Summary
Målet med detta protokoll är att direkt bioprinta bröst epitelceller som multicellulära sfäroider på förformade endotel nätverk för att snabbt skapa 3D bröst-endotel co-culture modeller som kan användas för läkemedelsscreening studier.
Abstract
Bioprinting växer fram som ett lovande verktyg för att tillverka 3D-modeller för mänsklig cancer som bättre rekapitulera kritiska kännetecken för in vivo-vävnadsarkitektur. I nuvarande skikt-för-lager extrudering bioprinting, enskilda celler extruderas i en bioink tillsammans med komplexa rumsliga och tidsmässiga signaler för att främja hierarkisk vävnad självmontering. Denna biofabriceringsteknik bygger dock på komplexa interaktioner mellan celler, bioinks och biokemiska och biofysiska signaler. Således kan självmontering ta dagar eller till och med veckor, kan kräva specifika bioinks och kan inte alltid uppstå när det finns mer än en celltyp inblandad. Vi utvecklade därför en teknik för att direkt bioprinta förformade 3D bröst epitelial sfäroider i en mängd olika bioinks. Bioprinted pre-formed 3D bröst epitelial sfäroider lidit sin livskraft och polariserade arkitektur efter utskrift. Vi tryckte dessutom 3D-sfäroiderna på vaskulär endotel cell nätverk för att skapa en co-culture modell. Således skapar den nya bioprintingtekniken snabbt en mer fysiologiskt relevant 3D-bröstmodell till lägre kostnad och med högre flexibilitet än traditionella bioprintingtekniker. Denna mångsidiga bioprintningsteknik kan extrapoleras för att skapa 3D-modeller av andra vävnader i ytterligare bioinks.
Introduction
3D in vitro Vascularized tumör modeller är viktiga verktyg för mekanistisk studie av cancer tillväxt och metastasering. För bröstcancer i synnerhet, bröst epitelceller odlade i Matrigel organisera i polariserade sfäroider som mer liknar in vivo bröst acinusarkitektur 1,2,3,4,5,6,7,8. 3D bröst epitelial cell kultur påverkar också cellfunktionen, med 3D kulturer som visar skillnader i epidermal tillväxtfaktor (EGF) receptor modulering8,9; Onkogenfunktion, inklusive ErbB210. tillväxt och apoptossignalering11,12; och kemoterapiresistens13,14. Vaskulär endotelceller svarar på samma sätt annorlunda på miljöstimulanser i 3D jämfört med traditionell 2D-kultur15,16,17,18. Emellertid, mycket av förståelsen av vaskulär endotel och bröst epitelial interaktioner kommer från 2D kultur med konditionerade medium eller Transwell insatser, eller 3D-modeller där de två celltyperna är fysisktseparerade 19,20,21,22,23. Dessa samkulturella modeller ger begränsad fysiologisk insikt, eftersom både 3D-kultur och cellcellskontakt är avgörande för vaskulär endotel – bröstepitela cellinteraktioner24,25,26.
3D-cancermodeller har tillverkats med hjälp av en mängd olika tekniker, inklusive hängande droppsfäroidbildning, bioprinting, magnetisk montering och kultur inom hydrogeler eller på konstruerade byggnadsställningar5,27,28,29. Mer nyligen skapades 3D tumör modeller med flera celltyper ordnade i sina respektive 3D strukturer. I ett exempel på en tumör-på-ett-chip plattform blandades cancer, endotel och stromal celler i en matris och injicerades sedan i de tre centrala vävnadskamrarna i en polydimethylsiloxane (PDMS) enhet. Vävnadskamrarna gränsar till två yttre kanaler som representerade en artär och venule. Efter 5-7 dagar av kultur bildade endotelceller ett mikrovaskulärt nätverk och cancerceller prolifererade för att bilda små tumörer nära vaskulaturen. Denna plattform användes sedan för att screena droger och läkemedelskombinationer30. Ytterligare plattformar för tumör-på-chip har skapats för att studera metastasering och cancertyper med specifika mekaniska stimuli (t.ex. mekanisk stam i lungan)31,32. Dessa plattformar inkluderar dock i allmänhet inte både vaskulatur och cancer i sina respektive 3D-strukturer.
Biofabricering visar stort löfte i att främja 3D in vitro vascularized tumör modeller, eftersom det möjliggör snäva rumslig kontroll över cell plats. Trots tillväxten av bioprinting under det senaste decenniet fokuserar få studier specifikt på tumörer33,34. I ett exempel användes 3D-utskrift av HeLa-celler i en gelatin/alginat/fibrinogen hydrogel för att skapa en in vitro livmoderhalscancer modell. Tumör celler var bioprinted som enskilda celler och sedan tillåtet att bilda sfäroider, som visade en högre spridning hastighet, ökad matris metalloproteinase uttryck och högre chemoresistance än celler i 2D kultur35. I dessa studier, som i många andra36,37, var dissocierade cellupphängningar bioprintade, och sedan fick cellkulturerna de nödvändiga mekaniska och biokemiska ledtrådarna för att cellerna skulle kunna bilda en 3D-struktur. Cellulär självmontering kan dock ta dagar eller veckor, kan kräva komplexa rumsliga och tidsmässiga miljösignaler eller inte uppstå när två celltyper är samkulturerade. Till exempel bröst epitelial celler inducerad celldöd i endotelceller i 2D-samkultur, och dissociated bröst epitelial celler bildade inte 3D sfäroider när bioprinted i alginate/gelatin hydrogels38. Dissocierade bröst epitelial eller cancerceller bildade sfäroider i alginate baserade bioinks endast när de är fastspända i cirkulära PDMS mögel. I andra fall bildades sfäroider med upphängda droppar i ultralåga cirkulära brunnsplattor och blandades sedan i alginatbaserade biobläck39,40.
Vi beskriver nu en alternativ 3D vävnad biomanufacturing metod i detta protokoll. Snarare än att så dissocierade celler och vänta på att dessa celler bildar 3D-strukturerna beskriver vi hur man skapar och bioprintar 3D-tumörsfäroider på ett kärlrörsnätverk för att skapa en tumörsamkulturmodell som kan användas nästan omedelbart. Tumör sfäroider kan odlas in vitro eller härrör från mänskliga vävnader (organoider). På samma sätt kan kärlrör odlas eller härledas från fettvävnad mikrovaskulära fragment. Bioinks kan variera från biologiskt inaktivt alginat till det mycket biologiskt aktiva Matrigel41. Eftersom denna 3D tumör co-culture modell kan skapas med en mängd olika cellstrukturer och bioinks, Det kan innehålla flera celltyper, extracellulära matriser och kemokine gradienter15,42. Även om de endotelnäten i sin nuvarande formulering inte kan perfunderas, kan framtida iterationer integrera denna metod med mikrofluider eller -on-chip-system. Bioprinting 3D bröst epitelial sfäroider på endotel nätverk möjliggör snabb biofabricering av mänskliga bröst modeller för läkemedelstestning och personlig precision medicin27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bröst epitelcell tillväxt och analys media
- MCF10A bröst epitelceller
OBS: Den icke-tumorigenic förevigade bröst epitelial cellinjen härrör från en patient med fibrocystic sjukdom43. Celler uttrycker inte östrogenreceptor.- För att förbereda 20 μg/ml epidermal tillväxtfaktor (EGF), lös upp 100 μg lyofiliserad EGF i 500 μL sterilt dH2O för att göra 200 μg/mL EGF. Tillsätt 500 μL 200 μg/ml EGF i 4,5 ml steril 0,1 % BSA i dH2O för att göra en 20 μg/mL EGF-stamlösning. Förvara beredda 20 μg/ml EGF alikvoter vid -20 °C i upp till 12 månader.
- För att förbereda 500 μg/ml hydrokortison, späd 1 mg hydrokortison i 1 ml absolut etanol (200 bevis). Tillsätt 1 ml steril DMEM F:12 till denna blandning för att göra en 500 μg/ml hydrokortisonbuljonglösning. Förvara hydrokortisonlager vid -80 °C i upp till 12 månader.
- För att förbereda 10 μg/ml koleratoxin, lös upp 1 mg koleratoxin lyofiliiserat pulver i 1 ml sterilt dH2O för att göra en 1 mg/ml koleratoxinlagerlösning. Lagra koleratoxinlager alikvoter vid -80 °C i upp till 12 månader.
- För att förbereda tillväxtmediet, tillsätt 500 μL EGF (20 μg/ml), 500 μL hydrokortison (500 μg/ml), 5 μL koleratoxin (1 mg/ml), 500 μL bovininsulin (10 mg/ml), 10 ml penicillin och streptcinomi. och 25 ml hästserum till 500 ml DMEM F:12 för en slutlig koncentration på 20 ng/ml EGF, 500 ng/mL hydrokortison, 10 ng/mL koleratoxin, 10 ng/mL bovininserum, 2% v/v penicillin och streptomycin och 5% v/v hästserum. Antibiotikakoncentrationen ökades till 2% för att ta hänsyn till minskad sterilitet i bioprintningsprocessen; Antibiotikakoncentrationen kan dock sänkas till 1%.
- För att förbereda Assay Medium, tillsätt 500 μL hydrokortison (500 μg/ml), 5 μL koleratoxin (1 mg/ml), 500 μL bovininsulin (10 mg/ml), 10 ml penicillin och streptomycin. och 25 ml hästserum till 500 ml DMEM F:12 för en slutlig koncentration av 500 ng/ml hydrokortison, 10 ng/ml koleratoxin, 10 ng/ml bovininsulin, 2% v/v penicillin och streptomycin och 5% v/v hästserum.
- MDA-MB-231
OBS: Trippelnegativa (saknar östrogenreceptor, progesteronreceptor och epidermal tillväxtfaktorreceptor 2) bröstcancer epitelcelllinjen skapas från pleurautgjutning av en kvinnlig patient med ögonbevarande bröst adenocarcinom44. Celler representerar en aggressiv, invasiv och dåligt differentierad bröstcancer.- För att förbereda tillväxt och analys medium, tillsätt 50 ml fetala nötkreatur serum, 10 mL penicillin och streptomycin och 25 mL hästserum till 500 mL DMEM för en slutlig koncentration 10% v/v fetala nötkreatur serum, 2% v/v penicillin och streptomycin och 5% v/v häst serum.
2. Bröst epitel cell kultur
- Frö 500 000 MCF10A- eller MDA-MB-231-celler i en 10 cm (P100) vävnadskulturrätt med 10 ml MCF10A eller MDA-MB-231 tillväxtmedier. MCF10A- och MDA-MB-231-celler når >90% sammanflöde på 48 timmar.
- För att passera bröst epitelceller, tvätta först celler med 10 ml varm PBS.
- Lossa bröstepitela celler genom att tillsätta 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA till skålen. Placera skålen i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 20-25 minuter.
- Lägg till 5 ml MCF10A eller MDA-MB-231 Growth Medium i de trypsiniserade cellerna för att neutralisera trypsin. Pipett cellmedieblandningen upp och ner för att återanvända celler och dela upp cellkluster.
- Tillsätt cellfjädringen i ett koniskt rör på 15 ml och centrifugera vid 1 200 x g i 3 minuter. Aspirera försiktigt supernatanten och återanvänd cellpelleten i 5 ml MCF10A eller MDA-MB-231 Growth Medium.
- Plåt 1 ml cellfjädring i 5 nya 10 cm vävnadskulturrätter tillsammans med MCF10A eller MDA-MB-231 Growth Medium. Placera disken i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Cellerna kommer att vara redo att passeras igen om 2-3 dagar. MCF10A-celler kan bibehållas till passage nummer 35, varefter de visar morfologiska förändringar. MDA-MB-231 celler kan bibehållas till passage nummer 24, varefter de visar morfologiska förändringar.
3. Bröst epitelial sfäroid bildas
- Frys in 200 μL pipettspetsar i 30 minuter innan analysen påbörjas. Håll tillväxtfaktorn reducerad matrislösning (t.ex. Matrigel) (10 mg/ml) på is under hela processen.
- Långsamt pipett 30 μL iskyl matrislösning med iskallt 200 μL pipettspetsar i varje brunn i en 8-brunns kammarbild. Börja från sidorna och dra pipettspetsen längs hörnen och lägg till en sista droppe i mitten av brunnen för att säkerställa jämn beläggning av varje brunn. Undvik luftbubblor under detta steg för att säkerställa ett enhetligt matrislösningsskikt. Använd nya pipetttips för varje brunn.
- Inkubationskammaren glider i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 15-20 minuter för att polymerisera matrislösningen.
- Återanvända trypsiniserade MCF10A-celler i MCF10A Assay Medium vid 200 000 celler/ml eller återanvända trypsiniserade MDA-MB-231-celler i MDA-MB-231 Growth Medium vid 200 000 celler/ml.
- Om du använder MCF10A-celler bereder du färskt MCF10A Spheroid Growth Medium genom att tillsätta 5 μL EGF (20 μg/ml) och 100 μL matrislösning till 5 ml assay medium för en slutlig koncentration av 2% matrislösning.
- Ta bort kammarbilden förbelagd med matrislösning från inkubatorn. Tillsätt 50 μL MCF10A eller MDA-MB-231 cellfjädring (10 000 celler) till varje brunn. Om du använder MCF10A-celler, tillsätt 450 μL MCF10A Spheroid Growth Medium. Om du använder MDA-MB-231-celler, tillsätt 450 μL MDA-MB-231 Growth Medium förblandat med 2% matrislösning (9 μL). Placera omedelbart kammarens glid i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Byt ut mediet var 4:e dag. Försiktigt pipett 200 μL gammalt medium ut från ett hörn av varje brunn med en 200 μL pipettspets. Luta under denna process kammarens glidning vid 45° för att säkerställa att sfäroiderna inte störs. Tillsätt 200 μL nyberedda MCF10A Spheroid Growth Medium eller MDA-MB-231 Growth Medium som tidigare blandats med 2% matrislösning till varje brunn i hörnet i droppar för att säkerställa att sfäroider förblir fästa vid matrisskiktet. Endast ~ 50% av mediet byts ut så att alla cytokiner som produceras av sfäroiderna inte är helt uttömda.
OBS: MCF10A bröst epitelial sfäroider tar upp till 8 dagar att polarisera och bilda ihåliga centra. MDA-MB-231 bröst epitelial sfäroider tar upp till 5 dagar att bilda och har inga ihåliga centra.
4. Endotelcellsnätverksbildning
- Mänsklig navelsträng endotel cell (HUVEC) Kultur
- Tillsätt innehållet i ett enda endoteltillväxtmedium-2-kit som innehåller insulintillväxtfaktor, fibroblasttillväxtfaktor, vaskulär endoteltillväxtfaktor, askorbinsyra, epidermal tillväxtfaktor, heparin och gentamicin-amphotericin B, tillsammans med 50 ml fetala nötkreatursserum, 5 ml penicillin-streptomycin och 5 ml 200 mM glutamin till 500 ml endotelbasalt medium-2 (EBM-2) för att skapa fullständigt endoteltillväxtmedium (EGM-2).
- Frö 500 000 endotelceller i en 10 cm vävnadskulturrätt i 10 ml EGM-2. Placera cellerna i en 37 °C, 5 % CO2-inkubator tills de når >80 % sammanflöde (cirka 48 timmar).
- Till passageceller, tvätta endotelceller med 10 ml varm PBS. Lossa HUVEC genom att tillsätta 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA till 10 cm vävnadskulturrätt. Övervaka cellerna noggrant efter faskontrastmikroskopi. Cellerna är klara när de är ballade men förblir fästa vid skålen.
- Aspirera försiktigt trypsin ur skålen. Tillsätt 8 ml EXTRA BOLAGSSTÄMMA-2 i skålen. Tvätta bort cellerna från skålen genom att pipetting EGM-2 upp och ner över hela skålytan.
- Alternativt kan du lägga till 5 ml EGM-2 till de trypsiniserade cellerna för att neutralisera trypsin. Pipett cellmedieblandningen upp och ner för att återanvända celler och dela upp cellkluster. Tillsätt cellfjädringen i ett koniskt rör på 15 ml och centrifugera vid 1 200 x g i 3 minuter. Aspirera försiktigt supernatanten och återanvänd cellpelleten i 10 ml EGM-2.
- Tillsätt 1 ml cellfjädring till 9 ml EGM-2 i en 10 cm vävnadskulturrätt. Placera disken i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Byt ut 2/3 av mediet mot färsk EGM-2 varannan dag. Cellerna är klara att passera om 3-5 dagar. HUVEC kan underhållas upp till passage 8 varefter de inte bildar nätverk.
- Endotelcellsnätverksbildning (HUVEC)
- Frys in 200 μL pipettspetsar i 30 minuter innan analysen påbörjas. Håll tillväxtfaktorreminerade matrislösning (10 mg/ml) på is under hela processen.
- Långsamt pipett 30 μL iskyl matrislösning med iskallt 200 μL pipettspetsar i varje brunn i en 8-brunns kammarbild. Börja från sidorna och dra pipettspetsen längs hörnen och lägg till en sista droppe i mitten av brunnen för att säkerställa jämn beläggning av varje brunn. Undvik luftbubblor under detta steg för att säkerställa ett enhetligt matrislösningsskikt. Använd nya pipetttips för varje brunn.
- Inkubatkammaren glider i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 15-20 minuter för att polymerisera Matrigel.
- Förfärga en 10 cm skål HUVEC med 10 μL rödcellsspårare (1:1000) i 30 minuter i 37 °C, 5% CO 2-inkubator.
- Tvätta endotelceller med 10 ml varm PBS. Lossa HUVEC genom att tillsätta 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA till 10 cm vävnadskulturrätt. Placera skålen i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 5 minuter för att helt lossa cellerna.
- Tillsätt 5 ml EGM-2 till skålen för att neutralisera trypsin. Överför cellfjädringen till ett koniskt rör på 25 ml. Centrifuge HUVEC vid 1 200 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 5 ml serumfri EBM-2.
- Räkna celler med trypanblått för att bestämma livskraftiga celler. Skapa en 1 x 106 cell/ml-lösning.
- Tillsätt 100 000 HUVEC till varje brunn med 200 μL serumfri EBM-2. Om fler celler läggs till skapar de ett ytmonoskikt i stället för ett rörnätverk.
- Inkubera HUVEC i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Efter 6 timmar, avbilda HUVEC-nätverk efter faskontrastmikroskopi. Nätverken är nu redo för kokultur med bröstsfäroider.
5. Bioprinting Bröst epitelial sfäroider på förformade HUVEC Networks
OBS: Ett biodeponeringssystem med dubbla munstycken bör användas för biofabriceringsprocessen. I detta fall hade systemet tre rörelsearmar för att tillåta mikronskala rumslig kontroll av materialdeposition samt två skruvdrivna motorer för att deponera bioink från 10 ml sprutor. Systemet bör funktionaliseras med ett högeffektivt partikelluftfiltreringssystem samt UV-steriliseringskapacitet för att upprätthålla en steril miljö under bioprintning. Bioprintern är UV-steriliserad i en timme före tryckprocessen.
- Skapa bröst epitelial sfäroider och HUVEC nätverk som tidigare beskrivits. Uppskatta antalet bröst epitelial sfäroider i varje brunn genom att räkna sfäroider i representativa fas kontrast mikroskopi bilder.
- Kapa 0,5 cm från änden av en 1000 μL pipettspets. Använd den skurna pipettspetsen för att försiktigt pipettera alla sfäroider ur 8-brunnskammarens rutschkana och in i ett 50 ml-rör. Återanvända sfäroider i den valda biobläcken vid 100 sfäroider/100 μL.
OBS: Högre sfäroidkoncentrationer kan resultera i sfäroidkluster och förhindra visualisering av interaktioner mellan sfäroiderna och endotelnätverken. - Passera sfäroidblandningen genom en 70 μm cellsil för att avlägsna alla stora eller klustrade sfäroider.
- Ladda de poolade sfäroiderna i en 10 ml steril spruta och kapa den med en 25-gauge steril nål. Fäst sprutan i biodepositionssystemet.
- Aspirera mediet från HUVEC-nätverken i 8-brunns kammarrutschbanan.
- Extrudera 100 μL bröstepitela sfäroider på 6 brunnar i HUVEC-nätverk med en flödeshastighet på 1 ml/min. Underhåll 2 brunnar i HUVEC-nätverk som kontroller.
- Tillsätt 400 μL MCF10A Spheroid Growth Medium om du använder MCF10A-sfäroider tryckta på HUVEC-nätverk eller lägg till 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium som tidigare blandades med 2% matrislösning om MDA-MB-231-sfäroider tryckta på HUVEC-nätverk. Respektive sfäroida tillväxtmedium bör användas i HUVEC-styrbrunnar.
- Inkubera samkulturer i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 24 - 96 timmar utan ett mediebyte. Samkulturer kommer att förbli livskraftiga i det ursprungliga mediet i upp till fyra dagar.
6. Konfokal mikroskopi
- Immunofluorescens och PBS-glycin tvättbuffert beredning
- Bered Immunofluorescence (IF) buffert 10x stamlösning genom att tillsätta 2,5 g natriumazid, 5 g bovint serumalbumin, 10 ml Triton X-100 och 2,05 ml Tween-20 i 500 ml 10x PBS. Justera pH till 7,4. Förvara stamlösningen i upp till ett år vid 4 °C för att undvika sedimentering.
- Skapa en fungerande IF-buffert genom att späda ut 50 ml buffert på 10x IF i 450 ml sterilt avjoniserat vatten. Förvara arbetslösningen i rumstemperatur i upp till en vecka.
- Förbered 10x PBS-Glycine buffert stamlösning genom att tillsätta 37,5 g glycin till 500 ml 10x PBS. Justera pH till 7,4. Förvara stamlösningen i upp till 6 månader vid 4 °C för att undvika sedimentering.
- Skapa en fungerande PBS-glycinlösning genom att späda ut 50 ml 10x PBS-glycinbuffert i 450 ml sterilt avjoniserat vatten. Förvara arbetslösningen vid 4 °C i upp till en vecka.
- Etikett Bioprinted Samples och Image av Confocal Microscopy
- Aspirera medium från biotryckta 3D-samkulturer och skölj 3 gånger med varm PBS. Fixa bioprintade 3D-samkulturer med 4% paraformaldehyd i 1 timme vid rumstemperatur. Skölj proverna 3 gånger i 20 minuter med 1x PBS-glycin.
- Blockera prover med IF-buffert blandat med 10% getserum i 90 minuter (primärt block), följt av 40 minuter med IF-buffert plus 10% getserum och Affinipure Fab-fragment (1:100, sekundärt block).
- Om du använder MCF10A-sfäroider ska etikettprover med primär antikropp för integrin α6 (1:100) i sekundär blockeringsbuffert över natten vid 4 °C, följt av en sekundär antikropp alexaflunor 488 (1:200) och Hoescht 33342 (1:1000) i 1 timme vid rumstemperatur skyddad mot ljus. MCF10A cellinjer uttrycker höga nivåer av integrin α6, vilket är viktigt för att visa sfäroid polarisering och morfologi.
- Om du använder MDA-MB-231-sfäroider, som uttrycker låga nivåer av integrin α6, etikettprover med Alexa Fluor 488 falloidin (1:100) och Hoescht 33342 (1:1000) i sekundär blockeringsbuffert i 4 timmar vid rumstemperatur skyddad från ljus. Falloidin möjliggör aktin filament visualisering så att sfäroid amorf och invasiv morfologi kan bedömas.
- Tvätta prover med 1X PBS-glycin 3 gånger i 20 minuter.
- Förbered proverna för montering genom att ta bort kammarbilden med hjälp av tillverkarens verktyg. Tillsätt en liten droppe antifadelösning till varje brunn. Placera ett 22 mm x 60 mm täckslip på varje kammarglas och täta försiktigt kanterna med klart nagellack.
- Bildprover med ett konfokalt mikroskop som Z-staplar på ~ 10 skivor i 5 μm steg. Om så önskas komprimerar du Z-plan till ett enda plan med kommandot Extended Focus i cellavbildningsprogram.
- Kvantifiera sfäroid vidhäftning till endotelnätverk med bild J. Antalet vidhäftade sfäroider kan kvantifieras med hjälp av analysplugin med lämplig partikelstorlek och cirkularitet. Normalisera antalet bifogade sfäroider till bildområdet.
- För att säkerställa reproducerbarhet, kvantifiera antalet vidhäftade sfäroider i 4 x 4 kaklade bilder av samkulturer. Om sfäroidnumret är statistiskt signifikant lägre än andra experiment bör försöket upprepas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bröst epitelceller bör själv organisera sig i 3D-sfäroider efter 5-8 dagars kultur på matrislösning och i odlingsmedium med 2% matrislösning. Icke-tumörogena MCF10A bröst epitelial sfäroider bör visas runt och ha en ihålig centrum, med integrin α6 polariseras till ytterkanten av sfäroiden (Figur 1, inset visar ihåliga centrum). Mycket invasiva MDA-MB-231 bröstcancer epitelceller bildar oregelbundna sfäroider. Sfäroider bör användas när de är cirka 100 – 300 μm i diameter. När sfäroider blir för stora och kommer i närheten, kommer sfäroiderna att gå samman för att bilda megasfäroider. Dessutom kan MDA-MB-231 bröst epitelial sfäroider visa celler migrera ut ur sfäroiderna om de upprätthålls i Matrigel kulturen för länge.
HUVEC bör själv organisera sig i rörliknande nätverk efter 6-8 timmars gles, serumfri kultur. Exempel kommer att ha flercelliga noder med anslutningar som bildas av linjer med 1-3 celler parallellt. HUVEC-nätverken kan avbildas genom faskontrastmikroskopi eller konfokal mikroskopi om de är märkta med Cell Tracker och Hoescht (Figur 2). ImageJ angiogenesis analyzer kan användas för att kvantifiera nätverkskorsningar, segment och grenar. HUVEC-nätverk dör om de lämnas i serumfritt medium längre än 16 timmar.
När bröst epitelial sfäroider bioprintas på HUVEC nätverk, bör både sfäroider och nätverk behålla sin ursprungliga morfologi i minst 24 timmar. MCF10A bröst epitelial sfäroider kommer att visas som runda objekt som klibbar direkt till endotel nätverk, medan MDA-MB-231 bröst epitelial sfäroider kommer att visas mer amorfa men fortfarande bifogas eller i närheten av endotel nätverk (Figur 3). HUVEC nätverk kommer att upprätthållas när co-cultured med bröst epitelial sfäroider. För samkulturer längre än 24 timmar kan bröstepitela celler migrera ut ur sfäroiderna och längs endotelnätverken. Enligt vår erfarenhet händer detta tidigare i tumorigenic snarare än icke-tumorigenic bröst epitelceller38. Vi har tidigare visat med hjälp av bioprintade samkulturer att läkemedelstester kan initieras så tidigt som 2 timmar efter sfäroid bioprinting, till exempel för att testa sfäroid vidhäftning på endotel nätverk45. Vi har också visat att 3D bröst sfäroider är mer resistenta mot anti-cancer läkemedel som Paklitaxel än när tryckt som enskilda celler eller i samkultur41,45. I avsaknad av bioprintade sfäroider misslyckas HUVEC-nätverkskontrollbrunnar på egen hand med att hålla sin nätverksmorfologi och dö efter 16 timmar.
Figur 1: Representativa konfokala mikroskopibilder av bröstepitela sfäroider. MCF10A sfäroider var märkta för integrin α6 (grön) och atomkärnor (blå). Cell fenotyp kan bekräftas efter bioprinting när sfäroider visas runt med en ihålig centrum (inset) och har integrin α6 polariseras vid ytterkanterna. MDA-MB-231 sfäroider var märkta för aktin (grön) och atomkärnor (blå). Cell fenotyp kan bekräftas när sfäroider är oregelbundet formade utan ihåliga centra och har cellprocesser invaderar in i den omgivande matrisen. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa bilder av HUVEC-nät efter faskontrast och konfokal mikroskopi. HUVEC-nätverk visas som små flercelliga noder med linjer med celler som förbinder noderna. För konfokal mikroskopi var cellerna märkta med Cell Tracker Red och Hoescht för atomkärnor (blå). Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa bilder av bröstepitela sfäroider samkulturerade med HUVEC-nätverk. MCF10A-sfäroider, märkta för integrin α6 (grön) och atomkärnor (blå), förblir runda och verkar fästa direkt på endotelnätverken. MDA-MB-231 sfäroider, märkta för aktin (grön) och atomkärnor (blå), verkar amorfa men förblir nära eller på endotel nätverk. Samkulturer upprätthåller denna morfologi i minst 24 timmar efter bioprinting, varefter bröstceller kan migrera ut längs endotelrören. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är det första i sitt slag att bioprint sfäroider i sin 3D arkitektur för samkultur med endotelceller också i sin 3D arkitektur. Kritiska protokoll steg inkluderar den första bildandet av bröst epitelial sfäroider och HUVEC nätverk. Extrem försiktighet måste iakttas vid utfodring av amningsepitela sfäroider, eftersom de lätt störs från matrislösningen. På samma sätt måste bröstepitela sfäroider behandlas varsamt när de pipetted av matrislösningen och blandas i nätverken. HUVEC-nätverk bör inte pläteras med för hög densitet eller lämnas längre än 16 timmar, eftersom de kommer att bilda ett monolager eller dö, respektive. Slutligen bör all bioprinting ske i en steril miljö vid 37 °C för att maximera cellens livskraft.
Bröst epitelial sfäroider kan bioprintas i en mängd olika bioinks förutom Matrigel, inklusive alginat och alginat-kollagen blandningar. Vi visade att sfäroider var livskraftiga och bibehöll sin morfologi när de trycktes i alginatbaserade bioinks41. Medan vi presenterar bioprinting här i matrislösningsbaserad biobläck, är andra billigare och lättare att använda bioinks också möjliga. Vi använde dessutom andra bröstcancer cellinjer, inklusive MCF-7 och genetiskt modifierade MCF10A-NeuN celler med liknande framgång38,41,45. Alternativa medel kan också användas för att skapa bröst epitelial sfäroider. Till exempel använde Lee et al. hydrogel microwell matriser som produceras med PDMS-stämplar för att skapa enhetligt stora sfäroider av kontrollerad storlek46. Slutligen kan alternativa endotelceller som tumör-härledda endotelceller användas, och i stället för att bilda HUVEC-nätverk kan fettvävnadsbaserade mikrovessuler direkt bioprintas som 3D-kärlstrukturer47.
En primär begränsning av denna metod var utmaningen att kontrollera bioprinted sfäroid plats och nummer. Sfäroider måste skrivas ut med relativt stora munstycken och inviscida vätskor för att förhindra sfäroidskador. Snabbt gelering bioinks kan bättre kontrollera sfäroid plats. Sfäroider kunde inte heller räknas i biobläcket, eftersom de var för stora för vår cellräknare. Vi förlitade oss istället på sfäroidantal som härrörde från faskontrastbilder tagna före pipetting sfäroider från Matrigel ytan. Alternativa sätt att bilda sfäroiderna kan bättre kontrollera deras antal och storlek. Vi kunde kontrollera sfäroidnummer och storlek med måttlig noggrannhet genom att använda cellsilar och odlingssfäroider på samma sätt varje gång. En sista begränsning är att bröst epitelceller migrerar ut ur sfäroiderna och längs endotel nätverk över tiden. Det är möjligt att alternativa bioinks skulle upphäva denna begränsning.
Direkt bioprinting av bröst epitelial sfäroider på förformade HUVEC nätverk möjliggör skapandet av en 3D in vitro tumör co-culture modell på kort tid. Forskare kan sedan snabbt undersöka interaktioner mellan sfäroider och vaskulatur med högre genomströmning. I framtiden kan bröst epitelial sfäroider bioprintas på perfused vaskulaturer, vilket skulle möjliggöra studier av flöde effekter. Dessutom kan tumör-härledda organoider och endotelceller bioprintas för att möjliggöra precisionsmedicin genom testning av läkemedelseffekt i en patientspecifik modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av NIH 1R01HL140239-01 till AMC. Vi vill tacka Cell Imaging Center vid Drexel University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity | Sanyo | MCO-20AIC | Cell incubation |
| 3D Bio printer | custom-made | None | Used for bioprinting |
| 8-well chamber slides | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | for seeding spheroids |
| 25-gauge needle | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | bioprinting syringe needle |
| Absolute ethanol (200 proof ) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | reconsitution of media components |
| Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | secondary block - Immunofluorescence |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday antibody-Immunofluorescence |
| Bovine insulin | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Media additive |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Blocking agent -Immunofluorescence |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Remove large or clustered spheroids |
| CellTracker™ Red CMTPX Dye | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | pre-stain for HUVEC tubes |
| Compact Centrifuge | Hermle- Labnet, Edison ,NJ | Z206A | For cell centrifugations |
| Cholera Toxin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Media additive |
| Conical tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Collecting and resuspending cells |
| Countess II-FL Cell counter | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | counting cells |
| Glass pipettes (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | cell resuspension |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A basal media |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 basal media |
| Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC basal media |
| Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors) |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Labelling MDA-MB-231 spheroids | |
| Fetal Bovine serum | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 media additive |
| Goat serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | Immunofluorescence labelling component |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | immunofluorescence buffer component |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Nuclei stain immunofluorescence |
| Horse Serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Media additive |
| Hydrocortisone | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Media additive |
| Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) | Cell applications, San Diego , CA | 200-05f | Endothelial cell lines |
| Integrin α6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Immunofluorescence spheroid labelling component |
| Live Dead assay | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| LSM 700 Confocal microscope | Zeiss, Thornwood, NY | Used to visualize cells | |
| Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Spheroid formation |
| MCF10A cells | ATCC | CRL-10317 | Breast cell line |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | HTB-26 | Breast cell line |
| Paraformaldehyde | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | cell fixative |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive |
| Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Wash buffer for cells before trypsinization |
| Phosphate buffer saline 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | immunofluorescence buffer component |
| Prolong gold antifade | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | immunofluorescence mountant medium |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ assay media component |
| Sodium Azide | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | immunofluorescence buffer component |
| Sterile syringe (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | bioprinting process |
| Tissue culture dish (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | monolayer cell culture |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | immunofluorescence buffer component |
| Trypan blue 0.4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | cell counter additive |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | cell detachment |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | immunofluorescence buffer component |
| Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC tube additive |
| Volocity 6.3 cell imaging software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z stack compresser |
References
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19 (2016).
- Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, Pt 5 1945-1957 (1995).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
- Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, Pt 12 2377-2388 (2003).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
- Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66 (2011).
- Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
- Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), Cambridge. 1068-1078 (2015).
- Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671 (2015).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), Kidlington. 539-553 (2015).
- Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
- Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589 (2016).
- Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), Cambridge. 1262-1271 (2013).
- Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S.
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
- Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
- Zhang, Y. S., et al.
- Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101 (2015).
- Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
- Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
- Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
- Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003 (2019).
- Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
- Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285 (2015).
- Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
- Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
- Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145 (2018).
- Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).
