Summary
Detta protokoll beskriver en effektiv cellfri metod för produktion av högkvalitativ proteoliposom genom dubbelskiktsdialysmetod med användning av vetecellfritt system och liposomer. Denna metod ger lämpliga medel för funktionell analys av membranproteiner, screening av läkemedelsmål och antikroppsutveckling.
Abstract
Membranproteiner spelar viktiga roller i en mängd olika cellulära processer och utför vitala funktioner. Membranproteiner är medicinskt viktiga vid läkemedelsupptäckt eftersom de är mål för mer än hälften av alla läkemedel. Ett hinder för att genomföra biokemiska, biofysiska och strukturella studier av membranproteiner samt antikroppsutveckling har varit svårigheten att producera stora mängder högkvalitativt membranprotein med korrekt konformation och aktivitet. Här beskriver vi en "dubbelskiktsdialysmetod" med hjälp av ett vetegroddscellsfritt system, liposomer och dialyskoppar för att effektivt syntetisera membranproteiner och förbereda renade proteoliposomer på kort tid med hög framgångsgrad. Membranproteiner kan produceras så mycket som i flera milligram, såsom GPCR, jonkanaler, transportörer och tetraspaniner. Denna cellfria metod bidrar till att minska tid, kostnad och ansträngning för att framställa högkvalitativa proteoliposomer och ger lämpliga medel för funktionell analys av membranproteiner, screening av läkemedelsmål och antikroppsutveckling.
Introduction
Membranproteiner är ett av de viktigaste läkemedelsmålen inom diagnos och terapi. Faktum är att hälften av små sammansatta läkemedel riktar sig till membranproteiner, såsom G-proteinkopplade receptorer (GPCR) och jonkanaler1. Under åren har forskare arbetat med biokemiska, biofysiska och strukturella studier av membranproteiner för att belysa deras struktur och funktion 2,3. Utveckling av monoklonala antikroppar mot membranproteiner utförs också aktivt för att påskynda funktionella och strukturella studier och för att utveckla terapeutiska och diagnostiska tillämpningar 4,5,6,7,8,9. Alla dessa studier kräver en stor mängd membranproteiner av hög kvalitet10. Till exempel behövs flera milligram renade membranproteiner med naturlig konformation för antikroppsutveckling. En mycket större mängd högrenade membranproteiner krävs för röntgenkristallografi. Massproduktion av membranproteiner är dock fortfarande en flaskhals i membranproteinforskningen11. Membranproteiner har komplicerade strukturer med en eller flera transmembranhelices och spelar viktiga roller i cellhomeostas. Heterolog överuttryck av membranproteiner leder till flera hinder såsom aggregering av membranproteiner som ackumuleras vid höga lokala koncentrationer eller störningar av cellulära signalvägar. Även om uttrycket är framgångsrikt står efterföljande steg i provberedningen också inför svårigheter. Till exempel kräver beredning av proteoliposom hög kompetens och yrkeserfarenhet inom solubilisering, rening och stabilisering av membranproteiner och kostar mycket ansträngning och tid också12,13.
Å andra sidan har viss avancerad teknik dykt upp under de senaste decennierna för att producera proteiner utan användning av levande celler 14,15,16,17,18. Cellfri proteinsyntesteknik rekonstituerar translationsreaktion i ett provrör. Eftersom det inte finns några begränsningar som det cellulära uttryckssystemet har, har cellfria system potential att syntetisera en mängd olika proteiner som är svåra att uttrycka eller visa toxicitet i celler. Renat cellextrakt eller rekonstituerat translationellt maskineri blandas med mall-mRNA, aminosyror och energikällor, och rekombinanta proteiner syntetiseras på kort tid. När det gäller membranproteinsyntesen tillsätts vissa typer av byggnadsställningar som består av lipider eller amfifiler, såsom liposomer, biceller, nanodiscs eller sampolymerer till den cellfria reaktionen 19,20,21,22,23,24. Syntetiserade membranproteiner interagerar med byggnadsställningarna och kan stabiliseras i vatten. Cellfria syntetiserade membranproteiner används i stor utsträckning i funktionella studier och antikroppsproduktion 25,26,27,28,29,30,31.
I detta protokoll beskriver vi en effektiv cellfri metod för proteoliposomproduktion med hjälp av vetecellfritt system och liposomer. Vetecellfritt proteinsyntessystem är ett kraftfullt in vitro-översättningssystem som använder extrakt från vetegroddar 15,32,33. Vetegroddar innehåller en stor mängd translationella maskiner och få översättningshämmare. Translationsmaskineriet i vete, en medlem av eukaryoter, är lämpligt för översättning av eukaryota proteiner, och dess översättningseffektivitet påverkas knappast av kodonanvändning av mallen mRNA. Med hjälp av vetecellfritt system har vi syntetiserat en mängd olika proteiner inklusive proteinkinaser 34,35, ubiquitinligaser36, transkriptionsfaktorer37 och membranproteiner med höga framgångsgrader. För membranproteinproduktion tillsätter vi lipidvesikelliposom i översättningsblandningen som ställning19,38. Hydrofoba domäner av membranprotein interagerar med lipid-dubbelskikt och är spontant integrerade med liposom. Densitetsgradientcentrifugering används för att strikt separera proteoliposom från endogena veteproteiner, även om en gemensam centrifugering av translationsreaktionsblandningen är tillräcklig för en enkel rening av proteoliposom20. Många typer av integrerade membranproteiner har syntetiserats med hjälp av vetecellfritt system och tillämpats för olika undersökningar och utvecklingar 25,38,39,40,41,42,43,44. Dessutom utvecklade vi "dubbelskiktsdialysmetoden" för storskalig produktion45,46. I denna metod nedsänks dialysanordningen av kopptyp i substratmatningsbufferten och två lager av translationsreaktionsblandning och substratmatningsbuffert bildas i koppen som visas i figur 1. Kontinuerlig tillförsel av substrat och avlägsnande av biprodukten kan effektivt utföras på både toppen och botten av reaktionsblandningen under lång tid, vilket leder till utmärkt översättningseffekt (figur 2A och figur 2B)45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av pEU-uttrycksplasmid
OBS: pEU-uttrycksplasmid bör inkludera startkodon, öppen läsram för målmembranprotein och stoppkodon i fragmentet (se figur 1). Lägg till sekvens(er) av detekterings-/reningstaggar på lämplig plats vid behov. Antingen restriktionsenzymsmältning eller sömlös kloning är tillämplig för subkloning. Här beskriver vi ett protokoll med en sömlös kloningsmetod.
- Förbered sätt in DNA-fragment.
- Förstärk genen av intresse med PCR med hjälp av cDNA-mallen, primer 1 och primer 2. Primer 1 och primer 2 innehåller 15 bp överlappningar för sömlös kloning respektive (se materialförteckningen).
OBS: Inkludera inte sekvenser som ska bearbetas och tas bort från moget protein i cellerna (t.ex. signalsekvens). Bearbetning av syntetiserat protein utförs inte i vetecellfritt system. Lägg inte till Kozak-sekvensen. pEU-E01-MCS-vektorn har E01-översättningsförstärkare. - Tillsätt 1/25 volym DpnI-restriktionsenzym till PCR-produkten för att ta bort mallplasmid-DNA. Inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
- Använd ett PCR-reningssats för att rena PCR-produkten och justera koncentrationen vid 20–50 ng/μl.
- Förstärk genen av intresse med PCR med hjälp av cDNA-mallen, primer 1 och primer 2. Primer 1 och primer 2 innehåller 15 bp överlappningar för sömlös kloning respektive (se materialförteckningen).
- Linjärisera pEU-E01-MCS-vektorn.
- Utför omvänd PCR med pEU-E01-MCS, primer 3 och primer 4.
- Tillsätt 1/25 volym DpnI-restriktionsenzym till den inversa PCR-produkten. Inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
- Använd ett PCR-reningssats för att rena PCR-produkten enligt tillverkarens rekommendation. Justera koncentrationen vid 20–50 ng/μl.
- Blanda 2 μL insert DNA-fragment, 2 μL linjäriserad vektor och 4 μL 2x sömlös kloningsenzymblandning.
- Transformera Escherichia coli stam JM109 med den sömlösa kloningsprodukten. Använd en spridare och sprid bakteriesuspensionen på en LB-ampicillinagarplatta.
OBS: pEU-vektorn har en ampicillinresistensmarkör. - Bekräfta sekvensen av uttrycket plasmid konstruerad med primer 5 och primer 6 från 5' respektive 3' sidan av MCS i pEU-plasmid.
- Förstärk och rena uttrycket plasmider.
- Odla den plasmidtransformerade E. coli-stammen JM109 i 150 ml LB-ampicillinmedium vid 37 °C och 125 slag per minut skakar över natten.
- Extrahera och rena plasmiderna med hjälp av kommersiellt tillgängligt plasmidprep midi-kit. Lös plasmider i 500 μl TE-buffert.
VARNING: Använd inte ett miniförberedande kit för extraktion av plasmider. Det ger inte tillräcklig kvalitet och kvantitet plasmid. - Tillsätt 500 μl fenol/kloroform/isoamylalkohol (25:24:1). Blanda kraftigt i 5 min och centrifugera i 5 min vid 17 800 x g och rumstemperatur. Överför den övre plasmidlösningen till ett nytt rör.
VARNING: Använd engångshandskar för att skydda huden mot fenol och kloroform.
OBS: För att avlägsna kontaminering av RNase från plasmidextraktionssatsen, rena plasmiderna med fenol-kloroformrening. - Tillsätt 500 μl kloroform för att avlägsna fenol helt. Blanda kraftigt i 5 min och centrifugera i 5 min vid 17 800 x g och rumstemperatur. Överför den övre plasmidlösningen till ett nytt rör.
- Tillsätt 2,5 volymprocent etanol och 1/8 volym 7,5 M ammoniumacetat och förvara vid -30 °C i 1 timme.
- Centrifugera vid 17 800 x g vid 4 °C i 10 minuter. Tvätta pelleten med 500 μl 70% etanol. Ta bort supernatanten försiktigt och låt pelleten torka i 5 minuter.
- Lös upp uttrycket plasmider i 100 μL ultrarent vatten helt. Mät koncentrationen av plasmider med absorbans vid 260 nm. Justera koncentrationen till 1 mg/ml.
2. In vitro-transkription
VARNING: Använd DNase och nukleasfria plaströr och tips i steg om transkription och översättning. Undvik autoklavering av plastvaror för att förhindra kontaminering.
- Skörda ultrarent vatten i ett nytt plaströr.
VARNING: Använd inte DEPC-behandlat vatten eftersom kvarvarande DEPC starkt hämmar reaktionen. Använd nyrenat ultrarent vatten för transkription och översättning. - Förbered transkriptionsreaktionsblandningen genom att blanda 115,2 μL ultrarent vatten, 40 μL transkriptionsbuffert LM, 20 μl NTP-blandning, 2,4 μl 80 U / μL RNas-hämmare, 2,4 μL 80 U / μL SP6-polymeras och 20 μL 1 mg / ml pEU-uttrycksplasmider. Blanda reagenserna försiktigt genom att invertera. Utför en snabb snurrning.
- Inkubera transkriptionsreaktionen vid 37 °C i 6 timmar.
- Blanda reaktionen försiktigt genom att invertera och snurra snabbt ner. Använd den omedelbart för översättning, annars frys och förvara vid -80 °C.
- Bekräfta transkriptionsprodukten genom elektrofores.
- Blanda 100 ml 1x TAE-buffert och 1 g agaros. Värm suspensionen i en mikrovågsugn för att förbereda 1% agaros TAE-gel.
- Ta 1 μL transkriptionsreaktion och blanda med 3 μL vatten och 4 μL 2x laddningsfärgämne.
OBS: Denaturering av RNA krävs inte. - Ladda 4 μL av blandningen och 2 μL DNA-stegmarkören till agaros TAE-gelén.
- Elektrofores vid 100 V i 20 min.
- Färga gelén i etidiumbromid i 30 min. Kontrollera stegbandsmönstret för mRNA med UV-transilluminator och gelbildare.
OBS: När ett utsmetat band på mindre än 500 bp observeras misstänks mRNA-nedbrytning.
3. Förberedelse av material för översättning
- Förbered översättningsbufferten.
- Blanda 27 ml nyberedt ultrarent vatten och 0,75 ml av varje 40x stamlösning för S1, S2, S3 respektive S4 i ett 50 ml rör.
OBS: Modulera materialmängderna enligt den slutliga erforderliga mängden 1x översättningsbuffert.
VARNING: Förvara eller frys inte den överflödiga 1x översättningsbufferten efter användning.
- Blanda 27 ml nyberedt ultrarent vatten och 0,75 ml av varje 40x stamlösning för S1, S2, S3 respektive S4 i ett 50 ml rör.
- Förbered kreatinkinasstamlösning. Lös upp frystorkat kreatinkinas i ultrarent vatten till en slutlig koncentration av 20 mg/ml. Fördela lösningen i små mängder (10 till 50 μl vardera) i 0,2 ml 8-bands PCR-rör. Frys rören i flytande kväve och förvara vid -80 °C.
VARNING: Frys inte kreatinkinaslösningen igen efter upptining. - Tvätta dialyskoppar (0,1 ml storlek) för att ta bort glycerol från dialysmembranet.
OBS: Det finns flera dialyskoppar i olika storlekar. Små muggar (0,1 ml) används för småskaligt test (avsnitt 5.4) respektive stora muggar (2 ml) för storskalig produktion (avsnitt 5.5). Tvättsteget för dialysmembran av stora koppar kan undvikas.- Lägg 1 ml ultrarent vatten i ett nytt 1,5 ml rör. Sätt i liten dialyskopp (0,1 ml) i röret. Tillsätt 0,5 ml ultrarent vatten i koppen.
- Inkubera i mer än 30 minuter vid rumstemperatur.
4. Beredning av liposomer
OBS: Här beskriver vi två protokoll för beredning av liposomer. Den ena använder färdigfrysta liposomer (avsnitt 4.1), medan den andra producerar liposomer genom att återfukta en tunn lipidfilm (avsnitt 4.2).
- Förbered liposomer med hjälp av frystorkade liposomer.
OBS: Ett enklare sätt att producera proteoliposom är att använda kommersiellt tillgängliga Asolectin liposom. Asolectin är en slags naturlig lipid extraherad från sojabönor.- Öppna injektionsflaskan som innehåller 10 mg frystorkade asolektinliposomer (se materialförteckningen) och tillsätt 200 μl översättningsbuffert (avsnitt 3.1) till botten av injektionsflaskan. Förslut injektionsflaskan och inkubera i 10 minuter.
- Blanda kraftigt genom att sätta injektionsflaskan på virvelblandaren i 1 min.
- Sätt i injektionsflaskan i ett 50 ml rör. Snurra ner röret genom att centrifugera vid 500 x g i 1 min.
- Använd en pipett och överför Asolectin-liposomsuspensionen (50 mg lipid/ml) till ett nytt 1,5 ml rör. Använd liposom omedelbart för översättning, frys annars i flytande kväve och förvara vid -80 °C.
- Förbered liposomer genom att hydrera en tunn lipidfilm.
- Om en lipid säljs i pulverform, lös upp i kloroform eller lämpligt organiskt lösningsmedel till 10-100 mg / ml koncentration.
OBS: En tunn lipidfilm kan framställas med användning av renade och / eller syntetiserade amfifila lipider. Reningsmetoden för asolektin har tidigare beskrivits38. Funktionellt modifierade lipider, såsom biotinylerade lipider, fluorescerande lipider och adjuvanslipider, kan tillsättas till de basala lipiderna för att producera funktionella liposomer. - Överför lipidlösningen som innehåller 50 mg lipid(er) till en indunstningskolv.
- Använd en roterande förångare, förånga lösningsmedlet och sprid lipiden jämnt på väggen i kolvbotten för att bilda en tunn lipidfilm.
- Sätt kolven i en vakuum exsickator och låt stå under undertryck över natten för att avlägsna lösningsmedlet helt.
- Tillsätt 1 ml omräkningsbuffert till indunstningskolven. Vrid kolven för att sprida bufferten över den tunna lipidfilmen. Inkubera i 5 minuter för att hydrera filmen.
- Sonicate kolven med en ultraljud homogenisator eller ultraljud renare. Ändra kolvens vinkel ibland så att lösningen kan röra filmen ordentligt. Se till att den tunna lipidfilmen skalas från botten och emulgeras helt och homogent.
OBS: Elektronmikrograf av biotinylerade lipider som innehåller liposomer visas i figur 1. - Överför liposomsuspensionen (50 mg lipider/ml) till ett nytt 1,5 ml rör. Om det inte ska användas omedelbart, frys liposomerna i flytande kväve och förvara vid -80 °C.
- Om en lipid säljs i pulverform, lös upp i kloroform eller lämpligt organiskt lösningsmedel till 10-100 mg / ml koncentration.
5. In vitro-översättning
- Tina vetegroddextraktet snabbt genom att flyta rören på vatten vid rumstemperatur i några minuter. Efter upptining, blanda omedelbart försiktigt genom att invertera rören, snurra ner och kyla på is tills de används.
OBS: Frys vetegroddsextrakt i flytande kväve efter användning och förvara vid -80 °C. Den tål flera frys- / upptiningscykler. - Tina 20 mg/ml stamlösning av kreatinkinas. Blanda 5 μl stamlösning och 45 μl omräkningsbuffert för att bereda 2 mg/ml kreatinkinaslösning.
VARNING: Återfrysning av kreatinkinas rekommenderas inte. - Tina liposomer eller mRNA vid behov.
- Utför en småskalig proteinöversättning.
- Ta bort vatten från både röret och dialyskoppen (0,1 ml), enligt beredningen i steg 3.3.2.
- Injicera 1 ml och 300 μl omräkningsbuffert i röret respektive dialyskoppen.
VARNING: Om dialyskoppens botten inte når ytan på översättningsbufferten i 1,5 ml röret, injicera ytterligare 50–100 μl buffert i röret. - Bered omräkningsreaktionsblandningen genom att blanda 15,6 μl omräkningsbuffert, 2,4 μl 2 mg/ml kreatinkinas, 12 μl 50 mg/ml liposomer, 15 μl vetegroddsextrakt och 15 μl mRNA. Blanda försiktigt genom att invertera rören och snurra ner.
- Aspirera 60 μL av translationsreaktionsblandningen med användning av en pipett på 200 μl.
- För in pipettspetsen i underytan av translationsbufferten i dialyskoppen. Pipettera ut reaktionsblandningen långsamt och försiktigt. Täck dialyskoppen med lock för att förhindra avdunstning.
OBS: Reaktionsblandningen sjunker naturligt till botten av koppen och bildar ett dubbelskikt. Stör inte dubbelskiktet genom att blanda eller skaka koppen.
- Gör en storskalig översättning (figur 1).
- Häll 22 ml översättningsbuffert i ett 25 ml rör. Sätt i en stor dialyskopp (2 ml) i röret och tillsätt 2 ml översättningsbuffert i koppen.
- Bered en translationsreaktionsblandning genom att blanda 130 μl omräkningsbuffert, 20 μl 2 mg/ml kreatinkinas, 100 μl 50 mg/ml liposom, 125 μl vetegroddsextrakt och 125 μl mRNA. Blanda försiktigt genom pipettering.
- Aspirera hela översättningsreaktionsblandningen (500 μl) med en pipett på 1 000 μl. Injicera translationsreaktionsblandningen i dialyskoppen på samma sätt som beskrivs i steg 5.4.5. Täck dialyskoppen med lock för att förhindra avdunstning.
- Inkubera reaktionerna vid 15 °C i 24 timmar.
- Blanda reaktionen väl i dialyskoppen genom pipettering. Överför den råa proteoliposomsuspensionen till ett nytt rör.
OBS: Ett plattbottnat 1,5 ml rör rekommenderas för att samla proteoliposomen från den småskaliga översättningen. Efter centrifugering bildar liposomer kompakt och lätt synlig pellet i rörets nedre hörn.
6. Rening av proteoliposomer
- Centrifugera röret som innehåller rå proteoliposomsuspension vid 17,800 x g vid 4 °C i 10 minuter.
- Ta bort supernatanten. Suspendera proteoliposompelleten i PBS (liten skala: 1 ml, stor skala: 10 ml) genom pipettering.
- Upprepa centrifugeringen och tvättningen av proteoliposomer i ytterligare två cirklar.
- Efter tvättning, tillsätt en liten mängd PBS och återupptäck proteoliposompelletsbrunnen genom pipettering. Mät suspensionsvolymen med en mikropipett. Lägg till PBS för att justera volymen till 60 μL (liten skala) eller 500 μL (stor skala). Överför suspensionen till ett nytt 1,5 ml rör.
- Överför 10 μL proteoliposomsuspension till ett nytt PCR-rör för SDS-PAGE. Dela upp resten av proverna i mindre portioner för användning vid behov. Frys i flytande kväve och förvara vid -80 °C.
7. SDS-PAGE och CBB-färgning
- Tillsätt 70 μl vatten och 40 μl 3x SDS-PAGE-provbuffert till 10 μl proteoliposomsuspension.
VARNING: Koka inte SDS-PAGE-provet, eftersom membranproteiner aggregerar och tränger knappast in i akrylamidgel i elektrofores. Tillsätt också tillräckligt med reduktionsmedel till SDS-PAGE-provbufferten (t.ex. 2-merkaptoetanol vid 3% slutlig koncentration) för att förhindra oxidation. - Ställ in en 5%–20% gradient SDS-PAGE-gel i en elektroforeskammare. Ladda 3 μL, 6 μL, 12 μL proteoliposomprover, 2 μL proteinstorleksmarkör och BSA-standardserier också.
- Elektrofores vid 52 mA, 400 V i 30 min.
- Färga gelén med CBB-färgämne i 1 timme. Avfärga i varmt vatten och skanna gelbilden.
- Med hjälp av NIH Image J-programvara (https://imagej.nih.gov/ij/) kvantifierar du bandintensiteten för membranprotein i varje körfält. Uppskatta mängden syntetiserade membranproteiner med BSA-standardserier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll kan delvis renade proteoliposomer erhållas på kort tid. Representativa resultat visas i figur 2A. Tjugofem GPCR av klass A, B och C syntetiserades framgångsrikt med hjälp av dubbelskiktsdialysmetoden (liten skala) och renades delvis genom centrifugering och bufferttvätt. Även om mängden syntetiserade proteiner varierar beroende på typen av protein, kan 50 till 400 μg membranproteiner vanligtvis syntetiseras per reaktion när stora dialyskoppar används. Flera milligram membranproteiner kan enkelt produceras genom att öka antalet reaktioner på grund av den höga skalbarheten hos vetecellfritt system. Ett förtest med en liten dialyskopp är tillräckligt för att bestämma produktionseffekten för målproteinet i dubbelskiktsdialysmetoden. Enligt den erhållna produktiviteten kan mängden målprotein som ska produceras med användning av stora dialyskoppar uppskattas.
Detta protokoll är lämpligt för uttryck av membranproteiner, särskilt för dem med flera transmembranhelices. I de flesta fall införlivas membranproteiner med tre eller flera transmembranhelixer lätt i proteoliposomer efter syntes (figur 2B), vilket ger en god produktivitet av proteoliposomer. Single-transmembrane-helix-proteiner syntetiseras vanligtvis smidigt; de integreras emellertid knappast i liposomer på grund av den lilla hydrofoba regionen. När det gäller proteiner med två transmembranhelices är huruvida de är förankrade i liposomer eller inte beroende av hur deras transmembranhelices exponeras.
Syntetiserade proteoliposomer uppsamlas genom enkel centrifugering och renas delvis med en tvättbuffert, vilket kraftigt förkortar reningsprocessen för membranproteiner. Även om både biologiska membran och membranproteiner har avlägsnats från vetegroddsextrakt i förväg, fälls ibland små mängder veteproteiner ut genom bindning till liposomer eller membranproteiner syntetiserade (figur 2A). Sådana proteinföroreningar är svåra att avlägsna genom enkel centrifugering och bufferttvätt. När ett högrenat membranprotein krävs är det nödvändigt att solubilisera de delvis renade proteoliposomerna med ett ytaktivt medel och rena dem genom kolonnkromatografi.
Figur 1: Schema för cellfri proteoliposomproduktion. SP6, SP6 promotor sekvens; E01, E01 översättningsförstärkare sekvens; Ampr, ampicillinresistens gen; DTT, ditiotreitol. Elektronmikrograf visar immunogoldmärkning av biotinylerad lipid som innehåller liposom. Bar, 0,2 μm. Denna elektronmikrografbild var från figur 1D i Takeda et al., 201545. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa resultat av proteoliposomproduktion med dubbelskiktsdialysmetod. (A) SDS-PAGE-bild av cellfria syntetiserade GPCR. Tjugofem utvalda GPCR syntetiserades med dubbelskiktsdialysmetoden. Proteoliposomer renades delvis och applicerades på SDS-PAGE och CBB-färgning. (B) Jämförelse av membranproteinproduktioner mellan olika översättningsmetoder. Dopaminreceptor D1 (DRD1) protein syntetiserades av varje metod i samma förhållande av vetegroddar extrakt, liposomer, och mRNA, respektive. DRD1-proteoliposom renades delvis genom centrifugering och utsattes för SDS-PAGE- och CBB-färgning. (C) Immunogold-märkning av DRD1-biotin / liposomkomplex. DRD1 biotinylerades enzymatiskt av BirA-biotinligas. Bar, 0,2 μm. Tomma pilspetsar indikerar DRD1-biotin på liposomer. Denna siffra modifierades från figur 1 i Takeda et al., 201545. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Applicering av funktionella proteoliposomer. (A) Immunisering av adjuvans lipidinnehållande proteoliposom. (B) Biotinylerad liposombaserad interaktionsanalys (BiLIA). Interaktion mellan membranprotein och antimembranproteinantikropp detekterades av AlphaScreen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade protokollet ger en metod för att producera membranproteiner med hög framgångsgrad. Detta protokoll är enkelt, mycket reproducerbart och lätt att skala upp. Det har också potential att minska tiden och kostnaden för experiment som konsumerar en stor mängd membranproteiner. Dubbelskiktsdialysmetoden förbättrar produktiviteten med 4–10 gånger jämfört med tvåskiktsmetoden eller dialysmetoden (figur 2B)45. I ett extremt fall ökade utbytet av en jonkanal och en transportör 30 respektive 20 gånger med dubbelskiktsdialysmetod än med dubbelskiktsmetod (data visas inte). Hög produktivitet av detta protokoll är en fördel vid antigenproduktion för immunisering. Proteoliposomer används ofta som immuniserande antigener för utveckling av antimembranproteinantikroppar. Högkoncentrerade och renade membranproteiner inbäddade i proteoliposom stimulerar effektivt immunsvaret och inducerar antikroppar41,47. Med hjälp av denna dubbelskiktsdialysmetod kan proteoliposomer som bär flera milligram membranproteiner för immuniseringsändamål enkelt beredas om några dagar. Faktum är att vår grupp har syntetiserat GPCR, jonkanaler och claudiner med hjälp av detta protokoll och immuniserade möss med produkterna för att erhålla monoklonala antikroppar mot dem31,41,45. Några av de erhållna monoklonala antikropparna verifierades som funktionella antikroppar, såsom antikroppar med hög affinitet, konformationskänsliga antikroppar, flödescytometri tillämpliga antikroppar och hämmande antikroppar, vilket indikerar att detta protokoll kan producera membranproteiner med funktionellt korrekta konformationer.
En annan attraktiv fördel med detta protokoll är att tillåta produktion av proteoliposomer som tilldelas specifika funktioner med användning av modifierade lipider, såsom biotinylerade lipider, fluorescerande lipider eller adjuvanslipider. Beredda proteoliposomer med specifika funktioner är användbara och tillämpliga på ett brett spektrum av experiment. Exempelvis gör adjuvanta lipidinnehållande proteoliposomer, såsom lipid A48 eller monofosforyllipid A (MPLA)49, lämpliga immuniserande antigener, eftersom de kan administreras direkt för att immunisera möss utan emulsion. Adjuvanta lipider stimulerar effektivt immunsvaret hos värddjur och inducerar antikroppar mot målmembranproteiner (figur 3A). Faktum är att vi framgångsrikt har inducerat flödescytometri tillämpliga antikroppar genom att immunisera möss med MPLA-innehållande proteoliposom31. Proteoliposomer framställda av biotinylerade lipider är också idealiska sonder för screeninganalyser. Vi utvecklade en screeningmetod med hög kapacitet för att välja antimembranproteinantikroppar med hjälp av biotinylerade proteoliposomer och AlphaScreen (BiLIA-metoden) (figur 3B)45. Sandwich ELISA kan också enkelt konstrueras med biotinylerade proteoliposomer och streptavidinbelagda plattor.
Slutligen finns det två viktiga försiktighetsåtgärder som bör åtgärdas när du använder den här metoden. För det första kan bildandet av disulfidbindningar vara otillräckligt på grund av de höga koncentrationerna av DTT i omräkningsbufferten, vilket möjligen påverkar strukturen hos vissa typer av membranproteiner15. Även om disulfidbindningar kan bildas efter att reduktanten har avlägsnats under reningsprocessen, bildas de möjligen till en annan typ snarare än de naturliga. Den andra är att membranproteiner inte glykosyleras. De enzymer som krävs för glykosylering är teoretiskt frånvarande i det cellfria systemet, eftersom biomembran, inklusive Golgi och ER, har avlägsnats under processen när vetegroddsextrakt produceras. Eftersom bristen på disulfidbindningar och glykosylering kan orsaka olika konformationer, bör noggrann övervägning och utvärdering göras av den experimentella designen, särskilt när post-translationella modifieringar är avgörande för det funktionella uttrycket av proteiner enligt experimentändamålen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) från AMED under bidragsnummer JP20am0101077. Detta arbete stöddes också delvis av JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ×3 SDS-PAGE sample buffer | Containing 10% 2-mercaptoethanol | ||
| 5-20% gradient SDS-PAGE gel | ATTO | E-D520L | |
| 70% ethanol | Diluted ethanol by ultrapure water. | ||
| Agarose | Takara Bio | ||
| Ammonium acetate | Nakalai tesque | 02406-95 | As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C. |
| Ampicillin Sodium | Nakalai tesque | 02739-74 | |
| Asolectin Liposome, lyophilized | CellFree Sciences | CFS-PLE-ASL | A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes. |
| BSA standard | 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer | ||
| CBB gel stain | |||
| cDNA clone of interest | Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment | ||
| Chloroform | Nakalai tesque | 08402-84 | |
| Cooled incubator | Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider. | ||
| Creatine kinase | Roche Diagnostics | 04524977190 | |
| Dialysis cup (0.1 mL) | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL |
| Dialysis cup (2 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88404 | Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL |
| DNA ladder marker | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | GeneRuler 1 kb DNA Ladder |
| DpnI | Thermo Fisher Scientific | FD1703 | FastDigest DpnI |
| E. coli strain JM109 | |||
| Electrophoresis chamber | ATTO | ||
| Ethanol (99.5%) | Nakalai tesque | 14713-95 | |
| Ethidium bromide | |||
| Evaporation flask, 100 mL | |||
| Gel imager | |||
| Gel scanner | We use document scanner and LED immuninator as a substitute. | ||
| LB broth | |||
| Lipids of interest | Avanti Polar Lipids | ||
| Micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| NTP mix | CellFree Sciences | CFS-TSC-NTP | Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each |
| Nuclease-free 25 mL tube | IWAKI | 362-025-MYP | |
| Nucrease-free plastic tubes | Watson bio labs | Do not autoclave. Use them separately from other experiments. | |
| Nucrease-free tips | Watson bio labs | Do not autoclave. Use them separately from other experiments. | |
| PBS buffer | |||
| PCR purification kit | MACHEREY-NAGEL | 740609 | NucleoSpin Gel and PCR Clean-up |
| pEU-E01-MCS vector | CellFree Sciences | CFS-11 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Plasmid prep Midi kit | MACHEREY-NAGEL | 740410 | NucleoBond Xtra Midi |
| Primer 1 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence. |
| Primer 2 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence. |
| Primer 3 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3' Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning. |
| Primer 4 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3' Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning. |
| Primer 5 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’ Sequencing primer, forward |
| Primer 6 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’ Sequencing primer, reverse |
| Protein size marker | Bio-Rad | 1610394 | Precision Plus Protein Standard |
| Rotary evaporator | |||
| seamless cloning enzyme mixture | New England BioLabs | E2611L | Gibson Assembly Master Mix Other seamless cloning reagents are also avairable. |
| SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor | CellFree Sciences | CFS-TSC-ENZ | |
| Submarine Electrophoresis system | |||
| TAE buffer | |||
| Transcription Buffer LM | CellFree Sciences | CFS-TSC-5TB-LM | |
| Translation buffer | CellFree Sciences | CFS-SUB-SGC | SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4). Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water. |
| Ultrapure water | We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle. |
||
| Ultrasonic homogenizer | Branson | SONIFIER model 450D-Advanced | Ultrasonic cleaner can be used as a substitute. |
| UV transilluminator | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Wheat germ extract | CellFree Sciences | CFS-WGE-7240 | WEPRO7240 |
References
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
- Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
- Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
- Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
- Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
- Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
- Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
- Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
- Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
- Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
- Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
- Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
- Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
- Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
- Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
- Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
- Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
- Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
- Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
- Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
- Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
- Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
- Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
- Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
- Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
- Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
- Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
- Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
- Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
- Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
- Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
- Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
- Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
- Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
- Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
- Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
- Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
- Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
- David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
- Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
- Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
- Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, Clifton, N.J. 49-67 (2018).
- Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
- Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
- Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).
