Summary
Målet med denne protokol er direkte bioprint bryst epitelceller som multicellulære sfæroider på præ-dannede endotel netværk til hurtigt at skabe 3D bryst-endotel co-kultur modeller, som kan bruges til narkotika screening undersøgelser.
Abstract
Bioprinting er ved at opstå som et lovende redskab til at fremstille 3D-menneskelige kræftmodeller, der bedre opsummerer kritiske kendetegn for in vivo vævsarkitektur. I den nuværende lag-for-lag ekstrudering bioprinting, er de enkelte celler ekstruderet i en bioink sammen med komplekse rumlige og tidsmæssige signaler til at fremme hierarkisk væv selvmontering. Denne biofabrikationsteknik er imidlertid afhængig af komplekse interaktioner mellem celler, bioinks og biokemiske og biofysiske signaler. Således kan selvmontering tage dage eller endda uger, kan kræve specifikke bioinks, og kan ikke altid forekomme, når der er mere end én celletype involveret. Vi har derfor udviklet en teknik til direkte bioprint forformede 3D bryst epitel sfæroider i en række bioinks. Bioprintede forformede 3D-brystepiteler opretholdt deres levedygtighed og polariserede arkitektur efter udskrivning. Vi har desuden trykt 3D-sfæroiderne på vaskulære endotelcellenetværk for at skabe en cokulturmodel. Således skaber den nye bioprintteknik hurtigt en mere fysiologisk relevant 3D-menneskelig brystmodel til lavere omkostninger og med højere fleksibilitet end traditionelle bioprintteknikker. Denne alsidige bioprint teknik kan ekstrapoleres til at skabe 3D-modeller af andre væv i yderligere bioinks.
Introduction
3D in vitro vaskulære tumor modeller er væsentlige værktøjer til mekanistisk undersøgelse af kræft vækst og metastaser. Især for brystkræft organiserer brystepitele celler dyrket i Matrigel i polariserede sfæroider, der mere ligner in vivo mammary acinus arkitektur1,2,3 ,4,5,6,7,8. 3D bryst epitelcellekultur påvirker også cellefunktionen, idet 3D-kulturer viser forskelle i epidermal vækstfaktor (EGF) receptormodulation8,9; onkogenfunktion, herunder ErbB210; vækst og apoptose, der signalerer11,12; kemoterapiresistens13,14. Vaskulære endotelceller reagerer ligeledes forskelligt på miljømæssige stimuli i 3D vs. traditionel 2D-kultur15,16,17,18. Men meget af forståelsen af vaskulære endotel og bryst epitel interaktioner kommer fra 2D-kultur ved hjælp af konditioneret medium eller Transwell skær, eller 3D-modeller, hvor de to celletyper er fysisk adskilt19,20,21,22,23. Disse co-kultur modeller giver begrænset fysiologisk indsigt, da både 3D-kultur og celle-celle kontakt er afgørende for vaskulær endotel - bryst epitelcelle interaktioner24,25,26.
3D kræftmodeller er blevet fremstillet ved hjælp af en række forskellige teknikker, herunder hængende dråbe sfæroid dannelse, bioprint, magnetisk samling, og kultur i hydrogels eller på manipuleret stilladser5,27,28,29. For nylig blev 3D-tumormodeller oprettet med flere celletyper arrangeret i deres respektive 3D-strukturer. I et eksempel på en tumor-on-a-chip platform, kræft, endotel, og stromale celler blev blandet ind i en matrix og derefter injiceres i de tre centrale væv kamre i en polydimethylsiloxan (PDMS) enhed. Vævskamrene var omkranset af to ydre kanaler, der repræsenterede en arterie og venule. Efter 5-7 dages kultur dannede endotelceller et mikrovaskulært netværk, og kræftceller spredte sig til at danne små tumorer nær vaskulaturen. Denne platform blev derefter brugt til at screene stoffer og lægemiddelkombinationer30. Yderligere tumor-on-a-chip platforme er blevet oprettet for at studere metastaser og kræfttyper med specifikke mekaniske stimuli (f.eks mekanisk stamme i lungen)31,32. Men, disse platforme generelt ikke omfatter både vaskulatur og kræft i deres respektive 3D-strukturer.
Biofabrication viser store løfter i at fremme 3D in vitro vaskulære tumor modeller, da det giver stram rumlig kontrol over celle placering. På trods af væksten i bioprinting i løbet af det seneste årti, få undersøgelser fokuserer specifikt på tumorer33,34. I et eksempel blev 3D-print af HeLa-celler i en gelatine / alginat / fibrinogen hydrogel brugt til at skabe en in vitro livmoderhalskræft model. Tumorceller blev bioprintet som individuelle celler og fik derefter lov til at danne sfæroider, som viste en højere spredningshastighed, øget matrix metalloproteinaseudtryk og højere chemoresistance end celler i 2D-kultur35. I disse undersøgelser, som i mange andre36,37, blev dissocierede celleophæng bioprintet, og derefter blev cellekulturerne forsynet med de nødvendige mekaniske og biokemiske signaler for at gøre det muligt for cellerne at danne en 3D-struktur. Men cellulære selvmontering kan tage dage eller uger, kan kræve komplekse rumlige og tidsmæssige miljømæssige signaler, eller kan ikke forekomme, når to celletyper er co-kulturperler. For eksempel, bryst epitelceller induceret celledød i endotelceller i 2D co-kultur, og dissociated bryst epitelceller ikke danne 3D-sfæroider, når bioprintet i alginat / gelatine hydrogels38. Dissociated bryst epitel eller kræftceller dannet sfæroider i alginat baseret bioinks kun når fanget i cirkulære PDMS forme. I andre tilfælde blev sfæroider dannet ved hjælp af suspenderede dråber i ultra-lav vedhæftet fil cirkulære brøndplader og derefter blandet i alginatbaserede bioinks39,40.
Vi beskriver nu en alternativ 3D-vævsbiofabrikationsmetode i denne protokol. I stedet for frø dissociated celler og vente på disse celler til at danne 3D-strukturer, beskriver vi, hvordan man skaber og bioprint 3D tumor sfæroider på en vaskulær rør netværk til at skabe en tumor co-kultur model, der kan bruges næsten øjeblikkeligt. Tumor sfæroider kan dyrkes in vitro eller stammer fra humane væv (organoider). Tilsvarende kan vaskulære rør dyrkes eller kan udledes af fedtvæv mikrovaskulære fragmenter. Bioinks kan variere fra biologisk inaktiv alginat til den meget biologisk aktive Matrigel41. Da denne 3D tumor co-kultur model kan oprettes med en række cellestrukturer og bioinks, det kan indarbejde flere celletyper, ekstracellulære matricer, og kemokin gradienter15,42. Mens endotelnetværkene i sin nuværende formulering ikke kan perfunderes, kan fremtidige gentagelser integrere denne metode med mikrofluider eller -on-chip-systemer. Bioprinting af 3D-brystepiteler på endotelnetværk muliggør hurtig biofabrikation af humane brystmodeller til test af lægemidler og personlig præcisionsmedicin27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bryst epitelcellevækst og assay medier
- MCF10A bryst epitelceller
BEMÆRK: Den ikke-tumorigen udødeliggjorte bryst epitelcellelinje er afledt af en patient med fibrocystisk sygdom43. Celler udtrykker ikke østrogenreceptor.- For at forberede 20 μg/mL epidermal vækstfaktor (EGF) opløses 100 μg lyofiliseret EGF i 500 μL steril dH2O for at fremstille 200 μg/mL EGF. Der tilsættes 500 μL på 200 μg/mL EGF til 4,5 ml steril 0,1% BSA i dH2O for at fremstille en 20 μg/mL EGF-stamopløsning. Der skal opbevares tilberedte 20 μg/mL EGF-aliquots ved -20 °C i op til 12 måneder.
- For at forberede 500 μg/mL hydrocortison fortyndes 1 mg hydrocortison i 1 mL absolut ethanol (200 bevis). Der tilsættes 1 ml steril DMEM F:12 til denne blanding for at fremstille en 500 μg/mL hydrocortison stamopløsning. Opbevar hydrocortisonlageret aliquots ved -80 °C i op til 12 måneder.
- For at forberede 10 μg/mL koleratoksin opløses 1 mg koleratoksinlyofiliseret pulver i 1 ml steril dH2O for at fremstille en opløsning af koleratoksinlageret på 1 mg/mL. Koleratoksinlageret aliquots opbevares ved -80 °C i op til 12 måneder.
- For at forberede vækstmedium tilsættes 500 μL EGF (20 μg/mL), 500 μL hydrocortison (500 μg/mL), 5 μL koleratoksin (1 mg/mL), 500 μL kvægin insulin (10 mg/ml), 10 ml penicillin og streptomycin og 25 mL hesteserum til 500 mL DMEM F:12 for en endelig koncentration på 20 ng/mL EGF, 500 ng/mL hydrocortison, 10 ng/mL koleratoksin 10 ng/mL kvægin insulin, 2% v/v penicillin og streptomycin og 5% v/v hesteserum. Koncentrationen af antibiotika blev forhøjet til 2% for at tage højde for nedsat sterilitet i bioprintprocessen; antibiotikakoncentrationen kan dog sænkes til 1 %.
- Tilberedning af Assay Medium tilsættes 500 μL hydrocortison (500 μg/mL), 5 μL koleratoksin (1 mg/mL), 500 μL kvægin insulin (10 mg/mL), 10 ml penicillin og streptomycin og 25 ml hesteserum til 500 ml DMEM F:12 for en endelig koncentration på 500 ng/mL hydrocortison, 10 ng/mL koleratoksin, 10 ng/mL kvægin insulin, 2% v/v penicillin og streptomycin og 5% v/v hesteserum.
- MDA-MB-231
BEMÆRK: Den tredobbelt-negative (mangler østrogen receptor, progesteron receptor, og epidermal vækstfaktor receptor 2) brystkræft epitelcelle linje er skabt af pleural effusion af en kvindelig patient med metastatisk mammary adenocarcinoma44. Celler repræsenterer en aggressiv, invasiv, og dårligt differentieret brystkræft.- For at forberede vækst og assay medium tilsættes 50 ml føtalt kvægserum, 10 ml penicillin og streptomycin og 25 ml hesteserum til 500 ml DMEM med henblik på en endelig koncentration på 10% v/v føtalt kvægserum, 2% v/v penicillin og streptomycin og 5% v/v hesteserum.
2. Bryst epitelcellekultur
- Seed 500.000 MCF10A eller MDA-MB-231 celler i en 10 cm (P100) vævskultur parabol med 10 mL MCF10A eller MDA-MB-231 vækst medier. MCF10A- og MDA-MB-231-celler når op på 90 % sammenløb på 48 timer.
- Til passage bryst epitelceller, første vaske celler med 10 mL varm PBS.
- Løsrive bryst epitelceller ved at tilføje 2 mL af 0,05% Trypsin-EDTA til fadet. Skålen anbringes i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 20-25 minutter.
- Tilføj 5 mL MCF10A eller MDA-MB-231 Growth Medium til de trypsiniserede celler for at neutralisere trypsin. Pipetter cellemedieblandingen op og ned for at genbruge celler og bryde celleklynger op.
- Celleaffjedringen tilsættes til et 15 mL konisk rør og centrifuge ved 1.200 x g i 3 minutter. Aspirer forsigtigt supernatanten og genbrug cellepillen i 5 mL MCF10A eller MDA-MB-231 Growth Medium.
- Plade 1 mL celleaffjedring i 5 nye 10 cm vævskulturretter sammen med MCF10A eller MDA-MB-231 Growth Medium. Placer opvasken i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Celler vil være klar til at blive passeret igen i 2-3 dage. MCF10A celler kan opretholdes til passage nummer 35, hvorefter de viser morfologiske ændringer. MDA-MB-231 celler kan vedligeholdes til passage nummer 24, hvorefter de viser morfologiske ændringer.
3. Bryst epitel sfæroid dannelse
- 200 μL pipettespidser fryses i 30 minutter, inden analysen påbegyndes. Hold vækstfaktor reduceret matrixopløsning (f.eks. Matrigel) (10 mg/mL) på is under hele processen.
- Rør langsomt 30 μL iskold matrixopløsning ved hjælp af iskolde 200 μL pipettespidser ind i hver brønd på et 8-brønds kammerdias. Start fra siderne og træk pipettespidsen langs hjørnerne, og tilføj en sidste dråbe til midten af brønden for at sikre jævn belægning af hver brønd. Undgå luftbobler under dette trin for at sikre et ensartet matrixopløsningslag. Brug nye pipettespidser til hver brønd.
- Inkuber kammerdias i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 15-20 minutter for at polymerisere matrixopløsningen.
- Resuspend trypsiniserede MCF10A-celler i MCF10A Assay Medium ved 200.000 celler/mL eller opbrugte trypsiniserede MDA-MB-231-celler i MDA-MB-231 Growth Medium ved 200.000 celler/mL.
- Hvis der anvendes MCF10A-celler, skal der fremstilles et friskt MCF10A-kugleformet vækstmedium ved at tilsætte 5 μL EGF (20 μg/mL) og 100 μL matrixopløsning til 5 ml Assay Medium for en endelig koncentration på 2% matrixopløsning.
- Kammerdiaset, der er forlakeret med matrixopløsning, fjernes fra inkubatoren. Der tilsættes 50 μL MCF10A eller MDA-MB-231 celleophæng (10.000 celler) til hver brønd. Hvis du bruger MCF10A-celler, tilsættes 450 μL MCF10A Sfæroidvækstmedium. Hvis du bruger MDA-MB-231 celler, tilsættes 450 μL MDA-MB-231 Vækstmedium forblandet med 2% matrixopløsning (9 μL). Placer straks kammerdiaset i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Udskift mediet hver 4. dag. Rør forsigtigt 200 μL gammelt medie ud fra det ene hjørne af hver brønd ved hjælp af en 200 μL pipettespids. Under denne proces glider kammeret ved 45° for at sikre, at spheroiderne ikke forstyrres. Der tilsættes 200 μL frisklavet MCF10A Kugleformet vækstmedium eller MDA-MB-231 Vækstmedium, der tidligere blev blandet med 2% matrixopløsning til hver brønd i hjørnet i dråber for at sikre, at sfæroider forbliver fastgjort til matrixlaget. Kun ~ 50% af medierne udskiftes, så alle cytokiner produceret af sfæroiderne ikke er helt udtømt.
BEMÆRK: MCF10A bryst epitel sfæroider tage op til 8 dage at polarisere og danne hule centre. MDA-MB-231 bryst epitel sfæroider tage op til 5 dage at danne og har ingen hule centre.
4. Endotelcellenetværksdannelse
- Human Navlestrengsåre Endotelcelle (HUVEC) Kultur
- Tilføj indholdet af et enkelt Endothelial Growth Medium-2-sæt, der indeholder insulinvækstfaktor, fibroblastvækstfaktor, vaskulær endotelvækstfaktor, ascorbinsyre, epidermal vækstfaktor, heparin og gentamicin-amphotericin B samt 50 ml føtalt kvægserum, 5 ml penicillin-streptomycin og 5 ml glutamin på 200 mM til 500 ml Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) for at skabe fuldstændig endothelial vækstmedium (EGM-2).
- Frø 500.000 endotelceller i en 10 cm vævskultur parabol i 10 mL EGM-2. Placer celler i en 37 °C, 5% CO2 inkubator, indtil de når >80% sammenløb (ca. 48 timer).
- Til passage celler, vask endotelceller med 10 mL varm PBS. Løsrive HUVEC ved at tilføje 2 mL på 0,05% Trypsin-EDTA til 10 cm vævskultur parabol. Overvåg cellerne nøje efter fasekontrastmikroskopi. Cellerne er klar, når de er balled op, men forbliver knyttet til fadet.
- Aspirer forsigtigt trypsin ud af skålen. Tilsæt 8 mL EGM-2 til skålen. Vask cellerne af fadet ved at pipetter EGM-2 op og ned over hele skåloverfladen.
- Alternativt kan du tilføje 5 mL EGM-2 til de trypsiniserede celler for at neutralisere trypsin. Pipetter cellemedieblandingen op og ned for at genbruge celler og bryde celleklynger op. Celleaffjedringen tilsættes til et 15 mL konisk rør og centrifuge ved 1.200 x g i 3 minutter. Indsug forsigtigt supernatanten og genbrug cellepillen i 10 mL EGM-2.
- Der tilsættes 1 mL celleaffjedring til 9 mL EGM-2 i en 10 cm vævskulturskål. Placer opvasken i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Ombytning 2/3 af mediet med frisk EGM-2 hver 2. dag. Celler vil være klar til passage i 3-5 dage. HUVEC kan opretholdes op til passage 8, hvorefter de undlader at danne netværk.
- Dannelse af endotelcellenetværk (HUVEC)
- 200 μL pipettespidser fryses i 30 minutter, inden analysen påbegyndes. Hold vækstfaktor reduceret matrixopløsning (10 mg/mL) på is under hele processen.
- Rør langsomt 30 μL iskold matrixopløsning ved hjælp af iskolde 200 μL pipettespidser ind i hver brønd på et 8-brønds kammerdias. Start fra siderne og træk pipettespidsen langs hjørnerne, og tilføj en sidste dråbe til midten af brønden for at sikre jævn belægning af hver brønd. Undgå luftbobler under dette trin for at sikre et ensartet matrixopløsningslag. Brug nye pipettespidser til hver brønd.
- Inkuber kammerdias i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 15-20 minutter for at polymerisere Matrigel.
- Forstå en 10 cm skål HUVEC med 10 μL røde celle tracker (1:1000) i 30 minutter i 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Vask endotelceller med 10 mL varm PBS. Løsrive HUVEC ved at tilføje 2 mL på 0,05% Trypsin-EDTA til 10 cm vævskultur parabol. Skålen anbringes i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 5 minutter for at frigøre cellerne helt.
- Tilsæt 5 mL EGM-2 til skålen for at neutralisere trypsin. Celleaffjedringen overføres til et konisk rør på 25 mL. Centrifuge HUVEC ved 1.200 x g i 5 minutter. Aspirere supernatant og genbruge celle pellet i 5 mL serum-fri EBM-2.
- Tæl celler ved hjælp af Trypan blå for at bestemme levedygtige celler. Opret en opløsning på 1 x10 6 celler/mL.
- Der tilsættes 100.000 HUVEC til hver brønd med 200 μL serumfri EBM-2. Hvis der tilføjes flere celler, vil de skabe en overflade monolayer snarere end et rør netværk.
- Huvec inkuberes i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Efter 6 timer, billede HUVEC netværk efter fase kontrast mikroskopi. Netværk er nu klar til cokultur med bryst sfæroider.
5. Bioprinting Bryst epitel sfæroider på forformede HUVEC Networks
BEMÆRK: Der bør anvendes et bioaflejringssystem med to dyser til biofabrikationsprocessen. I dette tilfælde havde systemet tre bevægelsesarme, der tillod rumlig kontrol af materialeaflejring i mikronskala samt to skruedrevne motorer til at deponere bioink fra 10 mL sprøjter. Systemet skal funktionaliseres med et højeffektivt partikelluftfiltreringssystem samt UV-steriliseringsfunktioner for at opretholde et sterilt miljø under bioprint. Bioprinteren er UV-steriliseret i en time før udskrivningsprocessen.
- Opret bryst epitel sfæroider og HUVEC netværk som tidligere beskrevet. Anslå antallet af bryst epitel sfæroider i hver brønd ved at tælle sfæroider i repræsentative fase kontrast mikroskopi billeder.
- Skær 0,5 cm af enden af en 1000 μL pipettespids. Brug den afskårne pipettespids til forsigtigt at pipette alle spheroids ud af 8-brønds kammerrutschebanen og ind i et 50 mL rør. Resuspend spheroids i den valgte bioink ved 100 sfæroider/100 μL.
BEMÆRK: Højere sfæroidkoncentrationer kan resultere i sfæroidklynger og forhindre visualisering af interaktioner mellem sfæroiderne og endotelnetværkene. - Spheroidblandingen overføres gennem en 70 μm celleflæser for at fjerne store eller grupperede sfæroider.
- Læg de samlede sfæroider i en 10 mL steril sprøjte, og læg den på med en 25-gauge steril nål. Fastgør sprøjten til bioaflejringssystemet.
- Indsug mediet fra HUVEC-netværkene i 8-brønds kammerdiaset.
- Ekstruder 100 μL brystepitelekotelreneider på 6 brønde af HUVEC-netværk med en strømningshastighed på 1 mL/min. Vedligehold 2 brønde af HUVEC-netværk som kontrol.
- Tilføj 400 μL MCF10A Sfæroid vækstmedium, hvis du bruger MCF10A-sfæroider trykt på HUVEC-netværk, eller tilføj 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium, der tidligere var blandet med 2% matrixopløsning, hvis du bruger MDA-MB-231-sfæroider trykt på HUVEC-netværk. Det respektive sfæroidvækstmedium skal anvendes i HUVEC-kontrolbrønde.
- Inkubere co-kulturer i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 24 - 96 timer uden en medieændring. Co-kulturer vil forblive levedygtige i det oprindelige medie i op til fire dage.
6. Konfokal mikroskopi
- Immunfluorescens og PBS-Glycine Wash Buffer Forberedelse
- Immunofluorescens (IF) buffer 10x stamopløsning fremstilles ved tilsætning af 2,5 g natriumazid, 5 g serumalbumin af kvæg, 10 ml Triton X-100 og 2,05 ml Tween-20 i 500 ml 10x PBS. Juster pH til 7,4. Stamopløsningen opbevares i op til et år ved 4 °C for at undgå sedimentering.
- Opret en fungerende IF-buffer ved at fortynde 50 mL 10x IF-buffer i 450 mL sterilt deioniseret vand. Arbejdløsningen opbevares ved stuetemperatur i op til en uge.
- Forbered 10x PBS-Glycine buffer lageropløsning ved at tilføje 37,5 g glycin til 500 ml 10x PBS. Juster pH til 7,4. Stamopløsningen opbevares i op til 6 måneder ved 4 °C for at undgå sedimentering.
- Opret en fungerende PBS-Glycine opløsning ved at fortynde 50 ml 10x PBS-Glycine buffer i 450 ml sterilt deioniseret vand. Arbejdopløsningen opbevares ved 4 °C i op til en uge.
- Etiket Bioprintede prøver og billede af Confocal Mikroskopi
- Aspirat medium fra bioprintet 3D co-kulturer og skyl 3 gange med varm PBS. Fix bioprintet 3D co-kulturer med 4% paraformaldehyd i 1 time ved stuetemperatur. Skyl prøverne 3 gange i 20 minutter med 1x PBS-Glycin.
- Blokprøver med IF-buffer blandet med 10% gedeserum i 90 minutter (primær blok), efterfulgt af 40 minutter med IF-buffer plus 10% gedeserum og Affinipure Fab-fragment (1:100, sekundær blok).
- Hvis der anvendes MCF10A-sfæroider, udtages der prøver med et primært antistof for integrin α6 (1:100) i sekundær blokeringsbuffer natten over ved 4 °C efterfulgt af et Alexa Fluor 488 sekundært antistof (1:200) og Hoescht 33342 (1:1000) i 1 time ved stuetemperatur beskyttet mod lys. MCF10A cellelinjer udtrykker høje niveauer af integrin α6, hvilket er afgørende for at vise sfærisk polarisering og morfologi.
- Hvis du bruger MDA-MB-231-sfæroider, som udtrykker lave niveauer af integrin α6, udtages etiketprøver med Alexa Fluor 488 falloidin (1:100) og Hoescht 33342 (1:1000) i sekundær blokeringsbuffer i 4 timer ved stuetemperatur beskyttet mod lys. Phalloidin muliggør actin filament visualisering, så sfæroid amorf og invasiv morfologi kan vurderes.
- Vask prøver med 1X PBS-glycin 3 gange i 20 minutter.
- Forbered prøver til montering ved at fjerne kammerdiaset ved hjælp af producentens værktøj. Tilsæt en lille dråbe antifadeopløsning til hver brønd. Placer en 22 mm x 60 mm coverlip på hvert kammer dias og forsigtigt forsegle kanterne med klar neglelak.
- Billede prøver ved hjælp af en confocal mikroskop som Z stakke af ~ 10 skiver i 5 μm trin. Hvis det ønskes, skal du komprimere Z-planer til et enkelt plan ved hjælp af kommandoen Udvidet fokus i software til cellebilledbehandling.
- Kvantificer sfæroid vedhæftning til endotelnetværk ved hjælp af Billede J. Antallet af klæbende sfæroider kan kvantificeres ved hjælp af analyse-plugin med den passende partikelstørrelse og cirkularitet. Normaliser antallet af vedhæftede sfæroider til billedområdet.
- For at sikre reproducerbarhed skal du kvantificere antallet af klæbende sfæroider i 4 x 4 flisebelagte billeder af samkulturer. Hvis kugleformede tal er statistisk signifikant lavere end andre forsøg, bør forsøget gentages.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bryst epitelceller bør selvorganisere i 3D-sfæroider efter 5-8 dages kultur på matrixopløsning og i kulturmedium med 2% matrixopløsning. Ikke-tumorigenic MCF10A bryst epitel sfæroider skal vises runde og har en hul center, med integrin α6 polariseret til yderkanten af kugleformet(Figur 1, indsat viser hule centre). Meget invasive MDA-MB-231 brystkræft epitelceller danner uregelmæssige sfæroider. Der bør anvendes spheroider, når de er omkring 100 – 300 μm i diameter. Når sfæroider bliver for store og kommer i nærheden, vil sfæroiderne slutte sig sammen for at danne megasfæroider. Derudover kan MDA-MB-231 bryst epitel sfæroider vise celler migrere ud af spheroids hvis de opretholdes i Matrigel kultur for længe.
HUVEC bør selv organisere sig i rørlignende netværk efter 6-8 timers sparsom, serumfri kultur. Prøver vil have flercellede noder med forbindelser, der er dannet af linjer af 1-3 celler parallelt. HUVEC-netværkene kan afbildes efter fasekontrastmikroskopi eller ved konfokal mikroskopi, hvis de er mærket med Cell Tracker og Hoescht (Figur 2). ImageJ angiogeneseanalysatoren kan bruges til at kvantificere netværkskryds, segmenter og grene. HUVEC-netværk vil dø, hvis de efterlades i serumfrit medium i mere end 16 timer.
Når bryst epitel sfæroider er bioprintet på HUVEC netværk, både sfæroider og netværk bør opretholde deres oprindelige morfologi i mindst 24 timer. MCF10A bryst epitel sfæroider vises som runde objekter, der klæber direkte til endotel netværk, mens MDA-MB-231 bryst epitel sfæroider vises mere amorfe endnu stadig er knyttet eller i nærheden af endotel netværk (Figur 3). HUVEC netværk vil blive opretholdt, når co-dyrket med bryst epitel sfæroider. For co-kulturer længere end 24 timer, bryst epitelceller kan migrere ud af spheroids og langs endotel netværk. I vores erfaring, dette sker tidligere i tumorigenic snarere end ikke-tumorigenic bryst epitelceller38. Vi har tidligere demonstreret ved hjælp af bioprintede co-kulturer, at test af lægemidler kan indledes så tidligt som 2 timer efter sfæroid bioprint, for eksempel at teste sfæroid vedhæftning på endotel netværk45. Vi har også vist, at 3D bryst sfæroider er mere resistente over for anti-cancer medicin som Paclitaxel end når de udskrives som individuelle celler eller i co-kultur41,45. I mangel af bioprintede sfæroider, HUVEC netværk kontrol brønde på egen hånd undlader at holde deres netværk morfologi og dø efter 16 timer.
Figur 1: Repræsentative konfokale mikroskopibilleder af brystepitelende sfæroider. MCF10A-sfæroider var mærket til integrin α6 (grøn) og kerne (blå). Cellephoenotype kan bekræftes efter bioprint, når sfæroider vises rundt med et hult center (indsat) og har integrin α6 polariseret ved yderkanterne. MDA-MB-231 sfæroider blev mærket for actin (grøn) og kerner (blå). Cellephoenotype kan bekræftes, når sfæroider er uregelmæssigt formet uden hule centre og har celleprocesser, der invaderer ind i den omgivende matrix. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative billeder af HUVEC-netværk efter fasekontrast og konfokal mikroskopi. HUVEC-netværk vises som små flercellede noder med cellelinjer, der forbinder noderne. Til konfokal mikroskopi blev celler mærket med Cell Tracker Red og Hoescht for nuclei (blå). Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative billeder af bryst epitel sfæroider co-dyrket med HUVEC netværk. MCF10A-sfæroider, mærket til integrin α6 (grøn) og kerne (blå), forbliver runde og vises direkte klæbet til endotelnetværkene. MDA-MB-231 sfæroider, mærket for actin (grøn) og kerner (blå), synes amorfe endnu forblive i nærheden af eller på endotel netværk. Co-kulturer opretholde denne morfologi i mindst 24 timer efter bioprint, hvorefter brystceller kan migrere ud langs endotelrør. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er den første af sin art til bioprint spheroids i deres 3D-arkitektur til co-kultur med endotelceller også i deres 3D-arkitektur. Kritiske protokoltrin omfatter den første dannelse af brystepitele sfæroider og HUVEC-netværk. Der skal udvises stor forsigtighed ved fodring af brystepitelespæroider, da de let afbrydes fra matrixopløsningen. På samme måde skal brystepitelende sfæroider behandles med forsigtighed, når de pipetters af matrixopløsningen og blandes i netværkene. HUVEC-netværk bør ikke belægges med for høj densitet eller efterlades i mere end 16 timer, da de vil danne henholdsvis et monolag eller dø. Endelig bør al bioprint forekomme i et sterilt miljø ved 37 °C for at maksimere celledygtigheden.
Bryst epitel sfæroider kan bioprintes i en række bioinks foruden Matrigel, herunder alginat og alginat-kollagen blandinger. Vi viste, at sfæroider var levedygtige og fastholdt deres morfologi, når de blev trykt i alginatbaserede bioinks41. Således mens vi præsenterer bioprint her i matrix løsning-baseret bioink, andre billigere og lettere at bruge bioinks er også muligt. Vi har desuden brugt andre brystkræft cellelinjer, herunder MCF-7 og genetisk modificerede MCF10A-NeuN celler med lignende succes38,41,45. Alternative midler kan også bruges til at skabe bryst epitel sfæroider. For eksempel brugte Lee et al. hydrogel microwell arrays produceret ved hjælp af PDMS-frimærker til at skabe ensartet størrelse sfæroider af kontrolleret størrelse46. Endelig kunne alternative endotelceller såsom tumor-afledte endotelceller anvendes, og i stedet for at danne HUVEC-netværk kunne fedtvævsafledte mikroveksler direkte bioprintes som 3D-vaskulære strukturer47.
En primær begrænsning af denne metode var udfordringen med at kontrollere bioprintet sfæroid placering og nummer. Spheroids skulle udskrives med relativt store dyser og i inviscid væsker for at forhindre sfæroid skader. Hurtigt gelering bioinks måske bedre kontrol sfæroid placering. Spheroids kunne heller ikke tælles i bioink, da de var for store til vores celletæller. Vi stolede i stedet på sfæroid tæller stammer fra fase kontrast billeder taget før pipetter spheroids fra Matrigel overflade. Alternative midler til at danne spheroids kunne bedre kontrollere deres antal og størrelse. Vi var i stand til at kontrollere sfæroid nummer og størrelse med moderat nøjagtighed ved hjælp af celle si og dyrkning sfæroider på samme måde hver gang. En sidste begrænsning er, at bryst epitelceller migrere ud af spheroids og langs endotel netværk over tid. Det er muligt, at alternative bioinks ville ophæve denne begrænsning.
Direkte bioprinting af bryst epitel sfæroider på forformede HUVEC netværk gør det muligt at skabe en 3D in vitro tumor co-kultur model på kort tid. Forskere kan derefter hurtigt undersøge interaktioner mellem sfæroider og vaskulatur med højere gennemløb. I fremtiden kan bryst epitel sfæroider bioprintes på perfunderede vaskulaturer, hvilket ville gøre det muligt at studere floweffekter. Derudover kan tumor-afledte organoider og endotelceller bioprintes for at muliggøre præcisionsmedicin gennem test af lægemiddeleffektivitet i en patientspecifik model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af NIH 1R01HL140239-01 til AMC. Vi vil gerne takke Cell Imaging Center på Drexel University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity | Sanyo | MCO-20AIC | Cell incubation |
| 3D Bio printer | custom-made | None | Used for bioprinting |
| 8-well chamber slides | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | for seeding spheroids |
| 25-gauge needle | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | bioprinting syringe needle |
| Absolute ethanol (200 proof ) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | reconsitution of media components |
| Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | secondary block - Immunofluorescence |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday antibody-Immunofluorescence |
| Bovine insulin | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Media additive |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Blocking agent -Immunofluorescence |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Remove large or clustered spheroids |
| CellTracker™ Red CMTPX Dye | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | pre-stain for HUVEC tubes |
| Compact Centrifuge | Hermle- Labnet, Edison ,NJ | Z206A | For cell centrifugations |
| Cholera Toxin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Media additive |
| Conical tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Collecting and resuspending cells |
| Countess II-FL Cell counter | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | counting cells |
| Glass pipettes (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | cell resuspension |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A basal media |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 basal media |
| Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC basal media |
| Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors) |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Labelling MDA-MB-231 spheroids | |
| Fetal Bovine serum | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 media additive |
| Goat serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | Immunofluorescence labelling component |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | immunofluorescence buffer component |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Nuclei stain immunofluorescence |
| Horse Serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Media additive |
| Hydrocortisone | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Media additive |
| Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) | Cell applications, San Diego , CA | 200-05f | Endothelial cell lines |
| Integrin α6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Immunofluorescence spheroid labelling component |
| Live Dead assay | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| LSM 700 Confocal microscope | Zeiss, Thornwood, NY | Used to visualize cells | |
| Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Spheroid formation |
| MCF10A cells | ATCC | CRL-10317 | Breast cell line |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | HTB-26 | Breast cell line |
| Paraformaldehyde | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | cell fixative |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive |
| Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Wash buffer for cells before trypsinization |
| Phosphate buffer saline 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | immunofluorescence buffer component |
| Prolong gold antifade | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | immunofluorescence mountant medium |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ assay media component |
| Sodium Azide | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | immunofluorescence buffer component |
| Sterile syringe (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | bioprinting process |
| Tissue culture dish (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | monolayer cell culture |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | immunofluorescence buffer component |
| Trypan blue 0.4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | cell counter additive |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | cell detachment |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | immunofluorescence buffer component |
| Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC tube additive |
| Volocity 6.3 cell imaging software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z stack compresser |
References
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19 (2016).
- Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, Pt 5 1945-1957 (1995).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
- Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, Pt 12 2377-2388 (2003).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
- Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66 (2011).
- Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
- Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), Cambridge. 1068-1078 (2015).
- Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671 (2015).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), Kidlington. 539-553 (2015).
- Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
- Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589 (2016).
- Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), Cambridge. 1262-1271 (2013).
- Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S.
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
- Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
- Zhang, Y. S., et al.
- Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101 (2015).
- Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
- Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
- Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
- Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003 (2019).
- Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
- Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285 (2015).
- Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
- Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
- Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145 (2018).
- Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).
