यक्तिगत कोशिकाओं के रूप में बायोप्रिंट किया गया था और फिर गोलाकार बनाने की अनुमति दी गई थी, जिसने उच्च प्रसार दर, मैट्रिक्स मेटललोप्रोटीस अभिव्यक्ति में वृद्धि, और 2डी संस्कृति35में कोशिकाओं की तुलना में उच्च रसायन को दिखाया। इन अध्ययनों में, कई अन्य लोगों कीतरह 36,37,अलग सेल निलंबन बायोप्रिंटेड किए गए थे, और फिर कोशिका संस्कृतियों को आवश्यक यांत्रिक और जैव रासायनिक संकेत प्रदान किए गए ताकि कोशिकाओं को 3 डी संरचना बनाने में सक्षम बनाया जा सके। हालांकि, सेलुलर आत्म-असेंबली में दिन या सप्ताह लग सकते हैं, जटिल स्थानिक और लौकिक पर्यावरणीय संकेतों की आवश्यकता हो सकती है, या तब नहीं हो सकती है जब दो सेल प्रकार सह-संस्कारी हों। उदाहरण के लिए, स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं ने 2डी सह-संस्कृति में एंडोथेलियल कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु को प्रेरित किया, और अलग स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं ने एल्गिनेट/जिलेटिन हाइड्रोगेल38में बायोप्रिंटेड होने पर 3 डी स्फेरॉइड नहीं बनाए। अलग स्तन एपिथेलियल या कैंसर कोशिकाओं को परिपत्र पीडीएमएस मोल्डों में फंसने पर ही एल्गिनेट आधारित बायोइंस में गोलाकार का गठन किया जाता है। अन्य मामलों में, अल्ट्रा-लो अटैचमेंट सर्कुलर वेल प्लेटों में निलंबित बूंदों का उपयोग करके गोलाकार का गठन किया गया था और फिर एल्गिनेट आधारित बायोइंक39,40में मिलाया गया था।

अब हम इस प्रोटोकॉल में एक वैकल्पिक 3 डी ऊतक बायोमैन्यूफैक्चरिंग विधि का वर्णन करते हैं। बीज के बजाय कोशिकाओं को अलग किया और इन कोशिकाओं के लिए प्रतीक्षा करने के लिए 3 डी संरचनाओं के रूप में, हम वर्णन कैसे बनाने के लिए और एक संवहनी ट्यूब नेटवर्क पर बायोप्रिंट 3 डी ट्यूमर spheroids एक ट्यूमर सह संस्कृति मॉडल है कि लगभग तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है बनाने के लिए । ट्यूमर स्पेरोइड्स को विट्रो में उगाया जा सकता है या मानव ऊतकों (ऑर्गेनॉइड) से प्राप्त किया जा सकता है। इसी तरह, संवहनी ट्यूबों को उगाया जा सकता है या एडीपोज ऊतक माइक्रोवैस्कुलर टुकड़ों से प्राप्त किया जा सकता है। बायोसिंक जैविक रूप से निष्क्रिय एल्गिनेट से लेकर अत्यधिक जैविक रूप से सक्रिय मैट्रिगेल41तक हो सकते हैं। चूंकि यह 3 डी ट्यूमर सह-संस्कृति मॉडल विभिन्न प्रकार की कोशिका संरचनाओं और बायोकिंप के साथ बनाया जा सकता है, इसलिए इसमें कई सेल प्रकार, एक्सट्रासेलुलर मैट्रिस और केमोकीन ग्रेडिएंट15,42शामिल हो सकते हैं। जबकि इसके वर्तमान निर्माण में, एंडोथेलियल नेटवर्क को केंद्रित नहीं किया जा सकता है, भविष्य के पुनरावृत्तियों को माइक्रोफ्लुइड या-ऑन-चिप सिस्टम के साथ इस विधि को एकीकृत किया जा सकता है। एंडोथेलियल नेटवर्क पर बायोप्रिंटिंग 3डी स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड दवा परीक्षण और व्यक्तिगत सटीक दवा27के लिए मानव स्तन मॉडल के तेजी से बायोफैब्रिकेशन में सक्षम बनाता है।

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Protocol

1. स्तन एपिथेलियल सेल ग्रोथ और परख मीडिया

  1. MCF10A स्तन एपिथेलियल कोशिकाएं
    नोट: गैर-ट्यूमरजनक अमर स्तन एपिथेलियल सेल लाइन फाइब्रोसिस्टिक रोग43वाले रोगी से ली गई है। कोशिकाएं एस्ट्रोजन रिसेप्टर व्यक्त नहीं करती हैं।
    1. 20 μg/mL एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) तैयार करने के लिए,200माइक्रोग्राम/एमएल ईजीएफ बनाने के लिए 500 माइक्रोनल ऑफ बाँझ डीएच 2 ओ में 100 माइक्रोन लियोफिलाइज्ड ईजीएफ को भंग करें। 20 μg/mL EGF के 500 μL को 20 μg/mL EGF स्टॉक समाधान बनाने के लिए डीएच2ओ में बाँझ 0.1% बीएसए के 4.5 एमएल में जोड़ें। स्टोर 12 महीने तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 μg/mL EGF aliquots तैयार किया ।
    2. 500 μg/mL हाइड्रोकॉर्टिसोन तैयार करने के लिए, पूर्ण इथेनॉल (200 सबूत) के 1 एमएल में 1 मिलीग्राम हाइड्रोकॉर्टिसोन को पतला करें। 500 μg/mL हाइड्रोकॉर्टिसोन स्टॉक समाधान बनाने के लिए इस मिश्रण में बाँझ डीएमईएम एफ: 12 का 1 एमएल जोड़ें। 12 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोकॉर्टिसोन स्टॉक एलिकोट्स स्टोर करें।
    3. 10 μg/ml हैजा टॉक्सिन तैयार करने के लिए, 1 मिलीग्राम हैजा टॉक्सिन स्टॉक समाधान बनाने के लिए बाँझ डीएच2 2ओ के 1 एमएल में हैजा टॉक्सिन lyophilized पाउडर को भंग करें । 12 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर हैजा टॉक्सिन स्टॉक एलिकोट्स स्टोर करें।
    4. ग्रोथ मीडियम तैयार करने के लिए ईजीएफ के 500 माइक्रोन (20 माइक्रोन/एमएल), हाइड्रोकॉर्टिसोन के 500 माइक्रोन (500 माइक्रोन/एमएल), हैजा टॉक्सिन के 5 माइक्रोन (1 मिलीग्राम/एमएल), 500 माइक्रोन गोजातीय इंसुलिन (10 मिलीग्राम/एमएल), 10 एम एल ऑफ पेनिकिलिन और स्लाव और 20 एनजी/एमएल ईजीएफ की अंतिम एकाग्रता के लिए डीएमईएम एफ के 500 एमएल तक घोड़े सीरम की 25 एमएल, 500 एनजी/एमएल हाइड्रोकॉर्टिसोन, 10 एनजी/एमएल हैजा टॉक्सिन, 10 एनजी/एमएल गोजातीय इंसुलिन, 2% v/v पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 5% v/v हॉर्स सीरम । बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया में कमी की बंध्यता के लिए एंटीबायोटिक एकाग्रता को बढ़ाकर 2% कर दिया गया था; हालांकि, एंटीबायोटिक एकाग्रता को 1% तक कम किया जा सकता है।
    5. परख माध्यम तैयार करने के लिए, हाइड्रोकॉर्टिसोन (500 माइक्रोन/एमएल), हैजा टॉक्सिन के 5 माइक्रोन (1 मिलीग्राम/एमएल), गोजातीय इंसुलिन (10 मिलीग्राम/एमएल), 10 एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 500 μL जोड़ें, और 500 एनजी/एमएल हाइड्रोकॉर्टिसोन, 10 एनजी/एमएल हैजा टॉक्सिन, 10 एनजी/एमएल गोजातीय इंसुलिन, 2% v/v पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 5% v/v हॉर्स सेरम की अंतिम एकाग्रता के लिए डीएमईएम एफ के ५०० एमएल के लिए 25 एमएल
  2. एमडीए-एमबी-231
    नोट: ट्रिपल-निगेटिव (एस्ट्रोजन रिसेप्टर, प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर, और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2) ब्रेस्ट कैंसर एपिथेलियल सेल लाइन मेटास्टैटिक मैमेरी एडेनोकार्सिनोमा४४के साथ एक महिला मरीज के प्लूरल एफफ्यूजन से बनाई गई है । कोशिकाएं एक आक्रामक, आक्रामक और खराब विभेदित स्तन कैंसर का प्रतिनिधित्व करती हैं।
    1. ग्रोथ और परख मीडियम तैयार करने के लिए 50 एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन की 10 एमएल और 25 एमएल हॉर्स सीरम को अंतिम एकाग्रता के लिए डीएमईएम के 500 एमएल में 10% वी/वी भ्रूण बोविन सीरम, 2% v/v पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 5% वी/हॉर्स सेरम जोड़ें ।

2. स्तन एपिथेलियल सेल संस्कृति

  1. बीज 500,000 MCF10A या एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं में एक 10 सेमी (P100) ऊतक संस्कृति पकवान MCF10A या एमडीए-एमबी-231 विकास मीडिया के 10 एमएल के साथ। एमसीएफ10ए और एमडीए-एमबी-231 सेल 48 घंटे में 90% संगम तक पहुंचते हैं।
  2. स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं को पारित करने के लिए, पहले गर्म पीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  3. डिश में 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 2 मिलीलीटर जोड़कर स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं को अलग करें। डिश को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 20-25 मिनट के लिए रखें।
  4. ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए ट्राइपसिनाइज्ड सेल्स में एमसीएफ10ए या एमडीए-एमबी-231 ग्रोथ मीडियम के 5 एमएल जोड़ें। कोशिका-मीडिया मिश्रण को कोशिकाओं को फिर से स्थापित करने और कोशिका समूहों को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  5. सेल सस्पेंशन को 15 एमएल शंकु नली में जोड़ें और 3 मिनट के लिए 1,200 x g पर सेंट्रलाइज करें। ध्यान से सुपरनेट को एस्पिरेट करें और एमसीएफ 10ए या एमडीए-एमबी-231 ग्रोथ मीडियम के 5 एमएल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
  6. एमसीएफ10ए या एमडीए-एमबी-231 ग्रोथ मीडियम के साथ 5 नए 10 सेमी टिश्यू कल्चर डिश में सेल सस्पेंशन की प्लेट 1 एमएल । व्यंजनों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें। कोशिकाओं को 2-3 दिनों में फिर से पारित करने के लिए तैयार हो जाएगा । MCF10A कोशिकाओं को 35 की संख्या में बनाए रखा जा सकता है, जिसके बाद वे रूपात्मक परिवर्तन दिखाते हैं। एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं को 24 नंबर पर रखा जा सकता है, जिसके बाद वे रूपात्मक परिवर्तन दिखाते हैं।

3. स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड गठन

  1. परख शुरू करने से पहले 30 मिनट के लिए 200 μL पिपेट सुझावों को फ्रीज करें। पूरी प्रक्रिया के लिए बर्फ पर ग्रोथ-फैक्टर कम मैट्रिक्स सॉल्यूशन (जैसे, मैट्रिक्स) (10 मिलीग्राम/एमएल) रखें ।
  2. धीरे-धीरे 8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के प्रत्येक कुएं में बर्फ-ठंडे 200 माइक्रोन पिपेट युक्तियों का उपयोग करके बर्फ-ठंडे मैट्रिक्स समाधान के 30 माइक्रोन को पिपेट करें। दोनों ओर से शुरू करें और कोनों के साथ पिपेट टिप खींचें, प्रत्येक कुएं की कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से केंद्र में एक अंतिम बूंद जोड़ें। एक समान मैट्रिक्स समाधान परत सुनिश्चित करने के लिए इस कदम के दौरान हवा के बुलबुले से बचें। प्रत्येक अच्छी तरह से नए पिपेट युक्तियों का उपयोग करें।
  3. मैट्रिक्स समाधान को पॉलीमराइज करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट चैंबर स्लाइड, 5%सीओ 2 इनक्यूबेटर 15-20 मिनट के लिए।
  4. रिसिम्प ने MCF10A परख माध्यम में एमसीएफ 10ए कोशिकाओं को २००,००० कोशिकाओं/एमएल या रिसिपेंड ट्राइपसिनाइज्ड एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं में २००,० कोशिकाओं/एमएनएल पर ।
  5. यदि MCF10A कोशिकाओं का उपयोग कर रहे हैं, तो 2% मैट्रिक्स समाधान की अंतिम एकाग्रता के लिए ईजीएफ (20 माइक्रोन/एमएल) के 5 माइक्रोन और मैट्रिक्स समाधान के 100 माइक्रोन जोड़कर ताजा MCF10A स्पेरोइड ग्रोथ मीडियम तैयार करें।
  6. इनक्यूबेटर से मैट्रिक्स समाधान के साथ कक्ष स्लाइड प्रीकोट्ड निकालें। प्रत्येक अच्छी तरह से MCF10A या एमडीए-एमबी-231 सेल निलंबन (10,000 कोशिकाओं) के 50 μL जोड़ें। यदि MCF10A कोशिकाओं का उपयोग कर रहे हैं, तो MCF10A स्पेरोइड ग्रोथ मीडियम के 450 माइक्रोन जोड़ें। एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं का उपयोग कर रहे हैं, तो 2% मैट्रिक्स समाधान (9 माइक्रोन) के साथ एमडीए-एमबी-231 ग्रोथ मीडियम प्रीमिक्स के 450 माइक्रोन जोड़ें। तत्काल चैंबर स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  7. हर 4 चार दिन में मीडियम बदलें। ध्यान से 200 माइक्रोट पाइप टिप का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के एक कोने से पुराने मीडिया के 200 माइक्रोन को ध्यान से पिपेट करें। इस प्रक्रिया के दौरान, यह सुनिश्चित करने के लिए कि गोलाकार परेशान न हों, चैंबर स्लाइड को 45 डिग्री पर झुकाएं। हौसले से तैयार MCF10A स्पेरोइड ग्रोथ मीडियम या एमडीए-एमबी-231 ग्रोथ मीडियम के 200 माइक्रोन जोड़ें, जो पहले बूंदों में कोने में प्रत्येक कुएं में 2% मैट्रिक्स समाधान के साथ मिलाया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि स्फेरॉइड मैट्रिक्स परत से जुड़े रहें। केवल ~ 50% मीडिया को बदल दिया जाता है ताकि स्फेरॉइड द्वारा उत्पादित सभी साइटोकिन पूरी तरह से समाप्त न हों।
    नोट: MCF10A स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड्स को ध्रुवीकरण और खोखले केंद्र बनाने में 8 दिन तक का समय लगता है। एमडीए-एमबी-231 स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड बनाने में 5 दिन तक का समय लगता है और इसमें कोई खोखले केंद्र नहीं होते हैं।

4. एंडोथेलियल सेल नेटवर्क गठन

  1. मानव नाभि नस एंडोथेलियल सेल (HUVEC) संस्कृति
    1. इंसुलिन ग्रोथ फैक्टर, फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर, वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर, एस्कॉर्बिक एसिड, एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर युक्त सिंगल एंडोथेलियल ग्रोथ मीडियम-2 किट की सामग्री जोड़ें, हेपरिन और जेंटामिसिन-एम्फोटेरिसिन बी, 50 एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम, 5 एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 200 mm ग्लूटामाइन के 5 एमएल के साथ एंडोथेलियल बेसल मीडियम-2 (ईबीएम-2) के 500 एमएल को पूरा एंडोथेलियल ग्रोथ मीडियम (ईजीएम-2) बनाने के लिए।
    2. बीज ईजीएम-2 के 10 एमएल में 10 सेमी टिश्यू कल्चर डिश में 500,000 एंडोथेलियल सेल्स। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में तब तक रखें जब तक कि वे पहुंच नहीं जाते और 80% गैस (लगभग 48 घंटे)।
    3. कोशिकाओं को पारित करने के लिए, गर्म पीबीएस के 10 एमएल के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं को धोएं। 10 सेमी टिश्यू कल्चर डिश में 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 2 मिलील जोड़कर अलग हुवेसी। चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की बारीकी से निगरानी करें। कोशिकाओं को तैयार कर रहे है जब वे ऊपर balled हैं, लेकिन पकवान से जुड़े रहते हैं ।
    4. ध्यान से ट्रिप्पसिन को डिश से बाहर करें। डिश में ईजीएम-2 का 8 एमएल डालें। पूरे पकवान की सतह पर ईजीएम-2 को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके डिश से कोशिकाओं को धोएं।
    5. वैकल्पिक रूप से, ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए ट्राइपसिनाइज्ड कोशिकाओं में ईजीएम-2 का 5 एमएल जोड़ें। कोशिका-मीडिया मिश्रण को कोशिकाओं को फिर से स्थापित करने और कोशिका समूहों को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें। सेल सस्पेंशन को 15 एमएल शंकु नली में जोड़ें और 3 मिनट के लिए 1,200 x g पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को सावधानी से एस्पिरेट करें और ईजीएम-2 के 10 एमएल में सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें।
    6. 10 सेमी टिश्यू कल्चर डिश में ईजीएम-2 के 9 एमएल में सेल सस्पेंशन का 1 एमएल डालें। व्यंजनों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें। हर 2 दिन में फ्रेश ईजीएम-2 के साथ मीडियम का एक्सचेंज 2/3 करें। कोशिकाएं 3-5 दिनों में पारित होने के लिए तैयार हो जाएंगी। HUVEC को 8 मार्ग तक बनाए रखा जा सकता है जिसके बाद वे नेटवर्क बनाने में विफल रहे हैं।
  2. एंडोथेलियल सेल (एचयूवीईसी) नेटवर्क फॉर्मेशन
  3. परख शुरू करने से पहले 30 मिनट के लिए 200 μL पिपेट सुझावों को फ्रीज करें। पूरी प्रक्रिया के लिए बर्फ पर ग्रोथ-फैक्टर कम मैट्रिक्स सॉल्यूशन (10 मिलीग्राम/एमएल) रखें।
  4. धीरे-धीरे 8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के प्रत्येक कुएं में बर्फ-ठंडे 200 माइक्रोन पिपेट युक्तियों का उपयोग करके बर्फ-ठंडे मैट्रिक्स समाधान के 30 माइक्रोन को पिपेट करें। दोनों ओर से शुरू करें और कोनों के साथ पिपेट टिप खींचें, प्रत्येक कुएं की कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से केंद्र में एक अंतिम बूंद जोड़ें। एक समान मैट्रिक्स समाधान परत सुनिश्चित करने के लिए इस कदम के दौरान हवा के बुलबुले से बचें। प्रत्येक अच्छी तरह से नए पिपेट युक्तियों का उपयोग करें।
  5. एक 37 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट चैंबर स्लाइड, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर 15-20 मिनट के लिए पॉलीमराइज करने के लिए।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए रेड सेल ट्रैकर (1:1000) के 10 माइक्रोल के साथ एचयूवीईसी की 10 सेमी डिश को प्री-दाग करें।
    2. गर्म पीबीएस के 10 एमएल के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं को धोएं। 10 सेमी टिश्यू कल्चर डिश में 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 2 मिलील जोड़कर अलग हुवेसी। डिश को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर को5 मिनट के लिए पूरी तरह से अलग करने के लिए रखें।
    3. ट्रिपसिन को बेअसर करने के लिए डिश में ईजीएम-2 का 5 एमएल डालें। सेल निलंबन को 25 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 1,200 x g पर सेंट्रलाइज HUVEC। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और सीरम-फ्री ईबीएम-2 के 5 एमएल में सेल पेलेट को रीसस्ट करें।
    4. व्यवहार्य कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। 1 x 106 सेल/एमएल सॉल्यूशन बनाएं।
    5. सीरम मुक्त ईबीएम-2 के 200 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से 100,000 HUVEC जोड़ें। यदि अधिक कोशिकाओं को जोड़ा जाता है, तो वे ट्यूब नेटवर्क के बजाय एक सतह मोनोलेयर बनाएंगे।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट एचयूवीईसी, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर। 6 घंटे के बाद, चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि HUVEC नेटवर्क। नेटवर्क अब स्तन स्फेरॉइड के साथ कूकल्चर के लिए तैयार हैं।

5. पूर्व-गठित एचयूवीईसी नेटवर्क पर बायोप्रिंटिंग स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड्स

नोट: बायोफैब्रिकेशन प्रक्रिया के लिए एक दोहरी नोजल बायो-जमाव प्रणाली का उपयोग किया जाना चाहिए। इस मामले में, सिस्टम में तीन मोशन आर्म्स थे, जो मैटेरियल जमाव के माइक्रोन-स्केल स्थानिक नियंत्रण के साथ-साथ दो स्क्रू चालित मोटर्स को 10 एमएल सीरिंज से बायोइंक जमा करने की अनुमति देते थे । बायोप्रिंटिंग के दौरान बाँझ वातावरण बनाए रखने के लिए प्रणाली को उच्च दक्षता कण हवा निस्पंदन प्रणाली के साथ-साथ यूवी-नसबंदी क्षमताओं के साथ कार्यात्मक किया जाना चाहिए। बायोप्रिंटर को प्रिंटिंग प्रक्रिया से पहले एक घंटे के लिए यूवी निष्फल किया जाता है।

  1. स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड और एचयूवीईसी नेटवर्क बनाएं जैसा कि पहले वर्णित है। प्रतिनिधि चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवियों में गोलाकार की गिनती करके प्रत्येक कुएं में स्तन एपिथेलियल स्फेरॉइड की संख्या का अनुमान लगाएं।
  2. 1000 माइक्रोट टिप के अंत से 0.5 सेमी काटें। 8-वेल चैंबर स्लाइड से बाहर और 50 एमएल ट्यूब में सभी स्फेरॉइड को ध्यान से पिपेट करने के लिए कट पिपेट टिप का उपयोग करें। चयनित बायोइंक में 100 स्फेरॉइड/100 माइक्रोन पर पुनर्सुस्कर स्फेरॉइड।
    नोट: उच्च गोलाकार सांद्रता के परिणामस्वरूप स्फेरॉइड क्लस्टरिंग हो सकती है और स्फेरॉइड और एंडोथेलियल नेटवर्क के बीच बातचीत के दृश्य को रोका जा सकता है।
  3. किसी भी बड़े या संकुल गोलाकार को हटाने के लिए 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से गोलाकार मिश्रण पास करें।
  4. पूल्ड स्फेरॉइड को 10 एमएल बाँझ सिरिंज में लोड करें और इसे 25 गेज बाँझ सुई के साथ कैप करें। सिरिंज को बायो-डिपेशन सिस्टम से अटैच करें।
  5. 8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में HUVEC नेटवर्क से माध्यम आकांक्षी ।
  6. 1 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर HUVEC नेटवर्क के 6 कुओं पर स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड के १०० माइक्रोन निकाला । नियंत्रण के रूप में HUVEC नेटवर्क के 2 कुओं को बनाए रखें।
  7. एचयूवीईसी नेटवर्क पर मुद्रित MCF10A स्पेरोइड ग्रोथ मीडियम के 400 माइक्रोन जोड़ें या एचयूवीईसी नेटवर्क पर मुद्रित एमसीएफ 10ए स्फेरॉइड का उपयोग करें या एचयूवीईसी नेटवर्क पर मुद्रित एमडीए-एमबी-231 ग्रोथ मीडियम को पहले 2% मैट्रिक्स समाधान के साथ मिश्रित करें। संबंधित स्फेरॉयड ग्रोथ मीडियम का इस्तेमाल एचयूवीईसी कंट्रोल कुओं में किया जाना चाहिए ।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस में सह-संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें, 24 के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर - 96 घंटे बिना मीडिया परिवर्तन के। सह-संस्कृतियां चार दिनों तक मूल माध्यम में व्यवहार्य रहेंगी ।

6. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस और पीबीएस-ग्लाइसिन वॉश बफर तैयारी
    1. 10x पीबीएस के 500 मीटर 100 मीटर में 2.5 ग्राम सोडियम एजाइड, 5 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन, ट्राइटन एक्स-100 के 10 एमएल और ट्वीन-20 के 2.05 एमएल जोड़कर इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) बफर 10x स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। पीएच को 7.4 पर समायोजित करें। तलछट से बचने के लिए स्टॉक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक साल तक स्टोर करें।
    2. बाँझ deionized पानी के 450 एमएल में बफर 10x के 50 एमएल को कमजोर करके एक काम कर रहे बफर बनाएं। एक सप्ताह तक कमरे के तापमान पर काम करने वाले समाधान को स्टोर करें।
    3. 10x पीबीएस-ग्लाइसिन बफर स्टॉक समाधान 10x पीबीएस के 500 एमएल में ग्लाइसिन के 37.5 ग्राम जोड़कर तैयार करें। पीएच को 7.4 पर समायोजित करें। तलछट से बचने के लिए स्टॉक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक स्टोर करें।
    4. बाँझ डिएक्रिन पानी के 450 एमएल में 10x पीबीएस-ग्लाइसिन बफर के 50 एमएल को कमजोर करके एक कामकाजी पीबीएस-ग्लाइसिन समाधान बनाएं। एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर काम करने वाले समाधान को स्टोर करें।
  2. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा बायोप्रिंटेड नमूने और छवि लेबल करें
    1. बायोप्रिंटेड 3 डी सह-संस्कृतियों से एस्पिरेट माध्यम और गर्म पीबीएस के साथ 3 बार कुल्ला। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ बायोप्रिंटेड 3 डी सह-संस्कृतियों को ठीक करें। 1x पीबीएस-ग्लाइसिन के साथ 20 मिनट के लिए 3 बार नमूने कुल्ला।
    2. यदि बफर 90 मिनट (प्राथमिक ब्लॉक) के लिए 10% बकरी सीरम के साथ मिश्रित के साथ नमूनों को ब्लॉक करें, इसके बाद यदि बफर प्लस 10% बकरी सीरम और एफ़ीनीपुरे फैब टुकड़ा (1:100, माध्यमिक ब्लॉक) के साथ 40 मिनट का समय दिया गया है।
    3. यदि MCF10A spheroids का उपयोग कर, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में माध्यमिक अवरुद्ध बफर में integrin α6 (1:100) के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों लेबल, एक एलेक्सा फ्लोर ४८८ माध्यमिक एंटीबॉडी (1:200) और Hoescht ३३३४२ (1:1000) के बाद 1 घंटे के तापमान पर प्रकाश से बचा । MCF10A सेल लाइनें इंटीग्रिन α6 के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं, जो स्पेरोइड ध्रुवीकरण और आकृति विज्ञान दिखाने के लिए आवश्यक है।
    4. यदि एमडीए-एमबी-231 स्फेरॉइड का उपयोग करते हैं, जो इंटीग्रीन α6 के निम्न स्तर को व्यक्त करते हैं, तो एलेक्सा फ्लोर 488 फालियाइडिन (1:100) और होएच 33342 (1:1000) के साथ लेबल नमूने, कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए बफर को प्रकाश से संरक्षित करते हैं। फालोइडिन ऐक्टिन फिलामेंट विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है इसलिए गोलाकार असंगत और आक्रामक आकृति विज्ञान का आकलन किया जा सकता है।
    5. 20 मिनट के लिए 1X पीबीएस-ग्लाइसिन 3 बार के साथ नमूने धोएं।
    6. निर्माता के उपकरण का उपयोग कर चैंबर स्लाइड को हटाकर बढ़ते के लिए नमूने तैयार करें। प्रत्येक अच्छी तरह से एंटीफैड समाधान की एक छोटी बूंद जोड़ें। प्रत्येक कक्ष स्लाइड पर 22 मिमी x 60 मिमी कवरलिप रखें और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ किनारों को ध्यान से सील करें।
    7. छवि नमूने 5 माइक्रोन चरणों में ~ 10 स्लाइस के जेड ढेर के रूप में एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं। यदि वांछित है, तो सेल इमेजिंग सॉफ्टवेयर में विस्तारित फोकस कमांड का उपयोग करके जेड विमानों को एक ही विमान में सेक करें।
    8. इमेज जे का उपयोग करके एंडोथेलियल नेटवर्क के लिए गोलायित आसंजन की मात्रा निर्धारित करें। उचित कण आकार और गोलाकारता के साथ विश्लेषण प्लगइन का उपयोग करके पालन किए गए स्फेरॉइड की संख्या निर्धारित की जा सकती है। छवि क्षेत्र में संलग्न स्फेरॉइड की संख्या को सामान्य करें।
    9. प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, सह-संस्कृतियों की 4 x 4 टाइल वाली छवियों में पालन किए गए स्फेरॉइड की संख्या की मात्रा निर्धारित करें। यदि गोलाकार संख्या सांख्यिकीय रूप से अन्य प्रयोगों की तुलना में काफी कम है, तो प्रयोग दोहराया जाना चाहिए।

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Representative Results

स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं को मैट्रिक्स समाधान पर संस्कृति के 5-8 दिनों के बाद और 2% मैट्रिक्स समाधान के साथ संस्कृति माध्यम में 3 डी स्फेरॉइड में स्वयं व्यवस्थित करना चाहिए। गैर-ट्यूमरजेनिक एमसीएफ 10ए स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड गोल दिखाई देने चाहिए और एक खोखले केंद्र होना चाहिए, जिसमें इंटीग्रिन α6 स्पेरोइड के बाहरी किनारे पर ध्रुवीकृत होता है(चित्रा 1,इनसेट खोखले केंद्र दिखाता है)। अत्यधिक आक्रामक एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर एपिथेलियल कोशिकाएं अनियमित स्फेरॉइड बनाती हैं। जब वे व्यास में लगभग 100 - 300 माइक्रोन होते हैं तो स्फेरॉइड का उपयोग किया जाना चाहिए। जब स्फेरॉइड बहुत बड़े हो जाते हैं और निकटता में आते हैं, तो गोलाकार मेगास्फेरॉइड बनाने के लिए एक साथ जुड़ेंगे। इसके अलावा, एमडीए-एमबी-231 स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड कोशिकाओं को बहुत लंबे समय तक मैट्रिगेल संस्कृति में बनाए रखने पर स्पेरोइड से बाहर निकलने वाले दिखा सकते हैं।

HUVEC को विरल, सीरम मुक्त संस्कृति के 6-8 घंटे के बाद ट्यूब की तरह नेटवर्क में स्वयं व्यवस्थित करना चाहिए । नमूनों में कनेक्शन के साथ बहुकोशिकीय नोड्स होंगे जो समानांतर में 1-3 कोशिकाओं की लाइनों से बनते हैं। एचयूवीईसी नेटवर्क को चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेज किया जा सकता है यदि उन्हें सेल ट्रैकर और होश(चित्रा 2)के साथ लेबल किया जाता है। इमेजजे एंजियोजेनेसिस एनालाइजर का उपयोग नेटवर्क जंक्शनों, खंडों और शाखाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। HUVEC नेटवर्क अगर 16 घंटे से अधिक समय के लिए सीरम मुक्त माध्यम में छोड़ दिया मर जाएगा ।

जब स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड एचयूवीसी नेटवर्क पर बायोप्रिंट किए जाते हैं, तो स्फेरॉइड और नेटवर्क दोनों को कम से कम 24 घंटे तक अपने मूल आकृति विज्ञान को बनाए रखना चाहिए। MCF10A स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड गोल वस्तुओं के रूप में दिखाई देंगे जो सीधे एंडोथेलियल नेटवर्क का पालन करते हैं, जबकि एमडीए-एमबी-231 स्तन एपिथेलियल स्पफेरॉइड अभी भी संलग्न या एंडोथेलियल नेटवर्क(चित्रा 3)के करीब निकटता में दिखाई देंगे। एचयूवीईसी नेटवर्क को तब बनाए रखा जाएगा जब स्तन एपिथेलियल स्फेरॉइड के साथ सह-संस्कारी होंगे। 24 घंटे से अधिक समय तक सह-संस्कृतियों के लिए, स्तन एपिथेलियल कोशिकाएं गोलाकारों से बाहर और एंडोथेलियल नेटवर्क के साथ माइग्रेट हो सकती हैं। हमारे अनुभव में, यह पहले ट्यूमर में होता है बजाय गैर-ट्यूमरजेनिक स्तन एपिथेलियल कोशिकाएं38। हमने पहले बायोप्रिंटेड सह-संस्कृतियों का उपयोग करके प्रदर्शन किया था कि दवा परीक्षण को स्पेरोइड बायोप्रिंटिंग के 2 घंटे बाद शुरू किया जा सकता है, उदाहरण के लिए एंडोथेलियल नेटवर्क45पर स्फेरॉयड आसंजन का परीक्षण करने के लिए। हमने यह भी दिखाया है कि 3डी स्तन गोलाकार व्यक्तिगत कोशिकाओं के रूप में या सह-संस्कृति41,45में मुद्रित होने की तुलना में Paclitaxel जैसी कैंसर रोधी दवाओं के लिए अधिक प्रतिरोधी होते हैं। बायोप्रिंटेड स्फेरॉइड के अभाव में, एचयूवीईसी नेटवर्क नियंत्रण कुओं अपने नेटवर्क आकृति विज्ञान को पकड़ने और 16 घंटे के बाद मरने में विफल रहते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड्स के प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां। MCF10A स्फेरॉइड को इंटीग्रिन α6 (ग्रीन) और न्यूक्लियी (नीला) के लिए लेबल किया गया था। सेल फेनोटाइप की पुष्टि बायोप्रिंटिंग के बाद की जा सकती है जब स्फेरॉइड एक खोखले केंद्र (इनसेट) के साथ गोल दिखाई देते हैं और बाहरी किनारों पर integrin α6 ध्रुवीकृत होते हैं। एमडीए-एमबी-231 स्फेरॉइड को ऐक्टिन (ग्रीन) और न्यूक्लियी (ब्लू) के लिए लेबल किया गया था। सेल फेनोटाइप की पुष्टि तब की जा सकती है जब स्फेरॉइड खोखले केंद्रों के बिना अनियमित रूप से आकार के होते हैं और आसपास के मैट्रिक्स में हमला करने वाली सेल प्रक्रियाएं होती हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: चरण विपरीत और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा HUVEC नेटवर्क के प्रतिनिधि छवियां। एचयूवीईसी नेटवर्क नोड्स को जोड़ने वाली कोशिकाओं की लाइनों के साथ छोटे बहुकोशिकीय नोड्स के रूप में दिखाई देते हैं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए, कोशिकाओं को सेल ट्रैकर रेड और होशच फॉर न्यूक्लियी (ब्लू) के साथ लेबल किया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: स्तन एपिथेलियल स्पफेरॉइड की प्रतिनिधि छवियां एचयूवीईसी नेटवर्क के साथ सह-संस्कारी हैं। MCF10A spheroids, integrin α6 (ग्रीन) और नाभिक (नीला) के लिए लेबल, दौर रहते है और एंडोथेलियल नेटवर्क के लिए सीधे पालन दिखाई देते हैं । एमडीए-एमबी-231 स्फेरॉइड, जो ऐक्टिन (ग्रीन) और न्यूक्लियी (नीला) के लिए लेबल किए गए हैं, अभी तक एंडोथेलियल नेटवर्क के पास या पर बने हुए हैं। सह-संस्कृतियां बायोप्रिंटिंग के बाद कम से कम 24 घंटे तक इस आकृति विज्ञान को बनाए रखते हैं, जिसके बाद स्तन कोशिकाएं एंडोथेलियल ट्यूबों के साथ माइग्रेट हो सकती हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल अपने 3 डी वास्तुकला में एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति के लिए अपने 3 डी वास्तुकला में बायोप्रिंट स्फेरॉइड के लिए अपनी तरह का पहला है। महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल चरणों में स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड्स और एचयूवीईसी नेटवर्क का प्रारंभिक गठन शामिल है। स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड्स को खिलाने में अत्यधिक सावधानी बरती जानी चाहिए, क्योंकि वे मैट्रिक्स समाधान से आसानी से बाधित होते हैं। इसी तरह, स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड को देखभाल के साथ इलाज किया जाना चाहिए जब उन्हें मैट्रिक्स समाधान से दूर किया जाता है और नेटवर्क में मिलाया जाता है। HUVEC नेटवर्क को घनत्व के बहुत अधिक पर नहीं चढ़ाया जाना चाहिए या 16 घंटे से अधिक समय तक छोड़ दिया जाना चाहिए, क्योंकि वे क्रमशः एक मोनोलेयर या मरेंगे। अंत में, सेल व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए सभी बायोप्रिंटिंग 37 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ वातावरण में होनी चाहिए।

स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड को मैट्रिक्स के अलावा विभिन्न प्रकार के बायोइंक में बायोप्रिंट किया जा सकता है, जिसमें एल्गिनेट और एल्गिनेट-कोलेजन मिश्रण शामिल हैं। हमने दिखा दिया कि गोलाकार व्यवहार्य थे और एल्गिनेट-आधारित बायोइंक41में मुद्रित होने पर उनकी आकृति विज्ञान को बनाए रखा। इस प्रकार जब हम मैट्रिक्स समाधान आधारित बायोइंक में बायोप्रिंटिंग पेश करते हैं, तो बायोइंक का उपयोग करने के लिए अन्य कम खर्चीले और आसान भी संभव हैं। इसके अतिरिक्त हमने एमसीएफ-7 और आनुवंशिक रूप से संशोधित एमसीएएफ 10ए-न्यून कोशिकाओं सहित अन्य स्तन कैंसर सेल लाइनों का उपयोग किया, जिसमें इसी तरह की सफलता38,41,45थी। वैकल्पिक साधनों का उपयोग स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड बनाने के लिए भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ली एट अल ने नियंत्रित आकार46के समान आकार के स्फेरॉइड बनाने के लिए पीडीएमएस टिकटों का उपयोग करके उत्पादित हाइड्रोजेल माइक्रोवेल सरणी का उपयोग किया। अंत में, ट्यूमर-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे वैकल्पिक एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है, और एचयूवीईसी नेटवर्क बनाने के बजाय, एडिपोस-टिश्यू व्युत्पन्न माइक्रोवेसेल्स को सीधे 3 डी संवहनी संरचनाओं47के रूप में बायोप्रिंट किया जा सकता है।

इस विधि की एक प्राथमिक सीमा बायोप्रिंटेड स्फेरॉइड स्थान और संख्या को नियंत्रित करने में चुनौती थी। स्फेरॉइड क्षति को रोकने के लिए अपेक्षाकृत बड़े नोजल और इनवाससिड तरल पदार्थों के साथ मुद्रित किया जाना था। तेजी से जेलिंग बायोइंक बेहतर स्फेरॉइड स्थान को नियंत्रित कर सकता है। स्फेरॉइड को भी बायोइंक में नहीं गिना जा सकता था, क्योंकि वे हमारे सेल काउंटर के लिए बहुत बड़े थे। हमने इसके बजाय मैट्रिगेल सतह से स्पेरोइड को पाइपिंग करने से पहले लिए गए चरण विपरीत छवियों से प्राप्त स्पेरोइड गिनती पर भरोसा किया। स्फेरॉइड बनाने के वैकल्पिक साधन उनकी संख्या और आकार को बेहतर नियंत्रित कर सकते हैं। हम हर बार उसी तरह सेल छीरने और खेती स्फेरॉइड का उपयोग करके मध्यम सटीकता के साथ गोलाकार संख्या और आकार को नियंत्रित करने में सक्षम थे। एक अंतिम सीमा यह है कि स्तन एपिथेलियल कोशिकाएं समय के साथ गोलाकार और एंडोथेलियल नेटवर्क के साथ बाहर निकल जाती हैं। यह संभव है कि वैकल्पिक बायोइंक इस सीमा को समाप्त कर देंगे।

पूर्व-गठित एचयूवीईसी नेटवर्क पर स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड्स की प्रत्यक्ष बायोप्रिंटिंग कम समय में 3 डी इन विट्रो ट्यूमर सह-संस्कृति मॉडल के निर्माण में सक्षम बनाती है। शोधकर्ताओं ने तो तेजी से उच्च थ्रूपुट के साथ spheroids और vasculature के बीच बातचीत की जांच कर सकते हैं । भविष्य में, स्तन एपिथेलियल स्पेरोइड्स को परफ्यूसेड वैक्यूल्चर पर बायोप्रिंट किया जा सकता है, जो प्रवाह प्रभावों के अध्ययन की अनुमति देगा। इसके अलावा, ट्यूमर से व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड और एंडोथेलियल कोशिकाओं को एक रोगी-विशिष्ट मॉडल में दवा प्रभावकारिता के परीक्षण के माध्यम से सटीक दवा सक्षम करने के लिए बायोप्रिंट किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को एनआईएच 1R01HL140239-01 द्वारा एएमसी को वित्त पोषित किया गया था । हम ड्रेक्सेल विश्वविद्यालय में सेल इमेजिंग सेंटर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity Sanyo MCO-20AIC Cell incubation
3D Bio printer custom-made None Used for bioprinting
8-well chamber slides VWR, Radnor, PA 53106-306 for seeding spheroids
25-gauge needle Sigma, St. Louis, MO Z192406-100EA bioprinting syringe needle
Absolute ethanol (200 proof ) Sigma, St.Louis, MO E7023-500ML reconsitution of media components
Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115006020 secondary block - Immunofluorescence
Alexa Fluor 488 (1:200) Thermo Fisher, Waltham, MA A-11006 Seconday antibody-Immunofluorescence
Bovine insulin Sigma, St.Louis, MO I-035-0.5ML MCF10A Media additive
Bovine serum albumin (BSA) Sigma, St.Louis, MO A2153-500G Blocking agent -Immunofluorescence
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning, Corning, NY 352350 Remove large or clustered spheroids
CellTracker™ Red CMTPX Dye Thermo Fisher, Waltham, MA C34552 pre-stain for HUVEC tubes
Compact Centrifuge Hermle- Labnet, Edison ,NJ Z206A For cell centrifugations
Cholera Toxin Sigma, St.Louis, MO C8052-.5MG MCF10A Media additive
Conical tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 62406-200 Collecting and resuspending cells
Countess II-FL Cell counter Thermo Fisher, Waltham, MA AMQAF1000 counting cells
Glass pipettes (10 mL) VWR, Radnor, PA 76184-746 cell resuspension
DMEM F:12 Thermo Fisher, Waltham, MA 11320033 MCF10A basal media
DMEM 1X VWR, Radnor, PA 10-014-CV MDA-MB-231 basal media
Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza, Durham, NC CC-3156 HUVEC basal media
Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) Lonza, Durham, NC CC-3162 Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)
Alexa Fluor™ 488 Phalloidin Thermo Fisher, Waltham, MA Labelling MDA-MB-231 spheroids
Fetal Bovine serum Cytiva, Logan, UT SH30071.03 HUVEC/MDA-MB-231 media additive
Goat serum Thermo Fisher, Waltham, MA 16210064 Immunofluorescence labelling component
Glycine Sigma, St.Louis, MO G8898-500G immunofluorescence buffer component
Hoescht 33342 Thermo Fisher, Waltham, MA 62249 Nuclei stain immunofluorescence
Horse Serum Thermo Fisher, Waltham, MA 16050130 MCF10A Media additive
Hydrocortisone Sigma, St.Louis, MO H0888-5G MCF10A Media additive
Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) Cell applications, San Diego , CA 200-05f Endothelial cell lines
Integrin α6 Millipore, Billerica, MA MAB1378 Immunofluorescence spheroid labelling component
Live Dead assay Thermo Fisher, Waltham, MA L3224 Live and dead cell stain assay for cell viability
LSM 700 Confocal microscope Zeiss, Thornwood, NY Used to visualize cells
Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml VWR, Radnor, PA 354230 Spheroid formation
MCF10A cells ATCC CRL-10317 Breast cell line
MDA-MB-231 cells ATCC HTB-26 Breast cell line
Paraformaldehyde Sigma, St.Louis, MO 158127-500G cell fixative
Penicillin and streptomycin Thermo Fisher, Waltham, MA 15140122 MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive
Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) Thermo Fisher, Waltham, MA 7001106 Wash buffer for cells before trypsinization
Phosphate buffer saline 10X Thermo Fisher, Waltham, MA AM9625 immunofluorescence buffer component
Prolong gold antifade Thermo Fisher, Waltham, MA P36934 immunofluorescence mountant medium
Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF Peprotech, Rocky Hill, NJ AF-100-15 MCF10A/ assay media component
Sodium Azide Sigma, St.Louis, MO S2002-25G immunofluorescence buffer component
Sterile syringe (10 mL) VWR, Radnor, PA 75846-757 bioprinting process
Tissue culture dish (10cm) VWR, Radnor, PA 25382-166 monolayer cell culture
Triton X-100 Sigma, St.Louis, MO T8787-250ML immunofluorescence buffer component
Trypan blue 0.4% Thermo Fisher, Waltham, MA 15250061 cell counter additive
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher, Waltham, MA 25300054 cell detachment
Tween -20 Thermo Fisher, Waltham, MA 85113 immunofluorescence buffer component
Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) Peprotech, Rocky Hill, NJ 100-20 HUVEC tube additive
Volocity 6.3 cell imaging software PerkinElmer, Hopkinton, MA Z stack compresser

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References

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Swaminathan, S., Clyne, A. M. Direct … More

Swaminathan, S., Clyne, A. M. Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks. J. Vis. Exp. (165), e61791, doi:10.3791/61791 (2020).

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