Summary
이 프로토콜의 목표는 약물 선별 연구에 사용될 수 있는 3D 유방 내피 상양 모델을 빠르게 만들기 위해 사전 형성된 내피 네트워크에 다세포 스페로이드로서 유방 상피 세포를 직접 바이오프린트하는 것입니다.
Abstract
바이오 프린팅은 생체 내 조직 아키텍처의 중요한 특징을 더 잘 재현하는 3D 인간 암 모델을 조작하는 유망한 도구로 부상하고 있습니다. 현재 층별 압출 바이오프린팅에서 개별 세포는 복잡한 공간 및 측두구 큐와 함께 바이오잉크에서 압출되어 계층 적 조직 자체 조립을 촉진합니다. 그러나, 이 생화 기술은 세포 사이 복잡한 상호 작용에 의존합니다, 생잉크 및 생화학및 생생물물리학 단서. 따라서, 자체 조립은 며칠 또는 몇 주가 걸릴 수 있으며, 특정 바이오잉크가 필요할 수 있으며, 하나 이상의 세포 유형이 관련될 때 항상 발생하지 않을 수 있다. 따라서 우리는 다양한 바이오 잉크에서 미리 형성된 3D 유방 상피 스페로이드를 직접 바이오 프린트하는 기술을 개발했습니다. 생체 인쇄 사전 형성 된 3D 유방 상피 스페로이드는 인쇄 후 생존력과 편광 아키텍처를 유지했습니다. 우리는 또한 공동 배양 모델을 만들기 위해 혈관 내피 세포 네트워크에 3D 스페로이드를 인쇄했습니다. 따라서, 새로운 바이오 프린팅 기술은 기존의 바이오 프린팅 기술보다 더 낮은 비용으로 더 높은 유연성으로 생리적으로 관련된 3D 인간 유방 모델을 빠르게 만듭니다. 이 다목적 바이오 프린팅 기술은 추가 바이오 잉크에서 다른 조직의 3D 모델을 생성하기 위해 추정 될 수있다.
Introduction
체외 혈관 종양 모델의 3D는 암 성장과 전이에 대한 기계론적 연구를 위한 필수 도구입니다. 특히 유방암의 경우, Matrigel에서 배양된 유방 상피 세포는 생체 내 유방 아시누스 건축1,2,3,4,5,6,7,8과더 가깝게 유사한 편광 스페로이드로구성된다. 3D 유방 상피 세포 배양또한 세포 기능에 영향을 미치며, 표피 성장 인자(EGF) 수용체 변조8,9의차이를 나타내는 3D 배양; ErbB210을포함하는 종양유전자 기능; 성장 및 세포사멸 신호11,12; 및 화학 요법 저항13,14. 혈관 내피 세포는 3D 대전통적인 2D 배양(15,16,17,18)에서환경 자극에 유사하게 반응한다. 그러나, 혈관 내피 및 유방 상피 상호 작용의 이해의 대부분은 조건부 배지 또는 트랜스웰 삽입을 사용하여 2D 배양에서 비롯되거나, 2개의 세포 유형이 물리적으로 분리되는 3D모델(19,20,21,22, 23)에서 비롯된다. 이러한 공동 배양 모델은 3D 배양과 세포 접촉이 혈관 내피-유방 상피 세포 상호 작용24,25,26에매우 중요하기 때문에 제한된 생리적 통찰력을 제공한다.
3D 암 모델은 하이드로겔 내 또는 엔지니어링 스캐폴드5,27, 28,29에매달려 방울 스페로이드 형성, 바이오 프린팅, 자기 조립 및 배양을 포함한 다양한 기술을 사용하여 제조되었다. 최근에는 3D 종양 모델이 각각의 3D 구조에 배치된 다중 세포 유형으로 만들어졌습니다. 종양-온-a-칩 플랫폼의 한 예에서, 암, 내피 및 기질 세포는 매트릭스로 혼합된 다음 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치에서 3개의 중앙 조직 챔버로 주입하였다. 조직 챔버는 동맥과 정맥을 나타내는 두 개의 외부 채널에 의해 경계되었다. 배양 5-7일 후, 내피 세포는 혈관망을 형성하고 암세포가 증식하여 혈관 근처에서 작은 종양을 형성하였다. 이 플랫폼은 약물 및 약물 조합30을검사하는 데 사용되었다. 추가 종양-온-a-칩 플랫폼은 특정 기계적 자극(예를 들어, 폐내의 기계적 변형)을 갖는 전이 및 암 유형을 연구하기 위해만들어졌으며(예를 들어, 폐내의 기계적 변형)31,32. 그러나, 이들 플랫폼은 일반적으로 각각의 3D 구조에 혈관과 암을 모두 포함하지 않는다.
생체 제작은 세포 위치에 대한 단단한 공간 제어를 가능하게 하기 때문에 체외 혈관 종양 모델에서 3D를 진행하는 데 큰 약속을 보여줍니다. 지난 10 년 동안 바이오 프린팅의 성장에도 불구하고, 몇몇 연구 결과는종양33,34에특히 집중합니다. 일 예에서, 젤라틴/알지네이트/피브리노겐 하이드로겔에서 HeLa 세포의 3D 프린팅은 체외 자궁 경부암 모델을 만드는 데 사용되었다. 종양 세포는 개별 세포로서 생보화된 다음 스페로이드를 형성할 수 있었는데, 이는 더 높은 증식율, 증가된 매트릭스 메탈로프로틴아제 발현, 그리고 2D배양35에서세포에 비해 더 높은 화학저항성을 보였다. 이러한 연구에서는, 다른 많은36,37,해리된 세포 현탁액이 생체 인쇄되었고, 그 후 세포 배양은 세포가 3D 구조를 형성할 수 있도록 필요한 기계적 및 생화학적 단서를 제공하였다. 그러나, 세포 자체 조립은 며칠 또는 몇 주가 걸릴 수 있고, 복잡한 공간 및 현세적 환경 단서를 요구할 수 있거나, 2개의 세포 모형이 공동 배양될 때 생기지 않을 수 있다. 예를 들어, 유방 상피 세포는 2D 공동 배양에서 내피 세포에서 세포 사멸을 유도하고, 해리된 유방 상피 세포는 alginate/젤라틴하이드로겔(38)에서생체 인쇄시 3D 스페로이드를 형성하지 않았다. 분리된 유방 상피 또는 암세포는 원형 PDMS 금형에 갇혀있을 때만 알기네이트 기반 바이오 잉크에서 스페로이드를 형성했습니다. 다른 경우에는, 스페로이드는 초저 부착 원형 웰 플레이트에서 일시 중단 된 방울을 사용하여 형성된 다음 알기네이트 기반 바이오 잉크(39,40)로혼합되었다.
우리는 지금 이 프로토콜에 있는 대안 3D 조직 생물학 제조 방법을 기술합니다. 종자 해리 된 세포를 보고 이러한 세포가 3D 구조를 형성할 때까지 기다리는 대신, 혈관 관 네트워크에 3D 종양 스페로이드를 생성하고 생체 인쇄하는 방법을 설명하여 거의 즉시 사용할 수 있는 종양 공동 배양 모델을 만듭니다. 종양 스페로이드는 체외에서 재배되거나 인간 조직 (organoids)에서 파생 될 수 있습니다. 유사하게, 혈관 관은 성장될 수 있고 지방 조직 미세 혈관 단편에서 파생될 수 있다. 바이오 잉크는 생물학적으로 비활성 알긴산에서 생물학적으로 활동적인마모겔(41)까지다양할 수 있다. 이러한 3D 종양 공동 배양 모델은 다양한 세포 구조 및 바이오 잉크로 생성될 수 있기 때문에 다세포 유형, 세포외 행렬 및 케모킨그라데이션(15,42)을통합할 수 있다. 현재 제형에서 내피 네트워크를 포함할 수는 없지만 향후 반복은 이 방법을 미세유체 또는 -온칩 시스템과 통합할 수 있습니다. 내피 네트워크에 바이오프린팅 3D 유방 상피 스페로이드를 심도 네트워크에 심상검사하여 약물 검사 및 맞춤형 정밀의학(27)을위한 인간 유방 모델의 신속한 생체 제작을 가능하게 한다.
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Protocol
1. 유방 상피 세포 성장 및 분석 미디어
- MCF10A 유방 상피 세포
참고: 비종양 불멸의 유방 상피 세포주는 섬유성질환(43)을가진 환자로부터 유래된다. 세포는 에스트로겐 수용체를 발현하지 않습니다.- 20 μg/mL 표피 성장 인자(EGF)를 준비하려면, 200 μg/mL EGF를 만들기 위해 멸균 dH2O의 500 μL에서 lyophilized EGF의 100 μg를 용해하십시오. 20μg/mL EGF의 500 μL을 dH2O에 멸균 0.1% BSA에 추가하여 20 μg/mL EGF 스톡 솔루션을 만듭니다. 최대 12개월 동안 -20°C에서 20μg/mL EGF 알리쿼트 20μg/mL EGF 알리쿼트를 보관하였다.
- 500 μg/mL 하이드로코르티손을 준비하려면 절대 에탄올 1mL(200 증거)에 하이드로코르티손 1 mg을 희석시합니다. 이 혼합물에 멸균 DMEM F:12 1mL을 추가하여 500 μg/mL 하이드로코르티손 스톡 용액을 만듭니다. 하이드로코르티손 주식 알리코트(-80°C)를 최대 12개월 동안 보관하십시오.
- 10 μg/mL 콜레라 독소를 제조하려면 1 mg/mL 콜레라 독소 스톡 용액을 만들기 위해 1mL의 멸균 dH2O에 콜레라 독소 리오필화 분말 1 mg을 용해하십시오. 콜레라 독소 육수 알리코를 -80°C에 최대 12개월 동안 보관하십시오.
- 성장 매체를 준비하려면 EGF (20 μg /mL), 하이드로 코르티손 500 μL (500 μg /mL), 콜레라 독소 5 μL (1 mg / mL), 500 μL 의 소 인슐린 (10 mg /mL), 페니실린 및 strepmyin 10 mL을 추가하십시오. 및 25mL의 말 세럼은 DMEM F:12의 최종 농도 20 ng/mL EGF, 500 ng/mL 하이드로코르티손, 10 ng/mL 콜레라 독소, 10 ng/mL 소 인슐린, 2% v/v 페니실린 및 streptomycin, 5% v. 항생제 농도는 바이오 프린팅 공정에서 멸균 감소를 고려하여 2%로 증가하였다. 그러나, 항생제 농도는 1%로 낮출 수 있다.
- 분석 매체를 준비하려면 하이드로 코르티손 500 μL (500 μg /mL), 콜레라 독소 5 μL (1 mg / mL), 소 인슐린 500 μL (10 mg / mL), 페니실린 및 연쇄 상류균증 10 mL을 추가하십시오. 및 말 혈청 의 25 mL DMEM F:12의 최종 농도500 ng /mL 하이드로 코르티손, 10 ng /mL 콜레라 독소, 10 ng /mL 소 인슐린, 2 % v / v 페니실린 및 연쇄 상피 민, 5 % v / v 말 의
- MDA-MB-231
참고: 삼중 음성(에스트로겐 수용체 결여, 황체 호르몬 수용체 및 표피 성장 인자 수용체 2) 유방암 상피 세포주는 전이성 유방 선암아데노암(44)을가진 여성 환자의 흉막 삼출에서 생성된다. 세포는 공격적이고 침습적이며 제대로 분화되지 않은 유방암을 나타냅니다.- 성장과 분석 매체를 준비하려면 50mL의 태아 소 세럼, 페니실린 과 연쇄 상류균제 10mL, 말 혈청 25mL을 DMEM 500mL에 추가하여 최종 농도 10% v/v 태아 소 혈청, 2% v/v 페니실린 및 streptoe vrume.
2. 유방 상피 세포 배양
- 종자 500,000 MCF10A 또는 MDA-MB-231 세포10cm (P100) 조직 배양 접시에 MCF10A 또는 MDA-MB-231 성장 배지의 10 mL. MCF10A 및 MDA-MB-231 세포는 48시간 만에 90%의 합류에 도달합니다.
- 유방 상피 세포를 통과하기 위해, 먼저 따뜻한 PBS의 10 mL로 세포를 씻어.
- 접시에 0.05%의 트립신-EDTA의 2mL를 추가하여 유방 상피 세포를 분리합니다. 접시를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 20-25분간 놓습니다.
- 트립시화 세포에 MCF10A 또는 MDA-MB-231 성장 매체의 5mL를 추가하여 트립신을 중화시한다. 세포를 다시 중단하고 세포 클러스터를 분해하기 위해 세포 미디어 혼합물을 위아래로 피펫합니다.
- 셀 서스펜션을 15mL 원물 튜브에 넣고 원심분리기를 1,200 x g에서 3분간 추가합니다. 신중하게 슈퍼나탈을 흡인하고 MCF10A 또는 MDA-MB-231 성장 매체의 5mL에서 세포 펠릿을 재중단한다.
- MCF10A 또는 MDA-MB-231 성장 매체와 함께 5개의 새로운 10cm 조직 배양 접시에 세포 현탁액의 플레이트 1 mL. 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 세포는 2-3 일 후에 다시 통과 될 준비가되어 있습니다. MCF10A 세포는 35번 통로로 유지될 수 있으며, 그 후 형태학적 변화를 보여준다. MDA-MB-231 세포는 24번 으로 유지될 수 있으며, 그 후 형태학적 변화를 보여준다.
3. 유방 상피 스페로이드 형성
- 분석 시작 전에 30분 동안 200 μL 파이펫 팁을 동결합니다. 전체 공정에 대한 성장 인자 감소 매트릭스 솔루션(예: Matrigel) (10 mg/mL)를 얼음에 보관하십시오.
- 얼음-차가운 매트릭스 용액의 30 μL을 천천히 파이펫으로 얼음-차가운 200 μL 파이펫 팁을 8웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 넣습니다. 측면에서 시작하여 코너를 따라 파이펫 팁을 드래그하여 우물 중앙에 마지막 방울을 추가하여 각 우물의 코팅을 보장합니다. 이 단계에서 기포를 방지하여 균일한 매트릭스 솔루션 레이어를 보장합니다. 각 웰에 새 파이펫 팁을 사용하십시오.
- 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 매트릭스 용액을 중합하기 위해 챔버 슬라이드를 15-20분 동안 배양한다.
- MCF10A 분석 배지에서 트립시화 된 MCF10A 세포를 200,000 세포 / mL에서 재일시 중단하거나 MDA-MB-231 성장 배지에서 200,000 세포 / mL에서 트립시화 된 MDA-MB-231 세포를 재일시 중단합니다.
- MCF10A 세포를 사용하는 경우, 2% 매트릭스 용액의 최종 농도를 위해 5 μL의 EGF(20 μg/mL) 및 100 μL의 매트릭스 용액을 추가하여 신선한 MCF10A 스페로이드 성장 매체를 준비한다.
- 인큐베이터에서 매트릭스 용액으로 미리 코팅된 챔버 슬라이드를 제거합니다. MCF10A 또는 MDA-MB-231 세포 현탁액(10,000셀)의 50μL을 각 웰에 추가합니다. MCF10A 셀을 사용하는 경우 MCF10A 스페로이드 성장 매체의 450 μL을 추가합니다. MDA-MB-231 셀을 사용하는 경우, MDA-MB-231 성장 중간 배지의 450 μL을 2% 매트릭스 용액(9 μL)으로 미리 혼합합니다. 즉시 챔버 슬라이드를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 배치합니다.
- 4일마다 배지를 교체합니다. 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 각 우물의 한 구석에서 오래된 미디어의 200 μL을 조심스럽게 피펫합니다. 이 과정에서 챔버 슬라이드를 45°로 기울여 스페로이드가 방해받지 않도록 합니다. 새로 준비된 MCF10A 스페로이드 성장 매체 또는 MDA-MB-231 성장 매체의 200 μL을 추가하여 이전에 는 2% 매트릭스 용액을 드롭의 모서리에 각각 곱하게 혼합하여 스페로이드가 매트릭스 층에 부착되어 있는지 확인합니다. 스페로이드에 의해 생성된 모든 사이토카인이 완전히 고갈되지 않도록 미디어의 ~50%만이 대체됩니다.
참고: MCF10A 유방 상피 스페로이드는 편광및 중공 센터를 형성하는 데 최대 8 일이 소요됩니다. MDA-MB-231 유방 상피 스페로이드는 형성하는 데 최대 5 일이 걸리며 중공 센터가 없습니다.
4. 내피 세포 네트워크 형성
- 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC) 배양
- 인슐린 성장 인자, 섬유아세포 성장인자, 혈관 내피 성장 인자, 아스코르브산을 함유한 단일 내피 성장 중-2 키트의 내용을 추가, 표피 성장 인자, 헤파린 및 젠타미신-암포테리신 B, 태아 소 혈청 50mL, 5mL 페니실린-연쇄 절제술신, 5mMMM글루타민 500mL의 500mL 에 대한 500mL의 내피성 기초 중간-2(EBM-2)가 내달 성장을 완성하였다.)
- 종자 500,000 내피 세포는 EGM-2의 10 mL에서 10cm 조직 배양 접시에. 세포가 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 도달할 때까지 >80% 인플루엔자(약 48시간)에 놓습니다.
- 세포를 통과하려면 내피 세포를 10mL의 따뜻한 PBS로 씻으시다. 10cm 조직 배양 접시에 트립신-EDTA0.05%의 2mL를 첨가하여 HUVEC를 분리합니다. 위상 조영 현미경 검사법에 의해 세포를 면밀히 모니터링합니다. 세포는 볼링을 할 때 준비되었지만 접시에 부착된 상태로 유지됩니다.
- 조심스럽게 접시에서 트립신을 흡인. 요리에 EGM-28 mL을 추가합니다. 전체 접시 표면에 EGM-2를 위아래로 파이프하여 접시에서 세포를 씻어내라.
- 대안적으로, 트립시네화된 세포에 EGM-2의 5mL를 추가하여 트립신을 중화시한다. 세포를 다시 중단하고 세포 클러스터를 분해하기 위해 세포 미디어 혼합물을 위아래로 피펫합니다. 셀 서스펜션을 15mL 원물 튜브에 넣고 원심분리기를 1,200 x g에서 3분간 추가합니다. 조심스럽게 슈퍼 나티를 흡인하고 EGM-2의 10 mL에서 세포 펠릿을 재중단.
- 10cm 조직 배양 접시에 EGM-2의 9mL에 세포 현탁액 1mL를 추가합니다. 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 2일마다 신선한 EGM-2로 매체의 2/3을 교환하십시오. 세포는 3-5 일 후에 통과 할 준비가되어 있습니다. HUVEC는 8번 통로까지 유지관리될 수 있으며, 그 후에는 네트워크를 형성하지 못합니다.
- 내피 세포 (HUVEC) 네트워크 형성
- 분석 시작 전에 30분 동안 200 μL 파이펫 팁을 동결합니다. 전체 공정에 대한 성장 인자 감소 매트릭스 솔루션 (10 mg / mL)을 얼음에 유지합니다.
- 얼음-차가운 매트릭스 용액의 30 μL을 천천히 파이펫으로 얼음-차가운 200 μL 파이펫 팁을 8웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 넣습니다. 측면에서 시작하여 코너를 따라 파이펫 팁을 드래그하여 우물 중앙에 마지막 방울을 추가하여 각 우물의 코팅을 보장합니다. 이 단계에서 기포를 방지하여 균일한 매트릭스 솔루션 레이어를 보장합니다. 각 웰에 새 파이펫 팁을 사용하십시오.
- 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 15-20분 동안 챔버 슬라이드를 배양하여 마트리겔을 중합한다.
- 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 30분 동안 적색 셀 트래커(1:1000)의 10μL(1:1000)를 가진 HUVEC 10cm 접시를 미리 얼룩지게 합니다.
- 따뜻한 PBS의 10mL로 내피 세포를 씻으시다. 10cm 조직 배양 접시에 트립신-EDTA0.05%의 2mL를 첨가하여 HUVEC를 분리합니다. 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 5분간 배치하여 세포를 완전히 분리합니다.
- 트립신을 중화시키기 위해 접시에 5 mL의 EGM-2를 추가합니다. 셀 서스펜션을 25mL 원문 튜브로 이송합니다. 원심 분리기 HUVEC 에서 1,200 x g5 분 동안. 수퍼내티드를 흡인시키고 혈청이 없는 EBM-2의 5mL에서 세포 펠릿을 재놓는다.
- Trypan blue를 사용하여 셀을 계산하여 실행 가능한 셀을 결정합니다. 1 x 106 셀/mL 용액을 만듭니다.
- 200 μL의 혈청 무료 EBM-2로 각 우물에 100,000 HUVEC를 추가합니다. 더 많은 셀이 추가되면 튜브 네트워크가 아닌 표면 단층층을 만듭니다.
- 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 HUVEC를 배양합니다. 6 시간 후, 위상 대조 현미경 검사법에 의해 이미지 HUVEC 네트워크. 네트워크는 이제 유방 스페로이드와 공동 문화에 대한 준비가되어 있습니다.
5. 사전 형성 된 HUVEC 네트워크에 바이오 프린팅 유방 상피 스페로이드
참고: 이중 노즐 바이오 증착 시스템은 생체 제작 공정에 사용해야 합니다. 이 경우, 시스템은 재료 증착의 미크론 규모의 공간 제어뿐만 아니라 2 개의 나사 구동 모터가 10 mL 주사기에서 바이오 잉크를 침전 할 수 있도록 세 개의 모션 암을 가지고 있었다. 이 시스템은 바이오 프린팅 중 멸균 환경을 유지하기 위해 고효율 미립자 공기 여과 시스템뿐만 아니라 UV 살균 기능으로 기능화되어야 합니다. 바이오 프린터는 인쇄 공정 전에 한 시간 동안 UV를 살균합니다.
- 이전에 설명된 바와 같이 유방 상피 스페로이드 및 HUVEC 네트워크를 만듭니다. 대표적인 상 대비 현미경 이미지에서 스페로이드를 계산하여 각 우물의 유방 상피 스페로이드 수를 추정한다.
- 1000 μL 파이펫 팁의 끝에서 0.5cm를 잘라냅니다. 컷 파이펫 팁을 사용하여 8웰 챔버 슬라이드에서 모든 스페로이드를 50mL 튜브로 조심스럽게 피펫합니다. 선택한 바이오잉크의 스페로이드를 100스페로이드/100 μL에서 재차판으로 재차판한다.
참고: 스페로이드 농도가 높을수록 스페로이드 클러스터링이 발생할 수 있으며 스페로이드와 내피 네트워크 간의 상호 작용의 시각화를 방지할 수 있습니다. - 70 μm 세포 스트레이너를 통해 스페로이드 혼합물을 전달하여 대형 또는 클러스터된 스페로이드를 제거합니다.
- 풀링된 스페로이드를 10mL 멸균 주사기에 넣고 25게이지 멸균 바늘로 캡을 씌울 수 있습니다. 주사기를 바이오 증착 시스템에 부착합니다.
- 8웰 챔버 슬라이드에서 HUVEC 네트워크에서 배지를 흡인합니다.
- 1 mL/분의 유량으로 HUVEC 네트워크의 6 우물에 유방 상피 스페로이드의 100 μL을 돌출합니다. HUVEC 네트워크의 2웰을 컨트롤로 유지 관리합니다.
- HUVEC 네트워크에 인쇄된 MCF10A 스페로이드를 사용하는 경우 MCF10A 스페로이드 성장 매체의 400μL을 추가하거나 이전에 는 2% 매트릭스 솔루션으로 혼합된 400μL MDA-MB-231 성장 매체를 추가합니다. 각각의 스페로이드 성장 배지는 HUVEC 제어 우물에서 사용되어야 한다.
- 37°C에서 공동 배양, 미디어 변화 없이 24~96시간 동안CO2 인큐베이터 5%를 배양한다. 공동 문화는 최대 4 일 동안 원래 매체에서 실행 가능한 유지됩니다.
6. 공초점 현미경 검사법
- 면역 형광 및 PBS-글리신 세척 버퍼 제제
- 면역불과(IF) 완충 10배 스톡 용액을 10x 의 약정 용액을 10x PBS500mL에 2.5g의 소 세럼 알부민 5g, 트리톤 X-100 100mL, 2.05mL의 Tween-20을 첨가하여 준비한다. pH를 7.4로 조정합니다. 퇴적물을 피하기 위해 최대 4 °C에서 1 년 동안 재고 용액을 저장하십시오.
- 멸균 분수 450mL에서 10x IF 버퍼 50mL를 희석하여 작동하는 IF 버퍼를 만듭니다. 작업 용액을 실온에서 최대 1주일 동안 보관하십시오.
- 10x PBS-글리신 버퍼 스톡 용액을 10x PBS의 500mL에 37.5 g의 글리신을 추가하여 준비하십시오. pH를 7.4로 조정합니다. 침전을 피하기 위해 최대 6개월 동안 4°C에 스톡 용액을 보관하십시오.
- 멸균 제열수 450mL에 10x PBS-글리신 버퍼 50mL를 희석하여 작동하는 PBS-글리신 솔루션을 만듭니다. 작업 용액을 최대 1주일 동안 4°C로 저장합니다.
- 공초점 현미경 검사법에 의한 라벨 생체 인쇄 샘플 및 이미지
- 생체 인쇄 3D 공동 배양에서 흡인 매체와 따뜻한 PBS와 함께 3 배 헹구세요. 생체 인쇄 3D 공동 배양을 4% 파라포름알데히드로 실온에서 1시간 동안 수정합니다. 1x PBS-글리신으로 20분 동안 3회 샘플을 헹구습니다.
- IF 버퍼가 10% 염소 세럼과 혼합된 90분(기본 블록)을 블록한 다음, IF 버퍼와 10% 염소 세럼 및 Affinipure Fab 조각(1:100, 보조 블록)으로 40분 이내로 샘플을 차단합니다.
- MCF10A 스페로이드를 사용하는 경우, 4°C에서 하룻밤 동안 이차 차단 버퍼에서 integrin α6(1:100)에 대한 1차 항체를 사용한 라벨 샘플, 알렉사 플루어 488 보조 항체(1:200) 및 Hoescht 33342(1:1000)가 1h 실내 온도에서 보호된다. MCF10A 세포주 는 스페로이드 편광 및 형태학을 보여주는 데 필수적인 높은 수준의 인테그린 α6을 발현합니다.
- 인테그린 α6의 낮은 수준을 표현하는 MDA-MB-231 스페로이드를 사용하는 경우, 알렉사 플루어 488 프할로이드(1:100) 및 Hoescht 33342(1:1000)를 가진 라벨 샘플이 빛으로부터 보호된 실온에서 4시간 동안 이차 차단 버퍼에 있습니다. Phalloidin은 변형 성 무정형 및 침략적 형태학을 평가 할 수 있도록 액틴 필라멘트 시각화를 가능하게합니다.
- 1X PBS-글리신으로 샘플을 3회 3회 세척하여 20분간 세척합니다.
- 제조업체의 도구를 사용하여 챔버 슬라이드를 제거하여 마운팅을 위한 샘플을 준비합니다. 각 웰에 작은 페이드 방지 솔루션을 추가합니다. 각 챔버 슬라이드에 22mm x 60mm 커버슬립을 배치하고 선명한 매니큐어로 가장자리를 조심스럽게 밀봉합니다.
- 공초점 현미경을 사용하여 이미지 샘플은 5 μm 단계에서 ~ 10 슬라이스의 Z 스택으로. 원하는 경우 셀 이미징 소프트웨어의 확장 포커스 명령을 사용하여 Z 평면을 단일 평면으로 압축합니다.
- 이미지 J를 사용하여 내피 네트워크에 스페로이드 접착을 정량화합니다. 부착된 스페로이드의 수는 적절한 입자 크기 및 원형으로 분석 플러그인을 사용하여 정량화될 수 있다. 이미지 영역에 부착된 스페로이드 수를 정규화합니다.
- 재현성을 보장하기 위해 공동 배양물의 4 x 4 타일 이미지에서 부착된 스페로이드의 수를 정량화합니다. 스페로이드 수가 다른 실험보다 통계적으로 현저히 낮은 경우 실험을 반복해야 한다.
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Representative Results
유방 상피 세포는 매트릭스 용액과 2 % 매트릭스 용액을 가진 배양 배지에서 5-8 일 간의 배양 후 3D 스페로이드로 자가 구성해야합니다. 비종양 MCF10A 유방 상피 스페로이드는 둥근 나타나고 속이 빈 중심을 가져야 하며, 인테그린 α6는 스페로이드의 바깥쪽 가장자리로 편광되어야한다(도 1,중공 센터는 빈 중심을 나타낸다). 고도로 침습적인 MDA-MB-231 유방암 상피 세포는 불규칙한 스페로이드를 형성합니다. 스페로이드는 직경 이 약 100 ~ 300 μm일 때 사용해야 합니다. 스페로이드가 너무 커지고 가까이 가면 스페로이드가 함께 결합되어 메가스페로이드를 형성합니다. 또한, MDA-MB-231 유방 상피 스페로이드는 너무 오랫동안 트리겔 배양에서 유지되는 경우 스페로이드에서 이동하는 세포를 보여줄 수 있다.
HUVEC는 6-8시간의 희소하고 세럼이 없는 문화를 겪은 후 튜브와 같은 네트워크로 자체 구성해야 합니다. 샘플에는 1-3 셀의 선이 병렬로 형성되는 연결이 있는 다세포 노드가 있습니다. HUVEC 네트워크는 세포 추적기 및 Hoescht(그림 2)로레이블이 붙은 경우 위상 대비 현미경 검사또는 공초점 현미경 검사법에 의해 이미지될 수 있습니다. ImageJ 혈관 신생 분석기는 네트워크 접합, 세그먼트 및 분기를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. HUVEC 네트워크는 16 시간 이상 혈청없는 매체에 남아있는 경우 사망합니다.
유방 상피 스페로이드가 HUVEC 네트워크에 생체 인쇄될 때, 스페로이드와 네트워크 둘 다 적어도 24 시간 동안 그들의 원래 형태를 유지해야 합니다. MCF10A 유방 상피 스페로이드는 내피 네트워크에 직접 부착되는 둥근 물체로 나타나며, MDA-MB-231 유방 상피 스페로이드는 더 비정질이 아직 부착되거나 내피 네트워크에 근접하게나타납니다(그림 3). HUVEC 네트워크는 유방 상피 스페로이드와 공동 배양 할 때 유지됩니다. 24시간 이상 공동 배양을 위해 유방 상피 세포는 스페로이드에서 나와 내피 네트워크를 따라 이동할 수 있다. 우리의 경험에서, 이것은 비 종양성 유방 상피 세포 보다는 오히려 종양성에서 일찌기 일어납니다38. 앞서 스페로이드 바이오프린팅 후 2시간 일찍 약물 검사를 시작할 수 있는 바이오프린팅 공동 배양을 사용하여 내피네트워크(45)에스페로이드 부착을 테스트하는 것을 시연했다. 우리는 또한 3D 유방 스페로이드가 개별 세포로 인쇄될 때보다 파클리탁셀과 같은 항암제에 더 저항성이 있는 것으로나타났습니다(41,45). 생체 인쇄 구체가없는 경우 HUVEC 네트워크 제어 우물은 네트워크 형태를 보유하지 못하고 16 시간 후에 죽지 못합니다.
그림 1: 유방 상피 스페로이드의 대표적인 공초점 현미경 심상. MCF10A 스페로이드는 인테그린 α6(녹색) 및 핵(blue)을 위해 표지되었다. 세포 표현형은 스페로이드가 중공 센터(inset)로 둥글게 나타나고 외부 가장자리에서 통합된 통합된 α6를 가질 때 생체 인쇄 후 확인할 수 있다. MDA-MB-231 스페로이드는 액틴(green) 및 핵(blue)을 위해 표지되었다. 세포 표현형은 스페로이드가 중공 센터 없이 불규칙하게 형성되고 주변 매트릭스로 침입하는 세포 공정을 가질 때 확인할 수 있다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 위상 대비 및 공초점 현미경 검사법에 의한 HUVEC 네트워크의 대표적인 이미지. HUVEC 네트워크는 노드를 연결하는 셀 줄이 있는 작은 다세포 노드로 나타납니다. 공초점 현미경 검사법의 경우, 세포는 핵(blue)을 위한 세포 추적기 레드 및 Hoescht로 표지되었다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HUVEC 네트워크와 공동 배양된 유방 상피 스페로이드의 대표적인 이미지. MCF10A 스페로이드는 인테그린 α6(녹색) 및 핵(blue)에 표지되어 원형으로 유지되고 내피 네트워크에 직접 부착된 것처럼 보입니다. ACTin (녹색) 및 핵 (파란색)에 레이블이 있는 MDA-MB-231 스페로이드는 비정질이 나타나지만 내피 네트워크에 가깝게 남아 있습니다. 공동 배양은 생체 인쇄 후 적어도 24 시간 동안이 형태를 유지하며, 그 후 유방 세포는 내피 튜브를 따라 이주 할 수 있습니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 3D 아키텍처에서도 내피 세포와 공동 배양을 위한 3D 아키텍처에서 바이오 프린트 스페로이드를 바이오프린트하는 최초의 프로토콜입니다. 중요한 프로토콜 단계는 유방 상피 스페로이드 및 HUVEC 네트워크의 초기 형성을 포함합니다. 그들은 쉽게 매트릭스 솔루션에서 중단으로, 유방 상피 스페로이드를 공급에 극단적 인주의를 취해야한다. 마찬가지로, 유방 상피 스페로이드는 매트릭스 용액에서 파이프를 벗겨 네트워크에 혼합할 때 주의를 기울여 처리해야합니다. HUVEC 네트워크는 밀도가 너무 높게 도금되거나 16시간 이상 방치되어서는 안 되며, 이는 각각 단층층또는 정지를 형성하기 때문에 됩니다. 마지막으로, 모든 바이오프린팅은 세포 생존가능성을 극대화하기 위해 37°C의 멸균 환경에서 발생해야 합니다.
유방 상피 스페로이드는 알기네이트와 알기네이트 콜라겐 블렌드를 포함하여 Matrigel 외에 다양한 바이오 잉크로 생체 인쇄될 수 있습니다. 우리는 스페로이드가 가능하다는 것을 보여주었고 alginate 기반 바이오 잉크(41)에인쇄 할 때 자신의 형태를 유지했다. 따라서 우리는 매트릭스 솔루션 기반 바이오 잉크에 여기에 바이오 프린팅을 제시하는 동안, 다른 저렴하고 쉽게 바이오 잉크를 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 유사한 성공을 가진 MCF-7 및 유전자 변형 MCF10A-NeuN 세포를 포함하여 그밖 유방암 세포주를38,41,45를 이용했습니다. 대체 수단은 또한 유방 상피 스페로이드를 만드는 데 사용될 수 있었습니다. 예를 들어, Lee 외는 PDMS 스탬프를 사용하여 생산된 하이드로겔 마이크로웰 어레이를 사용하여 제어된 크기46의균일한 크기의 스페로이드를 생성했습니다. 마지막으로, 종양 유래 내피 세포와 같은 대체 내피 세포를 사용할 수 있고, HUVEC 네트워크를 형성하기보다는, 지방 조직 유래 마이크로혈관은 3D 혈관구조(47)로직접 생질될 수 있다.
이 방법의 주요 제한은 생체 인쇄 스페로이드 위치와 번호를 제어하는 도전이었다. 스페로이드는 비교적 큰 노즐과 스페로이드 손상을 방지하기 위해 내장 된 유체로 인쇄되어야했습니다. 빠르게 젤링 바이오잉크는 스페로이드 위치를 더 잘 제어할 수 있습니다. 스페로이드는 또한 바이오잉크에 계산될 수 없었는데, 그 이유는 세포 카운터에 너무 컸기 때문에. 우리는 대신 트리겔 표면에서 스페이팅 스페로이드를 피펫하기 전에 촬영 한 위상 대비 이미지에서 파생 된 스페로이드 수에 의존했다. 스페로이드를 형성하는 대체 수단은 그들의 수와 크기를 더 잘 제어할 수 있었습니다. 우리는 세포 스트레이너를 사용하고 매번 동일한 방식으로 구체형을 배양하여 적당한 정확도로 스페로이드 수와 크기를 제어 할 수있었습니다. 최종 제한은 유방 상피 세포가 스페로이드에서 그리고 시간이 지남에 따라 내피 네트워크를 따라 이동하는 것입니다. 대체 바이오잉크가 이러한 한계를 부정할 수 있습니다.
사전 형성된 HUVEC 네트워크에서 유방 상피 스페로이드의 직접 생체 인쇄는 짧은 시간에 체외 종양 공동 배양 모델의 3D생성을 가능하게 한다. 연구원은 그 때 더 높은 처리량을 가진 스페로이드와 혈관 사이 상호 작용을 급속하게 검토할 수 있습니다. 미래에, 유방 상피 스페로이드는 유동 효력의 연구를 허용할 수 있는 perfused된 혈관에 bio인쇄될 수 있었습니다. 또한, 종양 유래 오르가노이드 및 내피 세포는 환자 특이적 모델에서 약물 효능 테스트를 통해 정밀 의학을 가능하게 하기 위해 생체 인쇄될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NiH 1R01HL140239-01에 의해 AMC에 투자되었습니다. 드렉셀 대학의 세포 이미징 센터에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity | Sanyo | MCO-20AIC | Cell incubation |
| 3D Bio printer | custom-made | None | Used for bioprinting |
| 8-well chamber slides | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | for seeding spheroids |
| 25-gauge needle | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | bioprinting syringe needle |
| Absolute ethanol (200 proof ) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | reconsitution of media components |
| Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | secondary block - Immunofluorescence |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday antibody-Immunofluorescence |
| Bovine insulin | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Media additive |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Blocking agent -Immunofluorescence |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Remove large or clustered spheroids |
| CellTracker™ Red CMTPX Dye | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | pre-stain for HUVEC tubes |
| Compact Centrifuge | Hermle- Labnet, Edison ,NJ | Z206A | For cell centrifugations |
| Cholera Toxin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Media additive |
| Conical tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Collecting and resuspending cells |
| Countess II-FL Cell counter | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | counting cells |
| Glass pipettes (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | cell resuspension |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A basal media |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 basal media |
| Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC basal media |
| Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors) |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Labelling MDA-MB-231 spheroids | |
| Fetal Bovine serum | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 media additive |
| Goat serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | Immunofluorescence labelling component |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | immunofluorescence buffer component |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Nuclei stain immunofluorescence |
| Horse Serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Media additive |
| Hydrocortisone | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Media additive |
| Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) | Cell applications, San Diego , CA | 200-05f | Endothelial cell lines |
| Integrin α6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Immunofluorescence spheroid labelling component |
| Live Dead assay | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| LSM 700 Confocal microscope | Zeiss, Thornwood, NY | Used to visualize cells | |
| Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Spheroid formation |
| MCF10A cells | ATCC | CRL-10317 | Breast cell line |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | HTB-26 | Breast cell line |
| Paraformaldehyde | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | cell fixative |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive |
| Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Wash buffer for cells before trypsinization |
| Phosphate buffer saline 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | immunofluorescence buffer component |
| Prolong gold antifade | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | immunofluorescence mountant medium |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ assay media component |
| Sodium Azide | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | immunofluorescence buffer component |
| Sterile syringe (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | bioprinting process |
| Tissue culture dish (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | monolayer cell culture |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | immunofluorescence buffer component |
| Trypan blue 0.4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | cell counter additive |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | cell detachment |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | immunofluorescence buffer component |
| Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC tube additive |
| Volocity 6.3 cell imaging software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z stack compresser |
References
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