Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Produção Livre de Células de Proteolipossomas para Análise Funcional e Desenvolvimento de Anticorpos Visando Proteínas de Membrana

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61871
Automatic Translation
1, 2
1Graduate School of Medicine, Ehime University, 2Proteo-Science Center, Ehime University

Summary

Este protocolo descreve um método eficiente livre de células para a produção de proteolipossomo de alta qualidade pelo método de diálise de duas camadas usando sistema livre de células de trigo e lipossomas. Este método fornece meios adequados para a análise funcional de proteínas de membrana, triagem de alvos de drogas e desenvolvimento de anticorpos.

Abstract

As proteínas de membrana desempenham papéis essenciais em uma variedade de processos celulares e desempenham funções vitais. As proteínas de membrana são clinicamente importantes na descoberta de medicamentos porque são os alvos de mais da metade de todos os medicamentos. Um obstáculo para a realização de estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais de proteínas de membrana, bem como o desenvolvimento de anticorpos, tem sido a dificuldade em produzir grandes quantidades de proteína de membrana de alta qualidade com conformação e atividade corretas. Aqui descrevemos um "método de diálise de bicamadas" usando um sistema livre de células germinativas de trigo, lipossomas e copos de diálise para sintetizar eficientemente proteínas de membrana e preparar proteolipossomos purificados em um curto espaço de tempo com uma alta taxa de sucesso. As proteínas de membrana podem ser produzidas tanto quanto em vários miligramas, como GPCRs, canais iônicos, transportadores e tetraspaninas. Este método livre de células contribui para reduzir o tempo, o custo e o esforço para a preparação de proteolipossomas de alta qualidade e fornece meios adequados para a análise funcional de proteínas de membrana, triagem de alvos de drogas e desenvolvimento de anticorpos.

Introduction

As proteínas de membrana são um dos alvos mais importantes da droga no diagnóstico e terapêutica. De fato, metade dos pequenos alvos de drogas compostas são proteínas de membrana, como receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e canais iônicos1. Ao longo dos anos, pesquisadores vêm trabalhando em estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais de proteínas de membrana para elucidar sua estrutura e função 2,3. O desenvolvimento de anticorpos monoclonais contra proteínas de membrana também é realizado ativamente, a fim de acelerar estudos funcionais e estruturais e desenvolver aplicações terapêuticas e diagnósticas 4,5,6,7,8,9. Todos esses estudos requerem uma grande quantidade de proteínas de membrana de alta qualidade10. Por exemplo, vários miligramas de proteínas de membrana purificadas com conformação natural são necessários para o desenvolvimento de anticorpos. Uma quantidade muito maior de proteínas de membrana altamente purificadas é necessária para a cristalografia de raios-X. No entanto, a produção em massa de proteínas de membrana continua sendo um gargalo na pesquisa de proteínas de membrana11. As proteínas de membrana têm estruturas complicadas com uma ou mais hélices transmembranares e desempenham papéis importantes na homeostase celular. A superexpressão heteróloga de proteínas de membrana leva a múltiplos obstáculos, como a agregação de proteínas de membrana que se acumulam em altas concentrações locais ou a perturbação das vias de sinal celular. Mesmo que a expressão seja bem-sucedida, as etapas subsequentes de preparação da amostra também enfrentam dificuldades. Por exemplo, o preparo do proteolipossomo requer habilidades de alto nível e experiências profissionais em solubilização, purificação e estabilização de proteínas de membrana, e também custa muito esforço e tempo12,13.

Por outro lado, algumas tecnologias avançadas têm surgido nas últimas décadas para produzir proteínas sem o uso de células vivas 14,15,16,17,18. A tecnologia de síntese proteica livre de células reconstitui a reação de tradução em um tubo de ensaio. Como não há limitações que o sistema de expressão celular tenha, os sistemas livres de células têm potencial para sintetizar uma variedade de proteínas que são difíceis de expressar ou mostrar toxicidade nas células. O extrato de células purificadas ou a maquinaria translacional reconstituída é misturado com mRNAs modelo, aminoácidos e fontes de energia, e as proteínas recombinantes são sintetizadas em um curto espaço de tempo. Em relação à síntese proteica da membrana, alguns tipos de andaimes compostos por lipídios ou anfífilos, como lipossomas, biceles, nanodiscos ou copolímeros são adicionados à reação livre de células 19,20,21,22,23,24. As proteínas de membrana sintetizadas interagem com os andaimes e podem ser estabilizadas em água. Proteínas de membrana sintetizadas livres de células são amplamente utilizadas em estudos funcionais e na produção de anticorpos 25,26,27,28,29,30,31.

Neste protocolo, descrevemos um método eficiente livre de células de produção de proteolipossomas usando sistema livre de células de trigo e lipossomas. O sistema de síntese proteica livre de células de trigo é um poderoso sistema de tradução in vitro que utiliza extrato de gérmen de trigo 15,32,33. O gérmen de trigo contém uma grande quantidade de máquinas de tradução e poucos inibidores de tradução. O maquinário translacional no trigo, um membro dos eucariotos, é adequado para traduzir proteínas eucarióticas, e sua eficiência de tradução dificilmente é afetada pelo uso do códon do mRNA modelo. Usando o sistema livre de células de trigo, sintetizamos uma variedade de proteínas, incluindo proteínas quinases 34,35, ubiquitina ligases36, fatores de transcrição37 e proteínas de membrana com altas taxas de sucesso. Para a produção de proteína de membrana, adicionamos lipossomo lipídico vesícula na mistura de tradução como andaime19,38. Os domínios hidrofóbicos da proteína de membrana interagem com a bicamada lipídica e são espontaneamente integrados com o lipossoma. A centrifugação por gradiente de densidade é usada para separar estritamente o proteolifossomo das proteínas endógenas do trigo, embora uma centrifugação comum da mistura de reação de translação seja suficiente para uma simples purificação do proteolipossomo20. Muitos tipos de proteínas de membrana integral têm sido sintetizados utilizando o sistema livre de células de trigo e aplicados para várias pesquisas e desenvolvimentos 25,38,39,40,41,42,43,44. Além disso, desenvolvemos o "método bicamada-diálise" para produção em larga escala45,46. Neste método, o dispositivo de diálise do tipo copo é imerso no tampão de alimentação do substrato, e duas camadas de mistura de reação de translação e tampão de alimentação do substrato são formadas no copo, como mostra a Figura 1. O fornecimento contínuo de substratos e a remoção do subproduto podem ser conduzidos de forma eficiente tanto na parte superior quanto na parte inferior da mistura reacional por um longo tempo, o que leva a uma excelente eficácia de tradução (Figura 2A e Figura 2B)45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparação do plasmídeo de expressão pEU

NOTA: o plasmídeo de expressão pEU deve incluir o códon inicial, o quadro de leitura aberto da proteína de membrana alvo e o códon de paragem no fragmento (ver Figura 1). Adicione sequência(s) de etiqueta(s) de detecção/purificação na posição apropriada, quando necessário. A digestão enzimática de restrição ou a clonagem sem costura são aplicáveis à subclonagem. Aqui descrevemos um protocolo usando um método de clonagem contínuo.

  1. Prepare inserir fragmento de DNA.
    1. Amplificar o gene de interesse por PCR usando o modelo de cDNA, primer 1 e primer 2. O primer 1 e o primer 2 contêm sobreposições de 15 pb para clonagem sem costura, respectivamente (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: Não inclua sequências a serem processadas e removidas da proteína madura nas células (por exemplo, sequência de sinal). O processamento da proteína sintetizada não é realizado em sistema livre de células de trigo. Não adicione a sequência Kozak. O vetor pEU-E01-MCS tem o potenciador de tradução E01.
    2. Adicione 1/25 de volume da enzima de restrição DpnI ao produto de PCR para remover o DNA plasmídico modelo. Incubar durante 30 min a 37 °C.
    3. Use um kit de purificação de PCR para purificar o produto de PCR e ajustar a concentração em 20-50 ng/μL.
  2. Linearizar o vetor pEU-E01-MCS.
    1. Conduza PCR inversa usando pEU-E01-MCS, primer 3 e primer 4.
    2. Adicionar 1/25 volume da enzima de restrição DpnI ao produto de PCR inverso. Incubar durante 30 min a 37 °C.
    3. Use um kit de purificação de PCR para purificar o produto de PCR de acordo com a recomendação do fabricante. Ajustar a concentração a 20–50 ng/μL.
  3. Misture 2 μL de fragmento de DNA inserido, 2 μL de vetor linearizado e 4 μL de 2x mistura de enzimas de clonagem sem costura.
  4. Transforme a cepa JM109 de Escherichia coli com o produto de clonagem sem costura. Usando um espalhador, espalhe a suspensão bacteriana em uma placa de ágar LB-ampicilina.
    NOTA: o vetor pEU tem um marcador de resistência à ampicilina.
  5. Confirmar a sequência do plasmídeo de expressão construído utilizando o primer 5 e o primer 6 do lado 5' e 3' do MCS no plasmídeo pEU, respetivamente.
  6. Amplificar e purificar os plasmídeos de expressão.
    1. Cultivar a cepa de E. coli transformada em plasmídeo JM109 em 150 mL de meio LB-ampicilina a 37 °C e 125 braçadas por minuto agitando durante a noite.
    2. Extraia e purifique os plasmídeos usando o kit midi de preparação de plasmídeos comercialmente disponível. Dissolva plasmídeos em 500 μL de tampão TE.
      CUIDADO: Não use um mini kit de preparação para extração de plasmídeos. Não fornece qualidade e quantidade suficientes de plasmídeo.
    3. Adicionar 500 μL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1). Misture vigorosamente por 5 min e centrifugar por 5 min a 17.800 x g e temperatura ambiente. Transfira a solução plasmídica superior para um novo tubo.
      CUIDADO: Use luvas descartáveis para proteger a pele do fenol e clorofórmio.
      NOTA: Para remover a contaminação da RNase do kit de extração de plasmídeos, purifice os plasmídeos usando a purificação fenol-clorofórmio.
    4. Adicione 500 μL de clorofórmio para remover completamente o fenol. Misture vigorosamente por 5 min e centrifugar por 5 min a 17.800 x g e temperatura ambiente. Transfira a solução plasmídica superior para um novo tubo.
    5. Adicionar 2,5 volume de etanol e 1/8 volume de acetato de amónio 7,5 M e conservar a -30 °C durante 1 h.
    6. Centrífuga a 17.800 x g a 4 °C durante 10 min. Lave o pellet com 500 μL de etanol a 70%. Retire o sobrenadante com cuidado e deixe o pellet por 5 minutos para secar.
    7. Dissolva completamente os plasmídeos de expressão em 100 μL de água ultrapura. Medir a concentração de plasmídeos com absorbância a 260 nm. Ajustar a concentração para 1 mg/ml.

2. Transcrição in vitro

CUIDADO: Use tubos e pontas de plástico sem DNase e nuclease nas etapas de transcrição e tradução. Evite autoclavar produtos de plástico para evitar a contaminação.

  1. Colha água ultrapura em um novo tubo de plástico.
    CUIDADO: Não use água tratada com DEPC porque o DEPC residual inibe fortemente a reação. Use água ultrapura recém-purificada para transcrição e tradução.
  2. Preparar a mistura de reação de transcrição misturando 115,2 μL de água ultrapura, 40 μL de tampão de transcrição LM, 20 μL de mistura NTP, 2,4 μL de 80 U/μL inibidor de RNase, 2,4 μL de 80 U/μL SP6 polimerase e 20 μL de plasmídeos de expressão pEU de 1 mg/mL. Misture os reagentes suavemente invertendo. Execute uma volta rápida.
  3. Incubar a reação de transcrição a 37 °C por 6 h.
  4. Misture a reação suavemente invertendo e gire rapidamente para baixo. Use-o imediatamente para tradução, caso contrário, congele e armazene a -80 °C.
  5. Confirme o produto de transcrição por eletroforese.
    1. Misture 100 mL de 1x tampão TAE e 1 g de agarose. Aqueça a suspensão em um forno de micro-ondas para preparar 1% de gel TAE de agarose.
    2. Tome 1 μL de reação de transcrição e misture com 3 μL de água e 4 μL de corante de carga 2x.
      NOTA: A desnaturação do RNA não é necessária.
    3. Carregar 4 μL da mistura e 2 μL do marcador de escada de ADN ao gel TAE de agarose.
    4. Eletroforese a 100 V por 20 min.
    5. Colorir o gel em brometo de etídio por 30 min. Verifique o padrão de banda de escada do mRNA usando transiluminador UV e imageador de gel.
      NOTA: Quando se observa uma banda manchada inferior a 500 pb, suspeita-se de degradação do ARNm.

3. Preparação de materiais para tradução

  1. Prepare o buffer de tradução.
    1. Misture 27 mL de água ultrapura preparada na hora e 0,75 mL de cada solução-estoque de 40x para S1, S2, S3 e S4, respectivamente, em um tubo de 50 mL.
      NOTA: Modular as quantidades de materiais de acordo com a quantidade final necessária de 1x buffer de tradução.
      CUIDADO: Não armazene ou congele novamente o buffer de tradução excedente de 1x após o uso.
  2. Preparar a solução-mãe de creatina quinase. Dissolver creatina quinase liofilizada em água ultrapura até uma concentração final de 20 mg/mL. Dispensar a solução em pequenas quantidades (10 a 50 μL cada) em tubos de PCR de 8 tiras de 0,2 ml. Congelar os tubos em azoto líquido e conservar a -80 °C.
    CUIDADO: Não volte a congelar a solução de creatina quinase após o descongelamento.
  3. Lave os copos de diálise (tamanho de 0,1 mL) para remover o glicerol da membrana de diálise.
    NOTA: Existem vários copos de diálise de tamanhos diferentes. Copos de pequeno porte (0,1 mL) são usados para teste em pequena escala (seção 5.4) e copos de grande porte (2 mL) para produção em larga escala (seção 5.5), respectivamente. A etapa de lavagem da membrana de diálise de copos de grande porte é evitável.
    1. Coloque 1 mL de água ultrapura em um novo tubo de 1,5 mL. Insira o copo de diálise de pequeno porte (0,1 mL) no tubo. Adicione 0,5 mL de água ultrapura ao copo.
    2. Incubar por mais de 30 min à temperatura ambiente.

4. Preparação de lipossomas

NOTA: Aqui descrevemos dois protocolos para a preparação de lipossomas. Um utiliza lipossomas liofilizados prontos a utilizar (secção 4.1), enquanto o outro produz lipossomas hidratando uma película lipídica fina (secção 4.2).

  1. Prepare lipossomas usando lipossomas liofilizados.
    NOTA: Uma maneira mais fácil de produzir proteolipossomo é usar lipossomo de Asolectin comercialmente disponível. A asolectina é um tipo de lipídio natural extraído da soja.
    1. Abra o frasco para injetáveis contendo 10 mg de lipossomas de Asolectina liofilizada (ver Tabela de Materiais) e adicione 200 μL de tampão de tradução (secção 3.1) ao fundo do frasco para injetáveis. Selar o frasco para injetáveis e incubar durante 10 minutos.
    2. Misture vigorosamente colocando o frasco para injetáveis no misturador de vórtices durante 1 min.
    3. Insira o frasco para injetáveis num tubo de 50 ml. Gire o tubo por centrifugação a 500 x g por 1 min.
    4. Usando uma pipeta, transfira a suspensão de lipossomas de Asolectina (50 mg de lipídios/mL) para um novo tubo de 1,5 mL. Use lipossomo imediatamente para tradução, caso contrário, congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C.
  2. Prepare lipossomas hidratando um filme lipídico fino.
    1. Se um lipídio for vendido em forma de pó, dissolver em clorofórmio ou solvente orgânico apropriado para a concentração de 10-100 mg / mL.
      NOTA: Um filme lipídico fino pode ser preparado usando lipídios anfifílicos purificados e/ou sintetizados. O método de purificação da asolectina é descrito anteriormente38. Lipídios funcionalmente modificados, como lipídios biotinilados, lipídios fluorescentes e lipídios adjuvantes, podem ser adicionados aos lipídios basais para produzir lipossomas funcionais.
    2. Transferir a solução lipídica contendo 50 mg de lípidos(s) para um balão de evaporação.
    3. Usando um evaporador rotativo, evapore o solvente e espalhe uniformemente o lipídio na parede do fundo do frasco para formar uma fina película de lipídios.
    4. Colocar o balão num exsicador a vácuo e deixar sob pressão negativa durante a noite para remover completamente o solvente.
    5. Adicionar 1 ml de tampão de translação ao balão de evaporação. Girar o balão para espalhar o tampão sobre a película lipídica fina. Incubar por 5 min para hidratar o filme.
    6. Sonicate o balão com um homogeneizador ultra-sônico ou limpador ultra-sônico. Altere ocasionalmente o ângulo do balão para permitir que a solução toque bem o filme. Certifique-se de que o filme lipídico fino seja descascado do fundo e emulsionado completa e homogeneamente.
      NOTA: A micrografia eletrônica de lipídios biotinilados contendo lipossomas é mostrada na Figura 1.
    7. Transfira a suspensão de lipossomas (50 mg de lípidos/ml) para um novo tubo de 1,5 ml. Se não for para ser usado imediatamente, congelar os lipossomas em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C.

5. Tradução in vitro

  1. Descongele o extrato de gérmen de trigo rapidamente, flutuando os tubos na água à temperatura ambiente por alguns minutos. Após o descongelamento, misture imediatamente suavemente invertendo os tubos, gire para baixo e esfrie no gelo até o uso.
    NOTA: Congelar o extracto de gérmen de trigo em azoto líquido após a utilização e conservar a -80 °C. Suporta vários ciclos de congelamento/descongelamento.
  2. Descongelar 20 mg/ml de solução de creatina quinase. Misture 5 μL de solução-mãe e 45 μL de tampão de tradução para preparar 2 mg/mL de solução de trabalho de creatina quinase.
    CUIDADO: O recongelamento da creatina quinase não é recomendado.
  3. Descongele lipossomas ou mRNAs quando necessário.
  4. Realize uma tradução de proteínas em pequena escala.
    1. Retirar a água do tubo e do copo de diálise (0,1 ml), tal como preparado no passo 3.3.2.
    2. Injete 1 mL e 300 μL de tampão de tradução no tubo e no copo de diálise, respectivamente.
      CUIDADO: Caso o fundo do copo de diálise não atinja a superfície do tampão de translação no tubo de 1,5 mL, injete 50 a 100 μL adicionais de tampão no tubo.
    3. Preparar a mistura de reação de tradução misturando 15,6 μL de tampão de tradução, 2,4 μL de 2 mg/mL de creatina quinase, 12 μL de 50 mg/mL de lipossomas, 15 μL de extrato de gérmen de trigo e 15 μL de mRNA. Misture suavemente invertendo os tubos e gire para baixo.
    4. Aspirar 60 μL da mistura de reacção de translação utilizando uma pipeta de 200 μL.
    5. Insira a ponta da pipeta na superfície inferior do tampão de tradução no copo de diálise. Pipetar a mistura de reação lenta e suavemente. Cubra o copo de diálise com uma tampa para evitar a evaporação.
      NOTA: A mistura de reação afunda naturalmente no fundo do copo e forma uma bicamada. Não perturbe a bicamada misturando ou agitando o copo.
  5. Realizar uma tradução em larga escala (Figura 1).
    1. Despeje 22 mL de tampão de tradução em um tubo de 25 mL. Insira um copo de diálise de grande porte (2 mL) no tubo e adicione 2 mL de tampão de tradução no copo.
    2. Prepare uma mistura de reação de tradução misturando 130 μL de tampão de tradução, 20 μL de 2 mg/mL de creatina quinase, 100 μL de 50 mg/mL de lipossoma, 125 μL de extrato de gérmen de trigo e 125 μL de mRNA. Misture suavemente por pipetagem.
    3. Aspirar toda a mistura de reação de translação (500 μL) usando uma pipeta de 1.000 μL. Injectar a mistura de reacção de tradução no copo de diálise da mesma forma descrita no passo 5.4.5. Cubra o copo de diálise com uma tampa para evitar a evaporação.
  6. Incubar as reacções a 15 °C durante 24 h.
  7. Misture bem a reação no copo de diálise por pipetagem. Transfira a suspensão bruta de proteolipossoma para um novo tubo.
    NOTA: Recomenda-se um tubo de fundo plano de 1,5 mL para coletar o proteoliposoma da tradução em pequena escala. Após a centrifugação, os lipossomas formam pellets compactos e facilmente visíveis no canto inferior do tubo.

6. Purificação de proteolipossomas

  1. Centrifugar o tubo que contém suspensão bruta de proteolipossoma a 17.800 x g a 4 °C durante 10 minutos.
  2. Remova o sobrenadante. Suspender o pellet de proteolipossomo em PBS (pequena escala: 1 mL, grande escala: 10 mL) por pipetagem.
  3. Repita a centrifugação e lavagem de proteolipossomas para mais dois círculos.
  4. Após a lavagem, adicione uma pequena quantidade de PBS e ressuspenda bem o pellet de proteolipossomo por pipetagem. Meça o volume da suspensão usando uma micropipeta. Adicione PBS para ajustar o volume para 60 μL (pequena escala) ou 500 μL (grande escala). Transfira a suspensão para um novo tubo de 1,5 mL.
  5. Transfira 10 μL de suspensão de proteolipossomas para um novo tubo de PCR para SDS-PAGE. Divida o resto das amostras em porções menores para uso quando necessário. Congelar em azoto líquido e conservar a -80 °C.

7. Coloração SDS-PAGE e CBB

  1. Adicionar 70 μL de água e 40 μL de 3x tampão de amostra SDS-PAGE a 10 μL de suspensão de proteolipossoma.
    CUIDADO: Não ferva a amostra SDS-PAGE, pois as proteínas de membrana se agregam e dificilmente penetram no gel de acrilamida na eletroforese. Além disso, adicione agente redutor suficiente ao tampão de amostra SDS-PAGE (por exemplo, 2-mercaptoetanol na concentração final de 3%) para evitar a oxidação.
  2. Defina um gel SDS-PAGE gradiente de 5% a 20% em uma câmara de eletroforese. Carregar 3 μL, 6 μL, 12 μL de amostras de proteolipossoma, 2 μL de marcador de tamanho de proteína e séries padrão BSA também.
  3. Eletroforese a 52 mA, 400 V por 30 min.
  4. Manchar o gel com corante CBB por 1 h. Descolorir em água quente e digitalizar a imagem do gel.
  5. Usando o software NIH Image J (https://imagej.nih.gov/ij/), quantifique a intensidade da banda da proteína de membrana em cada pista. Estimar a quantidade de proteínas de membrana sintetizadas com séries padrão BSA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Usando este protocolo, proteolipossomas parcialmente purificados podem ser obtidos em um curto espaço de tempo. Os resultados representativos são apresentados na Figura 2A. Vinte e cinco GPCRs de Classe A, B e C foram sintetizados com sucesso usando o método de diálise de bicamádas (pequena escala) e parcialmente purificados por centrifugação e lavagem tampão. Embora a quantidade de proteínas sintetizadas varie de acordo com o tipo de proteína, 50 a 400 μg de proteínas de membrana geralmente podem ser sintetizadas por reação quando grandes copos de diálise são usados. Vários miligramas de proteínas de membrana podem ser facilmente produzidos aumentando o número de reações, devido à alta escalabilidade do sistema livre de células de trigo. Um pré-teste usando um pequeno copo de diálise é suficiente para determinar a eficácia da produção da proteína-alvo no método de diálise bicamada. De acordo com a produtividade obtida, a quantidade da proteína-alvo a ser produzida usando grandes copos de diálise pode ser estimada.

Este protocolo é adequado para a expressão de proteínas de membrana, particularmente para aqueles com múltiplas hélices transmembranares. Na maioria dos casos, proteínas de membrana com três ou mais hélices transmembranares são facilmente incorporadas aos proteolipossomos após a síntese (Figura 2B), o que proporciona uma boa produtividade dos proteolipossomas. As proteínas de hélice transmembrana única são geralmente sintetizadas suavemente; no entanto, eles dificilmente se integram em lipossomas devido à pequena região hidrofóbica. Em relação às proteínas com duas hélices transmembranares, se elas estão ou não ancoradas aos lipossomas depende da forma como suas hélices transmembranares estão expostas.

Os proteoliposomas sintetizados são coletados por centrifugação simples e parcialmente purificados com um tampão de lavagem, o que encurta muito o processo de purificação das proteínas da membrana. Embora tanto as membranas biológicas quanto as proteínas de membrana tenham sido removidas dos extratos de gérmen de trigo de antemão, pequenas quantidades de proteínas de trigo às vezes são coprecipitadas pela ligação a lipossomas ou proteínas de membrana sintetizadas (Figura 2A). Tais contaminantes proteicos são difíceis de remover por simples centrifugação e lavagem tampão. Quando uma proteína de membrana altamente purificada é necessária, é necessário solubilizar os proteolipossomos parcialmente purificados com um surfactante e purificá-los por cromatografia em coluna.

Figure 1
Figura 1: Esquema de produção de proteolibossomas livres de células. Sequência promotora SP6, SP6; Sequência de potenciadores de tradução E01, E01; Ampr, gene de resistência à ampicilina; TDT, dithiothreitol. A micrografia eletrônica mostra a marcação imunodourada de lipídios biotinilados contendo lipossoma. Barra, 0,2 μm. Esta imagem de micrografia eletrônica foi da Figura 1D em Takeda et al., 201545. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos da produção de proteolipossomas pelo método bicamada-dialítica. (A) Imagem SDS-PAGE de GPCRs sintetizados livres de células. Vinte e cinco GPCRs selecionados foram sintetizados pelo método de diálise de bicamadas. Os proteolipossomas foram parcialmente purificados e aplicados nas colorações SDS-PAGE e CBB. As pontas das setas indicam GPCRs alvo. (B) Comparação das produções de proteínas de membrana entre diferentes métodos de tradução. A proteína do receptor de dopamina D1 (DRD1) foi sintetizada por cada método na mesma proporção de extrato de gérmen de trigo, lipossomas e mRNA, respectivamente. O proteolifossomo DRD1 foi parcialmente purificado por centrifugação e submetido à coloração SDS-PAGE e CBB. (C) Marcação imunoouro do complexo DRD1-biotina/lipossoma. DRD1 foi biotinilado enzimaticamente por BirA biotina ligase. Barra, 0,2 μm. As setas em branco indicam DRD1-biotina em lipossomas. Este número foi modificado a partir da Figura 1 em Takeda et al., 201545. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Aplicação de proteolipomossomas funcionais. (A) Imunização de proteolipossomo adjuvante contendo lipídios. (B) Ensaio de interação à base de lipossomas biotinilados (BiLIA). A interação entre a proteína de membrana e o anticorpo de proteína de membrana foi detectada pelo AlphaScreen. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O protocolo apresentado fornece um método de produção de proteínas de membrana a uma alta taxa de sucesso. Este protocolo é simples, altamente reprodutível e fácil de ampliar. Também tem o potencial de reduzir o tempo e o custo de experimentos que consomem uma grande quantidade de proteínas de membrana. O método bicamada-diálise melhora a produtividade em 4–10 vezes em comparação com o método bicamada ou método de diálise (Figura 2B)45. Em um caso extremo, o rendimento de um canal iônico e de um transportador aumentou 30 e 20 vezes, respectivamente, com o método de diálise de bicamadas, do que com o método de bicamadas (dados não mostrados). A alta produtividade desse protocolo é uma vantagem na produção de antígenos para imunização. Os proteolipossomas são frequentemente usados como antígenos imunizantes para o desenvolvimento de anticorpos proteicos antimembrana. Proteínas de membrana altamente concentradas e purificadas embutidas no proteolipossomo estimulam efetivamente a resposta imune e induzem anticorpos41,47. Usando este método de diálise de bicamadas, os proteolipossomas que transportam vários miligramas de proteínas de membrana para fins de imunização podem ser facilmente preparados em poucos dias. De fato, nosso grupo sintetizou GPCRs, canais iônicos e claudinas utilizando esse protocolo e imunizou camundongos com os produtos para obter anticorpos monoclonais contra eles31,41,45. Alguns dos anticorpos monoclonais obtidos foram verificados como anticorpos funcionais, como anticorpos de alta afinidade, anticorpos sensíveis à conformação, anticorpos aplicáveis à citometria de fluxo e anticorpos inibitórios, o que indica que esse protocolo é capaz de produzir proteínas de membrana com conformações funcionalmente corretas.

Outro benefício atraente deste protocolo é permitir a produção de proteolipossomas que recebem funções específicas usando lipídios modificados, como lipídios biotinilados, lipídios fluorescentes ou lipídios adjuvantes. Proteolipossomas preparados com funções específicas são úteis e aplicáveis a uma ampla gama de experimentos. Por exemplo, proteolipossomas adjuvantes contendo lipídios, como o lipídio A48 ou o lipídio monofosforil A (MPLA)49, produzem antígenos imunizantes convenientes, porque podem ser administrados diretamente para imunizar camundongos sem emulsão. Os lipídios adjuvantes estimulam efetivamente a resposta imune em animais hospedeiros, induzindo anticorpos contra proteínas da membrana alvo (Figura 3A). De fato, induzimos com sucesso anticorpos aplicáveis à citometria de fluxo imunizando camundongos com proteolipossomo contendo MPLA31. Além disso, proteolipossomas preparados a partir de lipídios biotinilados são sondas ideais para ensaios de triagem. Desenvolvemos um método de triagem de alto rendimento para selecionar anticorpos proteicos antimembrana usando proteolipossomas biotinilados e AlphaScreen (método BiLIA) (Figura 3B)45. O Sandwich ELISA também pode ser facilmente construído usando proteolipossomas biotinilados e placas revestidas de estreptavidina.

Finalmente, há duas ressalvas importantes que devem ser abordadas ao usar esse método. Primeiramente, a formação de ligações dissulfeto pode ser insuficiente devido às altas concentrações de TDT no tampão de translação, que possivelmente afetam a estrutura de alguns tipos de proteínas de membrana15. Embora as ligações dissulfeto sejam capazes de se formar depois que o redutor é removido durante o processo de purificação, elas possivelmente se formam em tipos diferentes, em vez dos naturais. A outra é que as proteínas de membrana não são glicosiladas. As enzimas necessárias para a glicosilação estão teoricamente ausentes no sistema livre de células porque durante o processo em que o extrato de gérmen de trigo é produzido, as biomembranas, incluindo Golgi e ER, foram removidas. Uma vez que a falta de ligações dissulfeto e glicosilação pode causar diferentes conformações, deve-se considerar e avaliar cuidadosamente o desenho experimental, particularmente quando as modificações pós-translacionais são críticas para a expressão funcional das proteínas de acordo com os propósitos experimentais.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo Projeto de Plataforma para Apoio à Descoberta de Medicamentos e Pesquisa em Ciências da Vida (Base para Apoiar a Descoberta Inovadora de Medicamentos e Pesquisa em Ciências da Vida (BINDS)) da AMED sob o Número de Concessão JP20am0101077. Este trabalho também foi parcialmente apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
×3 SDS-PAGE sample buffer Containing 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gel ATTO E-D520L
70% ethanol Diluted ethanol by ultrapure water.
Agarose Takara Bio
Ammonium acetate Nakalai tesque 02406-95 As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin Sodium Nakalai tesque 02739-74
Asolectin Liposome, lyophilized CellFree Sciences CFS-PLE-ASL A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interest Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
Chloroform Nakalai tesque 08402-84
Cooled incubator Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinase Roche Diagnostics 04524977190
Dialysis cup (0.1 mL) Thermo Fisher Scientific 69570 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL) Thermo Fisher Scientific 88404 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder marker Thermo Fisher Scientific SM0311 GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnI Thermo Fisher Scientific FD1703 FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamber ATTO
Ethanol (99.5%) Nakalai tesque 14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scanner We use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interest Avanti Polar Lipids
Micro centrifuge TOMY MX-307
NTP mix CellFree Sciences CFS-TSC-NTP Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tube IWAKI 362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubes Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tips Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kit MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vector CellFree Sciences CFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Plasmid prep Midi kit MACHEREY-NAGEL 740410 NucleoBond Xtra Midi
Primer 1 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size marker Bio-Rad 1610394 Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixture New England BioLabs E2611L Gibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor CellFree Sciences CFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LM CellFree Sciences CFS-TSC-5TB-LM
Translation buffer CellFree Sciences CFS-SUB-SGC SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure water We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizer Branson SONIFIER model 450D-Advanced Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extract CellFree Sciences CFS-WGE-7240 WEPRO7240

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
  3. Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
  4. Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
  5. Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
  6. Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
  7. Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
  8. Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
  9. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  10. Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
  11. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  12. Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
  13. Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
  14. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
  15. Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
  16. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  17. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
  18. Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
  19. Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
  20. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
  21. Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  22. Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
  23. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
  24. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  25. Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
  26. Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
  27. Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
  28. Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
  29. Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
  30. Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
  31. Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
  32. Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
  33. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
  34. Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
  35. Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
  36. Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
  37. Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
  38. Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
  39. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
  40. Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
  41. Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
  42. Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
  43. David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
  44. Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
  45. Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
  46. Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, Clifton, N.J. 49-67 (2018).
  47. Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
  48. Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
  49. Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).

Tags

Bioquímica Edição 163 proteína de membrana proteolibossa síntese proteica livre de células extrato de gérmen de trigo desenvolvimento de anticorpos GPCR canal iônico transportador
Produção Livre de Células de Proteolipossomas para Análise Funcional e Desenvolvimento de Anticorpos Visando Proteínas de Membrana
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, W., Takeda, H. Cell-Free… More

Zhou, W., Takeda, H. Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (163), e61871, doi:10.3791/61871 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter