Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di biostampare direttamente le cellule epiteliali del seno come sferoidi multicellulari su reti endoteliali pre-formate per creare rapidamente modelli di co-coltura endoteliale del seno 3D che possono essere utilizzati per studi di screening farmacologico.
Abstract
La biostampa sta emergendo come uno strumento promettente per fabbricare modelli di cancro umano 3D che ricapitolano meglio i tratti distintivi critici dell'architettura tissutale in vivo. Nell'attuale biostamma di estrusione strato per strato, le singole cellule vengono estruse in un bioink insieme a complessi segnali spaziali e temporali per promuovere l'auto-assemblaggio gerarchico dei tessuti. Tuttavia, questa tecnica di biofabbricazione si basa su interazioni complesse tra cellule, bioinchiostri e segnali biochimici e biofisici. Pertanto, l'auto-assemblaggio può richiedere giorni o addirittura settimane, può richiedere bioinchiostri specifici e potrebbe non verificarsi sempre quando è coinvolto più di un tipo di cellula. Abbiamo quindi sviluppato una tecnica per biostampare direttamente sferoidi epiteliali del seno 3D pre-formati in una varietà di bioinchiostri. Gli sferoidi epiteliali del seno 3D prestampati biostampati hanno sostenuto la loro vitalità e l'architettura polarizzata dopo la stampa. Abbiamo inoltre stampato gli sferoidi 3D su reti cellulari endoteliali vascolari per creare un modello di co-coltura. Pertanto, la nuova tecnica di biostamgrafia crea rapidamente un modello di seno umano 3D più fisiologicamente rilevante a costi inferiori e con una maggiore flessibilità rispetto alle tradizionali tecniche di biostamgrafia. Questa versatile tecnica di biostamce può essere estrapolata per creare modelli 3D di altri tessuti in bioinchiostri aggiuntivi.
Introduction
I modelli tumorali vascolarizzati in vitro 3D sono strumenti essenziali per lo studio meccanicistico della crescita e della metastasi del cancro. Per il cancro al seno in particolare, le cellule epiteliali del seno coltivate a Matrigel si organizzano in sferoidi polarizzati che assomigliano più da vicino all'architettura in vivo dell'acinomammario 1,2,3,4,5,6,7,8. La coltura cellulare epiteliale del seno 3D influisce anche sulla funzione cellulare, con colture 3D che mostrano differenze nella modulazione del recettore del fattore di crescita epidermica (EGF)8,9; funzione oncogene, compreso ErbB210; crescita e apoptosi segnalando11,12; e resistenza allachemioterapia 13,14. Le cellule endoteliali vascolari rispondono in modo diverso agli stimoli ambientali in 3D rispetto alla coltura 2Dtradizionale 15,16,17,18. Tuttavia, gran parte della comprensione delle interazioni endoteliali vascolari e epiteliali del seno proviene da coltura 2D utilizzando inserti condizionati di mezzo o Transwell, o modelli 3D in cui i due tipi di cellule sono fisicamenteseparati 19,20,21,22,23. Questi modelli di co-coltura forniscono una visione fisiologica limitata, poiché sia la coltura 3D che il contatto cellulare-cellulare sono fondamentali per le interazioni endoteliali vascolari - cellule epiteliali del seno24,25,26.
I modelli di cancro 3D sono stati fabbricati utilizzando una varietà di tecniche, tra cui la formazione di sferoidi a goccia appesa, la biostamce, l'assemblaggio magnetico e la coltura all'interno di idrogel osu impalcature ingegnerizzate 5,27,28,29. Più recentemente, i modelli di tumore 3D sono stati creati con più tipi di cellule disposte nelle rispettive strutture 3D. In un esempio di piattaforma tumorale su chip, il cancro, le cellule endoteliali e stromali sono state mescolate in una matrice e quindi iniettate nelle tre camere del tessuto centrale in un dispositivo polidimetilossano (PDMS). Le camere tissutali erano delimitate da due canali esterni che rappresentavano un'arteria e una venula. Dopo 5-7 giorni di coltura, le cellule endoteliali formarono una rete microvascolare e le cellule tumorali proliferarono per formare piccoli tumori vicino alla vascolarizzazione. Questa piattaforma è stata quindi utilizzata per migliorare le combinazioni di farmacie farmaci 30. Ulteriori piattaforme tumorali su chip sono state create per studiare metastasi e tipi di cancro con stimoli meccanici specifici (ad esempio, ceppo meccanico nel polmone)31,32. Tuttavia, queste piattaforme generalmente non includono sia la vascucolatura che il cancro nelle rispettive strutture 3D.
La biofabbricazione mostra grandi promesse nell'avanzamento dei modelli di tumore vascolarizzato 3D in vitro, poiché consente uno stretto controllo spaziale sulla posizione delle cellule. Nonostante la crescita della biostampa nell'ultimo decennio, pochi studi si concentrano specificamente sui tumori33,34. In un esempio, la stampa 3D di cellule HeLa in un idrogel gelatinoso/alginato/fibrinogeno è stata utilizzata per creare un modello di cancro cervicale in vitro. Le cellule tumorali sono state biostampate come singole cellule e quindi hanno permesso di formare sferoidi, che hanno mostrato un più alto tasso di proliferazione, un aumento dell'espressione metalloproteinasi della matrice e una maggiore chemioresistenza rispetto alle cellule nella coltura 2D35. In questi studi, come in molti altri36,37, le sospensioni cellulari dissociate sono state biostampate, e poi alle colture cellulari sono stati forniti i segnali meccanici e biochimici necessari per consentire alle cellule di formare una struttura 3D. Tuttavia, l'auto-assemblaggio cellulare può richiedere giorni o settimane, può richiedere segnali ambientali spaziali e temporali complessi o non può verificarsi quando due tipi di cellule sono co-coltivati. Ad esempio, le cellule epiteliali del seno hanno indotto la morte cellulare nelle cellule endoteliali in co-coltura 2D e le cellule epiteliali del seno dissociate non hanno formato sferoidi 3D quando biostampate in idrogel di alginato / gelatina38. Le cellule epiteliali o tumorali del seno dissociate formavano sferoidi in bioinchiostri a base di alginato solo quando intrappolati in stampi PDMS circolari. In altri casi, gli sferoidi sono stati formati utilizzando goccioline sospese in piastre circolari ad attacco ultra-basso e quindi mescolati in bioinchiostri a base di alginato39,40.
In questo protocollo descriviamo ora un metodo alternativo di biofabbricazione dei tessuti 3D. Piuttosto che seminare cellule dissociate e aspettare che queste cellule formino le strutture 3D, descriviamo come creare e biostampare sferoidi tumorali 3D su una rete di tubi vascolari per creare un modello di co-coltura tumorale che può essere utilizzato quasi immediatamente. Gli sferoidi tumorali possono essere coltivati in vitro o derivati da tessuti umani (organoidi). Allo stesso modo, i tubi vascolari possono essere coltivati o possono essere derivati da frammenti microvascolari del tessuto adiposo. I bioinchiaci possono variare dall'alginato biologicamente inattivo al Matrigel41 altamente biologicamente attivo. Poiché questo modello di co-coltura tumorale 3D può essere creato con una varietà di strutture cellulari e bioinchiostri, può incorporare più tipi di cellule, matrici extracellulari e gradienti di chemiochina15,42. Mentre nella sua formulazione attuale, le reti endoteliali non possono essere perfuse, le iterazioni future potrebbero integrare questo metodo con microfluidi o sistemi -on-chip. La biostampa di sferoidi epiteliali del seno 3D su reti endoteliali consente una rapida biofabbricazione dei modelli mammari umani per il test dei farmaci e la medicina diprecisione personalizzata 27.
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Protocol
1. Crescita delle cellule epiteliali del seno e mezzi di dosaggio
- Cellule epiteliali del seno MCF10A
NOTA: La linea cellulare epiteliale del seno immortalato non tumorigenica è derivata da un paziente con malattia fibrocistica43. Le cellule non esprimono il recettore degli estrogeni.- Per preparare 20 μg/mL di fattore di crescita epidermico (FEG), sciogliere 100 μg di FEG liofilizzato in 500 μL di dHsterile 2O per fare 200 μg/mL FEG. Aggiungere 500 μL di 200 μg/mL FEG in 4,5 mL di BSA sterile 0,1% in dH2O per fare una soluzione stock EGF da 20 μg/mL. Conservare le aliquote EGF da 20 μg/mL preparate a -20 °C per un massimo di 12 mesi.
- Per preparare 500 μg/mL idrocortisone, diluire 1 mg di idrocortisone in 1 mL di etanolo assoluto (dimostrazione 200). Aggiungere 1 mL di DMEM F:12 sterile a questa miscela per fare una soluzione di stock di idrocortisone da 500 μg/mL. Conservare le aliquote di stock di idrocortisone a -80 °C per un massimo di 12 mesi.
- Per preparare una tossina colera da 10 μg/mL, sciogliere 1 mg di polvere liofilizzata di tossine colera in 1 mL di dH2O sterile per fare una soluzione di 1 mg/mL di stock di tossine colera. Conservare le aliquote delle scorte di tossina colera a -80 °C per un massimo di 12 mesi.
- Per preparare il terreno di crescita, aggiungere 500 μL di EGF (20 μg/mL), 500 μL di idrocortisone (500 μg/mL), 5 μL di tossina colera (1 mg/mL), 500 μL di insulina bovina (10 mg/mL), 10 mL di penicillina e streptomicina, e da 25 mL di siero di cavallo a 500 mL di DMEM F:12 per una concentrazione finale di 20 ng/mL EGF, 500 ng/mL idrocortisone, 10 ng/mL tossina colera, 10 ng/mL di insulina bovina, 2% di penicillina e streptomicina e siero di cavallo 5% v/v. La concentrazione di antibiotici è stata aumentata al 2% per tenere conto della diminuzione della sterilità nel processo di biostamgrafia; tuttavia, la concentrazione di antibiotici può essere abbassata all'1%.
- Per preparare il mezzo di dosaggio, aggiungere 500 μL di idrocortisone (500 μg/mL), 5 μL di tossina colera (1 mg/mL), 500 μL di insulina bovina (10 mg/mL), 10 mL di penicillina e streptomicina, e da 25 mL di siero di cavallo a 500 mL di DMEM F:12 per una concentrazione finale di idrocortisone da 500 ng/mL, tossina colera 10 ng/mL, insulina bovina 10 ng/mL, 2% v/v penicillina e streptomicina e siero di cavallo 5% v/v.
- MDA-MB-231
NOTA: La linea cellulare epiteliale del cancro al seno tripla-negativa (priva di recettore degli estrogeni, recettore del progesterone e recettore del fattore di crescita epidermico 2) è creata dall'effusione pleurica di una paziente con adenocarcinoma mammario metastatico44. Le cellule rappresentano un cancro al seno aggressivo, invasivo e scarsamente differenziato.- Per preparare il terreno di crescita e di dosaggio, aggiungere 50 mL di siero bovino fetale, 10 mL di penicillina e streptomicina e 25 mL di siero di cavallo a 500 mL di DMEM per una concentrazione finale 10% v/v siero bovino fetale, 2% v/v penicillina e streptomicina e siero di cavallo 5% v/v.
2. Coltura cellulare epiteliale del seno
- Semina 500.000 cellule MCF10A o MDA-MB-231 in un piatto di coltura tissutale da 10 cm (P100) con 10 mL di supporti di crescita MCF10A o MDA-MB-231. Le celle MCF10A e MDA-MB-231 raggiungono la confluenza del 90% in 48 ore.
- Per passare le cellule epiteliali del seno, lavare prima le cellule con 10 mL di PBS caldo.
- Staccare le cellule epiteliali del seno aggiungendo 2 mL dello 0,05% di tripina-EDTA al piatto. Mettere il piatto in un incubatore di CO2 da 37 °C per 20-25 minuti.
- Aggiungere 5 mL di MCF10A o MDA-MB-231 Growth Medium alle celle tripsinziate per neutralizzare la tripina. Pipettare la miscela cella-supporto su e giù per rimospendare le cellule e rompere i cluster di celle.
- Aggiungere la sospensione cellulare a un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 1.200 x g per 3 minuti. Aspirare con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 5 mL di MCF10A o MDA-MB-231 Growth Medium.
- Piatto 1 mL di sospensione cellulare in 5 nuovi piatti di coltura tissutale da 10 cm insieme a MCF10A o MDA-MB-231 Growth Medium. Posizionare i piatti in un incubatore di CO 2 a 37 °C,5%. Le cellule saranno pronte per essere di nuovo passaggio in 2-3 giorni. Le cellule MCF10A possono essere mantenute al passaggio numero 35, dopo di che mostrano cambiamenti morfologici. Le cellule MDA-MB-231 possono essere mantenute al passaggio numero 24, dopo di che mostrano cambiamenti morfologici.
3. Formazione epiteliale dello sferoide del seno
- Congelare le punte della pipetta da 200 μL per 30 minuti prima di iniziare il saggio. Mantenere la soluzione a matrice ridotta del fattore di crescita (ad esempio Matrigel) (10 mg/mL) sul ghiaccio per l'intero processo.
- Pipettare lentamente 30 μL di soluzione a matrice ghiacciata utilizzando punte di pipetta ghiacciate da 200 μL in ogni pozzo di uno scivolo a camera da 8 pozzi. Iniziare dai lati e trascinare la punta della pipetta lungo gli angoli, aggiungendo una goccia finale al centro del pozzo per garantire un rivestimento uniforme di ogni pozzo. Evitare bolle d'aria durante questo passaggio per garantire uno strato di soluzione a matrice uniforme. Utilizzare nuove punte di pipetta per ogni pozzo.
- Incubare i vetrini della camera in un incubatore di CO2 a 37 °C per 15-20 minuti per polimerizzare la soluzione matriciale.
- Cellule MCF10A risuspend tripsinziate in MCF10A Assay Medium a 200.000 celle/mL o cellule MDA-MB-231 risospese in MDA-MB-231 Growth Medium a 200.000 celle/mL.
- Se si utilizzano cellule MCF10A, preparare un mezzo di crescita sferoide MCF10A fresco aggiungendo 5 μL di EGF (20 μg/mL) e 100 μL di soluzione matriciale a 5 mL di mezzo di dosaggio per una concentrazione finale di soluzione a matrice del 2%.
- Rimuovere lo scivolo della camera prerivestito con soluzione a matrice dall'incubatore. Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare MCF10A o MDA-MB-231 (10.000 celle) a ciascun pozzo. Se si utilizzano cellule MCF10A, aggiungere 450 μL di MCF10A Spheroid Growth Medium. Se si utilizzano celle MDA-MB-231, aggiungere 450 μL di MDA-MB-231 Growth Medium premiscelato con soluzione a matrice del 2% (9 μL). Posizionare immediatamente lo scivolo della camera in un incubatore di CO2 a 37 °C, al 5%.
- Sostituire il mezzo ogni 4 quattro giorni. Pipettare con cura 200 μL di vecchi supporti da un angolo di ciascun pozzo utilizzando una punta di pipetta da 200 μL. Durante questo processo, inclinare lo scivolo della camera a 45° per assicurarsi che gli sferoidi non siano disturbati. Aggiungere 200 μL di MCF10A Spheroid Growth Medium appena preparato o MDA-MB-231 Growth Medium precedentemente miscelato con soluzione a matrice del 2% ad ogni pozzo all'angolo in gocce per garantire che gli sferoidi rimangano attaccati allo strato della matrice. Solo circa il 50% del supporto viene sostituito in modo che tutte le citochine prodotte dagli sferoidi non siano completamente esaurite.
NOTA: Gli sferoidi epiteliali del seno MCF10A ci tano fino a 8 giorni per polarizzare e formare centri cavi. Gli sferoidi epiteliali del seno MDA-MB-231 richiedere fino a 5 giorni per formarsi e non hanno centri cavi.
4. Formazione della rete cellulare endoteliale
- Cultura della cellula endoteliale della vena ombelicale umana (HUVEC)
- Aggiungere il contenuto di un singolo kit di crescita endoteliale medium-2 contenente fattore di crescita dell'insulina, fattore di crescita dei fibroblasti, fattore di crescita endoteliale vascolare, acido ascorbico, fattore di crescita epidermico, eparina e gentamicina-ampotericina B, insieme a 50 mL di siero bovino fetale, 5 mL penicillina-streptomicina e 5 mL di glutammina da 200 mM a 500 mL di Basale Medio-2 Endoteliale (EBM-2) per creare un mezzo di crescita endoteliale completo (EGM-2).
- Semina 500.000 cellule endoteliali in un piatto di coltura tissutale di 10 cm in 10 mL di EGM-2. Posizionare le cellule in un incubatore di CO2 da 37 °C, 5% fino a raggiungere la confluenza >80% (circa 48 ore).
- Per passare le cellule, lavare le cellule endoteliali con 10 mL di PBS caldo. Staccare HUVEC aggiungendo 2 mL dello 0,05% di Tripina-EDTA al piatto di coltura tissutale da 10 cm. Monitorare da vicino le cellule mediante microscopia a contrasto di fase. Le cellule sono pronte quando vengono ballate verso l'alto ma rimangono attaccate al piatto.
- Aspirare con cura la triptina dal piatto. Aggiungere 8 mL di EGM-2 al piatto. Lavare le celle dal piatto pipettando l'EGM-2 su e giù su tutta la superficie del piatto.
- In alternativa, aggiungere 5 mL di EGM-2 alle cellule tripsinziate per neutralizzare la tripside. Pipettare la miscela cella-supporto su e giù per rimospendare le cellule e rompere i cluster di celle. Aggiungere la sospensione cellulare a un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 1.200 x g per 3 minuti. Aspirare con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 10 mL di EGM-2.
- Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a 9 mL di EGM-2 in un piatto di coltura tissutale da 10 cm. Posizionare i piatti in un incubatore di CO 2 a 37 °C,5%. Scambia 2/3 del mezzo con EGM-2 fresco ogni 2 giorni. Le cellule saranno pronte per il passaggio in 3-5 giorni. HUVEC può essere mantenuto fino al passaggio 8 dopo di che non riescono a formare reti.
- Formazione di rete huvec (Endothelial Cell)
- Congelare le punte della pipetta da 200 μL per 30 minuti prima di iniziare il saggio. Mantenere la soluzione a matrice ridotta del fattore di crescita (10 mg/mL) sul ghiaccio per l'intero processo.
- Pipettare lentamente 30 μL di soluzione a matrice ghiacciata utilizzando punte di pipetta ghiacciate da 200 μL in ogni pozzo di uno scivolo a camera da 8 pozzi. Iniziare dai lati e trascinare la punta della pipetta lungo gli angoli, aggiungendo una goccia finale al centro del pozzo per garantire un rivestimento uniforme di ogni pozzo. Evitare bolle d'aria durante questo passaggio per garantire uno strato di soluzione a matrice uniforme. Utilizzare nuove punte di pipetta per ogni pozzo.
- Incubare gli scivoli della camera in un incubatore di CO2 a 37 °C per 15-20 minuti per polimerizzare Matrigel.
- Pre-macchiare un piatto di 10 cm di HUVEC con 10 μL di tracker di globuli rossi (1:1000) per 30 minuti in 37 °C, 5% di incubatrice di CO2.
- Lavare le cellule endoteliali con 10 mL di PBS caldo. Staccare HUVEC aggiungendo 2 mL dello 0,05% di Tripina-EDTA al piatto di coltura tissutale da 10 cm. Mettere il piatto in un incubatore di 37 °C, 5% CO2 per 5 minuti per staccare completamente le cellule.
- Aggiungere 5 mL di EGM-2 al piatto per neutralizzare la tripina. Trasferire la sospensione cellulare su un tubo conico da 25 ml. Centrifuga HUVEC a 1.200 x g per 5 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 5 mL di EBM-2 senza siero.
- Contare le celle usando Trypan blue per determinare le celle vitali. Creare una soluzione a 1 x10 6 celle/mL.
- Aggiungere 100.000 HUVEC ad ogni pozzo con 200 μL di EBM-2 senza siero. Se vengono aggiunte più celle, creeranno un monostrato di superficie piuttosto che una rete di tubi.
- Incubare HUVEC in un incubatore di 37 °C, 5% CO2. Dopo 6 ore, immagine reti HUVEC per microscopia a contrasto di fase. Le reti sono ora pronte per la cocultura con sferoidi del seno.
5. Biostampa Sferoidi epiteliali del seno su reti HUVEC pre-formate
NOTA: Per il processo di biofabbricazione deve essere utilizzato un sistema di biodeposizione a doppio ugello. In questo caso, il sistema aveva tre bracci di movimento per consentire il controllo spaziale su scala micron della deposizione del materiale e due motori azionati a vite per depositare bioink da siringhe da 10 ml. Il sistema deve essere funzionalizzato con un sistema di filtrazione dell'aria di particolato ad alta efficienza e capacità di sterilizzazione UV per mantenere un ambiente sterile durante la biostampa. Il biostampatore viene sterilizzato ai raggi UV per un'ora prima del processo di stampa.
- Creare sferoidi epiteliali del seno e reti HUVEC come descritto in precedenza. Stimare il numero di sferoidi epiteliali del seno in ogni pozzo contando gli sferoidi nelle immagini rappresentative della microscopia a contrasto di fase.
- Tagliare 0,5 cm dall'estremità di una punta della pipetta da 1000 μL. Utilizzare la punta della pipetta tagliata per pipettare con cura tutti gli sferoidi fuori dal vetrino da camera a 8 pozza e in un tubo da 50 ml. Sferoidi resuspendi nel bioink selezionato a 100 sferoidi/100 μL.
NOTA: Concentrazioni più elevate di sferoidi possono causare il clustering degli sferoidi e impedire la visualizzazione delle interazioni tra gli sferoidi e le reti endoteliali. - Passare la miscela di sferoidi attraverso un colino cellulare da 70 μm per rimuovere eventuali sferoidi grandi o raggruppati.
- Caricare gli sferoidi raggruppati in una siringa sterile da 10 ml e cappuccio con un ago sterile calibro 25. Attaccare la siringa al sistema di bio-deposizione.
- Aspirare il mezzo dalle reti HUVEC nello scivolo da camera a 8 pozzi.
- Estrudere 100 μL di sferoidi epiteliali del seno su 6 pozzi di reti HUVEC ad una portata di 1 mL/min. Mantenere 2 pozzi di reti HUVEC come controlli.
- Aggiungere 400 μL di MCF10A Spheroid Growth Medium se si utilizzano sferoidi MCF10A stampati su reti HUVEC o aggiungere 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium precedentemente miscelato con soluzione a matrice del 2% se si utilizzano sferoidi MDA-MB-231 stampati su reti HUVEC. Il rispettivo mezzo di crescita dello sferoide deve essere utilizzato nei pozzi di controllo HUVEC.
- Incubare le co-colture in un incubatore di CO2 a 37 °C, 5% per 24 - 96 ore senza un cambiamento mediatico. Le co-culture rimarranno vitali nel mezzo originale per un massimo di quattro giorni.
6. Microscopia confocale
- Immunofluorescenza e preparazione tampone lavaggio PBS-glicina
- Preparare la soluzione tampone di immunofluorescenza (IF) 10x aggiungendo 2,5 g di azide di sodio, 5 g di albumina di siero bovino, 10 mL di Tritone X-100 e 2,05 mL di Tween-20 in 500 mL di 10x PBS. Regolare il pH a 7,4. Conservare la soluzione stock fino a un anno a 4 °C per evitare la sedimentazione.
- Creare un tampone IF funzionante diluire 50 mL di tampone IF 10x in 450 mL di acqua deionizzata sterile. Conservare la soluzione di lavoro a temperatura ambiente per un massimo di una settimana.
- Preparare 10x soluzione di scorta tampone PBS-Glicina aggiungendo 37,5 g di glicina a 500 mL di 10x PBS. Regolare il pH a 7,4. Conservare la soluzione stock fino a 6 mesi a 4 °C per evitare la sedimentazione.
- Creare una soluzione pbs-glicina funzionante diluire 50 mL di tampone PBS-Glicina 10x in 450 mL di acqua deionizzata sterile. Conservare la soluzione di lavoro a 4 °C per un massimo di una settimana.
- Etichetta campioni biostampati e immagine per microscopia confocale
- Aspirare il mezzo dalle co-colture 3D biostampate e risciacquare 3 volte con PBS caldo. Fissare co-colture 3D biostampate con paraformaldeide al 4% per 1 h a temperatura ambiente. Risciacquare i campioni 3 volte per 20 minuti con 1 pbs-glicina.
- Blocca i campioni con tampone IF mescolato con il 10% di siero di capra per 90 minuti (blocco primario), seguito da 40 minuti con buffer IF più il 10% di siero di capra e frammento affinipure fab (1:100, blocco secondario).
- Se si utilizzano sferoidi MCF10A, etichettare campioni con un anticorpo primario per l'integrina α6 (1:100) in tampone di blocco secondario durante la notte a 4 °C, seguiti da un anticorpo secondario Alexa Fluor 488 (1:200) e Hoescht 33342 (1:1000) per 1 h a temperatura ambiente protetto dalla luce. Le linee cellulari MCF10A esprimono alti livelli di integrina α6, che è essenziale per mostrare polarizzazione e morfologia dello sferoide.
- Se si utilizzano sferoidi MDA-MB-231, che esprimono bassi livelli di integrina α6, etichettare i campioni con Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) e Hoescht 33342 (1:1000) nel buffer di blocco secondario per 4 ore a temperatura ambiente protetta dalla luce. La phalloidina consente la visualizzazione del filamento di actina in modo da poter valutare la morfologia amorfa e invasiva dello sferoide.
- Lavare i campioni con 1X PBS-glicina 3 volte per 20 minuti.
- Preparare i campioni per il montaggio rimuovendo lo scivolo della camera utilizzando lo strumento del produttore. Aggiungere una piccola goccia di soluzione antifade ad ogni pozzo. Posizionare un coverslip da 22 mm x 60 mm su ogni scivolo della camera e sigillare accuratamente i bordi con smalto chiaro.
- Campioni di immagini che utilizzano un microscopio confocale come pile Z di ~10 fette in passaggi da 5 μm. Se lo si desidera, comprimere i piani Z in un singolo piano utilizzando il comando Messa a fuoco estesa nel software di imaging cellulare.
- Quantificare l'adesione dello sferoide alle reti endoteliali usando Image J. Il numero di sferoidi aderenti può essere quantificato utilizzando il plugin di analisi con la dimensione e la circolarità delle particelle appropriate. Normalizzare il numero di sferoidi collegati all'area dell'immagine.
- Per garantire la riproducibilità, quantificare il numero di sferoidi aderenti in 4 x 4 immagini piastrellate di co-culture. Se il numero di sferoidi è statisticamente significativamente inferiore rispetto ad altri esperimenti, l'esperimento deve essere ripetuto.
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Representative Results
Le cellule epiteliali del seno dovrebbero auto-organizzarsi in sferoidi 3D dopo 5-8 giorni di coltura su soluzione matriciale e in mezzo di coltura con soluzione matriciale al 2%. Gli sferoidi epiteliali al seno MCF10A non cancerogeni dovrebbero apparire rotondi e avere un centro cavo, con l'integrina α6 polarizzata al bordo esterno dello sferoide(Figura 1, l'interno mostra centri cavi). Le cellule epiteliali del cancro al seno MDA-MB-231 altamente invasive formano sferoidi irregolari. Gli sferoidi devono essere usati quando hanno un diametro di circa 100-300 μm. Quando gli sferoidi diventano troppo grandi e si avvicinano, gli sferoidi si uniranno per formare megasferoidi. Inoltre, gli sferoidi epiteliali del seno MDA-MB-231 possono mostrare cellule che migrano fuori dallo sferoide se mantenuti nella coltura di Matrigel per troppo tempo.
HUVEC dovrebbe auto-organizzarsi in reti simili a tubi dopo 6-8 ore di cultura sparsa e priva di siero. I campioni avranno nodi multicellulari con connessioni formate da linee di 1-3 celle in parallelo. Le reti HUVEC possono essere immaginiate mediante microscopia a contrasto di fase o microscopia confocale se sono etichettate con Cell Tracker e Hoescht (Figura 2). L'analizzatore di angiogenesi ImageJ può essere utilizzato per quantificare giunzioni di rete, segmenti e rami. Le reti HUVEC moriranno se lasciate in mezzo senza siero per più di 16 ore.
Quando gli sferoidi epiteliali del seno vengono biostampati sulle reti HUVEC, sia gli sferoidi che le reti dovrebbero mantenere la loro morfologia originale per almeno 24 ore. Gli sferoidi epiteliali del seno MCF10A appariranno come oggetti rotondi che aderiscono direttamente alle reti endoteliali, mentre gli sferoidi epiteliali del seno MDA-MB-231 appariranno più amorfo ma ancora attaccati o in prossimità delle reti endoteliali (Figura 3). Le reti HUVEC saranno mantenute quando co-coltivate con sferoidi epiteliali del seno. Per le co-colture più lunghe di 24 ore, le cellule epiteliali del seno possono migrare fuori dai sferoidi e lungo le reti endoteliali. Nella nostra esperienza, questo accade prima nelle cellule epiteliali del seno tumorigeniche piuttosto che non tumoriche38. In precedenza abbiamo dimostrato utilizzando co-colture biostampata che il test farmacologico può essere avviato già 2 ore dopo la biostampa sferoide, ad esempio per testare l'adesione degli sferoidi sulle reti endoteliali45. Abbiamo anche dimostrato che gli sferoidi mammari 3D sono più resistenti ai farmaci anti-cancro come Paclitaxel rispetto a quando stampati come singole cellule o in co-coltura41,45. In assenza di sferoidi biostampati, i pozzi di controllo della rete HUVEC da soli non riescono a mantenere la loro morfologia di rete e muoiono dopo 16 ore.
Figura 1: Immagini rappresentative di microscopia confocale di sferoidi epiteliali del seno. Gli sferoidi MCF10A sono stati etichettati per integrina α6 (verde) e nuclei (blu). Il fenotipo cellulare può essere confermato dopo la biostampa quando gli sferoidi appaiono rotondi con un centro cavo (interno) e hanno l'integrina α6 polarizzata ai bordi esterni. Gli sferoidi MDA-MB-231 erano etichettati per actina (verde) e nuclei (blu). Il fenotipo cellulare può essere confermato quando gli sferoidi sono di forma irregolare senza centri cavi e hanno processi cellulari che invadono la matrice circostante. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative delle reti HUVEC per contrasto di fase e microscopia confocale. Le reti HUVEC appaiono come piccoli nodi multicellulari con linee di celle che collegano i nodi. Per la microscopia confocale, le cellule sono state etichettate con Cell Tracker Red e Hoescht per nuclei (blu). Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative degli sferoidi epiteliali del seno co-coltivati con le reti HUVEC. Gli sferoidi MCF10A, etichettati per l'integrina α6 (verde) e i nuclei (blu), rimangono rotondi e appaiono aderenti direttamente alle reti endoteliali. Gli sferoidi MDA-MB-231, etichettati per actina (verde) e nuclei (blu), appaiono amorfo ma rimangono vicini o su reti endoteliali. Le co-colture mantengono questa morfologia per almeno 24 ore dopo la biostampa, dopo di che le cellule mammari possono migrare lungo i tubi endoteliali. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo è il primo del suo genere a biostampare sferoidi nella loro architettura 3D per la co-coltura con cellule endoteliali anche nella loro architettura 3D. I passaggi critici del protocollo includono la formazione iniziale di sferoidi epiteliali del seno e reti HUVEC. Estrema cautela deve essere presa nell'alimentazione degli sferoidi epiteliali del seno, in quanto sono facilmente interrotti dalla soluzione matriciale. Allo stesso modo, gli sferoidi epiteliali del seno devono essere trattati con cura quando vengono pipettati dalla soluzione matriciale e mescolati nelle reti. Le reti HUVEC non devono essere placcate ad una densità troppo elevata o lasciate per più di 16 ore, in quanto formeranno rispettivamente un monostrato o moriranno. Infine, tutta la biostammpa dovrebbe avvenire in un ambiente sterile a 37 °C per massimizzare la vitalità cellulare.
Gli sferoidi epiteliali del seno possono essere biostampati in una varietà di bioinchiostri oltre a Matrigel, tra cui miscele di alginato e collagene alginato. Abbiamo dimostrato che gli sferoidi erano vitali e mantenevano la loro morfologia quando stampati in bioinchiostri a base di alginato41. Così, mentre presentiamo la biostampa qui nel bioink a base di soluzione matrice, sono possibili anche altri bioinchiostri meno costosi e più facili da usare. Abbiamo inoltre utilizzato altre linee cellulari per il cancro al seno, tra cui MCF-7 e cellule MCF10A-NeuN geneticamente modificatecon successo simile 38,41,45. Mezzi alternativi potrebbero anche essere usati per creare gli sferoidi epiteliali del seno. Ad esempio, Lee et al. Infine, potrebbero essere utilizzate cellule endoteliali alternative come le cellule endoteliali derivate dal tumore, e piuttosto che formare reti HUVEC, i microvessel derivati dai tessuti adiposi potrebbero essere stampati direttamente come strutture vascolari 3D47.
Una limitazione primaria di questo metodo era la sfida nel controllare la posizione e il numero dello sferoide biostampato. Gli sferoidi dovevano essere stampati con ugelli relativamente grandi e in fluidi inviscidi per prevenire danni agli sferoidi. I bioinchiostri che gelificano rapidamente potrebbero controllare meglio la posizione dello sferoide. Anche gli sferoidi non potevano essere contati nel bioink, poiché erano troppo grandi per il nostro contatore cellulare. Ci siamo invece affidati ai conteggi degli sferoidi derivati dalle immagini di contrasto di fase scattate prima di pipeggiare gli sferoidi dalla superficie del Matrigel. Mezzi alternativi per formare gli sferoidi potrebbero controllare meglio il loro numero e le loro dimensioni. Siamo stati in grado di controllare il numero e le dimensioni degli sferoidi con una precisione moderata utilizzando filtri cellulari e coltivando sferoidi allo stesso modo ogni volta. Un'ultima limitazione è che le cellule epiteliali del seno migrano fuori dai sferoidi e lungo le reti endoteliali nel tempo. È possibile che i bioinchiostri alternativi abusino di questa limitazione.
La biostampa diretta degli sferoidi epiteliali del seno su reti HUVEC pre-formate consente la creazione di un modello di co-coltura tumorale in vitro 3D in breve tempo. I ricercatori possono quindi esaminare rapidamente le interazioni tra sferoidi e vascucolatura con una maggiore produttività. In futuro, gli sferoidi epiteliali del seno potrebbero essere biostampati su vasculure perfuse, il che consentirebbe lo studio degli effetti del flusso. Inoltre, gli organoidi e le cellule endoteliali derivati dal tumore potrebbero essere biostampati per consentire la medicina di precisione attraverso test dell'efficacia del farmaco in un modello specifico del paziente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata da NIH 1R01HL140239-01 ad AMC. Ringraziamo il Cell Imaging Center della Drexel University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity | Sanyo | MCO-20AIC | Cell incubation |
| 3D Bio printer | custom-made | None | Used for bioprinting |
| 8-well chamber slides | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | for seeding spheroids |
| 25-gauge needle | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | bioprinting syringe needle |
| Absolute ethanol (200 proof ) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | reconsitution of media components |
| Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | secondary block - Immunofluorescence |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday antibody-Immunofluorescence |
| Bovine insulin | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Media additive |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Blocking agent -Immunofluorescence |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Remove large or clustered spheroids |
| CellTracker™ Red CMTPX Dye | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | pre-stain for HUVEC tubes |
| Compact Centrifuge | Hermle- Labnet, Edison ,NJ | Z206A | For cell centrifugations |
| Cholera Toxin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Media additive |
| Conical tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Collecting and resuspending cells |
| Countess II-FL Cell counter | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | counting cells |
| Glass pipettes (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | cell resuspension |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A basal media |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 basal media |
| Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC basal media |
| Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors) |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Labelling MDA-MB-231 spheroids | |
| Fetal Bovine serum | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 media additive |
| Goat serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | Immunofluorescence labelling component |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | immunofluorescence buffer component |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Nuclei stain immunofluorescence |
| Horse Serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Media additive |
| Hydrocortisone | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Media additive |
| Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) | Cell applications, San Diego , CA | 200-05f | Endothelial cell lines |
| Integrin α6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Immunofluorescence spheroid labelling component |
| Live Dead assay | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| LSM 700 Confocal microscope | Zeiss, Thornwood, NY | Used to visualize cells | |
| Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Spheroid formation |
| MCF10A cells | ATCC | CRL-10317 | Breast cell line |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | HTB-26 | Breast cell line |
| Paraformaldehyde | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | cell fixative |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive |
| Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Wash buffer for cells before trypsinization |
| Phosphate buffer saline 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | immunofluorescence buffer component |
| Prolong gold antifade | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | immunofluorescence mountant medium |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ assay media component |
| Sodium Azide | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | immunofluorescence buffer component |
| Sterile syringe (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | bioprinting process |
| Tissue culture dish (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | monolayer cell culture |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | immunofluorescence buffer component |
| Trypan blue 0.4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | cell counter additive |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | cell detachment |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | immunofluorescence buffer component |
| Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC tube additive |
| Volocity 6.3 cell imaging software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z stack compresser |
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