Summary
Målet med denne protokollen er å direkte bioprint bryst epitelceller som flercellede sfæroider på pre-dannet endotelnettverk for raskt å skape 3D bryst-endotelkokultur modeller som kan brukes til narkotika screening studier.
Abstract
Bioprinting fremstår som et lovende verktøy for å fremstille 3D humane kreftmodeller som bedre rekapulerer kritiske kjennetegn på in vivo vevarkitektur. I dagens lag-for-lag ekstrudering bioprinting, individuelle celler ekstruderes i en bioink sammen med komplekse romlige og timelige signaler for å fremme hierarkisk vev selvmontering. Imidlertid er denne biofabrikasjonsteknikken avhengig av komplekse interaksjoner mellom celler, bioinks og biokjemiske og biofysiske signaler. Dermed kan selvmontering ta dager eller uker, kan kreve spesifikke bioinks, og kan ikke alltid oppstå når det er mer enn én celletype involvert. Vi utviklet derfor en teknikk for å direkte bioprint pre-dannet 3D bryst epitel sfæroider i en rekke bioinks. Bioprinted pre-dannet 3D bryst epitel sfæroider opprettholdt sin levedyktighet og polarisert arkitektur etter utskrift. Vi trykte i tillegg 3D-sfæroidene på vaskulære endotelcellenettverk for å skape en co-kulturmodell. Dermed skaper den nye bioprinting teknikken raskt en mer fysiologisk relevant 3D menneskelig brystmodell til lavere pris og med høyere fleksibilitet enn tradisjonelle bioprinting teknikker. Denne allsidige bioprintteknikken kan ekstrapoleres for å lage 3D-modeller av andre vev i ekstra bioinks.
Introduction
3D in vitro vaskulariserte tumormodeller er viktige verktøy for mekanistisk studie av kreftvekst og metastase. For brystkreft spesielt, bryst epitelceller dyrket i Matrigel organisere i polariserte sfæroider som ligner nærmere på in vivo mammary acinusarkitektur 1,2,3,4,5,6,7,8. 3D bryst epitelcellekultur påvirker også cellefunksjon, med 3D-kulturer som viser forskjeller i epidermal vekstfaktor (EGF) reseptormodulasjon8,9; onkogenfunksjon, inkludert ErbB210; vekst og apoptose signaliserer11,12; og kjemoterapiresistens 13,14. Vaskulære endotelceller reagerer på samme måte forskjellig på miljøstimuli i 3D vs. tradisjonell 2D-kultur15,16,17,18. Imidlertid kommer mye av forståelsen av vaskulære endotel- og brystepitelinteraksjoner fra 2D-kultur ved hjelp av beholdte medium- eller Transwell-innsatser, eller 3D-modeller der de to celletypene er fysisk separert19,20,21,22,23. Disse co-kultur modeller gir begrenset fysiologisk innsikt, siden både 3D kultur og celle-celle kontakt er avgjørende for vaskulær endotel - bryst epitelcelleinteraksjoner24,25,26.
3D kreftmodeller har blitt fabrikkert ved hjelp av en rekke teknikker, inkludert hengende drop sfæroid formasjon, bioprinting, magnetisk montering og kultur innen hydrogeler eller på konstruerte stillas5,27,28,29. Mer nylig ble 3D tumormodeller opprettet med flere celletyper arrangert i sine respektive 3D-strukturer. I ett eksempel på en tumor-on-a-chip plattform, kreft, endotel- og stromal celler ble blandet inn i en matrise og deretter injisert i de tre sentrale vevkamrene i en polydimetylsiloxane (PDMS) enhet. Vevskamrene ble avgrenset av to ytre kanaler som representerte en arterie og venule. Etter 5-7 dager med kultur dannet endotelceller et mikrovaskulært nettverk og kreftceller spredte seg for å danne små svulster i nærheten av vaskulaturen. Denne plattformen ble deretter brukt til å screene narkotika og narkotikakombinasjoner30. Ytterligere tumor-on-a-chip plattformer er opprettet for å studere metastase og krefttyper med spesifikke mekaniske stimuli (f.eks mekanisk belastning i lungene)31,32. Disse plattformene inkluderer imidlertid vanligvis ikke både vaskulatur og kreft i sine respektive 3D-strukturer.
Biofabrikasjon viser stort løfte i å fremme 3D in vitro vaskulariserte tumormodeller, siden det muliggjør tett romlig kontroll over celleplassering. Til tross for vekst av bioprinting i løpet av det siste tiåret, er det få studier som fokuserer spesielt påsvulster 33,34. I ett eksempel ble 3D-utskrift av HeLa-celler i en gelatin/alginat/fibrinogenhydrogel brukt til å lage en in vitro livmorhalskreftmodell. Tumorceller ble bioprinted som individuelle celler og deretter lov til å danne sfæroider, som viste en høyere spredningshastighet, økt matrise metalloproteinase uttrykk, og høyere chemoresistance enn celler i 2D kultur35. I disse studiene, som i mange andre36,37, dissosierte celle suspensjoner ble bioprinted, og deretter cellekulturer ble utstyrt med de nødvendige mekaniske og biokjemiske signaler for å gjøre det mulig for cellene å danne en 3D-struktur. Imidlertid kan cellulær selvmontering ta dager eller uker, kan kreve komplekse romlige og timelige miljøsignaler, eller kan ikke oppstå når to celletyper er co-kultivert. For eksempel induserte brystepitelceller celledød i endotelceller i 2D-kokultur, og dissosierte brystepitelceller dannet ikke 3D-sfæroider når biotrykket i alginat / gelatinhydrogels38. Dissosierte brystepitel- eller kreftceller dannet sfæroider i alginatbaserte bioinks bare når de er fanget i sirkulære PDMS-former. I andre tilfeller ble sfæroider dannet ved hjelp av suspenderte dråper i ultra-lav vedlegg sirkulære brønnplater og deretter blandet inn i alginatbaserte bioinks39,40.
Vi beskriver nå en alternativ 3D vev biomanufacturing metode i denne protokollen. I stedet for frø dissosierte celler og vente på at disse cellene skal danne 3D-strukturer, beskriver vi hvordan du lager og bioprint 3D tumor sfæroider på et vaskulært rørnettverk for å skape en tumorkokulturmodell som kan brukes nesten umiddelbart. Tumor spheroider kan dyrkes in vitro eller avledet fra menneskelig vev (organoider). På samme måte kan vaskulære rør dyrkes eller kan avledes fra fettvev mikrovaskulære fragmenter. Bioinks kan variere fra biologisk inaktiv alginat til den svært biologisk aktive Matrigel41. Siden denne 3D tumor co-kultur modellen kan opprettes med en rekke cellestrukturer og bioinks, kan den innlemme flere celletyper, ekstracellulære matriser, og chemokine gradienter15,42. Mens i sin nåværende formulering, endotelnettverkene kan ikke perfunderes, fremtidige iterasjoner kan integrere denne metoden med mikrofluids eller -on-chip systemer. Bioprinting 3D bryst epitelkuler på endotelnettverk muliggjør rask biofabrikasjon av menneskelige brystmodeller for narkotikatesting og personlig presisjon medisin27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bryst epitelcellevekst og analysemedier
- MCF10A bryst epitelceller
MERK: Den ikke-tumorigenic udødeliggjort bryst epitelcellelinjen er avledet fra en pasient med fibrocystisk sykdom43. Celler uttrykker ikke østrogenreseptor.- For å forberede 20 μg/ml epidermal vekstfaktor (EGF), oppløs 100 μg lyofilisert EGF i 500 μL steril dH2O for å lage 200 μg/ml EGF. Tilsett 500 μL på 200 μg/ml EGF i 4,5 ml steril 0,1 % BSA i dH2O for å lage en 20 μg/ml EGF-lagerløsning. Oppbevares tilberedt 20 μg/ml EGF-aliquots ved -20 °C i opptil 12 måneder.
- For å forberede 500 μg/ml hydrokortison, fortynne 1 mg hydrokortison i 1 ml absolutt etanol (200 proof). Tilsett 1 ml steril DMEM F:12 i denne blandingen for å lage en 500 μg/ml hydrokortisonlagerløsning. Oppbevar hydrokortisonbestanden ved -80 °C i opptil 12 måneder.
- For å forberede 10 μg/ml koleratoksin oppløs 1 mg koleratoksin lyofilisert pulver i 1 ml sterilt dH2O for å lage en 1 mg/ml koleratoksinlagerløsning. Oppbevar koleratoksinbestanden aliquots ved -80 °C i opptil 12 måneder.
- For å forberede vekstmedium, tilsett 500 μL EGF (20 μg/ml), 500 μL hydrokortison (500 μg/ml), 5 μL koleratoksin (1 mg/ml), 500 μL storfeinsulin (10 mg/ml), 10 ml penicillin og streptomycin, og 25 ml hesteserum til 500 ml DMEM F:12 for en endelig konsentrasjon på 20 ng/ml EGF, 500 ng/ml hydrokortison, 10 ng/ml koleratoksin, 10 ng/ml storfeinsulin, 2 % v/v penicillin og streptomycin og 5 % v/v hesteserum. Antibiotikakonsentrasjonen ble økt til 2% for å ta hensyn til redusert sterilitet i bioprintingsprosessen; Antibiotikakonsentrasjonen kan imidlertid senkes til 1%.
- For å forberede Analysemedium, tilsett 500 μL hydrokortison (500 μg/ml), 5 μL koleratoksin (1 mg/ml), 500 μL storfeinsulin (10 mg/ml), 10 ml penicillin og streptomycin, og 25 ml hesteserum til 500 ml DMEM F:12 for en endelig konsentrasjon på 500 ng/ml hydrokortison, 10 ng/ml koleratoksin, 10 ng/ml storfeinsulin, 2 % v/v penicillin og streptomycin og 5 % v/v hesteserum.
- MDA-MB-231 Leilighet
MERK: Den trippelnegative (mangler østrogenreseptor, progesteronreseptor og epidermal vekstfaktorreseptor 2) brystkreft epitelcellelinje er opprettet fra pleural effusjon av en kvinnelig pasient med metastatisk bryst adenokarsinom44. Celler representerer en aggressiv, invasiv og dårlig differensiert brystkreft.- For å forberede vekst og analyse medium, tilsett 50 ml føtal storfe serum, 10 ml penicillin og streptomycin, og 25 ml hesteserum til 500 ml DMEM for en endelig konsentrasjon 10% v / v fosterbovin serum, 2% v / v penicillin og streptomycin, og 5% v / v hest serum.
2. Bryst epitelcellekultur
- Seed 500,000 MCF10A eller MDA-MB-231 celler i en 10 cm (P100) vev kultur rett med 10 ml MCF10A eller MDA-MB-231 vekst medier. MCF10A- og MDA-MB-231-cellene når > 90% samløpet på 48 timer.
- For å passere bryst epitelceller, først vaske celler med 10 ml varm PBS.
- Løsne brystepitelceller ved å legge til 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA til parabolen. Plasser fatet i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 20-25 minutter.
- Legg til 5 ml MCF10A eller MDA-MB-231 Vekstmedium i de trypsiniserte cellene for å nøytralisere trypsin. Pipette cellemedieblandingen opp og ned for å gjenbruke celler og bryte opp celleklynger.
- Tilsett cellefjæringen i et konisk 15 ml konisk rør og sentrifuge ved 1200 x g i 3 minutter. Aspirer forsiktig den overnaturante og resuspend cellepellet i 5 ml MCF10A eller MDA-MB-231 VekstMedium.
- Plate 1 ml cellefjæring i 5 nye 10 cm vevskulturretter sammen med MCF10A eller MDA-MB-231 Vekstmedium. Legg oppvasken i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator. Celler vil være klar til å bli passasjer igjen i 2-3 dager. MCF10A-celler kan opprettholdes til passasje nummer 35, hvor etter som de viser morfologiske endringer. MDA-MB-231 celler kan opprettholdes til passasje nummer 24, hvor etter som de viser morfologiske endringer.
3. Bryst epitelisk sfæroid dannelse
- Frys 200 μL pipettespisser i 30 minutter før analysen startes. Hold vekstfaktor redusert matriseløsning (f.eks. Matrigel) (10 mg/ml) på is for hele prosessen.
- Pipette 30 μL iskald matriseløsning langsomt ved hjelp av iskalde 200 μL pipettespisser inn i hver brønn av et 8-brønns kammersklie. Start fra sidene og dra pipettespissen langs hjørnene, og legg til en siste dråpe til midten av brønnen for å sikre jevn belegg av hver brønn. Unngå luftbobler i løpet av dette trinnet for å sikre et jevnt matrix løsningslag. Bruk nye pipettespisser for hver brønn.
- Inkuber kammer glir i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 15-20 minutter for å polymerisere matriseløsningen.
- Resuspend trypsinized MCF10A celler i MCF10A Analyse Medium ved 200.000 celler / ml eller resuspend trypsinized MDA-MB-231 celler i MDA-MB-231 Growth Medium ved 200.000 celler / ml.
- Hvis du bruker MCF10A-celler, klargjør du friskt MCF10A sfæroidvekstmedium ved å tilsette 5 μL EGF (20 μg/ml) og 100 μL matriseløsning til 5 ml analysemedium for en endelig konsentrasjon på 2 % matrixløsning.
- Fjern kammerets skyv forhåndsbelagt med matriseløsning fra inkubatoren. Tilsett 50 μL mcf10A eller MDA-MB-231 celle suspensjon (10.000 celler) til hver brønn. Hvis du bruker MCF10A-celler, legger du til 450 μL mcf10A sfæroid vekstmedium. Hvis du bruker MDA-MB-231-celler, tilsett 450 μL MDA-MB-231 Vekstmedium forhåndsmikset med 2 % matrix-oppløsning (9 μL). Plasser umiddelbart kammeret i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator.
- Bytt medium hver fjerde dag. Pipette 200 μL med gamle medier forsiktig ut fra ett hjørne av hver brønn ved hjelp av en pipettespiss på 200 μL. Under denne prosessen vipper kammeret lysbildet på 45° for å sikre at spheroidene ikke forstyrres. Tilsett 200 μL nylaget MCF10A Spheroid Growth Medium eller MDA-MB-231 Growth Medium som tidligere var blandet med 2% matriseløsning til hver brønn på hjørnet i dråper for å sikre at sfæroider forblir festet til matriselaget. Bare ~ 50% av media er erstattet slik at alle cytokiner produsert av sfæroider ikke er helt utarmet.
MERK: MCF10A bryst epitelkuloider tar opptil 8 dager å polarisere og danne hule sentre. MDA-MB-231 bryst epitel sfæroider tar opptil 5 dager å danne og har ingen hule sentre.
4. Endotelcellenettverksdannelse
- Human Navlestreng Vene Endotelcelle (HUVEC) Kultur
- Tilsett innholdet i et enkelt endotelvekst medium-2 sett som inneholder insulinvekstfaktor, fibroblastvekstfaktor, vaskulær endotelvekstfaktor, askorbinsyre, epidermal vekstfaktor, heparin og gentamicin-amfotericin B, sammen med 50 ml føtal storfe serum, 5 ml penicillin-streptomycin og 5 ml på 200 mM glutamin til 500 ml Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) for å skape komplett Endotelvekstmedium (EGM-2).
- Frø 500.000 endotelceller i en 10 cm vev kultur rett i 10 ml EGM-2. Plasser celler i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator til de når >80 % samløpet (rundt 48 timer).
- For å passere celler, vask endotelceller med 10 ml varm PBS. Løsne HUVEC ved å tilsette 2 ml 0,05 % Trypsin-EDTA i den 10 cm store vevskulturfatet. Nøye overvåke cellene ved fase kontrast mikroskopi. Cellene er klare når de er balled opp, men forblir festet til parabolen.
- Aspirer forsiktig trypsin ut av parabolen. Tilsett 8 ml EGM-2 i fatet. Vask cellene av fatet ved å pipettere EGM-2 opp og ned over hele paraboloverflaten.
- Alternativt kan du legge til 5 ml EGM-2 i de trypsiniserte cellene for å nøytralisere trypsin. Pipette cellemedieblandingen opp og ned for å gjenbruke celler og bryte opp celleklynger. Tilsett cellefjæringen i et konisk 15 ml konisk rør og sentrifuge ved 1200 x g i 3 minutter. Aspirer forsiktig den overnaturante og resuspend cellepellet i 10 ml EGM-2.
- Tilsett 1 ml cellesuspensjon til 9 ml EGM-2 i en 10 cm vevskulturrett. Legg oppvasken i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator. Byr 2/3 av mediet med fersk EGM-2 annenhver dag. Celler vil være klar til å passere i 3-5 dager. HUVEC kan opprettholdes opp til passasje 8 hvor etter som de ikke klarer å danne nettverk.
- Nettverksdannelse for endotelcelle (HUVEC)
- Frys 200 μL pipettespisser i 30 minutter før analysen startes. Hold vekstfaktor redusert matriseløsning (10 mg/ml) på is for hele prosessen.
- Pipette 30 μL iskald matriseløsning langsomt ved hjelp av iskalde 200 μL pipettespisser inn i hver brønn av et 8-brønns kammersklie. Start fra sidene og dra pipettespissen langs hjørnene, og legg til en siste dråpe til midten av brønnen for å sikre jevn belegg av hver brønn. Unngå luftbobler i løpet av dette trinnet for å sikre et jevnt matrix løsningslag. Bruk nye pipettespisser for hver brønn.
- Inkuber kammer glir i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 15-20 minutter for å polymerisere Matrigel.
- Pre-stain en 10 cm tallerken huvec med 10 μL av røde celle tracker (1:1000) i 30 minutter i 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Vask endotelceller med 10 ml varm PBS. Løsne HUVEC ved å tilsette 2 ml 0,05 % Trypsin-EDTA i den 10 cm store vevskulturfatet. Plasser fatet i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 5 minutter for å løsne cellene helt.
- Tilsett 5 ml EGM-2 i fatet for å nøytralisere trypsinen. Overfør cellefjæringen til et konisk rør på 25 ml. Sentrifuge HUVEC ved 1200 x g i 5 minutter. Aspirer den overnaturante og resuspend cellepellet i 5 ml serumfri EBM-2.
- Telle celler som bruker Trypan blå for å bestemme levedyktige celler. Opprett en løsning på 1 x10 6 celler/ml.
- Tilsett 100 000 HUVEC i hver brønn med 200 μL serumfri EBM-2. Hvis flere celler legges til, vil de opprette en overflate monolayer i stedet for et rørnettverk.
- Inkuber HUVEC i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator. Etter 6 timer, bilde HUVEC nettverk etter fase kontrast mikroskopi. Nettverk er nå klar for coculture med bryst sfæroider.
5. Bioprinting Bryst epitelkuloider på forhåndsdannede HUVEC-nettverk
MERK: Et biodeponeringssystem med to dyser bør brukes til biofabrikasjonsprosessen. I dette tilfellet hadde systemet tre bevegelsesarmer for å tillate mikronskala romlig kontroll av materialavsetning samt to skruedrevne motorer for å deponere bioink fra 10 ml sprøyter. Systemet skal funksjonaliseres med et høyeffektivt partikkelluftfiltreringssystem samt UV-steriliseringsevner for å opprettholde et sterilt miljø under bioprinting. Bioskriveren er UV-sterilisert i en time før utskriftsprosessen.
- Lag bryst epitel spheroider og HUVEC nettverk som tidligere beskrevet. Anslå antall bryst epitel spheroider i hver brønn ved å telle sfæroider i representative fase kontrast mikroskopi bilder.
- Klipp 0,5 cm av enden av en 1000 μL pipettespiss. Bruk den kuttede pipettespissen til å forsiktig pipette alle sfæroider ut av 8-brønns kammersklie og inn i et 50 ml rør. Resuspend sfæroider i den valgte bioink ved 100 sfæroider/100 μL.
MERK: Høyere sfæroidkonsentrasjoner kan føre til spheroid klynger og forhindre visualisering av interaksjoner mellom sfæroider og endotelnettverkene. - Før spheroidblandingen gjennom en 70 μm cellesil for å fjerne store eller grupperte sfæroider.
- Legg de samlede sfæroidene i en 10 ml steril sprøyte og hette den med en 25-gauge steril nål. Fest sprøyten til bio-deponeringssystemet.
- Aspirer mediet av HUVEC-nettverkene i 8-brønns kammersklien.
- Ekstruder 100 μL brystepitele sfæroider på 6 brønner huvec-nettverk med en strømningshastighet på 1 ml/min. Vedlikehold 2 brønner av HUVEC-nettverk som kontroller.
- Legg til 400 μL mcf10A sfæroid vekst medium hvis du bruker MCF10A sfheroider trykt på HUVEC-nettverk eller legge til 400 μL MDA-MB-231 Vekst Medium tidligere blandet med 2% matrise løsning hvis du bruker MDA-MB-231 sfæroider trykt på HUVEC nettverk. Det respektive sfæroidvekstmediet bør brukes i HUVEC-kontrollbrønner.
- Inkuber medkulturer i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 24 – 96 timer uten medieendring. Co-kulturer vil forbli levedyktig i det opprinnelige mediet i opptil fire dager.
6. Konfokal mikroskopi
- Immunofluorescence og PBS-Glycine Wash Buffer Preparation
- Forbered Immunofluorescence (IF) buffer 10x lagerløsning ved å legge til 2,5 g natriumazid, 5 g storfe serumalbumin, 10 ml Triton X-100 og 2,05 ml Tween-20 i 500 ml 10x PBS. Juster pH til 7,4. Oppbevar lagerløsningen i opptil ett år ved 4 °C for å unngå sedimentering.
- Opprett en fungerende IF-buffer ved å fortynne 50 ml 10x HVIS-buffer i 450 ml sterilt deionisert vann. Oppbevar arbeidsløsningen ved romtemperatur i opptil en uke.
- Forbered 10x PBS-Glycine buffer lagerløsning ved å legge til 37,5 g glycin til 500 ml 10x PBS. Juster pH til 7,4. Oppbevar lageroppløsningen i opptil 6 måneder ved 4 °C for å unngå sedimentering.
- Lag en fungerende PBS-Glycine-løsning ved å fortynne 50 ml 10x PBS-Glycine-buffer i 450 ml sterilt deionisert vann. Oppbevar arbeidsløsningen ved 4 °C i opptil én uke.
- Etikett bioprintede prøver og bilde av konfokal mikroskopi
- Aspirer medium fra bioprinted 3D co-kulturer og skyll 3 ganger med varm PBS. Fiks bioprinted 3D-kokulturer med 4 % paraformaldehyd i 1 time ved romtemperatur. Skyll prøvene 3 ganger i 20 minutter med 1x PBS-Glycine.
- Blokker prøver med IF-buffer blandet med 10% geiteserum i 90 minutter (primærblokk), etterfulgt av 40 minutter med IF-buffer pluss 10% geiteserum og Affinipure Fab fragment (1:100, sekundær blokk).
- Hvis du bruker MCF10A-sfæroider, etikettprøver med primært antistoff for integrin α6 (1:100) i sekundær blokkeringsbuffer over natten ved 4 °C, etterfulgt av et Alexa Fluor 488 sekundært antistoff (1:200) og Hoescht 33342 (1:1000) i 1 t ved romtemperatur beskyttet mot lys. MCF10A cellelinjer uttrykker høye nivåer av integrin α6, noe som er viktig for å vise sfæroid polarisering og morfologi.
- Hvis du bruker MDA-MB-231 sfæroider, som uttrykker lave nivåer av integrin α6, etikettprøver med Alexa Fluor 488 falloidin (1:100) og Hoescht 33342 (1:1000) i sekundær blokkering buffer i 4 timer ved romtemperatur beskyttet mot lys. Falloidin muliggjør actin filament visualisering slik at sfæroid amorf og invasiv morfologi kan vurderes.
- Vask prøver med 1X PBS-glycin 3 ganger i 20 minutter.
- Klargjør prøver for montering ved å fjerne kammersklien ved hjelp av produsentens verktøy. Legg til en liten dråpe antifadeløsning til hver brønn. Plasser en 22 mm x 60 mm deksleglass på hvert kammersklie og forsegle kantene forsiktig med klar neglelakk.
- Bildeprøver ved hjelp av et konfokalt mikroskop som Z-stabler på ~ 10 skiver i 5 μm trinn. Komprimer eventiDer Z-plan til ett enkelt plan ved hjelp av kommandoen Extended Focus i cellebildeprogramvare.
- Kvantifisere sfæroid vedheft til endotelnettverk ved hjelp av bilde J. Antall adhered sfæroider kan kvantifiseres ved hjelp av analysere plugin med riktig partikkelstørrelse og sirkularitet. Normaliser antall vedlagte sfæroider til bildeområdet.
- For å sikre reproduserbarhet, kvantifisere antall tilslutnede sfæroider i 4 x 4 flislagte bilder av co-kulturer. Hvis sfæroidnummeret er statistisk signifikant lavere enn andre eksperimenter, bør eksperimentet gjentas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bryst epitelceller bør selv organisere i 3D-sfæroider etter 5-8 dager med kultur på matriseløsning og i kulturmedium med 2% matriseløsning. Ikke-tumorigenic MCF10A bryst epiteliske sfæroider skal vises rundt og har et hul senter, med integrin α6 polarisert til den ytre kanten av spheroid (Figur 1, inntreder viser hule sentre). Svært invasive MDA-MB-231 brystkreft epitelceller danner uregelmessige sfæroider. Sfæroider bør brukes når de er rundt 100 – 300 μm i diameter. Når sfæroider blir for store og kommer i nærheten, vil spheroidene bli sammen for å danne megaspheroider. I tillegg kan MDA-MB-231 brystepitele sfæroider vise celler som migrerer ut av sfæroidene hvis de vedlikeholdes i Matrigel-kulturen for lenge.
HUVEC bør selv organisere seg i rørlignende nettverk etter 6-8 timer med sparsom, serumfri kultur. Eksempler vil ha flercellede noder med tilkoblinger som er dannet av linjer med 1-3 celler parallelt. HUVEC-nettverkene kan avbildes av fasekontrastmikroskopi eller med konfokal mikroskopi hvis de er merket med Cell Tracker og Hoescht (figur 2). ImageJ angiogeneseanalysatoren kan brukes til å kvantifisere nettverkskoblinger, segmenter og grener. HUVEC-nettverk vil dø hvis de blir forlatt i serumfritt medium i mer enn 16 timer.
Når brystepitelsfæroider er biotrykt på HUVEC-nettverkene, bør både sfæroider og nettverk opprettholde sin opprinnelige morfologi i minst 24 timer. MCF10A bryst epitel spheroider vil vises som runde objekter som holder seg direkte til endotelnettverk, mens MDA-MB-231 bryst epitel spheroider vil vises mer amorfe ennå fortsatt festet eller i nærheten av endotelnettverk (Figur 3). HUVEC-nettverk vil bli opprettholdt når de dyrkes samtidig med brystepitelsfæroider. For co-kulturer lenger enn 24 timer, bryst epitelceller kan migrere ut av sfæroider og langs endotelnettverk. Etter vår erfaring skjer dette tidligere i tumorogen i stedet for ikke-tumorigenic bryst epitelceller38. Vi har tidligere demonstrert ved hjelp av bioprinted co-kulturer at narkotikatesting kan initieres så tidlig som 2 timer etter sfæroid bioprinting, for eksempel for å teste sfæroid vedheft på endotelnettverk45. Vi har også vist at 3D bryst sfæroider er mer motstandsdyktig mot anti-kreft medisiner som Paclitaxel enn når trykt som individuelle celler eller i co-kultur41,45. I fravær av bioprinted sfæroider, HUVEC nettverk kontroll brønner på egen hånd ikke klarer å holde sitt nettverk morfologi og dø etter 16 h.
Figur 1: Representative konfokale mikroskopibilder av brystepitele sfæroider. MCF10A-sfæroider ble merket for integrinske α6 (grønn) og kjerner (blå). Cellefenotype kan bekreftes etter bioprinting når sfæroider vises rundt med et hul senter (inntreden) og har integrin α6 polarisert på de ytre kantene. MDA-MB-231 sfæroider ble merket for actin (grønn) og kjerner (blå). Cellefenotype kan bekreftes når sfæroider er uregelmessig formet uten hule sentre og har celleprosesser som invaderer inn i den omkringliggende matrisen. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder av HUVEC-nettverk etter fasekontrast og konfokal mikroskopi. HUVEC-nettverk vises som små flercellede noder med linjer med celler som forbinder nodene. For konfokal mikroskopi ble cellene merket med Cell Tracker Red og Hoescht for kjerner (blå). Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av brystepitele sfæroider co-kultivert med HUVEC-nettverk. MCF10A-sfæroider, merket for integrinske α6 (grønn) og kjerner (blå), forblir runde og vises overholdt direkte til endeotelnettverkene. MDA-MB-231 sfæroider, merket for actin (grønn) og kjerner (blå), vises amorfe, men forblir nær eller på endotelnettverk. Co-kulturer opprettholde denne morfologi i minst 24 timer etter bioprinting, hvor etter som brystceller kan migrere ut langs endotelrørene. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er den første av sitt slag til bioprint sfæroider i sin 3D-arkitektur for co-kultur med endotelceller også i deres 3D-arkitektur. Kritiske protokolltrinn inkluderer den første dannelsen av brystepitelsfæroider og HUVEC-nettverk. Ekstrem forsiktighet må utvises ved fôring av brystepitele sfæroider, da de lett forstyrres fra matriseløsningen. På samme måte må brystepitele sfæroider behandles med forsiktighet når de er pipetted av matriseløsningen og blandet inn i nettverkene. HUVEC-nettverk bør ikke være belagt med for høy tetthet eller stå i mer enn 16 timer, da de vil danne en monolayer eller dø, henholdsvis. Til slutt bør all bioprinting forekomme i et sterilt miljø ved 37 °C for å maksimere cellelevebiliteten.
Bryst epitelsfæroider kan bioprinted i en rekke bioinks foruten Matrigel, inkludert alginat og alginat-kollagen blandinger. Vi viste at sfæroider var levedyktige og opprettholdt sin morfologi når de ble trykt i alginatbaserte bioinks41. Dermed er det også mulig å bruke bioinks mens vi presenterer bioprinting her i matriseløsningsbasert bioink. Vi brukte også andre brystkreftcellelinjer, inkludert MCF-7 og genmodifiserte MCF10A-NeuN-celler med lignendesuksess 38,41,45. Alternative midler kan også brukes til å lage bryst epitel sfæroider. For eksempel brukte Lee et al. hydrogel mikrobrønnarrayer produsert ved hjelp av PDMS-frimerker for å lage ensartet sfæroider av kontrollert størrelse46. Til slutt kan alternative endotelceller som tumoravledede endotelceller brukes, og i stedet for å danne HUVEC-nettverk, kan fettvev avledede mikrovesker direkte skrives ut som 3D vaskulærestrukturer 47.
En primær begrensning av denne metoden var utfordringen med å kontrollere bioprinted sfæroid plassering og nummer. Sfæroider måtte skrives ut med relativt store dyser og i usynlige væsker for å forhindre sfæroidskade. Raskt gelling bioinks kan bedre kontrollere sfæroid plassering. Sfæroider kunne heller ikke telles i bioink, siden de var for store for vår celleteller. Vi stolte i stedet på sfæroidtall avledet fra fasekontrastbilder tatt før pipettering sfæroider av Matrigel overflaten. Alternative måter å danne sfæroider kunne bedre kontrollere antall og størrelse. Vi var i stand til å kontrollere sfæroid nummer og størrelse med moderat nøyaktighet ved hjelp av cellesiler og kultivering sfæroider på samme måte hver gang. En endelig begrensning er at bryst epitelceller migrerer ut av sfæroider og langs endotelnettverkene over tid. Det er mulig at alternative bioinks ville oppheve denne begrensningen.
Direkte bioprinting av bryst epitelkuler på forhåndsdannede HUVEC-nettverk gjør det mulig å opprette en 3D in vitro tumor co-kultur modell på kort tid. Forskere kan deretter raskt undersøke interaksjoner mellom sfæroider og vaskulatur med høyere gjennomstrømning. I fremtiden kan brystepitelkuler biotrykkes på perfused vaskulaturer, noe som ville tillate studie av strømningseffekter. I tillegg kan tumoravledede organoider og endotelceller bioskrives for å muliggjøre presisjonsmedisin gjennom testing av legemiddeleffekt i en pasientspesifikk modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av NIH 1R01HL140239-01 til AMC. Vi vil gjerne takke Cell Imaging Center ved Drexel University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity | Sanyo | MCO-20AIC | Cell incubation |
| 3D Bio printer | custom-made | None | Used for bioprinting |
| 8-well chamber slides | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | for seeding spheroids |
| 25-gauge needle | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | bioprinting syringe needle |
| Absolute ethanol (200 proof ) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | reconsitution of media components |
| Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | secondary block - Immunofluorescence |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday antibody-Immunofluorescence |
| Bovine insulin | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Media additive |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Blocking agent -Immunofluorescence |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Remove large or clustered spheroids |
| CellTracker™ Red CMTPX Dye | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | pre-stain for HUVEC tubes |
| Compact Centrifuge | Hermle- Labnet, Edison ,NJ | Z206A | For cell centrifugations |
| Cholera Toxin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Media additive |
| Conical tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Collecting and resuspending cells |
| Countess II-FL Cell counter | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | counting cells |
| Glass pipettes (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | cell resuspension |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A basal media |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 basal media |
| Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC basal media |
| Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors) |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Labelling MDA-MB-231 spheroids | |
| Fetal Bovine serum | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 media additive |
| Goat serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | Immunofluorescence labelling component |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | immunofluorescence buffer component |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Nuclei stain immunofluorescence |
| Horse Serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Media additive |
| Hydrocortisone | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Media additive |
| Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) | Cell applications, San Diego , CA | 200-05f | Endothelial cell lines |
| Integrin α6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Immunofluorescence spheroid labelling component |
| Live Dead assay | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| LSM 700 Confocal microscope | Zeiss, Thornwood, NY | Used to visualize cells | |
| Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Spheroid formation |
| MCF10A cells | ATCC | CRL-10317 | Breast cell line |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | HTB-26 | Breast cell line |
| Paraformaldehyde | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | cell fixative |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive |
| Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Wash buffer for cells before trypsinization |
| Phosphate buffer saline 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | immunofluorescence buffer component |
| Prolong gold antifade | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | immunofluorescence mountant medium |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ assay media component |
| Sodium Azide | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | immunofluorescence buffer component |
| Sterile syringe (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | bioprinting process |
| Tissue culture dish (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | monolayer cell culture |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | immunofluorescence buffer component |
| Trypan blue 0.4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | cell counter additive |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | cell detachment |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | immunofluorescence buffer component |
| Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC tube additive |
| Volocity 6.3 cell imaging software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z stack compresser |
References
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19 (2016).
- Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, Pt 5 1945-1957 (1995).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
- Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, Pt 12 2377-2388 (2003).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
- Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66 (2011).
- Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
- Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), Cambridge. 1068-1078 (2015).
- Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671 (2015).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), Kidlington. 539-553 (2015).
- Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
- Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589 (2016).
- Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), Cambridge. 1262-1271 (2013).
- Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S.
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
- Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
- Zhang, Y. S., et al.
- Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101 (2015).
- Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
- Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
- Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
- Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003 (2019).
- Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
- Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285 (2015).
- Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
- Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
- Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145 (2018).
- Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).
