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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Um Modelo de Camundongo para Investigar o Papel de Fibroblastos Associados ao Câncer no Crescimento Tumoral

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61883
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2, 1,2,4
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

Um protocolo para co-injetar células cancerosas e fibroblastos e monitorar o crescimento do tumor ao longo do tempo é fornecido. Este protocolo pode ser utilizado para entender as bases moleculares do papel dos fibroblastos como reguladores do crescimento tumoral.

Abstract

Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) podem desempenhar um papel importante no crescimento tumoral, criando um microambiente promotor de tumores. Modelos para estudar o papel das CAFs no microambiente tumoral podem ser úteis para a compreensão da importância funcional de fibroblastos, fibroblastos de diferentes tecidos e fatores genéticos específicos em fibroblastos. Modelos murinos são essenciais para a compreensão dos contribuintes para o crescimento e progressão tumoral em um contexto in vivo. Aqui, um protocolo em que células cancerosas são misturadas com fibroblastos e introduzidas em camundongos para desenvolver tumores é fornecido. O tamanho do tumor ao longo do tempo e o peso final do tumor são determinados e comparados entre os grupos. O protocolo descrito pode fornecer mais informações sobre o papel funcional das CAFs no crescimento e progressão tumoral.

Introduction

Dentro do microambiente tumoral, um dos tipos celulares mais proeminentes é o fibroblasto associado ao câncer (CAF)1. Esses fibroblastos associados ao carcinoma podem desempenhar um papel supressor dotumor2,3. Por exemplo, fibroblastos que expressam S100A secretam colágenos que podem encapsular carcinógenos e proteger contra a formação de carcinomas4. Além disso, a depleção de miofibroblastos positivos para actina de músculo liso α (AME) no câncer de pâncreas causa imunossupressão e acelera a progressão do câncer de pâncreas2. As CAFs também podem co-evoluir com células cancerosas e promover a progressão tumoral 5,6,7,8. Os fibroblastos podem sintetizar e secretar proteínas da matriz extracelular que criam um ambiente promotor detumores8. Essas proteínas da matriz extracelular podem causar enrijecimento mecânico do tecido, que está associado à progressãotumoral9,10. A matriz extracelular depositada pode atuar como uma barreira física que inibe a infiltraçãoimunológica11. A deposição de matriz por CAFs também tem sido associada à invasão tumoral, uma vez que foi demonstrado que a fibronectina gerada por CAFs promove invasão tumoral12. As CAFs promovem angiogênese e recrutam células imunossupressoras para o microambiente tumoral, secretando fator transformador de crescimento-β (TGF-β), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), interleucina-6 (IL-6) e CXC-quimiocina ligante 12 (CXCL12)13,14,15. Devido ao seu papel central na promoção do crescimento tumoral, os fibroblastos associados ao câncer são um alvo emergente para a terapia antineoplásica 6,16,17,18.

O protocolo abaixo descreve um método para testar como os fibroblastos afetam o crescimento de tumores em um modelo de crescimento tumoral em camundongos bem estabelecido e amplamente utilizado. A fim de compreender a importância dos fibroblastos no microambiente tumoral, o protocolo padrão para introdução de células cancerosas em camundongos para monitorar seu crescimento foi modificado para incluir fibroblastos com a introdução de células cancerosas. As células cancerosas podem ser introduzidas por via subcutânea ou intradérmica. A introdução intradérmica resultaria em tumores que surgem da própria pele. Xenoenxertos nos quais células cancerosas e fibroblastos são co-injetados em camundongos representam uma importante ferramenta metodológica para dissecar o papel de fibroblastos, subpopulações de fibroblastos e fatores proteicos na capacidade de promover o crescimento do câncer19,20,21. Um protocolo detalhado para co-injeção de células cancerosas e fibroblastos em camundongos é fornecido. Esse método pode ser utilizado para comparar a presença ou ausência de fibroblastos, para comparar fibroblastos de diferentes fontes20 ou para comparar fibroblastos com e sem expressão de proteínas específicas19. Depois que as células cancerosas e fibroblastos são introduzidos, o tamanho do tumor pode ser monitorado ao longo do tempo. Ao final dos experimentos, os tumores podem ser dissecados e pesados. Ao monitorar o crescimento tumoral ao longo do tempo, a importância de diferentes fatores pode ser dissecada.

Existem possíveis abordagens alternativas para estudar o papel dos fibroblastos no crescimento tumoral. Como exemplo, existem modelos baseados em Cre-loxed que fornecem nocaute tecido-específico de genes com drivers expressos preferencialmente em fibroblastos. Tais abordagens também oferecem oportunidades para investigar o papel de genes e vias específicas em fibroblastos para a progressão tumoral. Em comparação com as abordagens baseadas em Cre-lox, o protocolo fornecido representaria uma abordagem significativamente mais rápida para monitorar o papel dos fibroblastos, pois o crescimento do tumor seria monitorado por apenas algumas semanas. A abordagem fornecida também é significativamente menos dispendiosa porque não requer a geração e alojamento de colónias de ratinhos geneticamente modificados. O protocolo fornecido pode ser usado para testar rapidamente o efeito do knockdown de diferentes genes usando shRNAs em vez de precisar desenvolver colônias de camundongos. A abordagem fornecida também é mais flexível, pois permitiria a comparação de diferentes números de fibroblastos, diferentes proporções de células cancerosas e fibroblastos, knockdown de diferentes genes e até mesmo comparação de fibroblastos de diferentes sítios ou espécies de tecidos. Uma abordagem Cre-lox teria a vantagem de que os fibroblastos estão presentes dentro dos camundongos em um contexto mais fisiológico.

O protocolo aqui relatado seria valioso para os cientistas que procuram monitorar os efeitos dos fibroblastos no crescimento do tumor de forma rápida e econômica. Este protocolo é especialmente valioso para os cientistas que investigam diferentes subgrupos de fibroblastos ou fibroblastos de diferentes fontes sobre o crescimento do tumor no crescimento do tumor. Se é importante que a iniciação do tumor ocorra em um contexto fisiológico, então modelos de camundongos geneticamente modificados devem ser considerados.

Existem várias abordagens possíveis para a realização desses experimentos. Camundongos imunocompetentes podem ser usados como hospedeiros, o que permitiria a investigação de interações fibroblasto-imune celular. Para modelos de camundongos imunocompetentes, células cancerosas de camundongos e fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) devem ser injetados. O uso de MEFs também permite que o investigador aproveite a ampla gama de linhagens de camundongos knockout para testar a presença ou ausência de um gene de interesse. Alternativamente, camundongos imunodeficientes podem ser usados para testar o papel dos fibroblastos humanos na promoção do crescimento de tumores em camundongos que são derivados de células cancerosas humanas. A introdução das células cancerosas pode ser realizada por via subcutânea ou ortotópica. Para o melanoma, como descrito abaixo, a mistura tumor-fibroblasto pode ser injetada por via intradérmica para injeção ortotópica que simula mais de perto o local dentro da pele onde um melanoma se desenvolveria.

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Protocol

Todos os experimentos descritos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade da Califórnia, Los Angeles.

NOTA: Selecione células cancerosas e fibroblastos que correspondam aos camundongos hospedeiros para a cepa de camundongo. Selecione células cancerosas e fibroblastos que correspondam ao sexo do camundongo hospedeiro. Obter ratos de colônias de reprodução ou comprá-los de fornecedores respeitáveis. Introduzir tumores em ratos que são ~8-10 semanas de idade. Camundongos com pelo estarão na fase telógena ou de repouso do ciclo do folículo piloso. Planeje uma proporção de 0,5 a 3 fibroblastos para célula cancerosa.

1. Determinar o número adequado de ratinhos a utilizar para a experimentação

  1. Antes de realizar os estudos, realize uma análise de poder para determinar o número apropriado de camundongos a serem usados para os estudos. Use a seguinte fórmula para determinar o tamanho da amostra para um experimento com a potência especificada:
    n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
    Se α é o nível de significância selecionado (geralmente 0,05), então 1-α/2 = 0,975 e Z=1,960.
    β é a potência e se 80% de potência é desejada, então Z=0,84.

    ES, o tamanho do efeito = \μ1-μ 0\/σ
    onde μ 0 é a média da hipótese H0, μ 1 é a média da hipótese H1 e σ é o desvio padrão do desfecho de interesse22.
    NOTA: Mais informações sobre o cálculo do tamanho da amostra podem ser encontradas22.

2. Gerar células cancerosas para injeção

  1. Determine a taxa de crescimento relevante com a seguinte equação:
    Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t

    Observação : um exemplo para células que dobram em 24 horas é mostrado
    Tempo de duplicação = ln(2)/taxa de crescimento
    24 horas = ln(2)/taxa de crescimento
    24*taxa de crescimento = .693
    Taxa de crescimento = .693/24= .028875
  2. Determine o número de células cancerosas para placa e a quantidade de tempo que as células precisam ser cultivadas antes da injeção.
    NOTA: 0,25-1 milhão de células cancerosas são injetadas para cada tumor formado.
  3. Calcular o número de dias necessários para gerar um número suficiente de células de acordo com a equação
    N(t)=N(0)egr*t
    onde N(t) é o número de células no tempo t, N(0) é o número de células no tempo 0, gr é a taxa de crescimento e t é o tempo.
    NOTA: Um exemplo desses cálculos para o crescimento de 500.000 células para gerar 106 células em cada um dos 12 tumores. Com base nesses cálculos, 5 dias são suficientes para crescer o número necessário de células:
    N(t)=N(0)egr*t
    12 x 106 = 500.000e(gr*t)
    12 x 106=500.000e(.028875*t)
    24=e(.028875*x)
    ln(24)=0,028875x
    3,178 = 0,028875x
    X=110 horas= 4,59 dias
    Dê tempo extra para que as células se fixem à placa e para as células que são perdidas durante a coleta.
  4. Células cancerosas de placa.
    NOTA: Use luvas e jalecos ao trabalhar com células cultivadas.
    NOTA: Realizar manipulações celulares em uma capela de fluxo laminar para minimizar a introdução de micróbios do ar nas amostras. Trate a capa de cultura de tecidos com luz ultravioleta antes de usar. Use técnica estéril e apenas plásticos e consumíveis de cultura celular estéril, como placas, pipetas e tubos cônicos tratados com cultura de tecidos.
    1. Calcular o número e o tamanho corretos das placas de cultura de tecidos com base no número de células no frasco para injetáveis e na concentração celular desejada uma vez plaqueadas.
    2. Rotular placas de cultura de tecidos.
    3. Prepare um banho-maria com água a 37 °C.
    4. Alíquota média em tubos cônicos e colocar em banho-maria a 37 °C. Muitas células cancerosas podem ser cultivadas no meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).
    5. Remova o número necessário de frascos para injetáveis de células congeladas do congelador de azoto líquido.
      NOTA: Use luvas de freezer ao manusear células em um freezer de nitrogênio líquido.
    6. Descongele rapidamente os frascos para injetáveis de células no banho-maria enquanto agita suavemente.
      NOTA: Adicione etanol às luvas durante o manuseio dos frascos para manter a esterilidade.
    7. Usando técnica estéril em uma capela de cultura de tecidos, pipetar as células em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de DMEM + 10% FBS.
    8. Centrifugar a mistura celular a 180 x g durante 5 minutos.
    9. Remova suavemente o sobrenadante com sucção estéril ou uma pipeta estéril de 10 mL.
    10. Ressuspenda suavemente as células no pellet em 1 mL de DMEM + 10% FBS.
    11. Pipetar as células ressuspensas em uma placa de cultura de tecidos marcada com uma p1000 estéril.
    12. Usando pipetas estéreis de 10 mL, meio pipeta com soro em placas de cultura de tecidos.
    13. Incubar placas de cultura de tecidos em incubadora de cultura de tecidos a 37 °C com 5% de CO2.
  5. Expandir células cancerosas para gerar células cancerosas suficientes para injeção.
    NOTA: Monitorar células com microscopia de luz para confluência. Tripsinizar a cada dois ou três dias ou conforme necessário para evitar que as células atinjam 100% de confluência. Se for necessário um grande número de células, use hiperfrascos (Tabela de Materiais) para cultivar um grande número de células de forma eficiente em termos de espaço e meio. Cada vez que as células precisam ser passadas, siga este procedimento:
    1. Retire o meio da placa com sucção estéril ou uma pipeta estéril de 10 mL.
    2. Lave suavemente a placa pipetando em solução salina tamponada com fosfato (PBS) quente. Em seguida, remova o PBS com sucção estéril ou uma pipeta.
    3. Pipetar 5 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) 1x em PBS para uma placa de 10 cm sobre as células e incubar por 5 minutos a 37 °C.
    4. Remova as células da placa com torneiras suaves para desalojar as células da placa.
    5. Usando uma pipeta estéril de 10 mL, colete as células em DMEM com soro FBS a 10% em tubos cônicos.
    6. Centrifugar tubos cônicos a 180 x g por 5 minutos.
    7. Retire o sobrenadante despejando-o. A pastilha de células deve estar visível. Observe-o para se certificar de que permanece no tubo.
    8. Ressuspender as células peletizadas adicionando 1 mL de DMEM + 10% FBS e pipetando para cima e para baixo suavemente.
    9. Alíquota ressuspendeu células em novas placas de cultura de tecidos de tamanho apropriado com DMEM + 10% FBS (10 mL de meio é adequado para uma placa de cultura de tecidos de 10 cm).

3. Gerar fibroblastos para injeção

NOTA: Os fibroblastos primários senescem após muitas duplicações/passagens. É importante usar fibroblastos primários após um número limitado de passagens ou duplicações. Acompanhe o número de passagens ou duplicações que os fibroblastos cresceram a partir da pele do rato ou humana. Use fibroblastos com menos de 15 passagens para fibroblastos dérmicos humanos primários. Use fibroblastos com menos de 9 passagens para fibroblastos embrionários de camundongos. Os fibroblastos são alterados quando se tornam confluentes. Tripsinizar os fibroblastos quando estes forem aproximadamente 90% confluentes. Os fibroblastos terão propriedades diferentes dependendo de como são cultivados. Muitos cientistas promovem o cultivo em substratos fisiologicamente mais relevantes do que placas de cultura de tecidos, como matrizes de colágeno 3D, que capturam de forma mais eficaz ambientes semelhantes a tecidos23,24,25.

  1. Use a equação da seção 2.1 para determinar a taxa de crescimento das células de fibroblastos.
  2. Use a equação da seção 2.2 para determinar o número de dias necessários para expandir os fibroblastos.
  3. Plaquear os fibroblastos conforme descrito na secção 2.3 utilizando o meio adequado no dia apropriado para garantir que as células cancerígenas e os fibroblastos estarão prontos para injeção no mesmo dia.
  4. Expandir os fibroblastos no meio apropriado para gerar um número suficiente de fibroblastos necessários após os procedimentos descritos na secção 2.4.

4. Raspe ratos para preparar ratos para injeção

NOTA: Use jalecos, redes de cabelo, capas de sapatos e luvas ao trabalhar com ratos.

  1. Um a dois dias antes da injeção, de acordo com as normas do Comitê Institucional de Cuidados com Animais, anestesiar os camundongos. Se estiver usando isoflurano para anestesia, use uma mistura de isoflurano e O2. Coloque os camundongos em uma câmara de anestesia e introduza uma mistura de isoflurano (5%)/ O2 para induzir a anestesia. Em seguida, colocar o cone nasal sobre o animal anestesiado para manter o plano cirúrgico da anestesia com fluxo constante da mistura isoflurano (2%)/O2 .
  2. Verifique se os animais estão no plano cirúrgico adequado da anestesia, apertando o dedo do mouse e confirmando que o mouse não se move.
  3. Usando um cortador de animais com lâmina cirúrgica #40, remova suavemente o pelo das posições apropriadas nos flancos dos camundongos, passando o cortador de animais sobre a pele várias vezes até que o pelo seja removido.
  4. Monitore os camundongos até que eles se recuperem da anestesia.

5. Preparar células cancerosas e fibroblastos para injeção

NOTA: Células cancerosas e fibroblastos devem ser injetados o mais rápido possível após a coleta, preferencialmente dentro de 30 minutos. Na manhã da injeção, colher as células cancerosas e fibroblastos separadamente das placas de cultura de tecido. Para cada tipo de célula, execute as seguintes etapas:

  1. Retire o meio da placa de cultura de tecidos com sucção estéril suave ou pipetando o meio.
  2. Pipetar suavemente em 5 mL de PBS sem interromper as células. Gire o PBS. Aspirar suavemente o PBS com sucção ou pipetar fora do PBS.
  3. Pipetar suavemente 5 mL de tripsina-EDTA em PBS na camada de células e incubar por 5 minutos a 37 °C.
  4. Remova as células da placa com toques suaves para desalojar as células. Pipetar as células várias vezes com uma pipeta de 10 mL e transferir as células para um tubo cônico contendo DMEM com FBS a 10%.
  5. Centrifugar os tubos cônicos a 180 x g por 5 minutos.
  6. Retire o sobrenadante despejando-o suavemente, retendo o pellet celular. Lave o pellet de célula duas vezes com PBS. De cada vez, pipetar 10 mL de PBS nas células. Misture suavemente com uma pipeta p1000.
  7. Centrifugar as células como no passo 5.5. Retire suavemente o PBS com uma pipeta e repita.
  8. Ressuspender as células peletizadas lavadas em 1 mL de PBS com p1000.
  9. Limpe uma lâmina do hemocitômetro com álcool e seque.
  10. Pipetar 100 μL da mistura celular em um tubo e adicionar 400 μL de azul de Trypan a 0,4% para uma concentração final de azul de Trypan de 0,32%.
  11. Encha suavemente as câmaras de um hemocitômetro de vidro sob a lamínula, pipetando a mistura celular até que a câmara esteja cheia.
  12. Usando um microscópio, concentre-se nas linhas de grade de uma objetiva de 10x.
  13. Conte as células vivas, sem manchas e as células azuis em um conjunto de 16 quadrados.
  14. Conte todos os 4 conjuntos de 16 quadrados.
  15. Faça a média da contagem de células para as células claras e azuis dos 4 conjuntos de 16 quadrados e multiplique por 10.000. Multiplique por 5 para corrigir a diluição de 1:5 do azul de Trypan.
  16. As contagens finais são a concentração em células/mL para as células viáveis e mortas. Multiplique pelo volume para determinar o número total de células cancerosas e fibroblastos. Confirme que a fração de células viáveis é de >80%.
  17. Confirmar que há um número suficiente de células de melanoma e fibroblastos para todas as injeções planejadas, supondo pelo menos 20% de perda de amostra durante as injeções.
  18. Transfira o número necessário de células para um novo tubo cônico e granule as células por centrifugação (180 x g por 5 minutos).
  19. Retire o sobrenadante com uma pipeta de 10 mL.
  20. Ressuspender o pellet na concentração necessária na quantidade apropriada de PBS grau da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) (50 μL por tumor para injeção intradérmica e 100 μL por tumor para injeção subcutânea).

6. Injetar células cancerígenas e fibroblastos em camundongos

OBS: Se aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da instituição, injetar dois tumores em cada camundongo, um em cada flanco. Randomize qual mouse receberá qual injeção nos flancos direito e esquerdo. Dependendo do número de camundongos a serem injetados, anestesiar os camundongos e injetar células cancerígenas e fibroblastos nos camundongos em lotes.

  1. Para injeção subcutânea de células cancerosas
    1. Anestesiar ratinhos conforme descrito na secção 4.1.
    2. Limpe a pele raspada com compressas com álcool.
    3. Encha uma seringa estéril com o volume desejado de células ou mistura de células e tampe a seringa com uma agulha de calibre 27.
      NOTA: Certifique-se de que não existem bolhas de ar. Mexa a seringa conforme necessário para remover as bolhas. Uma vez que as células tenham sido introduzidas na seringa, mantenha as células dentro das seringas bem misturadas, invertendo continuamente as seringas para evitar aglomeração.
    4. Insira a agulha na região subcutânea no flanco do rato e injete suavemente as células no rato. Use suspensão celular de 100 μL por tumor para injeção subcutânea (não é recomendado usar volume superior a 100 μL por injeção).
    5. Monitore os camundongos até que eles se recuperem da anestesia. Se necessário, forneça aos ratos materiais isolantes extras, como cabanas e/ou almofadas de aquecimento, para ajudar os ratos a se recuperarem totalmente.
  2. Para injeções intradérmicas de células cancerosas
    1. Anestesiar ratinhos conforme descrito na secção 4.1.
    2. Limpe a pele raspada com compressas com álcool.
    3. Encha uma seringa estéril com o volume desejado de células ou mistura de células e tampe a seringa com uma agulha de calibre 27.
      NOTA: Certifique-se de que não existem bolhas de ar. Mexa a seringa conforme necessário para remover as bolhas. Uma vez que as células tenham sido introduzidas na seringa, mantenha as células dentro das seringas bem misturadas, invertendo continuamente as seringas para evitar aglomeração.
    4. Insira uma agulha de calibre 27 na região intradérmica da pele no flanco do rato e injete suavemente as células na região intradérmica do rato. Use suspensão celular de 50μL por tumor para injeção intradérmica (não é recomendado usar volume superior a 50 μL por injeção).
    5. Monitore os camundongos até que eles se recuperem da anestesia. Se houver sinais de que os ratos estão em perigo, consulte um veterinário. Se necessário, forneça aos ratos materiais isolantes extras, como cabanas e/ou almofadas de aquecimento, para ajudar os ratos a se recuperarem totalmente.

7. Monitorar camundongos durante o crescimento do tumor

  1. Monitore os ratos diariamente para quaisquer sinais de dor ou angústia (postura curvada, contorções, vocalização, alongamento ao longo da gaiola, pressionando seu abdômen para o fundo do chão da gaiola ou relutância em se mover ao redor da gaiola) ou formação de abscesso. Se houver sinais de que os ratos estão em perigo, consulte um veterinário.
  2. Uma vez que os tumores são formados, medir o volume do tumor aproximadamente a cada dois a três dias. Meça o comprimento do tumor (o lado mais longo) e a largura (perpendicular ao comprimento) com paquímetro.
    NOTA: As práticas recomendadas são para que a mesma pessoa execute essas medições durante todo o experimento para reduzir a variabilidade nos dados. Para medições, anestesiar ratinhos conforme descrito na secção 4.1
  3. Calcule os volumes tumorais com a fórmula Volume= 0,5 x (Comprimento x Largura2).

8. Colher tumores e medir pesos tumorais

  1. Eutanasiar camundongos quando o crescimento do tumor atingir um desfecho experimental estabelecido pelo Comitê de Cuidados com Animais da instituição. Coloque os ratos em uma câmara e eutanasie-os com deslocamento lento (20-30% por minuto) do ar da câmara com CO2 comprimido por um minuto após a interrupção da respiração.
  2. Realizar deslocamento cervical nos camundongos. Conter o roedor em uma superfície firme e plana. Coloque uma caneta resistente ou outro objeto contra a parte de trás do pescoço na base do crânio. Empurre rapidamente para frente e para baixo com o objeto segurando a cabeça enquanto puxa para trás com a mão segurando a base da cauda. Confirme com palpação que a medula espinhal está cortada.
    NOTA: A luxação cervical deve ser realizada por pessoal de laboratório experiente.
  3. Para cada rato na experiência, confirme se o rato já não está vivo, verificando se não há respiração, batimentos cardíacos e resposta a um beliscão do dedo do pé.
  4. Usando um bisturi estéril e tesoura cirúrgica, excise todo o tumor do rato. Com tesoura cirúrgica, corte o tecido não tumoral do tumor.
  5. Pesar o tumor em uma balança analítica e registrar o peso do tumor.

9. Análise estatística dos volumes e pesos tumorais

  1. Comparar os volumes tumorais ao longo do tempo em cada grupo com análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas. Realizar análise pareada se dois tumores foram injetados por camundongo.
  2. Comparar os pesos tumorais entre os grupos com ANOVA usando um teste bicaudal. O teste post-hoc de Tukey pode então ser usado para determinar quais grupos são significativamente diferentes uns dos outros. Realizar análise pareada se dois tumores foram injetados por camundongo.

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Representative Results

Células de melanoma humano A2058 e fibroblastos dérmicos humanos primários foram cultivados em condições estéreis. As células foram coletadas e lavadas três vezes com PBS. Camundongos imunodeficientes (NU/J - cepa Foxn1 nude) foram injetados por via subcutânea em um flanco com 0,25 milhão de células de melanoma A2058 isoladamente. No outro flanco, camundongos foram injetados com uma mistura de 0,25 milhão de células de melanoma A2058 e 0,75 milhão de fibroblastos. As células foram injetadas em 12 camundongos imunodeficientes. As injeções nos flancos esquerdo e direito foram randomizadas. Os volumes tumorais foram monitorados nos dias 12, 14, 16, 19 e 21 dias após a injeção (Figura 1A). Após a eutanásia, os tumores foram excisados, imageados (Figura 1B) e pesados (Figura 1C). A presença dos fibroblastos resulta em tumores significativamente maiores.

Figure 1
Figura 1: Comparação do crescimento do melanoma na presença e ausência de fibroblastos co-injetados. Células de melanoma foram introduzidas em camundongos nus com ou sem fibroblastos primários da pele. (A) Gráfico do volume tumoral ao longo do tempo para melanomas com e sem fibroblastos co-injetados. O volume foi calculado como 0,5*comprimento*largura2. Os volumes médios e o erro padrão da média (EPM) são plotados. ANOVA foi realizada para determinar a significância. (B) Imagens de tumores excisados. (C) Pesos finais dos tumores ao final do experimento no 21º dia. Os pesos médios e a EPM são plotados. Um teste t bicaudal não pareado foi usado para comparar os pesos finais. * indica p < 0,05, *** indica p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

No experimento da Figura 1, a co-introdução de fibroblastos dérmicos humanos com células humanas de melanoma A2058 resultou em tumores maiores do que quando as células de melanoma foram introduzidas sem fibroblastos co-injetados. Essa diferença pode ser facilmente detectada com base no volume e peso tumoral. Os resultados são consistentes com múltiplos relatos de que fibroblastos associados ao câncer podem promover o crescimento tumoral5,6,7,8. Além dos desfechos discutidos aqui, como volume e peso tumoral, desfechos adicionais também podem ser monitorados. Análises adicionais também são possíveis. Por exemplo, os tumores que se desenvolvem podem ser coletados em formalina para fixação, incluídos em parafina e analisados com hematoxilina e eosina para histologia. Alternativamente, os tumores desenvolvidos podem ser coletados em composto de temperatura de corte ótima (OCT) para análise posterior com imunofluorescência para proteínas específicas.

Uma limitação importante desses experimentos é que os fibroblastos que são co-injetados com as células cancerosas podem senescer ou morrer após algumas divisões celulares. Alternativamente, os fibroblastos co-injetados podem migrar para longe do tumor, caso em que podem não afetar o crescimento tumoral. Se os fibroblastos senescerem, morrerem ou migrarem para longe do tumor, então eles se tornarão menos abundantes ao longo do tempo e o efeito dos fibroblastos co-introduzidos se tornará menos importante para o crescimento do tumor. De fato, espera-se que as células cancerosas introduzidas recrutem fibroblastos adicionais do hospedeiro. Para experimentos em que um gene específico é derrubado ou nocauteado nos fibroblastos introduzidos, ao longo do tempo, espera-se que o recrutamento de fibroblastos do hospedeiro que expressem a proteína codificada reduza qualquer fenótipo que possa ser observado. Para monitorar a presença dos fibroblastos introduzidos, os fibroblastos podem ser geneticamente modificados para expressar uma proteína fluorescente como a GFP26,27. Se os fibroblastos expressam GFP, a citometria de fluxo pode ser usada para monitorar o número de fibroblastos que estão presentes no tumor em diferentes dias após sua introdução. Como alternativa, a enzima luciferase pode ser introduzida nos fibroblastos e imagens de bioluminescência podem ser usadas para monitorar a quantidade de fibroblastos nos camundongos ao longo do tempo. Se os fibroblastos forem rapidamente eliminados do microambiente tumoral, os modelos de camundongos geneticamente modificados com Cre-lox abordariam essa preocupação e complementariam os estudos descritos.

Se os experimentos forem realizados introduzindo células cancerosas humanas e fibroblastos em camundongos nus, espera-se que o sistema imunológico limitado tenha um impacto significativo nos resultados. Camundongos nus atímicos (NU/J) carecem de células T e, portanto, não têm imunidade mediada por células. Eles também têm um defeito parcial no desenvolvimento de células B. A imunidade mediada por células, ou seja, a morte de células via células T CD8+ ativadas, pode desempenhar um papel importante na supressão do crescimento tumoral28,29. Em estudos recentes, a interação entre fibroblastos associados ao câncer e células T CD8+ tem sido relatada30,31,32. A introdução de células cancerosas de camundongos e fibroblastos de camundongos em camundongos com sistema imunológico pode ser considerada como uma abordagem alternativa que resolveria essa questão.

Outra abordagem alternativa é usar modelos de camundongos geneticamente modificados nos quais o sistema Cre-lox é usado para modular os níveis ou a atividade de proteínas específicas em fibroblastos do hospedeiro. Uma dessas abordagens é usar modelos Cre-lox enriquecidos com fibroblastos com drivers como FSP1, Col1a1, Col1a2 ou PDGFRa33,34,35. Com um modelo de Cre/lox recombinase, não haveria preocupação de que os fibroblastos injetados morressem ou migrassem para longe do tumor.

Existem algumas etapas no protocolo que são críticas para o seu sucesso. O crescimento dos fibroblastos é uma parte importante do protocolo e provavelmente contribuirá significativamente para o desfecho. Os fibroblastos primários senescem facilmente, e a passagem ou duplicação deve ser cuidadosamente monitorada para garantir que os fibroblastos estejam na fase de crescimento exponencial e não tenham senescido. Espera-se que os fibroblastos senescentes secretem altos níveis de citocinas que podem ter um efeito dramático sobre o crescimento tumoral36,37,38. Consequentemente, é de grande importância que o número de passagens seja cuidadosamente documentado e que os fibroblastos injetados não sejam senescentes, a menos que o protocolo exija a análise de fibroblastos senescentes.

Quando os fibroblastos se tornam confluentes, pode-se esperar que sofram um grande número de alterações, algumas das quais provavelmente serão revertidas quando reentrarem no ciclo celular 39,40,41,42,43,44. Manter os fibroblastos em estado proliferativo e dividi-los quando eles são 90% confluentes é importante para garantir que os estudos sejam o mais consistentes possível. A cultura de fibroblastos em placas de cultura de tecidos provavelmente também afeta seu comportamento, e alternativas como matrizes de colágeno 3D devem ser consideradas23,24,25. Fibroblastos cultivados em matrizes 3D apresentam padrões de migração substancialmente diferentes dos fibroblastos crescidos em superfícies2D 45,46,47,48,49, o que provavelmente afetaria sua capacidade de promoção tumoral quando introduzidos em tumores, onde os fibroblastos desempenharão um papel ativo no estabelecimento do microambiente da matriz extracelular tumoral50.

A injeção de células de melanoma no camundongo por injeção intradérmica pode produzir crescimento tumoral mais reprodutível do que injeções subcutâneas. Esta é uma etapa complicada, pois há muito pouco espaço na região intradérmica. É importante posicionar cuidadosamente a agulha. Se forem realizadas injeções intradérmicas, apenas 50 μL de solução são injetados. Mesmo para pesquisadores experientes, essas injeções podem vazar. É importante observar se cada injeção vazou para que, se nenhum tumor se formar, ele possa ser eliminado da análise final.

A preparação das seringas para injeção é outro passo crítico. É importante remover todas as bolhas da seringa, o que pode exigir o movimento da seringa para eliminar as bolhas. Também é importante que as células não se aglutinem. Inverta repetidamente as seringas para evitar aglomerações.

Outro aspecto complicado desses experimentos é que medir o volume do tumor pode ser variável de pessoa para pessoa. A fim de limitar a variabilidade nas medições de volume tumoral, é útil atribuir a um único membro do laboratório a responsabilidade de fazer todas as medições de volume tumoral em todos os camundongos e em todos os momentos ao longo de um experimento.

É preferível injetar células cancerígenas do mesmo sexo que o camundongo hospedeiro sempre que possível. É possível usar ambos os sexos e incluir o sexo como variável nos modelos de ANOVA para determinar se o sexo afeta o tamanho do tumor ao longo do tempo.

A compreensão do microambiente tumoral é essencial para o conhecimento da tumorigênese. O protocolo pode fornecer uma base para a compreensão do papel dos fibroblastos, diferentes tipos de fibroblastos e diferentes vias dentro dos fibroblastos que podem afetar o crescimento tumoral. Os achados desses experimentos poderão identificar novos alvos terapêuticos que impeçam os fibroblastos de promover o crescimentotumoral18.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório Coller pela contribuição útil. H.A.C. foi o bolsista Milton E. Cassel da Fundação Rita Allen. Agradecemos ao NIH/NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, ao Prêmio de Ciência da Equipe da Aliança de Pesquisa de Melanoma, ao Prêmio do Programa de Integração de Laboratório Clínico do Instituto de Pesquisa do Câncer, ao Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, ao Comitê Coordenador de Pesquisa do Câncer da Universidade da Califórnia, ao Prêmio Temático de Metabolismo da David Geffen School of Medicine, ao Clinical Translational Science Institute e ao Jonsson Comprehensive Cancer Center, Prêmios de Inovação do Centro de Pesquisa de Células-Tronco Amplas (Rose Hills e Ha Gaba), um Prêmio da UCLA SPORE em Câncer de Próstata (Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Número de Prêmio P50CA092131), um Prêmio de Inovação do Centro de Células-Tronco Amplas, do Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research da UCLA, o Programa de Treinamento em Biologia Celular Tumoral (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), o Programa de Dermatologia T32 na UCLA AR071307 e o Programa de Treinamento em Biologia Celular Muscular, Fisiopatologia e Terapêutica T32 da UCLA 5 T32 AF 65972.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228

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Um Modelo de Camundongo para Investigar o Papel de Fibroblastos Associados ao Câncer no Crescimento Tumoral
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Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus,… More

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