Summary
O objetivo deste protocolo é bioimprimir diretamente as células epiteliais mamárias como esferoides multicelulares em redes endoteliais pré-formadas para criar rapidamente modelos de cocultura 3D de mama endotelial que podem ser usados para estudos de triagem de medicamentos.
Abstract
A bioimpressão está emergindo como uma ferramenta promissora para fabricar modelos de câncer humano 3D que melhor recapitulem marcas críticas da arquitetura de tecidos in vivo. Na bioimpressão atual de extrusão de camada por camada, as células individuais são extrudadas em um bioink juntamente com pistas espaciais e temporais complexas para promover a auto-montagem do tecido hierárquico. No entanto, essa técnica de biofabricação conta com interações complexas entre células, bioinks e sinais bioquímicos e biofísicos. Assim, a automontagem pode levar dias ou até semanas, pode exigir bioinks específicos, e pode nem sempre ocorrer quando há mais de um tipo de célula envolvida. Desenvolvemos, portanto, uma técnica para bioimpressão pré-formada esferoides epiteliais de mama 3D em uma variedade de bioinks. Os esferoides epiteliais de mama 3D pré-formados bioimpressas sustentaram sua viabilidade e arquitetura polarizada após a impressão. Também imprimimos os esferoides 3D em redes de células endoteliais vasculares para criar um modelo de co-cultura. Assim, a nova técnica de bioimpressão cria rapidamente um modelo de mama humano 3D mais fisiologicamente relevante a um custo menor e com maior flexibilidade do que as técnicas tradicionais de bioimpressão. Esta técnica versátil de bioimpressão pode ser extrapolada para criar modelos 3D de outros tecidos em bioinks adicionais.
Introduction
Modelos de tumores vascularizados in vitro 3D são ferramentas essenciais para o estudo mecanicista do crescimento do câncer e da metástase. Para o câncer de mama em particular, as células epiteliais mamárias cultivadas em Matrigel se organizam em esferoides polarizados que se assemelham mais à arquitetura acinus mamária in vivo1,2,3,4,5,6,7,8. A cultura epitelial da mama 3D também impacta a função celular, com culturas 3D mostrando diferenças na modulação do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGF)8,9; função oncogene, incluindo ErbB210; crescimento e apoptose sinalizando11,12; e resistência à quimioterapia13,14. As células endoteliais vasculares respondem de forma semelhante aos estímulos ambientais em 3D vs. cultura 2D tradicional15,16,17,18. No entanto, grande parte da compreensão das interações epiteliais vasculares e mamárias vem da cultura 2D usando pastilhas médias ou transwell condicionadas, ou modelos 3D nos quais os dois tipos de células são fisicamente separados19,20,21,22,23. Esses modelos de cocultura fornecem uma visão fisiológica limitada, uma vez que tanto a cultura 3D quanto o contato celular-célula são fundamentais para a endotelial vascular – interações epiteliais mamárias24,25,26.
Modelos de câncer 3D foram fabricados utilizando uma variedade de técnicas, incluindo formação de spheroid suspensa, bioimpressão, montagem magnética e cultura dentro de hidrogéis ou em andaimes projetados5,27,28,29. Mais recentemente, modelos de tumor 3D foram criados com vários tipos de células dispostos em suas respectivas estruturas 3D. Em um exemplo de uma plataforma tumor-on-a-chip, câncer, células endoteliais e estromais foram misturados em uma matriz e, em seguida, injetados nas três câmaras centrais de tecido em um dispositivo polidimetilsiloxano (PDMS). As câmaras de tecido eram cercadas por dois canais externos que representavam uma artéria e venule. Após 5-7 dias de cultura, as células endoteliais formaram uma rede microvascular e as células cancerígenas proliferaram para formar pequenos tumores perto da vasculatura. Esta plataforma foi então usada para rastrear drogas e combinações de drogas30. Plataformas adicionais de tumor-on-a-chip foram criadas para estudar metástase e tipos de câncer com estímulos mecânicos específicos (por exemplo, tensão mecânica no pulmão)31,32. No entanto, essas plataformas geralmente não incluem vasculatura e câncer em suas respectivas estruturas 3D.
A biofabização mostra grande promessa no avanço de modelos de tumores vascularizados in vitro 3D, uma vez que permite um controle espacial rigoroso sobre a localização celular. Apesar do crescimento da bioimpressão na última década, poucos estudos se concentram especificamente nos tumores33,34. Em um exemplo, a impressão 3D de células HeLa em um hidrogel gelatina/alginato/fibrinogen foi usada para criar um modelo de câncer cervical in vitro. As células tumorais foram bioimpressas como células individuais e, em seguida, autorizadas a formar esferoides, que apresentaram maior taxa de proliferação, aumento da expressão metaloproteinase matricial e maior que a quimiosistência do que as células na cultura 2D35. Nesses estudos, como em muitos outros36,37, as suspensões celulares dissociadas foram bioimpressionadas, e então as culturas celulares foram fornecidas com as sugestões mecânicas e bioquímicas necessárias para permitir que as células formassem uma estrutura 3D. No entanto, a automontagem celular pode levar dias ou semanas, pode exigir pistas ambientais espaciais e temporais complexas, ou pode não ocorrer quando dois tipos de células são co-cultivados. Por exemplo, as células epiteliais mamárias induziram a morte celular em células endoteliais em cocultura 2D, e as células epiteliais de mama dissociadas não formaram esferoides 3D quando bioimpressionadas em hidrogéis de alginato/gelatina38. Células epiteliais de mama dissociadas ou cancerosas formaram esferoides em bioinks à base de alginato somente quando presos em moldes PDMS circulares. Em outros casos, os esferoides foram formados usando gotículas suspensas em placas de poço circular de fixação ultra-baixa e, em seguida, misturados em bioinks à base de alginato39,40.
Descrevemos agora um método alternativo de biomafação de tecido 3D neste protocolo. Em vez de células dissociadas de sementes e esperar que essas células formem as estruturas 3D, descrevemos como criar e bioimpressular spheróides tumorais 3D em uma rede de tubos vasculares para criar um modelo de co-cultura tumoral que pode ser usado quase imediatamente. Os esferoides tumorais podem ser cultivados in vitro ou derivados de tecidos humanos (organoides). Da mesma forma, os tubos vasculares podem ser cultivados ou podem ser derivados de fragmentos microvasculares teciduais adiposos. Os bioinks podem variar de alginato biologicamente inativo ao Matrigel41altamente biologicamente ativo . Uma vez que este modelo de cocultura tumoral 3D pode ser criado com uma variedade de estruturas celulares e bioinks, ele pode incorporar vários tipos de células, matrizes extracelulares e gradientes de quimiocina15,42. Enquanto em sua formulação atual, as redes endoteliais não podem ser perfundidas, futuras iterações poderiam integrar esse método com microfluidos ou sistemas -on-chip. Bioimpressão epitelial 3D em redes endoteliais permite a biofabricação rápida de modelos de mama humana para testes de drogas e medicina de precisão personalizada27.
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Protocol
1. Crescimento de células epiteliais mamárias e mídia de ensaio
- Células epiteliais mamárias MCF10A
NOTA: A linha de células epiteliais de mama imortalizada não tumorigênica é derivada de uma paciente com doença fibrocística43. As células não expressam receptor de estrogênio.- Para preparar 20 μg/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), dissolva 100 μg de EGF liofilizado em 500 μL de dH2O estéril para fazer 200 μg/mL EGF. Adicione 500 μL de 200 μg/mL EGF em 4,5 mL de BSA estéril de 0,1% em dH2O para fazer uma solução de estoque EGF de 20 μg/mL. Loja preparada 20 μg/mL EGF alíquotas a -20 °C por até 12 meses.
- Para preparar 500 μg/mL hidrocortisona, diluir 1 mg de hidrocortisona em 1 mL de etanol absoluto (prova de 200). Adicione 1 mL de DMEM F:12 estéreis a esta mistura para fazer uma solução de estoque de hidrocortisona de 500 μg/mL. Armazene alíquotas de estoque de hidrocortisona a -80 °C por até 12 meses.
- Para preparar 10 μg/mL toxina da cólera, dissolva 1 mg de pó liofilizado de toxina cólera em 1 mL de dH2O estéril para fazer uma solução de estoque de toxina de cólera de 1 mg/mL. Armazene alíquotas de estoque de toxinas de cólera a -80 °C por até 12 meses.
- Para preparar o Growth Medium, adicione 500 μL de EGF (20 μg/mL), 500 μL de hidrocortisona (500 μg/mL), 5 μL de toxina de cólera (1 mg/mL), 500 μL de insulina bovina (10 mg/mL), 10 mL de penicilina e estreptomia, e 25 mL de soro de cavalo a 500 mL de DMEM F:12 para uma concentração final de 20 ng/mL EGF, 500 ng/mL hidrocortisona, 10 ng/mL toxina de cólera, 10 ng/mL insulina bovina, penicilina v/v e estreptomicina, e 5% de soro v/v de cavalo. A concentração de antibióticos foi aumentada para 2% para explicar a diminuição da esterilidade no processo de bioimpressão; no entanto, a concentração de antibióticos pode ser reduzida para 1%.
- Para preparar o Assay Medium, adicione 500 μL de hidrocortisona (500 μg/mL), 5 μL de toxina de cólera (1 mg/mL), 500 μL de insulina bovina (10 mg/mL), 10 mL de penicilina e estreptomicina, e 25 mL de soro de cavalo a 500 mL de DMEM F:12 para uma concentração final de 500 ng/mL hidrocortisona, 10 ng/mL micose de cólera, 10 ng/mL insulina bovina, 2% v/v penicilina e estreptomicina, e 5% v/v de soro de cavalo.
- MDA-MB-231
NOTA: A linha celular epitelial do câncer de mama triplamente negativa (sem receptor de estrogênio, receptor de progesterona e receptor de fator de crescimento epidérmico 2) é criada a partir da efusão pleural de uma paciente do sexo feminino com adenocarcinoma mamário metastático44. As células representam um câncer de mama agressivo, invasivo e pouco diferenciado.- Para preparar o Crescimento e o Médio de Ensaio, adicione 50 mL de soro bovino fetal, 10 mL de penicilina e estreptomicina, e 25 mL de soro de cavalo a 500 mL de DMEM para concentração final 10% v/v soro bovino fetal, 2% v/v penicilina e estreptomicina, e 5% v/v de soro bovino.
2. Cultura celular epitelial mamária
- Semente 500.000 células MCF10A ou MDA-MB-231 em um prato de cultura de tecido de 10 cm (P100) com 10 mL de mcf10A ou mídia de crescimento MDA-MB-231. As células MCF10A e MDA-MB-231 atingem >90% de confluência em 48 horas.
- Para passar células epiteliais mamárias, primeiro lavar células com 10 mL de PBS quente.
- Despete as células epiteliais da mama adicionando 2 mL de 0,05% Trypsin-EDTA ao prato. Coloque o prato em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 por 20-25 minutos.
- Adicione 5 mL de MCF10A ou MDA-MB-231 Growth Medium às células experimentpsinizadas para neutralizar a trippsina. Pipeta a mistura de mídia celular para cima e para baixo para resuspend células e quebrar aglomerados celulares.
- Adicione a suspensão celular a um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 1.200 x g por 3 minutos. Aspire cuidadosamente o supernasal e resuspenha a pelota de célula em 5 mL de MCF10A ou MDA-MB-231 Growth Medium.
- Placa 1 mL de suspensão celular em 5 novos pratos de cultura tecidual de 10 cm, juntamente com MCF10A ou MDA-MB-231 Growth Medium. Coloque os pratos em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2. As células estarão prontas para serem passagem novamente em 2-3 dias. As células MCF10A podem ser mantidas na passagem número 35, após a qual apresentam alterações morfológicas. As células MDA-MB-231 podem ser mantidas na passagem número 24, após a qual apresentam alterações morfológicas.
3. Formação esferoide Epitelial de Mama
- Congele 200 pontas de pipeta μL por 30 minutos antes de iniciar o ensaio. Mantenha a solução matricial reduzida do fator de crescimento (por exemplo, Matrigel) (10 mg/mL) no gelo durante todo o processo.
- Pipeta lentamente 30 μL de solução de matriz gelada usando pontas de pipeta de 200 μL geladas em cada poço de um escorregador de câmara de 8 poços. Comece pelos lados e arraste a ponta da pipeta ao longo dos cantos, adicionando uma gota final ao centro do poço para garantir um revestimento uniforme de cada poço. Evite bolhas de ar durante esta etapa para garantir uma camada uniforme de solução de matriz. Use novas dicas de pipeta para cada poço.
- Incubar lâminas de câmara em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 15-20 minutos para polimerizar a solução matricial.
- Células MCF10A experimentadas de resuspendam em 200.000 células/mL ou células MDA-MB-231 experimentadas em MDA-MB-231 Em MDA-MB-231 Growth Medium a 200.000 células/mL.
- Se usar células MCF10A, prepare o novo McF10A Spheroid Growth Medium adicionando 5 μL de EGF (20 μg/mL) e 100 μL de solução matricial a 5 mL de Assay Medium para uma concentração final de 2% de solução matricial.
- Remova o slide da câmara pré-revestido com solução de matriz da incubadora. Adicione 50 μL de suspensão celular MCF10A ou MDA-MB-231 (10.000 células) a cada poço. Se usar células MCF10A, adicione 450 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium. Se usar células MDA-MB-231, adicione 450 μL de MDA-MB-231 Growth Medium pré-misturada com solução de matriz de 2% (9 μL). Coloque imediatamente o deslizamento da câmara em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
- Substitua o meio a cada 4 dias. Pipeta cuidadosamente 200 μL de mídia antiga de um canto de cada poço usando uma ponta de pipeta de 200 μL. Durante este processo, incline o deslizamento da câmara a 45° para garantir que os esferoides não sejam perturbados. Adicione 200 μL de McF10A Spheroid Growth Medium recém-preparado ou MDA-MB-231 Growth Medium previamente misturado com solução de matriz de 2% para cada poço no canto em gotas para garantir que os esferoides permaneçam ligados à matriz de camadas. Apenas ~50% da mídia é substituída para que todas as citocinas produzidas pelos esferoides não estejam completamente esgotadas.
NOTA: Os epitélios mamários MCF10A levam até 8 dias para polarizar e formar centros ocos. Os esferoides epiteliais mamários MDA-MB-231 levam até 5 dias para se formar e não têm centros ocos.
4. Formação da Rede celular endotelial
- Cultura da Célula Endotelial da Veia Umbilical Humana (HUVEC)
- Adicione o conteúdo de um único kit de crescimento endotelial médio-2 contendo fator de crescimento de insulina, fator de crescimento do fibroblasto, fator de crescimento endotelial vascular, ácido ascórbico, fator de crescimento epidérmico, heparina e gentamicina-anfotericina B, juntamente com 50 mL de soro bovino fetal, penicilina-estreptomicina de 5 mL e 5 mL de glutamina de 200 mM a 500 mL de Médio-2 Basal Endotelial (EBM-2) para criar médio completo de crescimento endotelial (EGM-2).
- Semente 500.000 células endoteliais em um prato de cultura tecidual de 10 cm em 10 mL de EGM-2. Coloque as células em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 até atingirem >80% de confluência (em torno de 48 horas).
- Para as células de passagem, lave as células endoteliais com 10 mL de PBS quente. Desprender huvec adicionando 2 mL de 0,05% Trypsin-EDTA ao prato de cultura tecidual de 10 cm. Monitore de perto as células por microscopia de contraste de fase. As células estão prontas quando estão emarinhadas, mas permanecem presas ao prato.
- Aspire cuidadosamente o trypsin para fora do prato. Adicione 8 mL de EGM-2 ao prato. Lave as células do prato, pipetando o EGM-2 para cima e para baixo sobre toda a superfície do prato.
- Alternativamente, adicione 5 mL de EGM-2 às células experimentadas para neutralizar a trippsina. Pipeta a mistura de mídia celular para cima e para baixo para resuspend células e quebrar aglomerados celulares. Adicione a suspensão celular a um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 1.200 x g por 3 minutos. Aspire cuidadosamente o supernasce e resuspenja a pelota de célula em 10 mL de EGM-2.
- Adicione 1 mL de suspensão celular a 9 mL de EGM-2 em um prato de cultura tecidual de 10 cm. Coloque os pratos em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2. Troque 2/3 do meio com EGM-2 fresco a cada 2 dias. As células estarão prontas para passar em 3-5 dias. O HUVEC pode ser mantido até a passagem 8 após o qual eles não conseguem formar redes.
- Formação de Rede de Células Endoteliais (HUVEC)
- Congele 200 pontas de pipeta μL por 30 minutos antes de iniciar o ensaio. Mantenha a solução matricial reduzida do fator de crescimento (10 mg/mL) no gelo durante todo o processo.
- Pipeta lentamente 30 μL de solução de matriz gelada usando pontas de pipeta de 200 μL geladas em cada poço de um escorregador de câmara de 8 poços. Comece pelos lados e arraste a ponta da pipeta ao longo dos cantos, adicionando uma gota final ao centro do poço para garantir um revestimento uniforme de cada poço. Evite bolhas de ar durante esta etapa para garantir uma camada uniforme de solução de matriz. Use novas dicas de pipeta para cada poço.
- Incubar lâminas de câmara em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2 por 15-20 minutos para polimerizar Matrigel.
- Pré-colorir um prato de 10 cm de HUVEC com 10 μL de rastreador de célula vermelha (1:1000) por 30 minutos em 37 °C, 5% incubadora CO2.
- Lave células endoteliais com 10 mL de PBS quente. Desprender huvec adicionando 2 mL de 0,05% Trypsin-EDTA ao prato de cultura tecidual de 10 cm. Coloque o prato em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 por 5 minutos para desprender totalmente as células.
- Adicione 5 mL de EGM-2 ao prato para neutralizar o trypsin. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 25 mL. Centrifugar HUVEC a 1.200 x g por 5 minutos. Aspire o supernasce e resuspense a pelota celular em 5 mL de EBM-2 sem soro.
- Conte células usando azul Trypan para determinar células viáveis. Crie uma solução de 1 x 106 células/mL.
- Adicione 100.000 HUVEC a cada poço com 200 μL de EBM-2 sem soro. Se mais células forem adicionadas, elas criarão uma monocamada superficial em vez de uma rede de tubos.
- Incubar huvec em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2. Após 6 horas, imagem redes HUVEC por microscopia de contraste de fase. As redes estão prontas para a cocultura com esferoides de mama.
5. Bioimpressão Epiteliais epitelóides em redes HUVEC pré-formadas
NOTA: Um sistema de bio-deposição de bico duplo deve ser usado para o processo de biofabização. Neste caso, o sistema tinha três braços de movimento para permitir o controle espacial em escala de micron da deposição de material, bem como dois motores acionados por parafuso para depositar bioink a partir de seringas de 10 mL. O sistema deve ser funcionalizado com um sistema de filtragem de ar particulado de alta eficiência, bem como capacidades de esterilização UV para manter um ambiente estéril durante a bioimpressão. A bioimpressora é esterilizada por uma hora antes do processo de impressão.
- Crie esferoides epiteliais mamários e redes HUVEC como descrito anteriormente. Estimar o número de esferoides epiteliais mamários em cada poço contando esferoides em imagens de microscopia de contraste de fase representativa.
- Corte 0,5 cm da extremidade de uma ponta de pipeta de 1000 μL. Use a ponta de pipeta cortada para pipeta cuidadosamente todos os esferoides fora do deslizamento de câmara de 8 poços e em um tubo de 50 mL. Spheróides resuspend no bioink selecionado a 100 esferoides/100 μL.
NOTA: Concentrações mais elevadas de esferoides podem resultar em agrupamento esferoides e impedir a visualização de interações entre os esferoides e as redes endoteliais. - Passe a mistura de esferoides através de um coador de células de 70 μm para remover quaisquer esferoides grandes ou agrupados.
- Carregue os esferoides agrupados em uma seringa estéril de 10 mL e tampe-a com uma agulha estéril de calibre 25. Conecte a seringa ao sistema de bio-deposição.
- Aspire o meio fora das redes HUVEC no slide de câmara de 8 poços.
- Extrude 100 μL de esferoides epiteliais mamários em 6 poços de redes HUVEC a uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Mantenha 2 poços de redes HUVEC como controles.
- Adicione 400 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium se usar spheroids MCF10A impressos em redes HUVEC ou adicionar 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium previamente misturado com solução de matriz de 2% se usar spheroids MDA-MB-231 impressos em redes HUVEC. O respectivo meio de crescimento esferoide deve ser utilizado em poços de controle HUVEC.
- Incubar co-culturas em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 24 – 96 horas sem alteração de mídia. As coculturas permanecerão viáveis no meio original por até quatro dias.
6. Microscopia Confocal
- Preparação de tampão de lavagem de imunofluorescência e PBS-Glycine
- Prepare a solução de estoque tampão de imunofluorescência (IF) 10x adicionando 2,5 g de azida de sódio, 5 g de albumina de soro bovino, 10 mL de Triton X-100 e 2,05 mL de Tween-20 em 500 mL de 10x PBS. Ajuste o pH para 7,4. Armazene a solução de estoque por até um ano a 4 °C para evitar sedimentação.
- Crie um buffer IF funcionando diluindo 50 mL de 10x IF tampão em 450 mL de água deionizada estéril. Armazene a solução de trabalho em temperatura ambiente por até uma semana.
- Prepare a solução de estoque tampão PBS-Glycine de 10x adicionando 37,5 g de glicina a 500 mL de PBS 10x. Ajuste o pH para 7,4. Armazene a solução de estoque por até 6 meses a 4 °C para evitar sedimentação.
- Crie uma solução PBS-Glycine em funcionamento diluindo 50 mL de tampão PBS-Glycine de 10x em 450 mL de água desionizada estéril. Armazene a solução de trabalho a 4 °C por até uma semana.
- Rotular Amostras bioimpressoras e imagem por Microscopia Confocal
- Aspirar meio a partir de co-culturas 3D bioimpressionadas e enxaguar 3 vezes com PBS quente. Corrija co-culturas 3D bioimpressoras com 4% de paraformaldeído por 1 h à temperatura ambiente. Enxágüe amostras 3 vezes por 20 minutos com 1x PBS-Glycine.
- Bloqueie amostras com tampão IF misturado com soro de cabra de 10% por 90 minutos (bloco primário), seguido de 40 minutos com tampão IF mais 10% de soro de cabra e fragmento de Affinipure Fab (1:100, bloco secundário).
- Se usar esferoides MCF10A, rotule amostras com um anticorpo primário para integrin α6 (1:100) no buffer de bloqueio secundário durante a noite a 4 °C, seguido por um Alexa Fluor 488 anticorpo secundário (1:200) e Hoescht 33342 (1:1000) para 1h à temperatura ambiente protegido da luz. As linhas celulares MCF10A expressam altos níveis de integrin α6, o que é essencial para mostrar polarização e morfologia efpheróides.
- Se usar spheroids MDA-MB-231, que expressam baixos níveis de integrin α6, rotule amostras com Alexa Fluor 488 fálice (1:100) e Hoescht 33342 (1:1000) em tampão de bloqueio secundário por 4 horas à temperatura ambiente protegido da luz. A falotinina permite a visualização de filamentos de actina para que a morfologia amorfo e invasiva e esfélide possa ser avaliada.
- Lave amostras com 1X PBS-glycine 3 vezes por 20 minutos.
- Prepare amostras para montagem removendo o slide da câmara usando a ferramenta do fabricante. Adicione uma pequena gota de solução antifade a cada poço. Coloque uma tampa de 22 mm x 60 mm em cada slide de câmara e sele cuidadosamente as bordas com esmalte claro.
- Amostras de imagem usando um microscópio confocal como pilhas Z de ~10 fatias em passos de 5 μm. Se desejar, comprimir os planos Z em um único plano usando o comando Extended Focus no software de imagem celular.
- Quantifique a adesão eferóide às redes endoteliais usando a imagem J. O número de esferoides aderidos pode ser quantificado usando o plugin de análise com o tamanho e circularidade de partículas apropriados. Normalize o número de esferoides conectados à área de imagem.
- Para garantir a reprodutibilidade, quantifique o número de esferoides aderidos em imagens de 4 x 4 de azulejos de co-culturas. Se o número de esferoides for estatisticamente significativamente menor do que outros experimentos, o experimento deve ser repetido.
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Representative Results
As células epiteliais mamárias devem se auto-organizar em esferoides 3D após 5-8 dias de cultura sobre solução matricial e em meio de cultura com solução de matriz de 2%. Epitóides epiteliais não tumorigênicos MCF10A devem aparecer redondos e ter um centro oco, com integrin α6 polarizado à borda externa do esferoide(Figura 1, inset mostra centros ocos). Células epiteliais altamente invasivas MDA-MB-231 formam esferoides irregulares. Os esferoides devem ser usados quando tiverem cerca de 100 a 300 μm de diâmetro. Quando os esferoides se tornam muito grandes e se aproximam, os esferoides se unirão para formar megaesferóides. Além disso, os esferoides epiteliais mamários MDA-MB-231 podem mostrar células migrando para fora dos esferoides se mantidas na cultura Matrigel por muito tempo.
O HUVEC deve se auto-organizar em redes semelhantes a tubos após 6-8 horas de cultura esparsa e livre de soro. As amostras terão nós multicelulares com conexões formadas de linhas de 1-3 células em paralelo. As redes HUVEC podem ser imagens por microscopia de contraste de fase ou por microscopia confocal se forem rotuladas com Cell Tracker e Hoescht(Figura 2). O analisador de angiogênese ImageJ pode ser usado para quantificar junções de rede, segmentos e ramos. As redes HUVEC morrerão se deixadas em meio livre de soro por mais de 16 horas.
Quando os esferoides epiteliais da mama são bioimpressas nas redes HUVEC, tanto os esferoides quanto as redes devem manter sua morfologia original por pelo menos 24 horas. Os esferoides epiteliais mamários MCF10A aparecerão como objetos redondos que aderem diretamente às redes endoteliais, enquanto os esferoides epiteliais mamários MDA-MB-231 aparecerão mais amorfos, mas ainda ligados ou próximos às redes endoteliais(Figura 3). As redes HUVEC serão mantidas quando co-cultivadas com esferoides epiteliais mamários. Para co-culturas com mais de 24 horas, as células epiteliais mamárias podem migrar para fora dos esferoides e ao longo das redes endoteliais. Em nossa experiência, isso acontece mais cedo em células epiteliais de mama tumorigênicas38. Anteriormente, demonstramos usando co-culturas bioimpressas que o teste de drogas pode ser iniciado até 2 horas após a bioimpressão esferoide, por exemplo, para testar a adesão eferóide às redes endoteliais45. Também mostramos que os esferoides de mama 3D são mais resistentes a drogas anticânculas como o Paclitaxel do que quando impressos como células individuais ou na co-cultura41,45. Na ausência de esferoides bioimprimidos, os poços de controle de rede HUVEC por conta própria não conseguem segurar sua morfologia de rede e morrem após 16 h.
Figura 1: Imagens representativas de microscopia confocal de esferoides epiteliais mamários. Os esferoides MCF10A foram rotulados para integrin α6 (verde) e núcleos (azul). O fenótipo celular pode ser confirmado após a bioimpressão quando os esferoides aparecem redondos com um centro oco (inset) e têm integrin α6 polarizado nas bordas externas. Os esferoides MDA-MB-231 foram rotulados para actin (verde) e núcleos (azul). O fenótipo celular pode ser confirmado quando os esferoides são irregularmente moldados sem centros ocos e têm processos celulares invadindo a matriz circundante. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas das redes HUVEC por contraste de fase e microscopia confocal. As redes HUVEC aparecem como pequenos nódulos multicelulares com linhas de células que conectam os nódulos. Para microscopia confocal, as células foram rotuladas com Cell Tracker Red e Hoescht para núcleos (azul). Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas de esferoides epiteliais de mama co-cultivados com redes HUVEC. Os esferoides MCF10A, rotulados para integrin α6 (verde) e núcleos (azul), permanecem redondos e aparecem aderidos diretamente às redes endoteliais. Os esferoides MDA-MB-231, rotulados para actina (verde) e núcleos (azul), parecem amorfos ainda permanecem próximos ou em redes endoteliais. Co-culturas mantêm essa morfologia por pelo menos 24 horas após a bioimpressão, após a qual as células mamárias podem migrar ao longo dos tubos endoteliais. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo é o primeiro de seu tipo a bioimpressão spheroids em sua arquitetura 3D para co-cultura com células endoteliais também em sua arquitetura 3D. As etapas críticas do protocolo incluem a formação inicial de esferoides epiteliais mamários e redes HUVEC. Deve-se ter extrema cautela na alimentação de esferoides epiteliais mamários, pois são facilmente interrompidos da solução matricial. Da mesma forma, os esferoides epiteliais mamários devem ser tratados com cuidado quando são pipetted fora da solução matricial e misturados nas redes. As redes HUVEC não devem ser banhadas em uma densidade muito alta ou deixadas por mais de 16 horas, pois formarão uma monocamadas ou morrerão, respectivamente. Finalmente, toda a bioimpressão deve ocorrer em um ambiente estéril a 37 °C para maximizar a viabilidade celular.
Esferoides epiteliais de mama podem ser bioimpressados em uma variedade de bioinks além de Matrigel, incluindo misturas de alginato e alginato-colágeno. Demonstramos que os esferoides eram viáveis e mantiveram sua morfologia quando impressos em bioinks à base de alginato41. Assim, enquanto apresentamos bioimpressão aqui no bioink baseado em solução matricial, outros bioinks menos baratos e fáceis de usar também são possíveis. Também usamos outras linhas de células cancerígenas de mama, incluindo MCF-7 e células MCF10A-NeuN geneticamente modificadas com sucesso semelhante38,41,45. Meios alternativos também poderiam ser usados para criar os esferoides epiteliais da mama. Por exemplo, Lee et al. usaram matrizes de microwell de hidrogel produzidas usando selos PDMS para criar esferoides de tamanho uniforme de tamanho controladotamanho 46. Finalmente, células endoteliais alternativas, como células endoteliais derivadas do tumor, poderiam ser usadas, e em vez de formar redes HUVEC, microvexis derivados de tecido adiposo poderiam ser diretamente bioimprimidos como estruturas vasculares 3D47.
Uma limitação primária desse método foi o desafio no controle da localização e número de esferoides bioimpressuais. Os esferoides tiveram que ser impressos com bicos relativamente grandes e em fluidos inviscid para evitar danos esferoides. Bioinks de gelagem rápida pode controlar melhor a localização esferoide. Esferoides também não podiam ser contados no bioink, já que eram grandes demais para o nosso contador de células. Em vez disso, contamos com contagens de esferoides derivadas de imagens de contraste de fase tiradas antes de pipetting spheroids fora da superfície de Matrigel. Meios alternativos de formação dos esferoides poderiam controlar melhor seu número e tamanho. Fomos capazes de controlar o número e o tamanho esferoides com precisão moderada usando filtros celulares e esferoides de cultivo da mesma forma todas as vezes. Uma limitação final é que as células epiteliais mamárias migram para fora dos esferoides e ao longo das redes endoteliais ao longo do tempo. É possível que bioinks alternativos revogem essa limitação.
A bioimpressão direta de esferoides epiteliais mamários em redes HUVEC pré-formadas permite a criação de um modelo de cocultura de tumor in vitro 3D em pouco tempo. Os pesquisadores podem então examinar rapidamente as interações entre esferoides e vasculatura com maior rendimento. No futuro, os esferoides epiteliais mamários poderiam ser bioimpressas em vasculaturas perfumadas, o que permitiria o estudo dos efeitos do fluxo. Além disso, organoides derivados de tumores e células endoteliais poderiam ser bioimpressionados para permitir a medicina de precisão através de testes de eficácia medicamentosa em um modelo específico do paciente.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo NIH 1R01HL140239-01 para a AMC. Gostaríamos de agradecer ao Centro de Imagens Celulares da Universidade Drexel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity | Sanyo | MCO-20AIC | Cell incubation |
| 3D Bio printer | custom-made | None | Used for bioprinting |
| 8-well chamber slides | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | for seeding spheroids |
| 25-gauge needle | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | bioprinting syringe needle |
| Absolute ethanol (200 proof ) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | reconsitution of media components |
| Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | secondary block - Immunofluorescence |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday antibody-Immunofluorescence |
| Bovine insulin | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Media additive |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Blocking agent -Immunofluorescence |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Remove large or clustered spheroids |
| CellTracker™ Red CMTPX Dye | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | pre-stain for HUVEC tubes |
| Compact Centrifuge | Hermle- Labnet, Edison ,NJ | Z206A | For cell centrifugations |
| Cholera Toxin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Media additive |
| Conical tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Collecting and resuspending cells |
| Countess II-FL Cell counter | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | counting cells |
| Glass pipettes (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | cell resuspension |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A basal media |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 basal media |
| Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC basal media |
| Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors) |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Labelling MDA-MB-231 spheroids | |
| Fetal Bovine serum | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 media additive |
| Goat serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | Immunofluorescence labelling component |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | immunofluorescence buffer component |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Nuclei stain immunofluorescence |
| Horse Serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Media additive |
| Hydrocortisone | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Media additive |
| Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) | Cell applications, San Diego , CA | 200-05f | Endothelial cell lines |
| Integrin α6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Immunofluorescence spheroid labelling component |
| Live Dead assay | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| LSM 700 Confocal microscope | Zeiss, Thornwood, NY | Used to visualize cells | |
| Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Spheroid formation |
| MCF10A cells | ATCC | CRL-10317 | Breast cell line |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | HTB-26 | Breast cell line |
| Paraformaldehyde | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | cell fixative |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive |
| Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Wash buffer for cells before trypsinization |
| Phosphate buffer saline 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | immunofluorescence buffer component |
| Prolong gold antifade | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | immunofluorescence mountant medium |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ assay media component |
| Sodium Azide | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | immunofluorescence buffer component |
| Sterile syringe (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | bioprinting process |
| Tissue culture dish (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | monolayer cell culture |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | immunofluorescence buffer component |
| Trypan blue 0.4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | cell counter additive |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | cell detachment |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | immunofluorescence buffer component |
| Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC tube additive |
| Volocity 6.3 cell imaging software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z stack compresser |
References
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