Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الطباعة الحيوية المباشرة لـ 3D Multicellular الثدي Spheroids على الشبكات السفحلية

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61791
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biology, Drexel University, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو مباشرة بيولوجيا خلايا الثدي الظهارية كما الزاوي المتعددة الخلايا على شبكات البطانية شكلت قبل لإنشاء بسرعة 3D الثدي endothelial نماذج الثقافة المشتركة التي يمكن استخدامها لدراسات فحص المخدرات.

Abstract

تظهر الطباعة البيولوجية كأداة واعدة لاختلاق نماذج سرطان الإنسان ثلاثية الأبعاد التي تختبأ بشكل أفضل السمات المميزة الحرجة في هندسة الأنسجة الحية. في طبقة الحالية طبقة بطباعة بيولوجية، يتم بثق الخلايا الفردية في bioink جنبا إلى جنب مع الإشارات المكانية والزمانية المعقدة لتعزيز الأنسجة الهرمية التجميع الذاتي. ومع ذلك، تعتمد تقنية المعالجة البيولوجية هذه على التفاعلات المعقدة بين الخلايا والبيوinkز والإشارات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية. وهكذا، قد يستغرق التجميع الذاتي أيامًا أو حتى أسابيع، وقد يتطلب وجود بيوينكس معينًا، وقد لا يحدث دائمًا عندما يكون هناك أكثر من نوع خلية واحد. لذلك قمنا بتطوير تقنية لطباعة مباشرة بيولوجى قبل تشكيل 3D ظهارة الثدي الظهارية في مجموعة متنوعة من bioinks. Bioprinted قبل تشكيلها 3D ظهارة الثدي الظهارية 19999 19909 الحفاظ على حيوية والهندسة المعمارية المستقطبة بعد الطباعة. بالإضافة إلى ذلك قمنا بطباعة الـ 3D spheroids على شبكات الخلايا البطانية الوعائية لإنشاء نموذج مشترك للثقافة. وهكذا، فإن تقنية الطباعة البيولوجية الجديدة تخلق بسرعة نموذج الثدي البشري ثلاثي الأبعاد ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية بتكلفة أقل وبمرونة أعلى من تقنيات الطباعة البيولوجية التقليدية. ويمكن استقراء هذه التقنية متعددة الاستعمالات البيولوجية لإنشاء نماذج 3D من الأنسجة الأخرى في bioinks إضافية.

Introduction

3D في النماذج في المختبر الأوعية الدموية هي أدوات أساسية للدراسة الميكانيكية لنمو السرطان والانبثاث. لسرطان الثدي على وجه الخصوص، خلايا الثدي الظهارية المستزرعة في Matrigel تنظيم في spheroids المستقطبة التي تشبه بشكل أوثق في في هندسة الأمومة في1،2،3،4،5،6،7،8. 3D الثدي ظهارية الخلية الثقافة يؤثر أيضا على وظيفة الخلية, مع الثقافات 3D تظهر الاختلافات في عامل النمو البشرة (EGF) مستقبلات التشكيل8,9; وظيفة oncogene، بما في ذلك ErbB210؛ النمو و المبرمجات signaling11,12; و علاج كيميائي المقاومة13,14. الخلايا البطانية الوعائية بالمثل تستجيب بشكل مختلف للمحفزات البيئية في 3D مقابل الثقافة التقليدية 2D15,16,17,18. ومع ذلك ، فإن الكثير من فهم التفاعلات الظهارية البطانية والثدي تأتي من 2D باستخدام المتوسطة أو إدراج ترانسويل ، أو نماذج ثلاثية الأبعاد التي يتم فصلها في نوعين من الخلايا جسديا19،20،21،22،23. هذه النماذج المشتركة في الثقافة توفر رؤية فسيولوجية محدودة، منذ كل من الثقافة 3D والاتصال الخلية هي حاسمة لالأوعية البطانية – الثدي التفاعلات خلية الظهارية24,25,26.

وقد تم تصنيع نماذج السرطان 3D باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات، بما في ذلك شنقا قطرة تشكيل spheroid، والطباعة الحيوية، والتجمع المغناطيسي، والثقافة داخل الهيدروجيل أو على السقالات هندسيا5،27،28،29. في الآونة الأخيرة، تم إنشاء نماذج الورم 3D مع أنواع الخلايا المتعددة مرتبة في هياكلها 3D. في مثال واحد من منصة ورم على رقاقة، السرطان، البطانية، والخلايا السترومال اختلطت في مصفوفة ومن ثم حقنها في غرف الأنسجة المركزية الثلاث في جهاز بوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS). كانت غرف الأنسجة تحدها قناتان خارجيتان تمثلان شريانًا وناجولًا. بعد 5-7 أيام من الثقافة، شكلت الخلايا البطانية شبكة الأوعية الدموية الدقيقة وتكاثرت الخلايا السرطانية لتشكيل أورام صغيرة بالقرب من الأوعية الدموية. ثم تم استخدام هذه المنصة لفحص المخدرات وتركيبات المخدرات30. وقد تم إنشاء منصات إضافية للورم على رقاقة لدراسة الانبثاث وأنواع السرطان مع المحفزات الميكانيكية محددة (على سبيل المثال، سلالة ميكانيكية في الرئة)31،32. ومع ذلك، فإن هذه المنصات عموما لا تشمل كلا من الأوعية الدموية والسرطان في هياكلها 3D.

يظهر Biofabrication وعدًا كبيرًا في تقدم نماذج الأورام ثلاثية الأبعاد في الأوعية الدموية ، لأنها تمكن من التحكم المكاني المحكم في موقع الخلية. على الرغم من نمو الطباعة البيولوجية على مدى العقد الماضي، تركز دراسات قليلة على الأورامتحديدا 33،34. في أحد الأمثلة، تم استخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد لخلايا HeLa في هيدروجيل الجيلاتين/ألجينات/الفيبرينوجين لإنشاء نموذج لسرطان عنق الرحم في المختبر. كانت الخلايا السرطانية مطبوعة بيولوجياً كخلايا فردية ثم سمح لها بتشكيل spheroids ، والتي أظهرت معدل انتشار أعلى ، وزيادة تعبير مصفوفة metalloproteinase ، وsemoresistance أعلى من الخلايا في ثقافة 2D35. في هذه الدراسات، كما في كثير من الآخرين36،37، تم طباعة التعليقات الخلية المنفصلة بيولوجيا، ومن ثم تم تزويد الثقافات الخلية مع العظة الميكانيكية والبيوكيميائية اللازمة لتمكين الخلايا لتشكيل هيكل 3D. ومع ذلك، قد يستغرق التجميع الذاتي الخلوي أيامًا أو أسابيع، وقد يتطلب إشارات بيئية مكانية وزمنية معقدة، أو قد لا يحدث عندما يكون نوعان من الخلايا مُزَمَّقَين. على سبيل المثال، خلايا الثدي الظهارية الناجمة موت الخلايا في الخلايا البطانية في 2D المشتركة في الثقافة، والخلايا الظهارية الثدي تفكك لم تشكل 3D spheroids عندما مطبوعة بيولوجيا في الهيدروجين / الجيلاتينhydrogels 38. فصل الثدي الظهارية أو الخلايا السرطانية شكلت spheroids في bioinks alginate القائمة فقط عندما تتشابك في قوالب PDMS دائرية. في حالات أخرى، تم تشكيل spheroids باستخدام قطرات معلقة في مرفق منخفضة جدا لوحات الآبار الدائرية ثم مختلطة في bioinks alginate القائمة39،40.

نحن الآن وصف بديل 3D الأنسجة البيولوجية طريقة في هذا البروتوكول. بدلا من البذور تفكك الخلايا والانتظار لهذه الخلايا لتشكيل هياكل 3D، ونحن وصف كيفية إنشاء و bioprint 3D الورم spheroids على شبكة أنبوب الأوعية الدموية لإنشاء نموذج الورم الثقافة المشتركة التي يمكن استخدامها على الفور تقريبا. يمكن زراعة الوريث الورمي في المختبر أو مشتق من الأنسجة البشرية (العضويات). وبالمثل، يمكن زراعة أنابيب الأوعية الدموية أو يمكن أن تستمد من شظايا الأنسجة الدهنية الدقيقة الأوعية الدموية. يمكن أن تتراوح Bioinks من ألجينات غير نشطة بيولوجيا إلى ماتريجل41نشطة بيولوجيا للغاية . منذ هذا الورم 3D المشتركة في الثقافة نموذج يمكن إنشاؤها مع مجموعة متنوعة من هياكل الخلايا وbioinks، فإنه يمكن أن تتضمن أنواع الخلايا المتعددة، المصفوفات خارج الخلية، وتدرجات chemokine15،42. وفي حين أنه لا يمكن في صياغته الحالية أن تكون شبكات البطانية مُطعّمة، فإن التكرارات المستقبلية يمكن أن تدمج هذه الطريقة مع أنظمة الـ microfluids أو الأنظمة على الشريحة. Bioprinting 3D ظهارة الثدي الظهارية على شبكات الضمان تمكن biofabrication السريع من نماذج الثدي البشري لاختبار المخدرات و الطب الدقيق شخصية27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الثدي نمو الخلايا الظهارية وملايس وسائل الإعلام

  1. خلايا الظهارية MCF10A
    ملاحظة: غير ورم خلد الثدي خلد خط الخلية الظهارية مشتق من المريض مع مرض فيزيائية43. الخلايا لا تعبر عن مستقبلات هرمون الاستروجين.
    1. لإعداد 20 ميكروغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF), قم بحل 100 ميكروغرام من EGF التحلل في 500 ميكرولتر من dH2O العقيمة لجعل 200 ميكروغرام / مل EGF. إضافة 500 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل EGF في 4.5 مل من العقيمة 0.1٪ BSA في dH2O لجعل 20 ميكروغرام / مل EGF حل الأسهم. مخزن أعد 20 ميكروغرام / مل EGF aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
    2. لتحضير 500 ميكروغرام/مل هيدروكورتيزون، تخفيف 1 ملغ من الهيدروكورتيزون في 1 مل من الإيثانول المطلق (200 دليل). إضافة 1 مل من DMEM العقيمة F:12 إلى هذا الخليط لجعل 500 ميكروغرام / مل محلول الأسهم الهيدروكورتيزون. تخزين ال aliquots مخزون الهيدروكورتيزون في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
    3. لإعداد 10 ميكروغرام / مل سم الكوليرا، حل 1 ملغ من مسحوق الكوليرا السمي في 1 مل من dHالعقيمة 2O لجعل 1 ملغم / مل الكوليرا السموم حل الأسهم. تخزين الكوليرا الأسهم السموم aliquots في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
    4. لإعداد متوسط النمو، إضافة 500 ميكرولتر من EGF (20 ميكروغرام / مل)، 500 ميكرولتر من الهيدروكورتيزون (500 ميكروغرام / مل)، 5 ميكرولتر من سم الكوليرا (1 ملغ / مل)، 500 ميكرولتر من الأنسولين البقري (10 ملغ / مل)، 10 مل من البنسلين والstreptomycin، و 25 مل من مصل الخيل إلى 500 مل من DMEM F:12 لتركيز نهائي من 20 نانوغرام / مل EGF، 500 نانوغرام / مل هيدروكورتيزون، 10 نانوغرام / مل سم الكوليرا، 10 نانوغرام / مل من الأنسولين البقري، 2٪ v / v البنسلين وstreptomycin، و 5٪ v / v مصل الخيل. وزاد تركيز المضادات الحيوية إلى 2 في المائة لمراعاة انخفاض العقم في عملية الطباعة البيولوجية؛ ومع ذلك، يمكن خفض تركيز المضادات الحيوية إلى 1٪.
    5. لإعداد Assay Medium، أضف 500 ميكرولتر من الهيدروكورتيزون (500 ميكروغرام/مل)، 5 ميكرولتر من سم الكوليرا (1 ملغ/مل)، 500 ميكرولتر من الأنسولين البقري (10 ملغم/مل)، 10 مل من البنسلين والستربتوميسين، و 25 مل من مصل الخيل إلى 500 مل من DMEM F:12 لتركيز نهائي من 500 نانوغرام / مل هيدروكورتيزون، 10 نانوغرام / مل سم الكوليرا، 10 نانوغرام / مل من الأنسولين البقري، 2٪ v / v البنسلين وstreptomycin، و 5٪ الخامس / الخامس مصل الخيل.
  2. MDA-MB-231
    ملاحظة: ثلاثية السلبية (تفتقر إلى مستقبلات هرمون الاستروجين، مستقبلات البروجسترون، ومستقبلات عامل النمو الجلدي 2) سرطان الثدي خط الخلية الظهارية يتم إنشاؤه من الانصباب الجنبي للمريضة مع الثدييات النقيلي44. تمثل الخلايا سرطان الثدي العدواني، الغازية، وضعف التمييز.
    1. لإعداد النمو والمدس المتوسطة، إضافة 50 مل من مصل البقر الجنين، 10 مل من البنسلين وstreptomycin، و 25 مل من مصل الخيل إلى 500 مل من DMEM لتركيز النهائي 10٪ v / v مصل البقر الجنين، 2٪ الخامس / الخامس البنسلين وstreptomycin، و 5٪ الخامس / الخامس مصل الخيل.

2. الثدي الظهارية الخلية ثقافة

  1. بذور 500،000 MCF10A أو MDA-MB-231 الخلايا في 10 سم (P100) طبق زراعة الأنسجة مع 10 مل من MCF10A أو MDA-MB-231 وسائل الإعلام النمو. تصل خلايا MCF10A و MDA-MB-231 إلى >90٪ في التقاء 48 ساعة.
  2. لتمرير الخلايا الظهارية الثدي، وغسل الخلايا الأولى مع 10 مل من برنامج تلفزيوني دافئ.
  3. فصل خلايا الثدي الظهارية بإضافة 2 مل من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى الطبق. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 20-25 دقيقة.
  4. إضافة 5 مل من MCF10A أو MDA-MB-231 متوسطة النمو إلى الخلايا التربسينيف لتحييد التربسين. Pipette الخلية وسائل الإعلام الخليط صعودا وهبوطا إلى خلايا resuspend وتفتيت مجموعات الخلايا.
  5. إضافة تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وطاردة مركزية في 1200 x ز لمدة 3 دقائق. التعرق بعناية وsususpend بيليه الخلية في 5 مل من MCF10A أو MDA-MB-231 متوسطة النمو.
  6. لوحة 1 مل من تعليق الخلية في 5 جديد 10 سم أطباق زراعة الأنسجة جنبا إلى جنب مع MCF10A أو MDA-MB-231 متوسطة النمو. ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. الخلايا ستكون جاهزة للمرور مرة أخرى في 2-3 أيام. يمكن الحفاظ على خلايا MCF10A إلى رقم مرور 35 ، وبعد ذلك تظهر التغيرات المورفولوجية. يمكن الحفاظ على خلايا MDA-MB-231 إلى رقم 24، وبعد ذلك تظهر التغيرات المورفولوجية.

3. الثدي تكوين الظهارية

  1. تجميد 200 μL نصائح ماصة لمدة 30 دقيقة قبل بدء الفحص. الحفاظ على عامل النمو حل مصفوفة مخفضة (على سبيل المثال، Matrigel) (10 ملغ / مل) على الجليد لكامل العملية.
  2. ببطء ماصة 30 ميكرولتر من الجليد الباردة حل المصفوفة باستخدام الجليد الباردة 200 μL نصائح ماصة في كل بئر من شريحة غرفة 8-جيدا. تبدأ من الجانبين واسحب تلميح ماصة على طول الزوايا، مضيفا قطرة النهائي إلى وسط البئر لضمان طلاء حتى من كل بئر. تجنب فقاعات الهواء خلال هذه الخطوة لضمان طبقة حل مصفوفة موحدة. استخدام نصائح جديدة الماصات لكل بئر.
  3. منزلقات غرفة احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة لمدة 15-20 دقيقة البلمرة حل المصفوفة.
  4. resuspend تريبسسيند MCF10A الخلايا في MCF10A Assay المتوسطة في 200،000 الخلايا / مل أو resuspend تبسيند MDA- MB-231 الخلايا في MDA-MB-231 متوسط النمو في 200،000 الخلايا / مل.
  5. إذا كان استخدام خلايا MCF10A، إعداد جديدة MCF10A Spheroid متوسط النمو عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من EGF (20 ميكروغرام / مل) و 100 ميكرولتر من مصفوفة الحل إلى 5 مل من Assay المتوسطة لتركيز النهائي من 2٪ مصفوفة الحل.
  6. إزالة شريحة الغرفة مُطفّلة مع حل المصفوفة من الحاضنة. أضف 50 ميكرولتر من MF10A أو MDA-MB-231 خلية تعليق (10,000 خلية) إلى كل بئر. في حالة استخدام خلايا MCF10A، أضف 450 ميكرولتر من MCF10A Spheroid Growth Medium. إذا كان استخدام خلايا MDA-MB-231، أضف 450 ميكرولتر من MDA-MB-231 Growth Medium مُزَوَّل مُسبقًا مع محلول مصفوفة 2٪ (9 ميكرولتر). مكان فوري الشريحة الغرفة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة.
  7. استبدال المتوسطة كل 4 أربعة أيام. بعناية ماصة 200 μL من وسائل الإعلام القديمة من زاوية واحدة من كل بئر باستخدام 200 ميكرولتر ماصة تلميح. أثناء هذه العملية، إمالة الشريحة الغرفة في 45 درجة للتأكد من أن لا يتم إزعاج الـ spheroids. إضافة 200 μL من إعداد حديثا MCF10A Spheroid متوسط النمو أو MDA-MB-231 متوسط النمو مختلطة سابقا مع 2٪ حل مصفوفة لكل بئر في الزاوية في قطرات لضمان أن تظل الزاويين تعلق على طبقة المصفوفة. يتم استبدال فقط ~ 50 ٪ من وسائل الإعلام بحيث لا يتم استنفاد جميع السيتوكينات التي تنتجها spheroids تماما.
    ملاحظة: MCF10A الظهارية الثدي الظهارية ظهارية يستغرق ما يصل إلى 8 أيام لاستقطاب وتشكيل مراكز جوفاء. MDA-MB-231 ظهار الثدي الظهارية 5 أيام يستغرق ما يصل إلى تشكيل وليس لديهم مراكز جوفاء.

4. تشكيل شبكة الخلايا endothelial

  1. ثقافة الخلية الوريدة الوريدية (HUVEC)
    1. إضافة محتويات واحدة Endothelial النمو متوسط 2 مجموعة تحتوي على عامل نمو الانسولين، عامل النمو الليفي، عامل النمو البطانية الوعائية، حمض الاسكوربيك، عامل نمو البشرة، الهيبارين وجنتاميسين-أمبروترين B، جنبا إلى جنب مع 50 مل من مصل الأبقار الجنين، 5 مل البنسلين-الستربتوميسين و5 مل من 200 مل الجلوتامين إلى 500 مل من Endothelial Basal متوسط-2 (EBM-2) لإنشاء كامل Endothelial النمو المتوسط (EGM-2).
    2. بذور 500،000 الخلايا البطانية في طبق ثقافة الأنسجة 10 سم في 10 مل من EGM-2. وضع الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة حتى تصل إلى> 80٪ التقاء (حوالي 48 ساعة).
    3. إلى الخلايا الممر، وغسل الخلايا البطانية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني دافئ. فصل HUVEC بإضافة 2 مل من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى طبق زراعة الأنسجة 10 سم. مراقبة الخلايا عن كثب عن طريق المجهر النقيض المرحلة. الخلايا جاهزة عندما يتم ّ ّ ّ ّ ّ ّ ّ ّ ّ ّ ّ اِلتِها، لكن تبقى مُلتصقة بالطبق.
    4. التعرق بعناية التربسين من الطبق. أضف 8 مل من EGM-2 إلى الطبق. غسل الخلايا قبالة الطبق عن طريق الأنابيب وEGM-2 صعودا وهبوطا على سطح الطبق بأكمله.
    5. بدلا من ذلك، إضافة 5 مل من EGM-2 إلى الخلايا التربسينized لتحييد التربسين. Pipette الخلية وسائل الإعلام الخليط صعودا وهبوطا إلى خلايا resuspend وتفتيت مجموعات الخلايا. إضافة تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وطاردة مركزية في 1200 x ز لمدة 3 دقائق. التعرق بعناية على افرا و resuspend بيليه الخلية في 10 مل من EGM-2.
    6. أضف 1 مل من تعليق الخلايا إلى 9 مل من EGM-2 في طبق زراعة الأنسجة 10 سم. ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. تبادل 2/3 من المتوسط مع جديد EGM-2 كل 2 أيام. الخلايا ستكون جاهزة للمرور في 3-5 أيام. ويمكن الحفاظ على HUVEC حتى مرور 8 بعد ذلك أنها تفشل في تشكيل الشبكات.
  2. تشكيل الشبكة الخلوية (HUVEC)
  3. تجميد 200 μL نصائح ماصة لمدة 30 دقيقة قبل بدء الفحص. الحفاظ على عامل النمو حل مصفوفة مخفضة (10 ملغ / مل) على الجليد للعملية برمتها.
  4. ببطء ماصة 30 ميكرولتر من الجليد الباردة حل المصفوفة باستخدام الجليد الباردة 200 μL نصائح ماصة في كل بئر من شريحة غرفة 8-جيدا. تبدأ من الجانبين واسحب تلميح ماصة على طول الزوايا، مضيفا قطرة النهائي إلى وسط البئر لضمان طلاء حتى من كل بئر. تجنب فقاعات الهواء خلال هذه الخطوة لضمان طبقة حل مصفوفة موحدة. استخدام نصائح جديدة الماصات لكل بئر.
  5. منزلقات غرفة احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة لمدة 15-20 دقيقة لبليمرة Matrigel.
    1. ما قبل وصمة عار طبق 10 سم من HUVEC مع 10 ميكرولتر من تعقب الخلايا الحمراء (1:1000) لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة.
    2. غسل الخلايا البطانية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني دافئ. فصل HUVEC بإضافة 2 مل من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى طبق زراعة الأنسجة 10 سم. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا بالكامل.
    3. إضافة 5 مل من EGM-2 إلى الطبق لتحييد التربسين. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 25 مل. جهاز طرد مركزي HUVEC في 1200 x ز لمدة 5 دقائق. التعرق وssuspend بيليه الخلية في 5 مل من المصل خالية EBM-2.
    4. عد الخلايا باستخدام Trypan الأزرق لتحديد الخلايا القابلة للحياة. إنشاء 1 × 106 خلية / مل الحل.
    5. إضافة 100،000 HUVEC إلى كل بئر مع 200 ميكرولتر من مصل خال EBM-2. إذا تم إضافة المزيد من الخلايا، فإنها سوف تخلق سطح أحادية الطبقات بدلا من شبكة أنبوب.
    6. احتضان HUVEC في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. بعد 6 ساعات، شبكات HUVEC الصورة عن طريق المجهر النقيض المرحلة. الشبكات جاهزة الآن لزراعة تربية النخاع مع ثدي.

5. bioprinting الثدي الظهارية spheroids على شبكات HUVEC شكلت مسبقا

ملاحظة: ينبغي استخدام نظام ترسب أحيائي مزدوج الفوهة لعملية المعالجة البيولوجية. في هذه الحالة، كان لدى النظام ثلاثة أذرع للحركة للسماح بالتحكم المكاني على نطاق ميكرون في ترسب المواد بالإضافة إلى محركين مُحركين من أجل إيداع بيوينك من 10 مَقنَنَعٍ 10 مل. وينبغي أن يكون هذا النظام وظيفيا مع نظام تصفية الهواء الجسيمات عالية الكفاءة، فضلا عن قدرات الأشعة فوق البنفسجية التعقيم للحفاظ على بيئة معقمة أثناء الطباعة الحيوية. الطابعة الحيوية هي الأشعة فوق البنفسجية تعقيم لمدة ساعة قبل عملية الطباعة.

  1. إنشاء ظهارة الثدي الظهارية وشبكات HUVEC كما هو موضح سابقا. تقدير عدد الظهارية الثدي spheroids في كل بئر عن طريق عد الزفيرويدات في مرحلة تمثيلية على النقيض صور المجهر.
  2. قطع 0.5 سم قبالة نهاية 1000 ميكرولتر ماصة تلميح. استخدام تلميح قطع ماصة إلى ماص بعناية جميع spheroids من الشريحة غرفة 8-جيدا وإلى أنبوب 50 مل. فسوسيبند spheroids في bioink المحدد في 100 spheroids /100 μL.
    ملاحظة: قد يؤدي تركيزات الزفير الأعلى في تجميع spheroid ومنع التصور من التفاعلات بين spheroids والشبكات البطانية.
  3. تمرير الخليط من خلال مصفاة الخلايا 70 ميكرومتر لإزالة أي الزفيرويدات الكبيرة أو متفاوتة المسافات.
  4. قم بتحميل الـ spheroids المجمعة في حقنة معقمه 10 مل و اِكدها بإبرة معقمه قياس 25 قياساً. ربط الحقنة بنظام الترسيب الحيوي.
  5. التعرق الوسيط قبالة شبكات HUVEC في الشريحة غرفة 8-جيدا.
  6. قذف 100 ميكرولتر من الظهارات الثدي على 6 آبار من شبكات HUVEC بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة. الحفاظ على بئرين من شبكات HUVEC كضوابط.
  7. إضافة 400 μL من MCF10A Spheroid متوسط النمو إذا كان استخدام SPHEROIDs MCF10A المطبوعة على شبكات HUVEC أو إضافة 400 ميكرولتر MDA-MB-231 متوسط النمو مختلطة سابقا مع 2٪ حل مصفوفة إذا كان يستخدم MDA-MB-231 spheroids المطبوعة على شبكات HUVEC. وينبغي استخدام وسيلة النمو ذات الزفيرة في آبار التحكم في HUVEC.
  8. احتضان الثقافات المشتركة في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة لمدة 24 - 96 ساعة دون تغيير وسائل الإعلام. وستظل الثقافات المشتركة قابلة للحياة في الوسط الأصلي لمدة تصل إلى أربعة أيام.

6. المجهر الكونكوكل

  1. Immunofluorescence وPBS-جلايسين تحضير العازلة
    1. إعداد Immunofluorescence (IF) العازلة 10x حل المخزون بإضافة 2.5 غرام من أزيميد الصوديوم، 5 غرام من الألبومين مصل الأبقار، 10 مل من تريتون X-100، و 2.05 مل من توين-20 في 500 مل من برنامج تلفزيوني 10x. ضبط درجة اله إلى 7.4. تخزين المحلل المخزون لمدة تصل إلى عام في 4 درجة مئوية لتجنب الترسب.
    2. إنشاء عازلة IF العمل عن طريق تمييع 50 مل من 10x IF العازلة في 450 مل من المياه المعقمة deionized. قم بتخزين حل العمل في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
    3. إعداد 10x PBS-Glycine محلول المخزون الاحتياطي بإضافة 37.5 غرام من الجليسين إلى 500 مل من برنامج تلفزيوني 10x. ضبط درجة اله إلى 7.4. تخزين المحلل المخزون لمدة تصل إلى 6 أشهر في 4 درجة مئوية لتجنب الترسب.
    4. إنشاء العمل برنامج تلفزيوني-جليكاين حل عن طريق تخفيف 50 مل من 10x PBS-الجليسين العازلة في 450 مل من المياه المعقمة deionized. تخزين حل العمل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  2. تسمية عينات مطبوعة بيولوجيا والصورة عن طريق المجهر Confocal
    1. متوسطة من الاستزراع المشترك ثلاثي الأبعاد المطبوعة بيولوجيًا وشطف 3 مرات مع PBS الدافئ. إصلاح الثقافات المشتركة ثلاثية الأبعاد المطبوعة بيولوجيًا مع 4٪ من الـ paraformaldehyde لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. شطف العينات 3 مرات لمدة 20 دقيقة مع 1X PBS-جليسين.
    2. عينات كتلة مع عازلة IF مختلطة مع مصل الماعز 10٪ لمدة 90 دقيقة (كتلة الأولية)، تليها 40 دقيقة مع IF العازلة بالإضافة إلى مصل الماعز 10٪ و أفينيبور فاب جزء (1:100، كتلة الثانوية).
    3. إذا كان استخدام MCF10A spheroids، تسمية عينات مع جسم مضاد الأولية ل α integrin (1:100) في العازلة منع الثانوية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، تليها اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية (1:200) وهويشت 33342 (1:1000) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. تعبر خطوط خلايا MCF10A عن مستويات عالية من α6 integrin، وهو أمر ضروري لإظهار الاستقطاب الزنجي والمورفولوجيا.
    4. إذا كان استخدام MDA-MB-231 spheroids، التي تعبر عن مستويات منخفضة من integrin α6، تسمية العينات مع اليكسا فلور 488 phalloidin (1:100) وهويشت 33342 (1:1000) في العازلة منع الثانوية لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. Phalloidin تمكن actin خيوط التصور حتى يمكن تقييم المورفولوجيا غير متبلور والغازية.
    5. غسل العينات مع 1X PBS-الجليسين 3 مرات لمدة 20 دقيقة.
    6. إعداد عينات للتركيب عن طريق إزالة شريحة الغرفة باستخدام أداة الشركة المصنعة. إضافة قطرة صغيرة من حل antifade إلى كل بئر. ضع غطاء 22 مم × 60 مم على كل شريحة غرفة وختم الحواف بعناية بتلميع الأظافر الواضح.
    7. عينات الصورة باستخدام المجهر confocal كما مكدسات Z من ~ 10 شرائح في 5 μm الخطوات. إذا رغبت في ذلك، ضغط طائرات Z في مستوى واحد باستخدام الأمر "التركيز الموسع" في برامج التصوير الخلوي.
    8. كمي التصاق spheroid إلى الشبكات البطانية باستخدام صورة J. يمكن قياس عدد الـ spheroids المُلتزم به كميًا باستخدام البرنامج المساعد التحليل مع حجم الجسيمات والتواميم المناسبة. تطبيع عدد الـ spheroids المرفقة إلى ناحية الصورة.
    9. لضمان إعادة التكاثر، كمي عدد الزى المنضم في 4 × 4 صور من الثقافات المشتركة. إذا كان عدد spheroid أقل بشكل ملحوظ إحصائيًا من التجارب الأخرى، يجب تكرار التجربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يجب أن خلايا الثدي الظهارية الذاتي تنظيم في 3D spheroids بعد 5-8 أيام من الثقافة على حل مصفوفة وفي ثقافة المتوسطة مع 2٪ حل مصفوفة. غير ورم MCF10A ظهار الثدي الطفو يجب أن تظهر جولة ولها مركز أجوف، مع α6 integrin الاستقطاب إلى الحافة الخارجية للpheroid(الشكل 1، inset يظهر مراكز جوفاء). تتشكل الخلايا الظهارية لسرطان الثدي من خلايا ظهارية غير منتظمة. يجب استخدام الـ Spheroids عندما تكون قطرها حوالي 100 – 300 ميكرومتر. عندما تصبح الـ spheroids كبيرة جداً وتقترب من بعضها البعض، سوف تنضم الـ spheroids معاً لتشكيل megaspheroids. بالإضافة إلى ذلك، قد تظهر ظهارات الثدي MDA-MB-231 الخلايا التي يتم ترحيلها من الـ spheroids إذا تم الاحتفاظ بها في ثقافة Matrigel لفترة طويلة جداً.

وينبغي أن ينظم HUVEC نفسه في شبكات تشبه الأنبوب بعد 6-8 ساعات من الثقافة المتناثرة الخالية من المصل. وسوف يكون العينات العقد متعددة الخلايا مع الاتصالات التي تتكون من خطوط من 1-3 خلايا في موازاة. يمكن تصوير شبكات HUVEC عن طريق المجهر على النقيض من المرحلة أو عن طريق المجهر confocal إذا كانت تسمى مع تعقب الخلية وهويشت (الشكل 2). يمكن استخدام محلل توليد الأوعية الدموية ImageJ لتحديد نقاط التوصيل الشبكية، والأجزاء، والفروع. وستموت شبكات HUVEC إذا تركت في وسط خال من المصل لفترة أطول من 16 ساعة.

عندما يتم طباعة الظهارة الظهارية الثدي الظهارية bioheroids على شبكات HUVEC، وينبغي أن كلا من spheroids والشبكات الحفاظ على مورفولوجيا الأصلي لمدة 24 ساعة على الأقل. سوف MCF10A الظهارية الثدي الظهارية تظهر ككائنات مستديرة التي تلتزم مباشرة إلى الشبكات endothelial، في حين أن MDA-MB-231 ظهار الثدي ظهاري سوف تظهر أكثر غير متبلور بعد المرفقة أو على مقربة من الشبكات endothelial(الشكل 3). وسيتم الحفاظ على شبكات HUVEC عندما تشارك في الثقافة مع ظهار الثدي الظهارية الظهارية. بالنسبة للثقافات المشتركة التي تزيد عن 24 ساعة، قد تهاجر خلايا الثدي الظهارية من الزفيرويدات وعلى طول الشبكات البطانية. في تجربتنا، وهذا يحدث في وقت سابق في الأورام بدلا من الخلايا الظهارية الثدي غير ورم38. لقد أظهرنا سابقا باستخدام الثقافات المشتركة المطبوعة بيولوجيا أن اختبار المخدرات يمكن أن تبدأ في وقت مبكر 2 ساعات بعد الطباعة الحيوية spheroid، على سبيل المثال لاختبار التصاق spheroid على شبكات البطانية45. لقد أظهرنا أيضا أن 3D spheroids الثدي هي أكثر مقاومة للأدوية المضادة للسرطان مثل Paclitaxel من عند طباعة الخلايا الفردية أو في ثقافة المشتركة41,45. في غياب الـ(بيوهيرو) مطبوعة بيولوجياً، تخفق شبكة HUVEC في التحكم بالآبار من تلقاء نفسها في الاحتفاظ بمورفولوجيا شبكتها وتموت بعد 16 ساعة.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل صور المجهر confocal من الظهارة الصدرية. تم تصنيف spheroids MCF10A لα 6 integrin (الأخضر) والنوى (الأزرق). يمكن تأكيد النمط الظاهري للخلية بعد الطباعة الحيوية عندما تظهر الـ spheroids مستديرة مع مركز مجوف (inset) ويكون α6 مستقطبًا عند الحواف الخارجية. تم تصنيف MDA-MB-231 spheroids لـ actin (الأخضر) والنوى (الأزرق). يمكن تأكيد النمط الظاهري للخلايا عندما يتم تشكيل spheroids بشكل غير منتظم دون مراكز جوفاء ولها عمليات الخلية الغازية في المصفوفة المحيطة. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صور تمثيلية لشبكات HUVEC حسب الطور التباين والمجهر الناسخ. تظهر شبكات HUVEC كعقد صغيرة متعددة الخلايا مع خطوط من الخلايا التي تربط العقد. بالنسبة للمجهر confocal، تم تسمية الخلايا مع خلية تعقب الأحمر وهويشت للنيوكلي (الأزرق). شريط مقياس = 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صور تمثيلية لبشرة ظهارية الثدي شاركوا في الاستزراع مع شبكات HUVEC. تبقى الـ MCF10A spheroids، التي تحمل علامة α integrin (الأخضر) والنوى (الأزرق)، مستديرة وتظهر ملتصقة مباشرة بالشبكات البطانية. يبدو أن الـ MDA-MB-231 spheroids، المسمى بـ actin (الأخضر) والنوى (الأزرق)، غير متبلور، ومع ذلك تبقى قريبة أو على شبكات البطانية. تحافظ الثقافات المشتركة على هذا المورفولوجيا لمدة 24 ساعة على الأقل بعد الطباعة الحيوية ، وبعد ذلك قد تهاجر خلايا الثدي على طول أنابيب البطانية. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول هو الأول من نوعه لـ bioprint spheroids في هندستها المعمارية ثلاثية الأبعاد من أجل المشاركة في الثقافة مع الخلايا البطانية أيضًا في هندستها ثلاثية الأبعاد. وتشمل خطوات البروتوكول الحاسمة التكوين الأولي لبشرة الثدي الظهارية وشبكات HUVEC. يجب توخي الحذر الشديد في تغذية الظهارية الثدي spheroids، كما أنها تعطلت بسهولة من حل مصفوفة. وبالمثل، يجب أن يعامل الظهارة الصدرية spheroids بعناية عندما تكون pipetted قبالة حل مصفوفة ومختلطة في الشبكات. وينبغي ألا تكون شبكات HUVEC مطلية بدرجة عالية جدا من الكثافة أو تترك لأكثر من 16 ساعة، لأنها ستشكل طبقة أحادية أو تموت، على التوالي. وأخيراً، ينبغي أن تحدث جميع الطباعة البيولوجية في بيئة معقمّة عند 37 درجة مئوية لتعظيم قابلية الخلية للاستمرار.

يمكن أن تكون الظهارية الثدي spheroids مطبوعة بيولوجيا في مجموعة متنوعة من bioinks إلى جانب Matrigel، بما في ذلك الخلينات وelginate-الكولاجين يمزج. لقد أثبتنا أن الـ spheroids كانت قابلة للحياة وحافظت على مورفولوجيا عند طباعتها في bioinks alginate المستندةإلى 41. وهكذا في حين نقدم الطباعة البيولوجية هنا في bioink القائم على حل المصفوفة ، وغيرها من أقل تكلفة وأسهل لاستخدام bioinks هي أيضا ممكنة. نحن تستخدم بالإضافة إلى ذلك خطوط خلايا سرطان الثدي الأخرى، بما في ذلك MCF-7 والخلايا MCF10A-NeuN المعدلة وراثيا مع نجاح مماثل38،41،45. ويمكن أيضا أن تستخدم وسائل بديلة لخلق الظهارية الثدي الظهارية. على سبيل المثال، استخدم Lee وآخرون صفائف الهيدروجيل ميكروويل التي تم إنتاجها باستخدام طوابع PDMS لإنشاء قواعد مائية موحدة الحجم الحجم46. وأخيرا، يمكن استخدام الخلايا البطانية البديلة مثل الخلايا البطانية المشتقة من الورم، وبدلا من تشكيل شبكات HUVEC، يمكن أن تكون الخلايا الدقيقة المشتقة من الأنسجة الدهنية مطبوعة بيولوجيا مباشرة كهياكل الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد47.

وكان أحد القيود الأساسية لهذا الأسلوب هو التحدي في التحكم في موقع الزفيرة المطبوعة بيولوجياً ورقمها. كان لا بد من طباعة الـ(ئي) مع فوهات كبيرة نسبياً وفي سوائل غير خفيّة لمنع تلف الزّوئيّة. بسرعة التبلور bioinks قد أفضل السيطرة على موقع spheroid. يمكن أيضا أن لا يمكن أن تحسب Spheroids في bioink ، لأنها كانت كبيرة جدا بالنسبة لدينا عداد الخلية. اعتمدنا بدلا من ذلك على التهم spheroid المستمدة من الصور النقيض المرحلة التي اتخذت قبل الأنابيب spheroids قبالة سطح Matrigel. يمكن لوسائل بديلة لتشكيل spheroids أفضل السيطرة على عددهم وحجمها. كنا قادرين على السيطرة على عدد spheroid والحجم مع دقة معتدلة باستخدام مصافي الخلايا وتجمهر spheroids بنفس الطريقة في كل مرة. القيد النهائي هو أن خلايا الثدي الظهارية تهاجر من الزفيرود وعلى طول شبكات البطانية مع مرور الوقت. ومن الممكن أن تؤدي البيوينك البديلة إلى إلغاء هذا القيد.

الطباعة البيولوجية المباشرة من الظهارة الثدي الظهارية spheroids على شبكات HUVEC شكلت مسبقا تمكن من إنشاء 3D في المختبر الورم في الثقافة المشتركة نموذج في وقت قصير. يمكن للباحثين بعد ذلك فحص التفاعلات بين الزفيرويدات والأوعية الدموية بسرعة مع إنتاجية أعلى. في المستقبل، يمكن أن تكون مطبوعة الظهارة الثدي الظهارية الظهارية bioheroids على الأوعية الدموية المطعّمة، والتي من شأنها أن تسمح لدراسة آثار التدفق. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون organoids المشتقة من الورم والخلايا البطانية مطبوعة بيولوجيا لتمكين الطب الدقيق من خلال اختبار فعالية المخدرات في نموذج خاص بالمريض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا البحث من قبل المعاهد القومية للصحة 1R01HL140239-01 إلى AMC. نود أن نشكر مركز التصوير الخلوي في جامعة دريكسل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity Sanyo MCO-20AIC Cell incubation
3D Bio printer custom-made None Used for bioprinting
8-well chamber slides VWR, Radnor, PA 53106-306 for seeding spheroids
25-gauge needle Sigma, St. Louis, MO Z192406-100EA bioprinting syringe needle
Absolute ethanol (200 proof ) Sigma, St.Louis, MO E7023-500ML reconsitution of media components
Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115006020 secondary block - Immunofluorescence
Alexa Fluor 488 (1:200) Thermo Fisher, Waltham, MA A-11006 Seconday antibody-Immunofluorescence
Bovine insulin Sigma, St.Louis, MO I-035-0.5ML MCF10A Media additive
Bovine serum albumin (BSA) Sigma, St.Louis, MO A2153-500G Blocking agent -Immunofluorescence
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning, Corning, NY 352350 Remove large or clustered spheroids
CellTracker™ Red CMTPX Dye Thermo Fisher, Waltham, MA C34552 pre-stain for HUVEC tubes
Compact Centrifuge Hermle- Labnet, Edison ,NJ Z206A For cell centrifugations
Cholera Toxin Sigma, St.Louis, MO C8052-.5MG MCF10A Media additive
Conical tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 62406-200 Collecting and resuspending cells
Countess II-FL Cell counter Thermo Fisher, Waltham, MA AMQAF1000 counting cells
Glass pipettes (10 mL) VWR, Radnor, PA 76184-746 cell resuspension
DMEM F:12 Thermo Fisher, Waltham, MA 11320033 MCF10A basal media
DMEM 1X VWR, Radnor, PA 10-014-CV MDA-MB-231 basal media
Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza, Durham, NC CC-3156 HUVEC basal media
Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) Lonza, Durham, NC CC-3162 Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)
Alexa Fluor™ 488 Phalloidin Thermo Fisher, Waltham, MA Labelling MDA-MB-231 spheroids
Fetal Bovine serum Cytiva, Logan, UT SH30071.03 HUVEC/MDA-MB-231 media additive
Goat serum Thermo Fisher, Waltham, MA 16210064 Immunofluorescence labelling component
Glycine Sigma, St.Louis, MO G8898-500G immunofluorescence buffer component
Hoescht 33342 Thermo Fisher, Waltham, MA 62249 Nuclei stain immunofluorescence
Horse Serum Thermo Fisher, Waltham, MA 16050130 MCF10A Media additive
Hydrocortisone Sigma, St.Louis, MO H0888-5G MCF10A Media additive
Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) Cell applications, San Diego , CA 200-05f Endothelial cell lines
Integrin α6 Millipore, Billerica, MA MAB1378 Immunofluorescence spheroid labelling component
Live Dead assay Thermo Fisher, Waltham, MA L3224 Live and dead cell stain assay for cell viability
LSM 700 Confocal microscope Zeiss, Thornwood, NY Used to visualize cells
Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml VWR, Radnor, PA 354230 Spheroid formation
MCF10A cells ATCC CRL-10317 Breast cell line
MDA-MB-231 cells ATCC HTB-26 Breast cell line
Paraformaldehyde Sigma, St.Louis, MO 158127-500G cell fixative
Penicillin and streptomycin Thermo Fisher, Waltham, MA 15140122 MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive
Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) Thermo Fisher, Waltham, MA 7001106 Wash buffer for cells before trypsinization
Phosphate buffer saline 10X Thermo Fisher, Waltham, MA AM9625 immunofluorescence buffer component
Prolong gold antifade Thermo Fisher, Waltham, MA P36934 immunofluorescence mountant medium
Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF Peprotech, Rocky Hill, NJ AF-100-15 MCF10A/ assay media component
Sodium Azide Sigma, St.Louis, MO S2002-25G immunofluorescence buffer component
Sterile syringe (10 mL) VWR, Radnor, PA 75846-757 bioprinting process
Tissue culture dish (10cm) VWR, Radnor, PA 25382-166 monolayer cell culture
Triton X-100 Sigma, St.Louis, MO T8787-250ML immunofluorescence buffer component
Trypan blue 0.4% Thermo Fisher, Waltham, MA 15250061 cell counter additive
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher, Waltham, MA 25300054 cell detachment
Tween -20 Thermo Fisher, Waltham, MA 85113 immunofluorescence buffer component
Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) Peprotech, Rocky Hill, NJ 100-20 HUVEC tube additive
Volocity 6.3 cell imaging software PerkinElmer, Hopkinton, MA Z stack compresser

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  3. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  5. Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19 (2016).
  6. Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, Pt 5 1945-1957 (1995).
  7. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  8. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  9. Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
  10. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
  11. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
  14. Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
  15. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, Pt 12 2377-2388 (2003).
  16. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  17. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
  18. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
  19. Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
  20. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
  21. Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66 (2011).
  22. Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
  23. Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), Cambridge. 1068-1078 (2015).
  24. Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671 (2015).
  25. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  26. Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
  27. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), Kidlington. 539-553 (2015).
  28. Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  29. Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
  30. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589 (2016).
  31. Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), Cambridge. 1262-1271 (2013).
  32. Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  33. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  34. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  35. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
  36. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting the Cancer Microenvironment. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1710-1721 (2016).
  37. Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101 (2015).
  38. Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
  39. Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
  40. Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
  41. Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003 (2019).
  42. Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
  43. Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285 (2015).
  44. Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
  45. Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
  46. Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145 (2018).
  47. Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 165، الطباعة الحيوية، bioinks، 3D في نماذج في المختبر شارك الثقافة، spheroids الثدي، والخلايا البطانية، والسرطان
الطباعة الحيوية المباشرة لـ 3D Multicellular الثدي Spheroids على الشبكات السفحلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Swaminathan, S., Clyne, A. M. Direct … More

Swaminathan, S., Clyne, A. M. Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks. J. Vis. Exp. (165), e61791, doi:10.3791/61791 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter