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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

종양 성장에서 암 관련 섬유아세포의 역할을 조사하기 위한 마우스 모델

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61883
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2, 1,2,4
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

암세포와 섬유아세포를 공동 주입하고 시간 경과에 따른 종양 성장을 모니터링하는 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 종양 성장의 조절자로서 섬유아세포의 역할에 대한 분자적 기초를 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

암 관련 섬유아세포(CAF)는 종양 촉진 미세 환경을 만들어 종양 성장에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 종양 미세 환경에서 CAF의 역할을 연구하는 모델은 섬유아세포, 다른 조직의 섬유아세포 및 섬유아세포의 특정 유전적 요인의 기능적 중요성을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마우스 모델은 생체 내 맥락에서 종양 성장 및 진행에 대한 기여자를 이해하는 데 필수적입니다. 여기서, 암세포가 섬유아세포와 혼합되어 마우스에 도입되어 종양이 발생하는 프로토콜이 제공됩니다. 시간 경과에 따른 종양 크기 및 최종 종양 가중치를 결정하고 그룹 간에 비교합니다. 설명된 프로토콜은 종양 성장 및 진행에서 CAF의 기능적 역할에 대한 더 많은 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Introduction

종양 미세 환경 내에서 가장 두드러진 세포 유형 중 하나는 암 관련 섬유아세포(CAF)입니다.1. 이러한 암종 관련 섬유아세포는 종양 억제 역할을 할 수 있다 2,3. 예를 들어, S100A를 발현하는 섬유아세포는 발암물질을 캡슐화하고 암종 형성을 예방할 수 있는 콜라겐을 분비한다4. 또한, 췌장암에서 α평활근 액틴(SMA) 양성 근섬유아세포의 고갈은 면역억제를 유발하고 췌장암 진행을 가속화한다2. CAF는 또한 암세포와 함께 진화하여 종양 진행을 촉진할 수 있습니다 5,6,7,8. 섬유아세포는 종양 촉진 환경을 조성하는 세포외 기질 단백질을 합성하고 분비할 수 있다8. 이러한 세포외 기질 단백질은 조직의 기계적 경화를 유발할 수 있으며, 이는 종양 진행과 관련이 있다 9,10. 침착된 세포외 기질은 면역 침윤을 억제하는 물리적 장벽으로 작용할 수 있다(11). CAF에 의한 매트릭스 침착은 또한 CAF에 의해 생성된 피브로넥틴이 종양 침윤을 촉진하는 것으로 나타났기 때문에 종양 침윤과 관련이 있다12. CAF는 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨-6(IL-6) 및 CXC-케모카인 리간드 12(CXCL12)를 분비하여 혈관신생을 촉진하고 면역억제 세포를 종양 미세환경으로 모집합니다13,14,15. 종양 성장을 촉진하는 데 중심적인 역할을 하기 때문에, 암-관련 섬유아세포는 항암 요법의 새로운 표적이다 6,16,17,18.

아래 프로토콜은 잘 확립되고 널리 사용되는 종양 성장 마우스 모델에서 섬유아세포가 종양 성장에 어떻게 영향을 미치는지 테스트하는 방법을 설명합니다. 종양 미세환경에서 섬유아세포의 중요성을 이해하기 위해, 암세포를 마우스에 도입하여 이들의 성장을 모니터링하기 위한 표준 프로토콜은 암세포가 도입된 섬유아세포를 포함하도록 수정되었다. 암세포는 피하 또는 피내로 도입될 수 있다. 피내 도입은 피부 자체에서 발생하는 종양을 유발합니다. 암세포와 섬유아세포를 마우스에 동시 주입하는 이종이식편은 암 성장을 촉진하는 능력에서 섬유아세포, 섬유아세포의 하위 집단 및 단백질 인자의 역할을 해부하기 위한 중요한 방법론적 도구를 나타낸다 19,20,21. 암세포와 섬유아세포를 마우스에 공동 주입하기 위한 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 방법은 섬유아세포의 존재 유무를 비교하거나, 다른 공급원의 섬유아세포를 비교하거나20, 특정 단백질의 발현이 있는 섬유아세포와 발현되지 않은 섬유아세포를 비교하는 데 사용할 수 있다19. 암세포와 섬유아세포가 도입된 후 시간이 지남에 따라 종양 크기를 모니터링할 수 있습니다. 실험이 끝나면 종양을 해부하고 무게를 측정 할 수 있습니다. 시간 경과에 따른 종양 성장을 모니터링함으로써 다양한 요인의 중요성을 분석할 수 있습니다.

종양 성장에서 섬유아세포의 역할을 연구하기 위한 가능한 대안적 접근법이 있습니다. 예를 들어, 섬유아세포에서 우선적으로 발현되는 동인과 함께 유전자의 조직 특이적 녹아웃을 제공하는 Cre-loxed 기반 모델이 있습니다. 이러한 접근법은 또한 종양 진행을 위한 섬유아세포에서 특정 유전자 및 경로의 역할을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다. Cre-lox 기반 접근법과 비교할 때, 제공된 프로토콜은 종양 성장이 단 몇 주 동안 모니터링되기 때문에 섬유아세포의 역할을 모니터링하는 훨씬 더 빠른 접근 방식을 나타냅니다. 제공된 접근법은 또한 유전자 조작 마우스의 콜로니를 생성하고 수용 할 필요가 없기 때문에 훨씬 저렴합니다. 제공된 프로토콜은 마우스 콜로니를 개발할 필요 없이 shRNA를 사용하여 다양한 유전자의 녹다운 효과를 신속하게 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 제공된 접근법은 또한 상이한 수의 섬유아세포의 비교, 상이한 암세포 및 섬유아세포의 상이한 비율, 상이한 유전자의 녹다운, 심지어 상이한 조직 부위 또는 종의 섬유아세포의 비교를 허용하기 때문에 더 유연하다. Cre-lox 접근법은 섬유아세포가 보다 생리학적 맥락에서 생쥐 내에 존재한다는 이점이 있습니다.

여기에 보고된 프로토콜은 종양 성장에 대한 섬유아세포의 영향을 빠르고 비용 효율적으로 모니터링하려는 과학자들에게 유용할 것입니다. 이 프로토콜은 종양 성장, 종양 성장에 대한 다양한 출처의 섬유아세포 또는 섬유아세포의 다양한 하위 집합을 조사하는 과학자에게 특히 유용합니다. 종양 개시가 생리학적 맥락에서 발생하는 것이 중요하다면 유전자 조작 마우스 모델을 고려해야 합니다.

이러한 실험을 수행하기 위한 몇 가지 가능한 방법이 있습니다. 면역력이 있는 마우스를 숙주로 사용할 수 있으며, 이를 통해 섬유아세포-면역 세포 상호작용을 조사할 수 있습니다. 면역 능력이 있는 마우스 모델의 경우 마우스 암세포와 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 주입해야 합니다. MEF를 사용하면 연구자가 광범위한 녹아웃 마우스 균주를 활용하여 관심 유전자의 존재 여부를 테스트할 수 있습니다. 대안적으로, 면역-결핍 마우스는 인간 암세포로부터 유래된 마우스에서 종양의 성장을 촉진하는데 있어서의 인간 섬유아세포의 역할을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 상기 암세포의 도입은 피하 또는 동소적으로 수행될 수 있다. 흑색종의 경우, 후술하는 바와 같이, 종양-섬유아세포 혼합물은 흑색종이 발생할 피부 내의 위치를 보다 밀접하게 시뮬레이션하는 동소 주사를 위해 피내 주사될 수 있다.

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Protocol

설명된 모든 실험은 로스앤젤레스 캘리포니아 대학의 동물 관리 위원회의 승인을 받았습니다.

참고: 마우스 균주에 대해 숙주 마우스와 일치하는 암세포와 섬유아세포를 선택하십시오. 숙주 마우스의 성별과 일치하는 암세포와 섬유아세포를 선택합니다. 번식 식민지에서 생쥐를 얻거나 평판이 좋은 공급 업체에서 구입하십시오. ~8-10주령의 생쥐에 종양을 도입합니다. 털이 있는 마우스는 모낭 주기의 휴지기 또는 휴지기에 있습니다. 암세포에 대한 0.5 대 3의 섬유 아세포 비율을 계획하십시오.

1. 실험에 사용할 적절한 마우스 수를 결정합니다.

  1. 연구를 수행하기 전에 검정력 분석을 수행하여 연구에 사용할 적절한 마우스 수를 결정합니다. 다음 공식을 사용하여 지정된 검정력으로 실험의 표본 크기를 확인할 수 있습니다.
    n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
    α가 선택된 유의 수준(일반적으로 0.05)이면 1-α/2 = 0.975이고 Z=1.960입니다.
    β 는 검정력이고 80%의 검정력이 필요한 경우 Z=0.84입니다.

    ES, 효과 크기 = \μ1-μ 0\/σ
    여기서, μ 0은 가설 H0 하의 평균이고, μ 1 가설 H1 하의 평균이고, σ 는 관심 있는 결과의 표준 편차이다22.
    참고: 표본 크기 계산에 대한 자세한 내용은22에서 확인할 수 있습니다.

2. 주입용 암세포 생성

  1. 다음 방정식으로 관련 성장률을 결정하십시오.
    Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t

    참고: 24시간 만에 두 배가 되는 셀의 예가 나와 있습니다
    배가 시간 = ln(2)/성장률
    24시간 = ln(2)/성장률
    24 * 성장률 = .693
    성장률 = .693/24= .028875
  2. 플레이트할 암세포의 수와 주입 전에 세포를 성장시켜야 하는 시간을 결정합니다.
    참고: 형성된 각 종양에 대해 0.25-100만 개의 암세포가 주입됩니다.
  3. 방정식에 따라 충분한 수의 셀을 생성하는 데 필요한 일 수를 계산합니다.
    N(t)=N(0)egr*t
    여기서 N(t)는 시간 t의 세포 수, N(0)은 시간 0의 세포 수, gr은 성장 속도, t는 시간입니다.
    참고: 500,000개의 세포를 성장시켜 12개의 종양 각각에 10개의6 개 세포를 생성하는 이러한 계산의 예입니다. 이러한 계산에 따르면 필요한 수의 셀을 늘리는 데 5 일이면 충분합니다.
    N(t)=N(0)egr*t
    12 x 106 = 500,000E(Gr*T)
    12 x 106=500,000e(.028875*t)
    24=e(.028875*x)
    ln(24)=0.028875배
    3.178=0.028875배
    X=110시간= 4.59일
    세포가 플레이트에 부착되고 수집 중에 손실된 세포에 대해 추가 시간을 허용합니다.
  4. 플레이트 암세포.
    참고: 배양된 세포로 작업할 때는 장갑과 실험복을 착용하십시오.
    참고: 공기에서 샘플로 미생물이 유입되는 것을 최소화하기 위해 층류 후드에서 세포 조작을 수행합니다. 사용하기 전에 조직 배양 후드를 자외선으로 처리하십시오. 멸균 기술과 조직 배양 처리된 플레이트, 피펫 및 원뿔형 튜브와 같은 멸균 세포 배양 플라스틱 용기 및 소모품만 사용하십시오.
    1. 바이알의 세포 수와 도금 후 원하는 세포 농도를 기준으로 조직 배양 플레이트의 정확한 수와 크기를 계산합니다.
    2. 조직 배양 플레이트에 라벨을 붙입니다.
    3. 37°C에서 물로 수조를 준비합니다.
    4. 배지를 원뿔형 튜브에 분취하고 37°C의 수조에 넣습니다. 많은 암세포는 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)에서 성장할 수 있습니다.
    5. 액체 질소 냉동고에서 필요한 수의 냉동 세포 바이알을 제거합니다.
      알림: 액체 질소 냉동고에서 셀을 취급할 때는 냉동실 장갑을 사용하십시오.
    6. 부드럽게 흔들면서 수조에서 세포 바이알을 빠르게 해동하십시오.
      알림: 무균 상태를 유지하기 위해 바이알을 취급하는 동안 장갑에 에탄올을 첨가하십시오.
    7. 조직 배양 후드에서 멸균 기술을 사용하여 10mL의 DMEM + 10% FBS가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 세포를 피펫팅합니다.
    8. 세포 혼합물을 180 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    9. 멸균 흡입 또는 멸균 10mL 피펫으로 상층액을 부드럽게 제거합니다.
    10. 펠릿의 세포를 1mL의 DMEM + 10% FBS로 부드럽게 재현탁합니다.
    11. 재현탁된 세포를 멸균된 p1000으로 표지된 조직 배양 플레이트에 피펫팅합니다.
    12. 멸균 10 mL 피펫을 사용하여 혈청이 포함된 피펫 배지를 조직 배양 플레이트에 넣습니다.
    13. 조직 배양 플레이트를 5%CO2와 함께 37°C의 조직 배양 배양기에서 배양한다.
  5. 암세포를 확장하여 주사하기에 충분한 암세포를 생성합니다.
    참고: 밀도를 위해 광학 현미경으로 세포를 모니터링합니다. 2-3일마다 또는 세포가 100% 합류에 도달하는 것을 방지하기 위해 필요에 따라 트립신을 주입합니다. 많은 수의 세포가 필요한 경우 하이퍼플라스크(재료 표)를 사용하여 공간 및 중간 효율적인 방식으로 많은 수의 세포를 성장시킵니다. 세포를 통과시켜야 할 때마다 다음 절차를 따르십시오.
    1. 멸균 흡입 또는 멸균 10mL 피펫으로 플레이트에서 배지를 제거합니다.
    2. 따뜻한 인산염 완충 식염수(PBS)에서 피펫팅하여 플레이트를 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 멸균 흡입 또는 피펫으로 PBS를 제거합니다.
    3. 피펫 5 mL의 PBS 중의 1x 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 10 cm 플레이트에 넣고 세포 상에 37°C에서 5분 동안 배양한다.
    4. 플레이트에서 세포를 제거하기 위해 부드러운 탭으로 플레이트에서 세포를 제거합니다.
    5. 멸균된 10mL 피펫을 사용하여 원뿔형 튜브에서 10% FBS 혈청과 함께 DMEM에 세포를 수집합니다.
    6. 원뿔형 튜브를 180 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    7. 상층액을 부어 제거하십시오. 세포 펠릿이 보여야 합니다. 튜브에 남아 있는지 확인하십시오.
    8. 1mL의 DMEM + 10% FBS를 추가하고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 펠렛화된 세포를 재현탁합니다.
    9. DMEM + 10% FBS를 사용하여 적절한 크기의 새로운 조직 배양 플레이트에 세포를 분취하여 재현탁합니다(10cm 조직 배양 플레이트에는 10mL의 배지가 적합함).

3. 주입을 위한 섬유아세포 생성

참고: 일차 섬유아세포는 너무 많은 배가/통과 후에 노화됩니다. 제한된 수의 계대 또는 배가 후에 일차 섬유아세포를 사용하는 것이 중요합니다. 섬유아세포가 마우스 또는 인간의 피부에서 성장한 계대 또는 배가의 수를 추적합니다. 일차 인간 진피 섬유아세포에 대해 15개 미만의 계대를 가진 섬유아세포를 사용하십시오. 마우스 배아 섬유아세포에는 계대가 9개 미만인 섬유아세포를 사용하십시오. 섬유아세포는 합류할 때 변경됩니다. 섬유아세포가 약 90% 합류할 때 트립신을 생성합니다. 섬유아세포는 배양 방법에 따라 다른 특성을 갖습니다. 많은 과학자들은 조직과 같은 환경을 보다 효과적으로 포착하는 3D 콜라겐 매트릭스와 같은 조직 배양 플레이트보다 생리학적으로 더 관련성이 높은 기질에서 배양을 촉진합니다23,24,25.

  1. 섹션 2.1의 방정식을 사용하여 섬유아세포의 성장률을 결정합니다.
  2. 섹션 2.2의 방정식을 사용하여 섬유아세포를 확장하는 데 필요한 일수를 결정합니다.
  3. 암 세포와 섬유아세포가 같은 날에 주사할 준비가 되도록 적절한 날에 적절한 배지를 사용하여 섹션 2.3에 설명된 대로 섬유아세포를 플레이트에 넣습니다.
  4. 섹션 2.4에 설명된 절차에 따라 필요한 충분한 수의 섬유아세포를 생성하기 위해 적절한 배지에서 섬유아세포를 확장합니다.

4. 주사를 위해 생쥐를 준비하기 위해 생쥐를 면도합니다.

알림: 쥐와 함께 작업할 때는 실험복, 머리망, 신발 커버 및 장갑을 착용하십시오.

  1. 주사 1-2 일 전에 기관 동물 관리위원회 (Institutional Animal Care Committee)의 규칙에 따라 마우스를 마취시킵니다. 마취를 위해 이소 플루 란을 사용하는 경우 이소 플루 란과 O2 의 혼합물을 사용하십시오. 마우스를 마취실에 넣고 이소플루란(5%)/O2 혼합물을 도입하여 마취를 유도합니다. 그런 다음 마취된 동물에 노즈콘을 놓아 이소플루란(2%)/O2 혼합물의 일정한 흐름으로 마취의 수술 평면을 유지합니다.
  2. 마우스의 발가락을 꼬집고 마우스가 움직이지 않는지 확인하여 동물이 적절한 마취 수술 평면에 있는지 확인합니다.
  3. 수술용 칼날 #40이 있는 동물 클리퍼를 사용하여 털이 제거될 때까지 동물 클리퍼를 피부 위로 여러 번 통과시켜 마우스 옆구리의 적절한 위치에서 털을 부드럽게 제거합니다.
  4. 마취에서 회복 될 때까지 마우스를 모니터링하십시오.

5. 암세포와 섬유아세포 주사용 준비

참고: 암세포와 섬유아세포는 채취 후 가능한 한 빨리, 가급적이면 30분 이내에 주입해야 합니다. 주사 당일 아침에 조직 배양 플레이트에서 암세포와 섬유아세포를 따로 채취합니다. 각 셀 유형에 대해 다음 단계를 수행합니다.

  1. 부드러운 멸균 흡입으로 또는 배지를 피펫팅하여 조직 배양 플레이트에서 배지를 제거합니다.
  2. 세포를 방해하지 않고 5mL의 PBS에 부드럽게 피펫합니다. PBS를 소용돌이칩니다. PBS를 흡입하거나 피펫으로 PBS를 부드럽게 흡인합니다.
  3. PBS 중의 Trypsin-EDTA 5mL를 세포층 상에 부드럽게 피펫팅하고 37°C에서 5분 동안 배양한다.
  4. 세포를 제거하기 위해 부드러운 탭으로 플레이트에서 세포를 제거합니다. 10mL 피펫으로 세포를 여러 번 피펫팅하고 10% FBS가 포함된 DMEM이 들어 있는 원뿔형 튜브로 세포를 옮깁니다.
  5. 원뿔형 튜브를 180 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
  6. 세포 펠릿을 유지하면서 부드럽게 부어 상청액을 제거합니다. 세포 펠릿을 PBS로 2회 세척한다. 매번, PBS 10mL를 세포 상에 피펫팅한다. p1000 피펫으로 부드럽게 혼합합니다.
  7. 단계 5.5에서와 같이 세포를 원심분리한다. 피펫으로 PBS를 부드럽게 제거하고 반복합니다.
  8. 세척된 펠렛화된 세포를 p1000을 사용하여 PBS 1mL에 재현탁합니다.
  9. 혈구계 슬라이드를 알코올로 청소하고 건조시킵니다.
  10. 세포 혼합물 100 μL를 튜브에 피펫하고 0.32%의 최종 트리판 블루 농도를 위해 0.4% 트리판 블루 400 μL를 첨가합니다.
  11. 챔버가 가득 찰 때까지 세포 혼합물을 피펫팅하여 커버슬립 아래에 있는 유리 혈구계의 챔버를 부드럽게 채웁니다.
  12. 현미경을 사용하여 10x 대물렌즈의 격자선에 초점을 맞춥니다.
  13. 염색되지 않은 살아있는 세포와 청색 세포를 16개의 정사각형으로 구성된 한 세트로 계산합니다.
  14. 16 개의 사각형으로 구성된 4 세트를 모두 센다.
  15. 16개의 정사각형으로 구성된 4개 세트에서 투명 셀과 파란색 셀의 셀 수를 평균화하고 10,000을 곱합니다. 트리판 블루에서 5:1 희석을 수정하려면 5를 곱합니다.
  16. 최종 개수는 생존 가능한 세포와 죽은 세포에 대한 cells/mL 단위의 농도입니다. 암세포와 섬유아세포의 총 수를 결정하기 위해 부피를 곱하십시오. 생존 가능한 세포의 비율이 >80%인지 확인합니다.
  17. 주사 중 샘플의 손실이 최소 20%라고 가정하고 계획된 모든 주사에 대해 충분한 수의 흑색종 세포와 섬유아세포가 있는지 확인합니다.
  18. 필요한 수의 세포를 새로운 원뿔형 튜브로 옮기고 원심분리(5분 동안 180 x g)로 세포를 펠릿화합니다.
  19. 10mL 피펫으로 상층액을 제거합니다.
  20. 적절한 양의 미국 약전(USP) 등급 PBS(피내 주사의 경우 종양당 50μL, 피하 주사의 경우 종양당 100μL)에 필요한 농도로 펠릿을 재현탁합니다.

6. 생쥐에 암세포와 섬유아세포 주입

참고: 기관 동물 관리 위원회(Institutional Animal Care Committee)의 승인을 받은 경우 각 마우스에 각 측면에 하나씩 두 개의 종양을 주입합니다. 어떤 마우스가 오른쪽과 왼쪽 측면에서 어떤 주사를 받을지 무작위로 지정합니다. 주입할 마우스의 수에 따라 마우스를 마취시키고 암세포와 섬유아세포를 마우스에 일괄적으로 주입합니다.

  1. 암세포의 피하 주사 용
    1. 섹션 4.1에 설명된 대로 마우스를 마취합니다.
    2. 알코올 면봉으로 면도한 피부를 닦습니다.
    3. 멸균 주사기에 원하는 양의 세포 또는 세포 혼합물을 채우고 주사기를 27게이지 바늘로 덮습니다.
      알림: 기포가 없는지 확인하십시오. 필요에 따라 주사기를 튕겨 기포를 제거합니다. 세포가 주사기에 도입되면 응집을 방지하기 위해 주사기를 지속적으로 뒤집어 주사기 내의 세포가 잘 혼합되도록 유지합니다.
    4. 마우스 옆구리의 피하 부위에 바늘을 삽입하고 세포를 마우스에 부드럽게 주입합니다. 피하 주사를 위해 종양 당 100 μL 세포 현탁액을 사용하십시오 (주사 당 100 μL 이상의 부피를 사용하는 것은 권장되지 않습니다).
    5. 마취에서 회복 될 때까지 마우스를 모니터링하십시오. 필요한 경우 쥐가 완전히 회복할 수 있도록 오두막 및/또는 가열 패드와 같은 추가 단열재를 생쥐에게 제공하십시오.
  2. 암세포의 피내 주사
    1. 섹션 4.1에 설명된 대로 마우스를 마취합니다.
    2. 알코올 면봉으로 면도한 피부를 닦습니다.
    3. 멸균 주사기에 원하는 양의 세포 또는 세포 혼합물을 채우고 주사기를 27게이지 바늘로 덮습니다.
      알림: 기포가 없는지 확인하십시오. 필요에 따라 주사기를 튕겨 기포를 제거합니다. 세포가 주사기에 도입되면 응집을 방지하기 위해 주사기를 지속적으로 뒤집어 주사기 내의 세포가 잘 혼합되도록 유지합니다.
    4. 27게이지 바늘을 마우스 옆구리 피부의 피내 부위에 삽입하고 마우스의 피내 부위에 세포를 부드럽게 주입합니다. 피내 주사를 위해 종양당 50μL 세포 현탁액을 사용하십시오(주사당 50μL 이상의 부피 사용은 권장되지 않음).
    5. 마취에서 회복 될 때까지 마우스를 모니터링하십시오. 생쥐가 곤경에 처해 있다는 징후가 있으면 수의사와 상담하십시오. 필요한 경우 쥐가 완전히 회복할 수 있도록 오두막 및/또는 가열 패드와 같은 추가 단열재를 생쥐에게 제공하십시오.

7. 종양 성장 중 마우스 모니터링

  1. 통증이나 고통 (구부러진 자세, 몸부림, 발성, 케이지를 따라 스트레칭, 케이지 바닥의 바닥까지 복부 누르기 또는 케이지 주위를 움직이기를 꺼림) 또는 농양 형성의 징후가 있는지 매일 마우스를 모니터링합니다. 생쥐가 곤경에 처해 있다는 징후가 있으면 수의사와 상담하십시오.
  2. 종양이 형성되면 약 2-3일마다 종양 부피를 측정합니다. 캘리퍼스로 종양 길이(가장 긴 쪽)와 너비(길이에 수직)를 측정합니다.
    참고: 모범 사례는 동일한 사람이 실험 전반에 걸쳐 이러한 측정을 수행하여 데이터의 변동성을 줄이는 것입니다. 측정을 위해, 섹션 4.1에 설명 된대로 마우스를 마취시킨다
  3. 공식 부피 = 0.5 x (길이 x 너비2)로 종양 부피를 계산하십시오.

8. 종양 채취 및 종양 무게 측정

  1. 종양 성장이 동물 관리 위원회(Committee on Animal Care)에서 설정한 실험 종점에 도달하면 마우스를 안락사시킵니다. 마우스를 챔버에 넣고 호흡 중단 후 1분 동안 압축된CO2 로 챔버 공기를 천천히(분당 20-30%) 변위로 안락사시킵니다.
  2. 생쥐에서 자궁 경부 탈구를 수행하십시오. 단단하고 평평한 표면에 설치류를 제지하십시오. 두개골 바닥의 목 뒤쪽에 튼튼한 펜이나 다른 물체를 놓습니다. 꼬리 밑 부분을 잡고 뒤로 당기면서 머리를 고정하는 물체로 빠르게 앞뒤로 밉니다. 척수가 절단되었는지 촉진으로 확인하십시오.
    알림: 경추 탈구는 숙련된 실험실 직원이 수행해야 합니다.
  3. 실험의 각 마우스에 대해 호흡, 심장 박동 및 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인하여 마우스가 더 이상 살아 있지 않은지 확인합니다.
  4. 멸균 메스와 수술 용 가위를 사용하여 마우스에서 전체 종양을 절제합니다. 수술 용 가위로 종양에서 비 종양 조직을 잘라냅니다.
  5. 분석 저울에서 종양의 무게를 측정하고 종양 무게를 기록합니다.

9. 종양 부피 및 종양 무게의 통계 분석

  1. 반복 측정 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 각 그룹의 시간 경과에 따른 종양 부피를 비교합니다. 마우스당 두 개의 종양이 주입된 경우 쌍 분석을 수행합니다.
  2. 양측 검정을 사용하여 ANOVA를 사용하여 그룹 간의 종양 가중치를 비교합니다. 그런 다음 Tukey의 사후 테스트를 사용하여 서로 유의하게 다른 그룹을 확인할 수 있습니다. 마우스당 두 개의 종양이 주입된 경우 쌍 분석을 수행합니다.

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Representative Results

A2058 인간 흑색종 세포 및 일차 인간 진피 섬유아세포를 무균 조건 하에서 배양하였다. 세포를 수거하고 PBS로 3회 세척하였다. 면역결핍 마우스(NU/J - Foxn1 누드 균주)를 0.25백만 개의 A2058 흑색종 세포만으로 한쪽 측면에 피하 주사했습니다. 다른 측면에서, 마우스에 0.25 백만 개의 A2058 흑색 종 세포와 0.75 백만 개의 섬유 아세포의 혼합물을 주사 하였다. 세포를 12마리의 면역 결핍 마우스에 주입했습니다. 왼쪽과 오른쪽 측면에 대한 주사는 무작위로 이루어졌습니다. 종양 부피는 주사 후 12일, 14일, 16일, 19일 및 21일에 모니터링되었습니다(그림 1A). 안락사 시, 종양을 절제하고, 이미지화하고(그림 1B) 무게를 측정했습니다(그림 1C). 섬유아세포의 존재는 상당히 더 큰 종양을 초래합니다.

Figure 1
그림 1: 공동 주입된 섬유아세포의 존재 및 부재 시 흑색종 성장 비교. 흑색종 세포는 일차 피부 섬유아세포가 있거나 없는 누드 마우스에 도입되었습니다. (A) 공동 주입된 섬유아세포가 있거나 없는 흑색종에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피의 플롯. 부피는 0.5*길이*너비2로 계산되었습니다. 평균 부피와 평균의 표준 오차(SEM)가 표시됩니다. 유의성을 결정하기 위해 ANOVA를 수행했습니다. (B) 절제된 종양의 이미지. (C) 21일째 실험 종료 시 종양의 최종 가중치. 평균 가중치와 SEM이 표시됩니다. 최종 가중치를 비교하기 위해 짝을 이루지 않은 양측 t-검정을 사용했습니다. *는 p < 0.05를 나타내고, ***는 p < 0.001을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

도 1의 실험에서, 인간 A2058 흑색종 세포와 인간 진피 섬유아세포를 공동-도입한 결과, 흑색종 세포가 섬유아세포와 공동주입되지 않은 경우보다 더 큰 종양이 발생하였다. 이 차이는 종양 부피와 종양 무게에 따라 쉽게 감지할 수 있습니다. 상기 결과는 암-관련 섬유아세포가 종양 성장을 촉진할 수 있다는 다수의 보고와 일치한다 5,6,7,8. 종양 부피 및 종양 무게와 같이 여기에서 논의된 종점 외에도 추가 종점도 모니터링할 수 있습니다. 추가 분석도 가능합니다. 예를 들어, 발생하는 종양은 고정을 위해 포르말린으로 수집하고, 파라핀에 포매하고, 조직학을 위해 헤마톡실린 및 에오신으로 분석할 수 있습니다. 대안적으로, 발달된 종양은 특정 단백질에 대한 면역형광을 이용한 추가 분석을 위해 최적 절단 온도 화합물(OCT)로 수집될 수 있다.

이러한 실험의 한 가지 중요한 한계는 암세포와 함께 주입된 섬유아세포가 몇 번의 세포 분열 후에 노화되거나 죽을 수 있다는 것입니다. 대안적으로, 공동 주입된 섬유아세포는 종양으로부터 멀리 이동할 수 있으며, 이 경우 종양 성장에 영향을 미치지 않을 수 있다. 섬유아세포가 노화되거나 죽거나 종양에서 멀어지면 시간이 지남에 따라 풍부해지지 않고 공동 도입된 섬유아세포의 효과가 종양 성장에 덜 중요해집니다. 실제로, 도입된 암세포는 숙주로부터 추가적인 섬유아세포를 모집할 것으로 예상된다. 도입된 섬유아세포에서 특정 유전자가 녹다운되거나 녹아웃되는 실험의 경우, 시간이 지남에 따라 암호화된 단백질을 발현하는 숙주 섬유아세포의 모집은 관찰될 수 있는 모든 표현형을 감소시킬 것으로 예상됩니다. 도입된 섬유아세포의 존재를 모니터링하기 위해, 섬유아세포는 GFP26,27과 같은 형광 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 섬유아세포가 GFP를 발현하는 경우, 유세포 분석을 사용하여 도입 후 다른 날에 종양 내에 존재하는 섬유아세포의 수를 모니터링할 수 있습니다. 대안적으로, 루시페라아제 효소는 섬유아세포에 도입될 수 있고, 생체발광 이미징은 시간 경과에 따른 마우스의 섬유아세포의 양을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 섬유아세포가 종양 미세 환경에서 빠르게 제거되면 Cre-lox 유전자 조작 마우스 모델이 이러한 문제를 해결하고 설명된 연구를 보완할 것입니다.

인간 암세포와 섬유아세포를 누드 마우스에 도입하여 실험을 수행하면 제한된 면역 체계가 결과에 상당한 영향을 미칠 것으로 예상됩니다. 무흉선 누드 마우스(NU/J)는 T 세포가 부족하여 세포 매개 면역이 부족합니다. 그들은 또한 B 세포 발달에 부분적인 결함이 있습니다. 세포 매개 면역, 즉 활성화된 CD8+ T 세포를 통한 세포 사멸은 종양 성장 억제에 중요한 역할을 할 수 있습니다28,29. 최근 연구에서 암 관련 섬유아세포와 CD8+ T 세포 사이의 상호 작용이 보고되었습니다30,31,32. 면역 체계가 있는 마우스에 마우스 암세포와 마우스 섬유아세포를 도입하는 것은 이 문제를 해결할 수 있는 대안으로 간주될 수 있습니다.

또 다른 대안적 접근법은 Cre-lox 시스템을 사용하여 숙주 섬유아세포에서 특정 단백질의 수준 또는 활성을 조절하는 유전자 조작 마우스 모델을 사용하는 것입니다. 이러한 접근법 중 하나는 FSP1, Col1a1, Col1a2 또는 PDGFRa33,34,35와 같은 드라이버와 함께 섬유아세포가 풍부한 Cre-lox 모델을 사용하는 것입니다. Cre/lox 재조합효소 모델을 사용하면 주입된 섬유아세포가 죽거나 종양에서 멀어질 염려가 없습니다.

제공된 프로토콜에는 성공에 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 섬유아세포의 성장은 프로토콜의 중요한 부분이며 결과에 크게 기여할 가능성이 있습니다. 일차 섬유아세포는 쉽게 노화되며, 섬유아세포가 기하급수적인 성장 단계에 있고 노화되지 않았는지 확인하기 위해 통로 또는 배가를 주의 깊게 모니터링해야 합니다. 노화 섬유아세포는 종양 성장에 극적인 영향을 미칠 수 있는 높은 수준의 사이토카인을 분비할 것으로 예상된다36,37,38. 따라서 통과 번호를 주의 깊게 문서화하고 프로토콜이 노화성 섬유아세포의 분석을 요구하지 않는 한 주입된 섬유아세포가 노화되지 않는 것이 매우 중요합니다.

섬유아세포가 합류하면 많은 변화를 겪을 것으로 예상할 수 있으며, 그 중 일부는 세포 주기 39,40,41,42,43,44에 다시 들어갈 때 역전될 가능성이 있습니다. 섬유아세포를 증식 상태로 유지하고 90% 합류할 때 분할하는 것은 연구가 가능한 한 일관성을 유지하도록 하는 데 중요합니다. 조직 배양 플레이트에서 섬유아세포를 배양하는 것도 섬유아세포의 거동에 영향을 미칠 가능성이 높으며 3D 콜라겐 매트릭스와 같은 대안을 고려해야 합니다23,24,25. 3D 매트릭스에서 배양된 섬유아세포는 2D 표면(45,46,47,48,49)에서 성장한 섬유아세포와는 실질적으로 상이한 이동 패턴을 나타내며, 이는 종양 내로 도입될 때 이들의 종양 촉진 능력에 영향을 미칠 가능성이 있으며, 여기서 섬유아세포는 종양 세포외 기질 미세환경(50)을 확립하는데 능동적인 역할을 할 것이다.

피내 주사를 통해 흑색종 세포를 마우스에 주입하면 피하 주사보다 더 재현 가능한 종양 성장을 얻을 수 있습니다. 이것은 피내 부위에 공간이 거의 없기 때문에 까다로운 단계입니다. 바늘을 조심스럽게 배치하는 것이 중요합니다. 피내 주사를 시행하면 50 μL의 용액 만 주입됩니다. 숙련 된 연구원의 경우에도 이러한 주사가 누출 될 수 있습니다. 종양이 형성되지 않으면 최종 분석에서 제거 될 수 있도록 각 주사가 누출되었는지 여부를 기록하는 것이 중요합니다.

주사기 준비는 또 다른 중요한 단계입니다. 기포를 제거하기 위해 주사기를 튕겨야 할 수 있는 주사기에서 모든 기포를 제거하는 것이 중요합니다. 세포가 뭉치지 않는 것도 중요합니다. 뭉치는 것을 방지하기 위해 주사기를 반복적으로 뒤집습니다.

이 실험의 또 다른 까다로운 측면은 종양 부피 측정이 사람마다 다를 수 있다는 것입니다. 종양 부피 측정의 변동성을 제한하기 위해 실험 전반에 걸쳐 모든 마우스와 모든 시점에서 모든 종양 부피 측정을 수행할 책임을 단일 실험실 구성원에게 할당하는 것이 도움이 됩니다.

가능하면 숙주 마우스와 동일한 성별의 암세포를 마우스에 주입하는 것이 바람직합니다. 성별이 시간 경과에 따른 종양 크기에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 ANOVA 모델에서 성별을 모두 사용하고 성별을 변수로 포함할 수 있습니다.

종양 미세 환경을 이해하는 것은 종양 형성에 대한 통찰력을 얻는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 섬유아세포의 역할, 다양한 유형의 섬유아세포 및 종양 성장에 영향을 미칠 수 있는 섬유아세포 내의 다양한 경로를 이해하기 위한 기초를 제공할 수 있습니다. 이러한 실험의 결과는 섬유아세포가 종양 성장을 촉진하는 것을 막는 새로운 치료 표적을 식별할 수 있다18.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 도움이 되는 의견을 주신 Coller 연구소의 모든 구성원에게 감사를 표합니다. H.A.C.는 리타 앨런 재단의 밀턴 E. 카셀 학자였다. 우리는 NIH/NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, 흑색종 연구 연합 팀 과학상, 암 연구소 임상 실험실 통합 프로그램 상, Iris Cantor 여성 건강 센터/UCLA CTSI NIH 보조금 UL1TR000124, 캘리포니아 대학교 암 연구 조정 위원회, David Geffen 의과대학 대사 주제상, 임상 중개 과학 연구소 및 존슨 종합 암 센터, Broad Stem Cell Research Center(Rose Hills 및 Ha Gaba)의 혁신상, 전립선암에 대한 UCLA SPORE의 상(수상 번호 P50CA092131에 따라 국립 보건원 국립 암 연구소), Broad Stem Cell Center의 혁신상, UCLA의 Eli and Edythe Broad 재생 의학 및 줄기 세포 연구 센터, 종양 세포 생물학 교육 프로그램(USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), UCLA AR071307의 피부과 T32 프로그램 및 UCLA 근육 세포 생물학, 병태생리학 및 치료학 T32 교육 프로그램 5 T32 AF 65972.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228

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Cancer Research 암 관련 섬유아세포 이종 이식편 흑색종 피내 주사 동소 종양 미세환경
종양 성장에서 암 관련 섬유아세포의 역할을 조사하기 위한 마우스 모델
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