Summary
Denne protokol beskriver en effektiv cellefri metode til produktion af proteoliposom af høj kvalitet ved dobbeltlagsdialysemetode ved anvendelse af hvedecellefrit system og liposomer. Denne metode giver passende midler til funktionel analyse af membranproteiner, screening af lægemiddelmål og antistofudvikling.
Abstract
Membranproteiner spiller væsentlige roller i en række cellulære processer og udfører vitale funktioner. Membranproteiner er medicinsk vigtige i lægemiddelopdagelse, fordi de er mål for mere end halvdelen af alle lægemidler. En hindring for at gennemføre biokemiske, biofysiske og strukturelle undersøgelser af membranproteiner samt antistofudvikling har været vanskeligheden ved at producere store mængder membranprotein af høj kvalitet med korrekt konformation og aktivitet. Her beskriver vi en "dobbeltlagsdialysemetode" ved hjælp af et hvedekimcellefrit system, liposomer og dialysekopper til effektivt at syntetisere membranproteiner og forberede oprensede proteoliposomer på kort tid med en høj succesrate. Membranproteiner kan produceres så meget som i flere milligram, såsom GPCR'er, ionkanaler, transportører og tetraspaniner. Denne cellefri metode bidrager til at reducere tid, omkostninger og indsats til fremstilling af proteoliposomer af høj kvalitet og giver passende midler til funktionel analyse af membranproteiner, screening af lægemiddelmål og antistofudvikling.
Introduction
Membranproteiner er et af de vigtigste lægemiddelmål inden for diagnose og terapi. Faktisk er halvdelen af små sammensatte lægemidler mål membranproteiner, såsom G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) og ionkanaler1. Gennem årene har forskere arbejdet med biokemiske, biofysiske og strukturelle undersøgelser af membranproteiner for at belyse deres struktur og funktion 2,3. Udvikling af monoklonale antistoffer mod membranproteiner udføres også aktivt for at fremskynde funktionelle og strukturelle undersøgelser og udvikle terapeutiske og diagnostiske anvendelser 4,5,6,7,8,9. Alle disse undersøgelser kræver en stor mængde membranproteiner af høj kvalitet10. For eksempel er der brug for flere milligram oprensede membranproteiner med naturlig konformation til antistofudvikling. En meget større mængde højt oprensede membranproteiner er nødvendige for røntgenkrystallografi. Masseproduktion af membranproteiner er dog fortsat en flaskehals i membranproteinforskningen11. Membranproteiner har komplicerede strukturer med en eller flere transmembranspiraler og spiller vigtige roller i cellehomeostase. Heterolog overekspression af membranproteiner fører til flere forhindringer såsom aggregering af membranproteiner, der akkumuleres ved høje lokale koncentrationer eller forstyrrelse af cellulære signalveje. Selvom udtrykket er vellykket, står efterfølgende trin i prøveforberedelsen også over for vanskeligheder. For eksempel kræver forberedelse af proteoliposom færdigheder og erhvervserfaring på højt niveau inden for opløselse, oprensning og stabilisering af membranproteiner og koster også meget indsats og tid12,13.
På den anden side er der opstået nogle avancerede teknologier i de seneste årtier til at producere proteiner uden brug af levende celler 14,15,16,17,18. Cellefri proteinsynteseteknologi rekonstituerer translationsreaktion i et reagensglas. Da der ikke er nogen begrænsninger, som det cellulære ekspressionssystem har, har cellefrie systemer potentiale til at syntetisere en række proteiner, der er vanskelige at udtrykke eller vise toksicitet i celler. Renset celleekstrakt eller rekonstitueret translationelt maskineri blandes med skabelon-mRNA'er, aminosyrer og energikilder, og rekombinante proteiner syntetiseres på kort tid. Med hensyn til membranproteinsyntesen tilsættes nogle slags stilladser sammensat af lipider eller amfifile, såsom liposomer, biceller, nanodiscs eller copolymerer til den cellefrie reaktion 19,20,21,22,23,24. Syntetiserede membranproteiner interagerer med stilladserne og kan stabiliseres i vand. Cellefri syntetiserede membranproteiner anvendes i vid udstrækning i funktionelle undersøgelser og antistofproduktion 25,26,27,28,29,30,31.
I denne protokol beskriver vi en effektiv cellefri metode til proteoliposomproduktion ved hjælp af hvedecellefrit system og liposomer. Hvedecellefrit proteinsyntesesystem er et kraftfuldt in vitro-oversættelsessystem, der bruger ekstrakt fra hvedekim 15,32,33. Hvedekim indeholder en stor mængde translationelle maskiner og få oversættelsesinhibitorer. Det translationelle maskineri i hvede, et medlem af eukaryoter, er velegnet til oversættelse af eukaryote proteiner, og dets oversættelseseffektivitet påvirkes næppe af kodonbrug af skabelonens mRNA. Ved hjælp af hvedecellefrit system har vi syntetiseret en række proteiner, herunder proteinkinaser 34,35, ubiquitinligaser36, transkriptionsfaktorer37 og membranproteiner med høje succesrater. Til membranproteinproduktion tilføjer vi lipidvesikelliposomet i oversættelsesblandingen som stillads19,38. Hydrofobe domæner af membranprotein interagerer med lipiddobbeltlag og integreres spontant med liposom. Densitetsgradientcentrifugering anvendes til strengt at adskille proteoliposom fra endogene hvedeproteiner, selvom en fælles centrifugering af translationsreaktionsblandingen er tilstrækkelig til en simpel oprensning af proteoliposom20. Mange slags integrerede membranproteiner er blevet syntetiseret ved hjælp af hvedecellefrit system og anvendt til forskellige undersøgelser og udviklinger 25,38,39,40,41,42,43,44. Desuden udviklede vi "dobbeltlagsdialysemetoden" til storskalaproduktion45,46. I denne metode nedsænkes kop-type dialyseanordning i substrattilførselsbufferen, og der dannes to lag oversættelsesreaktionsblanding og substrattilførselsbuffer i koppen som vist i figur 1. Kontinuerlig tilførsel af substrater og fjernelse af biproduktet kan effektivt udføres i både toppen og bunden af reaktionsblandingen i lang tid, hvilket fører til fremragende oversættelseseffektivitet (figur 2A og figur 2B)45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af pEU-ekspressionsplasmid
BEMÆRK: pEU-ekspressionsplasmid skal omfatte startkodon, åben læseramme for målmembranprotein og stopkodon i fragmentet (se figur 1). Tilføj detektions-/rensningsmærkesekvens(er) på den relevante position, når det er nødvendigt. Enten restriktionsenzymfordøjelse eller sømløs kloning kan anvendes til underkloning. Her beskriver vi en protokol ved hjælp af en problemfri kloningsmetode.
- Forbered indsæt DNA-fragment.
- Forstærk genet af interesse ved PCR ved hjælp af cDNA-skabelonen, primer 1 og primer 2. Primer 1 og primer 2 indeholder henholdsvis 15 bp overlapninger til sømløs kloning (se materialetabellen).
BEMÆRK: Medtag ikke sekvenser, der skal behandles og fjernes fra modent protein i cellerne (f.eks. Signalsekvens). Behandling af syntetiseret protein udføres ikke i hvedecellefrit system. Tilføj ikke Kozak-sekvens. pEU-E01-MCS vektor har E01 oversættelsesforstærker. - Tilsæt 1/25 volumen DpnI-restriktionsenzym til PCR-produktet for at fjerne skabelonplasmid-DNA. Inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
- Brug et PCR-rensningssæt til at rense PCR-produktet og justere koncentrationen ved 20-50 ng / μL.
- Forstærk genet af interesse ved PCR ved hjælp af cDNA-skabelonen, primer 1 og primer 2. Primer 1 og primer 2 indeholder henholdsvis 15 bp overlapninger til sømløs kloning (se materialetabellen).
- Linearize pEU-E01-MCS vektor.
- Udfør omvendt PCR ved hjælp af pEU-E01-MCS, primer 3 og primer 4.
- Tilsæt 1/25 volumen DpnI-restriktionsenzym til det inverse PCR-produkt. Inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
- Brug et PCR-rensningssæt til at rense PCR-produktet i henhold til producentens anbefaling. Koncentrationen justeres ved 20-50 ng/μL.
- Bland 2 μL insert DNA-fragment, 2 μL lineariseret vektor og 4 μL 2x sømløs kloningsenzymblanding.
- Transformer Escherichia coli-stamme JM109 med det sømløse kloningsprodukt. Brug en spreder til at sprede bakteriesuspensionen på en LB-ampicillin agarplade.
BEMÆRK: pEU-vektor har en ampicillinresistensmarkør. - Bekræft sekvensen af ekspressionsplasmidet konstrueret ved hjælp af primer 5 og primer 6 fra henholdsvis 5' og 3' side af MCS i pEU-plasmid.
- Forstærk og rens udtrykket plasmider.
- Kultur den plasmidtransformerede E. coli-stamme JM109 i 150 ml LB-ampicillinmedium ved 37 ° C og 125 slag pr. Minut ryster natten over.
- Ekstrahers og rens plasmiderne ved hjælp af kommercielt tilgængeligt plasmidforberedelsesmidi-sæt. Opløs plasmider i 500 μL TE-buffer.
FORSIGTIG: Brug ikke et mini-forberedelsessæt til plasmidekstraktion. Det giver ikke tilstrækkelig kvalitet og mængde plasmid. - Der tilsættes 500 μL phenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1). Bland kraftigt i 5 min, og centrifuge i 5 min ved 17.800 x g og stuetemperatur. Overfør den øvre plasmidopløsning til et nyt rør.
FORSIGTIG: Brug engangshandsker for at beskytte huden mod phenol og chloroform.
BEMÆRK: For at fjerne forurening af RNase fra plasmidekstraktionssæt skal plasmiderne renses ved hjælp af phenol-chloroformrensning. - Tilsæt 500 μL chloroform for at fjerne phenol fuldstændigt. Bland kraftigt i 5 min, og centrifuge i 5 min ved 17.800 x g og stuetemperatur. Overfør den øvre plasmidopløsning til et nyt rør.
- Der tilsættes 2,5 volumen/ethanol og 1/8 volumen 7,5 M ammoniumacetat, og der opbevares -30 °C i 1 time.
- Centrifuge ved 17.800 x g ved 4 °C i 10 min. Vask pelleten med 500 μL 70% ethanol. Fjern supernatanten forsigtigt og lad pelleten stå i 5 minutter for at tørre op.
- Opløs ekspressionsplasmiderne fuldstændigt i 100 μL ultrarent vand. Koncentrationen af plasmider med absorbans måles ved 260 nm. Koncentrationen justeres til 1 mg/ml.
2. In vitro transkription
FORSIGTIG: Brug DNase og nukleasefri plastrør og tip i trin til transkription og oversættelse. Undgå autoklavering af plastvarer for at forhindre forurening.
- Høst ultrarent vand i et nyt plastrør.
FORSIGTIG: Brug ikke DEPC-behandlet vand, da resterende DEPC kraftigt hæmmer reaktionen. Brug friskrenset ultrarent vand til transkription og oversættelse. - Forbered transkriptionsreaktionsblanding ved at blande 115,2 μL ultrarent vand, 40 μL transkriptionsbuffer LM, 20 μL NTP-blanding, 2,4 μL 80 U / μL RNasehæmmer, 2,4 μL 80 U / μL SP6-polymerase og 20 μL 1 mg / ml pEU-ekspressionsplasmider. Bland reagenserne forsigtigt ved at invertere. Udfør et hurtigt spin.
- Transkriptionsreaktionen inkuberes ved 37 °C i 6 timer.
- Bland reaktionen forsigtigt ved at vende og drej hurtigt ned. Brug det straks til oversættelse, ellers fryses og opbevares ved -80 ° C.
- Bekræft transkriptionsproduktet ved elektroforese.
- Bland 100 ml 1x TAE-buffer og 1 g agarose. Opvarm suspensionen i en mikrobølgeovn for at forberede 1% agarose TAE gel.
- Tag 1 μL transkriptionsreaktion og bland med 3 μL vand og 4 μL 2x belastningsfarvestof.
BEMÆRK: Denaturering af RNA er ikke påkrævet. - Der fyldes 4 μL af blandingen og 2 μL DNA-stigemarkør på agarose-TAE-gelen.
- Elektroforese ved 100 V i 20 min.
- Plet gelen i ethidiumbromid i 30 min. Kontroller stigebåndmønsteret for mRNA ved hjælp af UV-transilluminator og gelkamera.
BEMÆRK: Når der observeres et udtværet bånd på mindre end 500 bp, mistænkes mRNA-nedbrydning.
3. Forberedelse af materiale til oversættelse
- Forbered oversættelsesbufferen.
- Bland 27 ml frisklavet ultrarent vand og 0,75 ml af hver 40x stamopløsning til henholdsvis S1, S2, S3 og S4 i et 50 ml rør.
BEMÆRK: Moduler mængden af materialer i henhold til den endelige krævede mængde 1x oversættelsesbuffer.
FORSIGTIG: Opbevar eller genfrys ikke den overskydende 1x oversættelsesbuffer efter brug.
- Bland 27 ml frisklavet ultrarent vand og 0,75 ml af hver 40x stamopløsning til henholdsvis S1, S2, S3 og S4 i et 50 ml rør.
- Forbered kreatinkinasestamopløsning. Lyofiliseret kreatinkinase opløses i ultrarent vand til en endelig koncentration på 20 mg/ml. Opløsningen dispenseres i små mængder (10 til 50 μL hver) i 0,2 ml 8-strimmel PCR-rør. Rørene fryses i flydende nitrogen, og opbevares ved -80 °C.
FORSIGTIG: Genfrys ikke kreatinkinaseopløsning efter optøning. - Vask dialysekopper (0,1 ml størrelse) for at fjerne glycerol fra dialysemembranen.
BEMÆRK: Der er flere dialysekopper i forskellige størrelser. Små kopper (0,1 ml) anvendes til test i lille skala (afsnit 5.4) og store kopper (2 ml) til produktion i stor skala (afsnit 5.5). Vasketrinnet af dialysemembranen i store kopper kan undgås.- Kom 1 ml ultrarent vand i et nyt 1,5 ml rør. Indsæt lille dialysekop (0,1 ml) i røret. Tilsæt 0,5 ml ultrarent vand i koppen.
- Inkuberes i mere end 30 minutter ved stuetemperatur.
4. Fremstilling af liposomer
BEMÆRK: Her beskriver vi to protokoller til fremstilling af liposomer. Den ene bruger klar til brug frysetørrede liposomer (afsnit 4.1), mens den anden producerer liposomer ved at hydrere en tynd lipidfilm (afsnit 4.2).
- Forbered liposomer ved hjælp af frysetørrede liposomer.
BEMÆRK: En lettere måde at producere proteoliposom på er at bruge kommercielt tilgængeligt Asolectin liposom. Asolectin er en slags naturligt lipid ekstraheret fra sojabønner.- Åbn hætteglasset, der indeholder 10 mg frysetørrede Asolectin-liposomer (se materialetabellen), og tilsæt 200 μL oversættelsesbuffer (pkt. 3.1) i bunden af hætteglasset. Forsegl hætteglasset og inkuber i 10 min.
- Bland kraftigt ved at sætte hætteglasset på hvirvelblanderen i 1 min.
- Indsæt hætteglasset i et 50 ml rør. Drej røret ned ved centrifugering ved 500 x g i 1 min.
- Ved hjælp af en pipette overføres Asolektin liposomsuspensionen (50 mg lipid / ml) til et nyt 1,5 ml rør. Brug liposomet straks til oversættelse, ellers fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
- Forbered liposomer ved at hydrere en tynd lipidfilm.
- Hvis et lipid sælges i pulverform, opløses i chloroform eller passende organisk opløsningsmiddel til 10-100 mg / ml koncentration.
BEMÆRK: En tynd lipidfilm kan fremstilles ved hjælp af rensede og / eller syntetiserede amfifile lipider. Oprensningsmetoden for asolectin er tidligere beskrevet38. Funktionelt modificerede lipider, såsom biotinylerede lipider, fluorescerende lipider og adjuverende lipider, kan tilsættes til de basale lipider for at producere funktionelle liposomer. - Lipidopløsningen indeholdende 50 mg lipid(er) overføres til en fordampningskolbe.
- Ved hjælp af en roterende fordamper inddampes opløsningsmiddel og jævnt spredes lipidet på kolbebundens væg for at danne en tynd film af lipid.
- Kolben anbringes i en vakuumudtørring, og lad den stå under undertryk natten over for at fjerne opløsningsmidlet helt.
- Der tilsættes 1 ml translation buffer til fordampningskolben. Kolben drejes for at sprede bufferen over den tynde lipidfilm. Inkuber i 5 minutter for at hydrere filmen.
- Sonicate kolben med en ultralyd homogenisator eller ultralyd renere. Skift lejlighedsvis kolbens vinkel, så opløsningen kan røre filmen grundigt. Sørg for, at den tynde lipidfilm skrælles fra bunden og emulgeres fuldstændigt og homogent.
BEMÆRK: Elektronmikrograf af biotinylerede lipider indeholdende liposomer er vist i figur 1. - Overfør liposomsuspensionen (50 mg lipider / ml) til et nyt 1,5 ml rør. Hvis det ikke skal anvendes straks, fryses liposomerne i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
- Hvis et lipid sælges i pulverform, opløses i chloroform eller passende organisk opløsningsmiddel til 10-100 mg / ml koncentration.
5. In vitro oversættelse
- Optø hvedekimekstraktet hurtigt ved at flyde rørene på vand ved stuetemperatur i et par minutter. Efter optøning blandes straks forsigtigt ved at vende rørene om, drejes ned og afkøles på is indtil brug.
BEMÆRK: Frys hvedekimekstrakt i flydende nitrogen efter brug, og opbevar ved -80 °C. Det modstår flere fryse- / optøningscyklusser. - Optøning 20 mg/ml kreatinkinasestamopløsning. Der blandes 5 μL stamopløsning og 45 μL translation buffer for at fremstille 2 mg/ml kreatinkinase-arbejdsopløsning.
FORSIGTIG: Genfrysning af kreatinkinase anbefales ikke. - Optø liposomer eller mRNA'er, når det kræves.
- Udfør en lille proteinoversættelse.
- Der fjernes vand fra både røret og dialysekoppen (0,1 ml) som forberedt i trin 3.3.2.
- Der injiceres 1 ml og 300 μL oversættelsesbuffer i henholdsvis røret og dialysekoppen.
FORSIGTIG: Hvis bunden af dialysekoppen ikke når overfladen af oversættelsesbufferen i 1,5 ml røret, injiceres yderligere 50-100 μL buffer til røret. - Translation reaction mixture fremstilles ved at blande 15,6 μL translation buffer, 2,4 μL 2 mg/ml kreatinkinase, 12 μL 50 mg/ml liposomer, 15 μL hvedekimekstrakt og 15 μL mRNA. Bland forsigtigt ved at vende rørene og dreje ned.
- Der aspireres 60 μL af translationsreaktionsblandingen ved anvendelse af en 200 μL pipette.
- Pipettespidsen indsættes i undergrunden af oversættelsesbufferen i dialysekoppen. Pipetter reaktionsblandingen langsomt og forsigtigt. Dæk dialysekoppen med et låg for at forhindre fordampning.
BEMÆRK: Reaktionsblandingen synker naturligt til bunden af koppen og danner et dobbeltlag. Forstyr ikke dobbeltlaget ved at blande eller ryste koppen.
- Gennemfør en storstilet oversættelse (figur 1).
- Hæld 22 ml oversættelsesbuffer i et 25 ml rør. Indsæt en stor dialysekop (2 ml) i røret og tilsæt 2 ml oversættelsesbuffer i koppen.
- Der fremstilles en translation reaction blanding ved at blande 130 μL translation buffer, 20 μL 2 mg/ml kreatinkinase, 100 μL 50 mg/ml liposom, 125 μL hvedekimekstrakt og 125 μL mRNA. Bland forsigtigt ved pipettering.
- Opstil hele translationsreaktionsblandingen (500 μL) ved hjælp af en 1.000 μL pipette. Translation reaction mixture injiceres i dialysekoppen på samme måde som beskrevet i trin 5.4.5. Dæk dialysekop med låg for at forhindre fordampning.
- Reaktionerne inkuberes ved 15 °C i 24 timer.
- Bland reaktionen godt i dialysekoppen ved pipettering. Overfør den rå proteoliposomophæng til et nyt rør.
BEMÆRK: Et fladbundet 1,5 ml rør anbefales til opsamling af proteoliposomet fra den lille oversættelse. Efter centrifugering danner liposomer kompakte og let synlige pellets i nederste hjørne af røret.
6. Oprensning af proteoliposomer
- Røret med rå proteoliposomsuspension centrifugeres ved 17.800 x g ved 4 °C i 10 min.
- Fjern supernatanten. Proteoliposompelleten ophænges i PBS (lille skala: 1 ml, stor skala: 10 ml) ved pipettering.
- Gentag centrifugering og vask af proteoliposomer i yderligere to cirkler.
- Efter vask tilsættes en lille mængde PBS og proteoliposompellet igen ved pipettering. Mål suspensionsvolumenet ved hjælp af en mikropipette. Tilføj PBS for at justere lydstyrken til 60 μL (lille skala) eller 500 μL (stor skala). Overfør suspensionen til et nyt 1,5 ml rør.
- Overfør 10 μL proteoliposomsuspension til et nyt PCR-rør til SDS-PAGE. Del resten af prøverne op i mindre portioner til brug, når det er nødvendigt. Frys i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
7. SDS-PAGE og CBB farvning
- Der tilsættes 70 μL vand og 40 μL 3x SDS-PAGE prøvebuffer til 10 μL proteoliposomsuspension.
FORSIGTIG: Kog ikke SDS-PAGE-prøven, da membranproteiner aggregeres, og trænger næppe ind i acrylamidgel i elektroforese. Tilsæt også nok reduktionsmiddel til SDS-PAGE-prøvebuffer (f.eks. 2-mercaptoethanol ved 3% endelig koncentration) for at forhindre oxidation. - Indstil en 5% -20% gradient SDS-PAGE gel i et elektroforesekammer. Læg også 3 μL, 6 μL, 12 μL proteoliposomprøver, 2 μL proteinstørrelsesmarkør og BSA-standardserier.
- Elektroforese ved 52 mA, 400 V i 30 min.
- Plet gelen med CBB-farvestof i 1 time. Affarv i varmt vand og scan gelbilledet.
- Brug NIH Image J-software (https://imagej.nih.gov/ij/) til at kvantificere båndintensiteten af membranprotein i hver bane. Anslå mængden af syntetiserede membranproteiner med BSA-standardserier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved anvendelse af denne protokol kan delvist oprensede proteoliposomer opnås på kort tid. Repræsentative resultater er vist i figur 2A. Femogtyve GPCR'er i klasse A, B og C blev syntetiseret med succes ved hjælp af dobbeltlagsdialysemetoden (lille skala) og delvist oprenset ved centrifugering og buffervask. Selvom mængden af syntetiserede proteiner varierer alt efter proteintypen, kan 50 til 400 μg membranproteiner normalt syntetiseres pr. reaktion, når der anvendes store dialysekopper. Flere milligram membranproteiner kan let produceres ved at øge antallet af reaktioner på grund af den høje skalerbarhed af hvedecellefrit system. En fortest ved hjælp af en lille dialysekop er tilstrækkelig til at bestemme produktionseffektiviteten af målproteinet i dobbeltlagsdialysemetoden. I henhold til den opnåede produktivitet kan mængden af målproteinet, der skal produceres ved hjælp af store dialysekopper, estimeres.
Denne protokol er velegnet til ekspression af membranproteiner, især for dem med flere transmembranhelices. I de fleste tilfælde inkorporeres membranproteiner med tre eller flere transmembranhelices let i proteoliposomer efter syntese (figur 2B), hvilket giver en god produktivitet af proteoliposomer. Enkelttransmembran-helixproteiner syntetiseres normalt glat; de integreres dog næppe i liposomer på grund af den lille hydrofobe region. Med hensyn til proteiner med to transmembranspiraler afhænger det af, hvordan deres transmembranhelices udsættes for eller ej.
Syntetiserede proteoliposomer opsamles ved simpel centrifugering og oprenses delvist med en vaskebuffer, hvilket i høj grad forkorter oprensningsprocessen af membranproteiner. Selvom både biologiske membraner og membranproteiner er blevet fjernet fra hvedekimekstrakter på forhånd, udfældes små mængder hvedeproteiner undertiden ved binding til liposomer eller membranproteiner syntetiseret (figur 2A). Sådanne proteinforurenende stoffer er vanskelige at fjerne ved simpel centrifugering og buffervask. Når der kræves et stærkt oprenset membranprotein, er det nødvendigt at opløse de delvist oprensede proteoliposomer med et overfladeaktivt middel og rense dem ved søjlekromatografi.
Figur 1: Ordning for cellefri proteoliposomproduktion. SP6, SP6 promotor sekvens; E01, E01 oversættelsesforstærker sekvens; Ampr, ampicillin resistens gen; DTT, dithiothreitol. Elektronmikrograf viser immunogold mærkning af biotinyleret lipid indeholdende liposom. Bar, 0,2 μm. Dette elektronmikrografbillede var fra figur 1D i Takeda et al., 201545. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater af proteoliposomproduktion ved dobbeltlagsdialysemetode. (A) SDS-PAGE-billede af cellefri syntetiserede GPCR'er. Femogtyve udvalgte GPCR'er blev syntetiseret ved dobbeltlagsdialysemetoden. Proteoliposomer blev delvist renset og anvendt til SDS-PAGE og CBB farvning. Pilespidser angiver mål-GPCR'er. (B) Sammenligning af membranproteinproduktioner mellem forskellige oversættelsesmetoder. Dopaminreceptor D1 (DRD1) protein blev syntetiseret ved hver metode i samme forhold mellem hvedekimekstrakt, liposomer og mRNA. DRD1 proteoliposom blev delvist renset ved centrifugering og udsat for SDS-PAGE og CBB farvning. (C) Immunogold mærkning af DRD1-biotin / liposomkompleks. DRD1 blev enzymatisk biotinyleret af BirA biotin ligase. Bar, 0,2 μm. Tomme pilespidser angiver DRD1-biotin på liposomer. Dette tal blev ændret fra figur 1 i Takeda et al., 201545. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Anvendelse af funktionelle proteoliposomer. (A) Immunisering af adjuverende lipidholdigt proteoliposom. (B) Biotinyleret liposombaseret interaktionsassay (BiLIA). Interaktion mellem membranprotein og antimembranproteinantistof blev detekteret af AlphaScreen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol giver en metode til fremstilling af membranproteiner med en høj succesrate. Denne protokol er enkel, meget reproducerbar og let at skalere op. Det har også potentialet til at reducere tid og omkostninger ved eksperimenter, der bruger en stor mængde membranproteiner. Dobbeltlagsdialysemetoden forbedrer produktiviteten med 4-10 gange sammenlignet med dobbeltlagsmetoden eller dialysemetoden (figur 2B)45. I ekstreme tilfælde steg udbyttet af en ionkanal og en transportør henholdsvis 30 og 20 gange med dobbeltlagsdialysemetode end ved dobbeltlagsmetode (data ikke vist). Høj produktivitet af denne protokol er en fordel i antigenproduktion til immunisering. Proteoliposomer bruges ofte som immuniserende antigener til udvikling af antimembranproteinantistoffer. Stærkt koncentrerede og oprensede membranproteiner indlejret i proteoliposom stimulerer effektivt immunrespons og inducerer antistoffer41,47. Ved hjælp af denne dobbeltlagsdialysemetode kan proteoliposomer, der bærer flere milligram membranproteiner til immuniseringsformål, let fremstilles på få dage. Faktisk har vores gruppe syntetiseret GPCR'er, ionkanaler og claudiner ved hjælp af denne protokol og immuniserede mus med produkterne for at opnå monoklonale antistoffer mod dem31,41,45. Nogle af de opnåede monoklonale antistoffer blev verificeret som funktionelle antistoffer, såsom antistoffer med høj affinitet, konformationsfølsomme antistoffer, flowcytometri anvendelige antistoffer og hæmmende antistoffer, hvilket indikerer, at denne protokol er i stand til at producere membranproteiner med funktionelt korrekte konformationer.
En anden attraktiv fordel ved denne protokol er at tillade produktion af proteoliposomer, der tildeles specifikke funktioner ved hjælp af modificerede lipider, såsom biotinylerede lipider, fluorescerende lipider eller adjuverende lipider. Forberedte proteoliposomer med specifikke funktioner er nyttige og anvendelige til en lang række eksperimenter. For eksempel gør adjuverende lipidholdige proteoliposomer, såsom lipid A48 eller monophosphoryllipid A (MPLA)49, praktiske immuniserende antigener, fordi de kan administreres direkte for at immunisere mus uden emulsion. Adjuverende lipider stimulerer effektivt immunrespons hos værtsdyr og inducerer antistoffer mod målmembranproteiner (figur 3A). Faktisk har vi med succes induceret flowcytometri anvendelige antistoffer ved at immunisere mus med MPLA-indeholdende proteoliposom31. Proteoliposomer fremstillet af biotinylerede lipider er også ideelle sonder til screeningsassays. Vi udviklede en screeningsmetode med høj kapacitet til at vælge antimembranproteinantistoffer ved hjælp af biotinylerede proteoliposomer og AlphaScreen (BiLIA-metode) (figur 3B)45. Sandwich ELISA er også i stand til let at konstruere ved hjælp af biotinylerede proteoliposomer og streptavidinbelagte plader.
Endelig er der to vigtige forbehold, der skal behandles, når du bruger denne metode. For det første kan dannelsen af disulfidbindinger være utilstrækkelig på grund af de høje koncentrationer af DTT i translationsbufferen, som muligvis påvirker strukturen af nogle slags membranproteiner15. Selvom disulfidbindinger er i stand til at dannes, efter at reduktanten er fjernet under rensningsprocessen, dannes de muligvis til en anden type snarere end de naturlige. Den anden er, at membranproteiner ikke glykosyleres. De enzymer, der kræves til glykosylering, er teoretisk fraværende i det cellefrie system, fordi biomembraner, herunder Golgi og ER, er blevet fjernet under processen, når hvedekimekstrakt produceres. Da manglen på disulfidbindinger og glykosylering kan forårsage forskellige konformationer, bør forsøgsdesignet overvejes nøje og evalueres, især når posttranslationelle modifikationer er kritiske for proteinernes funktionelle ekspression i henhold til de eksperimentelle formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) fra AMED under Grant Number JP20am0101077. Dette arbejde blev også delvist støttet af JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ×3 SDS-PAGE sample buffer | Containing 10% 2-mercaptoethanol | ||
| 5-20% gradient SDS-PAGE gel | ATTO | E-D520L | |
| 70% ethanol | Diluted ethanol by ultrapure water. | ||
| Agarose | Takara Bio | ||
| Ammonium acetate | Nakalai tesque | 02406-95 | As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C. |
| Ampicillin Sodium | Nakalai tesque | 02739-74 | |
| Asolectin Liposome, lyophilized | CellFree Sciences | CFS-PLE-ASL | A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes. |
| BSA standard | 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer | ||
| CBB gel stain | |||
| cDNA clone of interest | Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment | ||
| Chloroform | Nakalai tesque | 08402-84 | |
| Cooled incubator | Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider. | ||
| Creatine kinase | Roche Diagnostics | 04524977190 | |
| Dialysis cup (0.1 mL) | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL |
| Dialysis cup (2 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88404 | Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL |
| DNA ladder marker | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | GeneRuler 1 kb DNA Ladder |
| DpnI | Thermo Fisher Scientific | FD1703 | FastDigest DpnI |
| E. coli strain JM109 | |||
| Electrophoresis chamber | ATTO | ||
| Ethanol (99.5%) | Nakalai tesque | 14713-95 | |
| Ethidium bromide | |||
| Evaporation flask, 100 mL | |||
| Gel imager | |||
| Gel scanner | We use document scanner and LED immuninator as a substitute. | ||
| LB broth | |||
| Lipids of interest | Avanti Polar Lipids | ||
| Micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| NTP mix | CellFree Sciences | CFS-TSC-NTP | Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each |
| Nuclease-free 25 mL tube | IWAKI | 362-025-MYP | |
| Nucrease-free plastic tubes | Watson bio labs | Do not autoclave. Use them separately from other experiments. | |
| Nucrease-free tips | Watson bio labs | Do not autoclave. Use them separately from other experiments. | |
| PBS buffer | |||
| PCR purification kit | MACHEREY-NAGEL | 740609 | NucleoSpin Gel and PCR Clean-up |
| pEU-E01-MCS vector | CellFree Sciences | CFS-11 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Plasmid prep Midi kit | MACHEREY-NAGEL | 740410 | NucleoBond Xtra Midi |
| Primer 1 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence. |
| Primer 2 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence. |
| Primer 3 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3' Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning. |
| Primer 4 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3' Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning. |
| Primer 5 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’ Sequencing primer, forward |
| Primer 6 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’ Sequencing primer, reverse |
| Protein size marker | Bio-Rad | 1610394 | Precision Plus Protein Standard |
| Rotary evaporator | |||
| seamless cloning enzyme mixture | New England BioLabs | E2611L | Gibson Assembly Master Mix Other seamless cloning reagents are also avairable. |
| SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor | CellFree Sciences | CFS-TSC-ENZ | |
| Submarine Electrophoresis system | |||
| TAE buffer | |||
| Transcription Buffer LM | CellFree Sciences | CFS-TSC-5TB-LM | |
| Translation buffer | CellFree Sciences | CFS-SUB-SGC | SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4). Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water. |
| Ultrapure water | We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle. |
||
| Ultrasonic homogenizer | Branson | SONIFIER model 450D-Advanced | Ultrasonic cleaner can be used as a substitute. |
| UV transilluminator | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Wheat germ extract | CellFree Sciences | CFS-WGE-7240 | WEPRO7240 |
References
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
- Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
- Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
- Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
- Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
- Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
- Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
- Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
- Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
- Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
- Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
- Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
- Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
- Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
- Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
- Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
- Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
- Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
- Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
- Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
- Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
- Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
- Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
- Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
- Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
- Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
- Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
- Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
- Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
- Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
- Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
- Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
- Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
- Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
- Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
- Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
- Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
- Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
- David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
- Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
- Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
- Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, Clifton, N.J. 49-67 (2018).
- Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
- Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
- Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).
