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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un modelo de ratón para investigar el papel de los fibroblastos asociados al cáncer en el crecimiento tumoral

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61883
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2, 1,2,4
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

Se proporciona un protocolo para coinyectar células cancerosas y fibroblastos y monitorear el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo. Este protocolo se puede utilizar para comprender las bases moleculares del papel de los fibroblastos como reguladores del crecimiento tumoral.

Abstract

Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) pueden desempeñar un papel importante en el crecimiento tumoral al crear un microambiente promotor de tumores. Los modelos para estudiar el papel de los CAF en el microambiente tumoral pueden ser útiles para comprender la importancia funcional de los fibroblastos, los fibroblastos de diferentes tejidos y los factores genéticos específicos en los fibroblastos. Los modelos de ratón son esenciales para comprender los factores que contribuyen al crecimiento y la progresión del tumor en un contexto in vivo. Aquí, se proporciona un protocolo en el que las células cancerosas se mezclan con fibroblastos y se introducen en ratones para desarrollar tumores. Los tamaños de los tumores a lo largo del tiempo y los pesos finales de los tumores se determinan y comparan entre los grupos. El protocolo descrito puede proporcionar más información sobre el papel funcional de los CAF en el crecimiento y la progresión del tumor.

Introduction

Dentro del microambiente tumoral, uno de los tipos celulares más prominentes es el fibroblasto asociado al cáncer (CAF)1. Estos fibroblastos asociados a carcinomas pueden desempeñar un papel supresor tumoral 2,3. Por ejemplo, los fibroblastos que expresan S100A secretan colágenos que pueden encapsular carcinógenos y proteger contra la formación de carcinoma4. Además, el agotamiento de miofibroblastos positivos para actina del músculo liso α liso (AME) en el cáncer de páncreas causa inmunosupresión y acelera la progresión del cáncer de páncreas2. Los CAF también pueden coevolucionar con las células cancerosas y promover la progresión tumoral 5,6,7,8. Los fibroblastos pueden sintetizar y secretar proteínas de la matriz extracelular que crean un ambiente promotor de tumores8. Estas proteínas de la matriz extracelular pueden causar rigidez mecánica del tejido, que se asocia con la progresión tumoral 9,10. La matriz extracelular depositada puede actuar como una barrera física que inhibe la infiltración inmune11. La deposición de la matriz por CAF también se ha asociado con la invasión tumoral, ya que se ha demostrado que la fibronectina generada por CAF promueve la invasión tumoral12. Los CAF promueven la angiogénesis y reclutan células inmunosupresoras para el microambiente tumoral mediante la secreción del factor de crecimiento transformante β (TGF-β), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la interleucina-6 (IL-6) y el ligando 12 de quimiocina CXC (CXCL12)13,14,15. Debido a su papel central en la promoción del crecimiento tumoral, los fibroblastos asociados al cáncer son un objetivo emergente para la terapia contra el cáncer 6,16,17,18.

El siguiente protocolo describe un método para probar cómo los fibroblastos afectan el crecimiento de tumores en un modelo de ratón bien establecido y ampliamente utilizado de crecimiento tumoral. Con el fin de comprender la importancia de los fibroblastos en el microambiente tumoral, el protocolo estándar para la introducción de células cancerosas en ratones para controlar su crecimiento se modificó para incluir fibroblastos con la introducción de células cancerosas. Las células cancerosas se pueden introducir por vía subcutánea o intradérmica. La introducción intradérmica daría lugar a tumores que surgen de la piel misma. Los xenoinjertos en los que las células cancerosas y los fibroblastos son coinyectados en ratones representan una importante herramienta metodológica para diseccionar el papel de los fibroblastos, las subpoblaciones de fibroblastos y los factores proteicos en la capacidad de promover el crecimiento del cáncer 19,20,21. Se proporciona un protocolo detallado para la coinyección de células cancerosas y fibroblastos en ratones. Este método puede ser utilizado para comparar la presencia o ausencia de fibroblastos, para comparar fibroblastos de diferentes fuentes20, o para comparar fibroblastos con y sin expresión de proteínas específicas19. Después de que se introducen las células cancerosas y los fibroblastos, el tamaño del tumor se puede controlar con el tiempo. Al final de los experimentos, los tumores pueden ser diseccionados y pesados. Al monitorear el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo, se puede diseccionar la importancia de diferentes factores.

Existen posibles enfoques alternativos para estudiar el papel de los fibroblastos en el crecimiento tumoral. Como ejemplo, hay modelos basados en Cre-loxed que proporcionan la eliminación de genes específicos del tejido con impulsores expresados preferentemente en fibroblastos. Tales enfoques también brindan oportunidades para investigar el papel de genes y vías específicas en fibroblastos para la progresión tumoral. En comparación con los enfoques basados en Cre-lox, el protocolo proporcionado representaría un enfoque significativamente más rápido para monitorear el papel de los fibroblastos porque el crecimiento tumoral se monitorizaría en unas pocas semanas. El enfoque proporcionado también es significativamente menos costoso porque no requiere generar y albergar colonias de ratones genéticamente modificados. El protocolo proporcionado se puede utilizar para probar rápidamente el efecto de la eliminación de diferentes genes utilizando shRNAs en lugar de necesitar desarrollar colonias de ratones. El enfoque proporcionado también es más flexible porque permitiría una comparación de diferentes números de fibroblastos, diferentes proporciones de células cancerosas y fibroblastos, derribo de diferentes genes e incluso comparación de fibroblastos de diferentes sitios de tejidos o especies. Un enfoque Cre-lox tendría la ventaja de que los fibroblastos están presentes dentro de los ratones en un contexto más fisiológico.

El protocolo reportado aquí sería valioso para los científicos que buscan monitorear los efectos de los fibroblastos en el crecimiento tumoral de manera rápida y rentable. Este protocolo es especialmente valioso para los científicos que investigan diferentes subconjuntos de fibroblastos o fibroblastos de diferentes fuentes sobre el crecimiento tumoral en el crecimiento tumoral. Si es importante que la iniciación del tumor ocurra en un contexto fisiológico, entonces se deben considerar modelos de ratón genéticamente modificados.

Hay varios enfoques posibles para realizar estos experimentos. Los ratones inmunocompetentes pueden usarse como huéspedes, lo que permitiría la investigación de las interacciones fibroblasto-célula inmune. Para los modelos de ratón inmunocompetentes, se deben inyectar células cancerosas de ratón y fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). El uso de MEFs también permite al investigador aprovechar la amplia gama de cepas de ratones knockout para probar la presencia o ausencia de un gen de interés. Alternativamente, los ratones inmunodeficientes se pueden usar para probar el papel de los fibroblastos humanos en la promoción del crecimiento de tumores en ratones que se derivan de células cancerosas humanas. La introducción de las células cancerosas se puede realizar por vía subcutánea u ortotópica. Para el melanoma, como se describe a continuación, la mezcla de tumor y fibroblastos se puede inyectar por vía intradérmica para una inyección ortotópica que simula más de cerca la ubicación dentro de la piel donde se desarrollaría un melanoma.

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Protocol

Todos los experimentos descritos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de California, Los Ángeles.

NOTA: Seleccione células cancerosas y fibroblastos que coincidan con los ratones huéspedes para la cepa de ratón. Seleccione células cancerosas y fibroblastos que coincidan con el sexo del ratón huésped. Obtenga ratones de colonias de cría o cómprelos a proveedores de buena reputación. Introducir tumores en ratones que tienen ~ 8-10 semanas de edad. Los ratones con pelaje estarán en la fase telógena o de reposo del ciclo del folículo piloso. Planifique una proporción de 0.5 a 3 fibroblastos por célula cancerosa.

1. Determinar el número apropiado de ratones que se utilizarán para la experimentación

  1. Antes de realizar los estudios, realice un análisis de potencia para determinar el número apropiado de ratones que se utilizarán para los estudios. Utilice la fórmula siguiente para determinar el tamaño de muestra de un experimento con la potencia especificada:
    n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
    Si α es el nivel de significación seleccionado (generalmente 0,05), entonces 1-α/2 = 0,975 y Z=1,960.
    β es la potencia y si se desea un 80% de potencia, entonces Z = 0.84.

    ES, el tamaño del efecto = \μ1-μ 0\/σ
    donde μ 0 es la media bajo la hipótesis H0, μ 1 es la media bajo la hipótesis H1, y σ es la desviación estándar del resultado de interés22.
    NOTA: Se puede encontrar más información sobre el cálculo del tamaño de la muestra22.

2. Generar células cancerosas para inyección

  1. Determine la tasa de crecimiento relevante con la siguiente ecuación:
    Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t

    NOTA: Se muestra un ejemplo de celdas que se duplican en 24 horas
    Tiempo de duplicación = ln(2)/tasa de crecimiento
    24 horas = ln(2)/tasa de crecimiento
    24*tasa de crecimiento = .693
    Tasa de crecimiento = .693/24= .028875
  2. Determinar el número de células cancerosas en placa y la cantidad de tiempo que las células necesitan ser cultivadas antes de la inyección.
    NOTA: Se inyectan entre 0,25 y 1 millón de células cancerosas por cada tumor formado.
  3. Calcular el número de días necesarios para generar un número suficiente de celdas de acuerdo con la ecuación
    N(t)=N(0)egr*t
    donde N(t) es el número de células en el tiempo t, N(0) es el número de células en el tiempo 0, gr es la tasa de crecimiento y t es el tiempo.
    NOTA: Un ejemplo de estos cálculos para cultivar 500,000 células para generar 106 células en cada uno de los 12 tumores. Según estos cálculos, 5 días son suficientes para crecer el número necesario de células:
    N(t)=N(0)egr*t
    12 x 106 = 500.000e(gr*t)
    12 x 106=500,000e(.028875*t)
    24=e(.028875*x)
    ln(24)=0,028875x
    3,178=0,028875x
    X=110 horas= 4,59 días
    Deje tiempo adicional para que las celdas se adhieran a la placa y para las celdas que se pierden durante la recolección.
  4. Células cancerosas de placa.
    NOTA: Use guantes y batas de laboratorio cuando trabaje con células cultivadas.
    NOTA: Realice manipulaciones celulares en una campana de flujo laminar para minimizar la introducción de microbios del aire en las muestras. Trate la campana de cultivo de tejidos con luz ultravioleta antes de usarla. Utilice una técnica estéril y solo artículos y consumibles de cultivo celular estéril, como placas tratadas con cultivo de tejidos, pipetas y tubos cónicos.
    1. Calcule el número y el tamaño correctos de las placas de cultivo de tejidos en función del número de células en el vial y la concentración celular deseada una vez plateadas.
    2. Etiquete las placas de cultivo de tejidos.
    3. Preparar un baño maría con agua a 37 °C.
    4. Medio alícuota en tubos cónicos y colocar en un baño maría a 37 °C. Muchas células cancerosas se pueden cultivar en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS).
    5. Retire el número requerido de viales de células congeladas del congelador de nitrógeno líquido.
      NOTA: Use guantes de congelador cuando manipule celdas en un congelador de nitrógeno líquido.
    6. Descongele rápidamente los viales celulares en el baño de agua mientras agita suavemente.
      NOTA: Agregue etanol a los guantes mientras manipula viales para mantener la esterilidad.
    7. Usando una técnica estéril en una campana de cultivo de tejidos, pipetea las células en un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de DMEM + 10% FBS.
    8. Centrifugar la mezcla celular a 180 x g durante 5 minutos.
    9. Retire suavemente el sobrenadante con aspiración estéril o una pipeta estéril de 10 ml.
    10. Resuspenda suavemente las células en el pellet en 1 ml de DMEM + 10% FBS.
    11. Pipet las células resuspendidas en una placa de cultivo de tejido marcado con un p1000 estéril.
    12. Uso de pipetas estériles de 10 ml, medio pipeta con suero en placas de cultivo de tejidos.
    13. Incubar placas de cultivo de tejidos en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C con 5% deCO2.
  5. Expandir las células cancerosas para generar suficientes células cancerosas para la inyección.
    NOTA: Monitoree las células con microscopía óptica para la confluencia. Tripsinizar cada dos o tres días o según sea necesario para evitar que las células alcancen el 100% de confluencia. Si se requiere un gran número de células, use hiperfrascos (Tabla de materiales) para cultivar un gran número de células de una manera eficiente en el espacio y el medio. Cada vez que sea necesario pasar las celdas, siga este procedimiento:
    1. Retire el medio de la placa con succión estéril o una pipeta estéril de 10 ml.
    2. Lave suavemente el plato pipeteando sobre solución salina tamponada con fosfato tibio (PBS). Luego retire el PBS con succión estéril o una pipeta.
    3. Pipeta 5 ml de 1x ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) en PBS durante una placa de 10 cm sobre las células e incubar durante 5 minutos a 37 °C.
    4. Retire las células de la placa con golpecitos suaves para desalojar las células de la placa.
    5. Usando una pipeta estéril de 10 ml, recolecte las células en DMEM con suero FBS al 10% en tubos cónicos.
    6. Centrifugar tubos cónicos a 180 x g durante 5 minutos.
    7. Retire el sobrenadante vertiéndolo. El pellet celular debe ser visible. Míralo para asegurarte de que permanezca en el tubo.
    8. Resuspender las células peletizadas añadiendo 1 mL de DMEM + 10% FBS y pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente.
    9. Alícuota células resuspendidas en nuevas placas de cultivo de tejidos del tamaño apropiado con DMEM + 10% FBS (10 ml de medios es adecuado para una placa de cultivo de tejido de 10 cm).

3. Generar fibroblastos para inyección

NOTA: Los fibroblastos primarios senescenciarán después de demasiadas duplicaciones/pasajes. Es importante utilizar fibroblastos primarios después de un número limitado de pasajes o duplicaciones. Lleve un registro del número de pasajes o duplicaciones que los fibroblastos han crecido a partir de la piel del ratón o humano. Use fibroblastos con menos de 15 pasajes para fibroblastos dérmicos humanos primarios. Use fibroblastos con menos de 9 pasajes para fibroblastos embrionarios de ratón. Los fibroblastos se alteran cuando se vuelven confluentes. Tripsinizar los fibroblastos cuando son aproximadamente 90% confluentes. Los fibroblastos tendrán diferentes propiedades dependiendo de cómo se cultiven. Muchos científicos promueven el cultivo en sustratos fisiológicamente más relevantes que las placas de cultivo de tejidos, como las matrices de colágeno 3D que capturan de manera más efectiva entornos similares a los tejidos23,24,25.

  1. Utilice la ecuación de la sección 2.1 para determinar la tasa de crecimiento de las células de fibroblastos.
  2. Utilice la ecuación de la sección 2.2 para determinar el número de días necesarios para expandir los fibroblastos.
  3. Colocar los fibroblastos en placa como se describe en la sección 2.3 utilizando el medio apropiado en el día apropiado para asegurar que las células cancerosas y los fibroblastos estén listos para la inyección el mismo día.
  4. Expandir los fibroblastos en el medio apropiado para generar un número suficiente de fibroblastos necesarios siguiendo los procedimientos descritos en la sección 2.4.

4. Afeitar ratones para preparar ratones para la inyección

NOTA: Use batas de laboratorio, redes para el cabello, cubiertas para zapatos y guantes cuando trabaje con ratones.

  1. Uno o dos días antes de la inyección, de acuerdo con las reglas del Comité Institucional de Cuidado Animal, anestesiar a los ratones. Si usa isoflurano para la anestesia, use una mezcla de isoflurano yO2. Coloque los ratones en una cámara de anestesia e introduzca una mezcla de isoflurano (5%)/O2 para inducir la anestesia. Luego, colocar el cono de la nariz sobre el animal anestesiado para mantener el plano quirúrgico de la anestesia con un flujo constante de isoflurano (2%)/mezclaO2 .
  2. Revise a los animales para asegurarse de que estén en el plano quirúrgico apropiado de anestesia pellizcando el dedo del pie del ratón y confirmando que el ratón no se mueve.
  3. Usando un cortaanimales con cuchilla quirúrgica # 40, retire suavemente el pelaje de las posiciones apropiadas en los flancos de los ratones pasando el cortaanimales sobre la piel varias veces hasta que se retire el pelaje.
  4. Controle a los ratones hasta que se recuperen de la anestesia.

5. Preparar las células cancerosas y los fibroblastos para la inyección

NOTA: Las células cancerosas y los fibroblastos deben inyectarse tan pronto como sea posible después de la recolección, preferiblemente dentro de los 30 minutos. En la mañana de la inyección, recolecte las células cancerosas y los fibroblastos por separado de las placas de cultivo de tejidos. Para cada tipo de celda, realice los pasos siguientes:

  1. Retire el medio de la placa de cultivo de tejidos con una succión estéril suave o pipeteando el medio.
  2. Pipetear suavemente 5 ml de PBS sin interrumpir las células. Agite el PBS. Aspire suavemente el PBS con succión o pipeta del PBS.
  3. Pipetear suavemente 5 ml de tripsina-EDTA en PBS sobre la capa celular e incubar durante 5 minutos a 37 °C.
  4. Retire las células de la placa con golpecitos suaves para desalojar las células. Pipet las células varias veces con una pipeta de 10 ml y transfiera las células a un tubo cónico que contenga DMEM con 10% de FBS.
  5. Centrifugar los tubos cónicos a 180 x g durante 5 minutos.
  6. Retire el sobrenadante vertiéndolo suavemente, reteniendo la bolita celular. Lave el pellet celular dos veces con PBS. Cada vez, pipetear 10 ml de PBS en las células. Mezclar suavemente con una pipeta p1000.
  7. Centrifugar las celdas como en el paso 5.5. Retire suavemente el PBS con una pipeta y repita.
  8. Resuspender las células lavadas y granuladas en 1 ml de PBS con un p1000.
  9. Limpie un portaobjetos del hemocitómetro con alcohol y séquelo.
  10. Pipet 100 μL de la mezcla celular en un tubo y añadir 400 μL de azul de tripano al 0,4% para obtener una concentración final de azul de tripano del 0,32%.
  11. Llene suavemente las cámaras de un hemocitómetro de vidrio debajo del cubreobjetos pipeteando la mezcla celular hasta que la cámara esté llena.
  12. Usando un microscopio, concéntrese en las líneas de cuadrícula de un objetivo 10x.
  13. Cuente las celdas vivas, sin teñir y las celdas azules en un conjunto de 16 cuadrados.
  14. Cuenta los 4 conjuntos de 16 cuadrados.
  15. Promedia el recuento de celdas para las celdas claras y azules de los 4 conjuntos de 16 cuadrados y multiplica por 10.000. Multiplique por 5 para corregir la dilución 1:5 del azul de tripano.
  16. Los recuentos finales son la concentración en células/ml para las células viables y muertas. Multiplique por el volumen para determinar el número total de células cancerosas y fibroblastos. Confirme que la fracción de células que son viables es >80%.
  17. Confirme que hay un número suficiente de células de melanoma y fibroblastos para todas las inyecciones planificadas, suponiendo al menos un 20% de pérdida de muestra durante las inyecciones.
  18. Transfiera el número requerido de células a un nuevo tubo cónico y granule las células por centrifugación (180 x g durante 5 minutos).
  19. Retire el sobrenadante con una pipeta de 10 ml.
  20. Resuspender el pellet a la concentración requerida en la cantidad apropiada de PBS de grado de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) (50 μL por tumor para inyección intradérmica y 100 μL por tumor para inyección subcutánea).

6. Inyectar células cancerosas y fibroblastos en ratones

NOTA: Si es aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional, inyecte dos tumores en cada ratón, uno en cada flanco. Aleatorice qué ratón recibirá qué inyección en los flancos derecho e izquierdo. Dependiendo del número de ratones a inyectar, anestesiar a los ratones e inyectar células cancerosas y fibroblastos en los ratones en lotes.

  1. Para inyección subcutánea de células cancerosas
    1. Anestesiar a los ratones como se describe en la sección 4.1.
    2. Limpie la piel afeitada con hisopos con alcohol.
    3. Llene una jeringa estéril con el volumen deseado de células o mezcla de células y tape la jeringa con una aguja de calibre 27.
      NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas de aire. Mueva la jeringa según sea necesario para eliminar las burbujas. Una vez que se hayan introducido células en la jeringa, mantenga las células dentro de las jeringas bien mezcladas invirtiendo continuamente las jeringas para evitar la formación de grumos.
    4. Inserte la aguja en la región subcutánea en el flanco del ratón e inyecte suavemente las células en el ratón. Use una suspensión de células de 100 μL por tumor para inyección subcutánea (no se recomienda usar un volumen superior a 100 μL por inyección).
    5. Controle a los ratones hasta que se recuperen de la anestesia. Si es necesario, proporcione a los ratones materiales aislantes adicionales como cabañas y / o almohadillas térmicas para ayudar a los ratones a recuperarse por completo.
  2. Para inyecciones intradérmicas de células cancerosas
    1. Anestesiar a los ratones como se describe en la sección 4.1.
    2. Limpie la piel afeitada con hisopos con alcohol.
    3. Llene una jeringa estéril con el volumen deseado de células o mezcla de células y tape la jeringa con una aguja de calibre 27.
      NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas de aire. Mueva la jeringa según sea necesario para eliminar las burbujas. Una vez que se hayan introducido células en la jeringa, mantenga las células dentro de las jeringas bien mezcladas invirtiendo continuamente las jeringas para evitar la formación de grumos.
    4. Inserte una aguja de calibre 27 en la región intradérmica de la piel en el flanco del ratón e inyecte suavemente las células en la región intradérmica del ratón. Use suspensión de células de 50 μL por tumor para inyección intradérmica (no se recomienda usar un volumen superior a 50 μL por inyección).
    5. Controle a los ratones hasta que se recuperen de la anestesia. Si hay signos de que los ratones están en peligro, consulte a un veterinario. Si es necesario, proporcione a los ratones materiales aislantes adicionales como cabañas y / o almohadillas térmicas para ayudar a los ratones a recuperarse por completo.

7. Monitorear ratones durante el crecimiento del tumor

  1. Controle a los ratones diariamente para detectar cualquier signo de dolor o angustia (postura encorvada, retorcerse, vocalización, estirarse a lo largo de la jaula, presionar su abdomen contra el fondo del piso de la jaula o renuencia a moverse alrededor de la jaula) o formación de abscesos. Si hay signos de que los ratones están en peligro, consulte a un veterinario.
  2. Una vez que se forman los tumores, mida el volumen del tumor aproximadamente cada dos o tres días. Medir la longitud del tumor (el lado más largo) y el ancho (perpendicular a largo) con calibradores.
    NOTA: Las mejores prácticas son que la misma persona realice estas mediciones a lo largo del experimento para reducir la variabilidad en los datos. Para las mediciones, anestesiar ratones como se describe en la sección 4.1
  3. Calcular los volúmenes tumorales con la fórmula Volumen = 0,5 x (Largo x Ancho2).

8. Cosechar tumores y medir el peso de los tumores

  1. Eutanasia a ratones cuando el crecimiento tumoral alcanza un punto final experimental establecido por el Comité de Cuidado Animal de la institución. Coloque los ratones en una cámara y eutanasiéselos con un desplazamiento lento (20-30% por minuto) del aire de la cámara conCO2 comprimido durante un minuto después del cese de la respiración.
  2. Realizar la dislocación cervical en los ratones. Sujete al roedor sobre una superficie firme y plana. Coloque un bolígrafo resistente u otro objeto contra la parte posterior del cuello en la base del cráneo. Empuje rápidamente hacia adelante y hacia abajo con el objeto que sujeta la cabeza mientras tira hacia atrás con la mano que sostiene la base de la cola. Confirme con palpación que la médula espinal está cortada.
    NOTA: La luxación cervical debe ser realizada por personal de laboratorio experimentado.
  3. Para cada ratón en el experimento, confirme que el ratón ya no está vivo comprobando que no hay respiración, latidos del corazón y no hay respuesta a un pellizco en el dedo del pie.
  4. Usando un bisturí estéril y tijeras quirúrgicas, extirpe todo el tumor del ratón. Con tijeras quirúrgicas, recorte el tejido no tumoral del tumor.
  5. Pesar el tumor en una balanza analítica y registrar el peso del tumor.

9. Análisis estadístico de volúmenes tumorales y pesos tumorales

  1. Comparar los volúmenes tumorales a lo largo del tiempo en cada grupo con el análisis de varianza de medidas repetidas (ANOVA). Realice un análisis pareado si se inyectaron dos tumores por ratón.
  2. Comparar los pesos tumorales entre los grupos con ANOVA usando una prueba de dos colas. La prueba post-hoc de Tukey se puede utilizar para determinar qué grupos son significativamente diferentes entre sí. Realice un análisis pareado si se inyectaron dos tumores por ratón.

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Representative Results

Las células de melanoma humano A2058 y los fibroblastos dérmicos humanos primarios se cultivaron en condiciones estériles. Las células se recolectaron y lavaron tres veces con PBS. Los ratones inmunodeficientes (NU/J - cepa desnuda Foxn1) se inyectaron por vía subcutánea en un flanco con 0,25 millones de células de melanoma A2058 solamente. En el otro flanco, a los ratones se les inyectó una mezcla de 0,25 millones de células de melanoma A2058 y 0,75 millones de fibroblastos. Se inyectaron células en 12 ratones inmunodeficientes. Las inyecciones en los flancos izquierdo y derecho fueron aleatorias. Los volúmenes tumorales se monitorizaron los días 12, 14, 16, 19 y 21 días después de la inyección (Figura 1A). Tras la eutanasia, los tumores fueron extirpados, fotografiados (Figura 1B) y pesados (Figura 1C). La presencia de los fibroblastos resulta en tumores significativamente más grandes.

Figure 1
Figura 1: Comparación del crecimiento del melanoma en presencia y ausencia de fibroblastos coinyectados. Las células de melanoma se introdujeron en ratones desnudos con o sin fibroblastos primarios de la piel. (A) Gráfico del volumen tumoral a lo largo del tiempo para melanomas con y sin fibroblastos coinyectados. El volumen se calculó como 0.5 * longitud * ancho2. Se representan gráficamente los volúmenes medios y el error estándar de la media (SEM). Se realizó ANOVA para determinar la significación. (B) Imágenes de tumores extirpados. (C) Pesos finales de los tumores al final del experimento el día 21. Se representan los pesos medios y SEM. Se utilizó una prueba t de dos colas no pareada para comparar los pesos finales. * indica p < 0,05, *** indica p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En el experimento de la Figura 1, la cointroducción de fibroblastos dérmicos humanos con células de melanoma A2058 humanas dio lugar a tumores más grandes que cuando las células de melanoma se introdujeron sin fibroblastos coinyectados. Esta diferencia podría detectarse fácilmente en función del volumen y el peso del tumor. Los resultados son consistentes con múltiples informes de que los fibroblastos asociados al cáncer pueden promover el crecimiento tumoral 5,6,7,8. Además de los criterios de valoración que se analizan aquí, como el volumen y el peso del tumor, también se pueden controlar criterios de valoración adicionales. También son posibles análisis adicionales. Por ejemplo, los tumores que se desarrollan pueden recogerse en formalina para su fijación, incrustarse en parafina y analizarse con hematoxilina y eosina para la histología. Alternativamente, los tumores desarrollados se pueden recolectar en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) para su posterior análisis con inmunofluorescencia para proteínas específicas.

Una limitación importante de estos experimentos es que los fibroblastos que se inyectan conjuntamente con las células cancerosas pueden senescencia o morir después de algunas divisiones celulares. Alternativamente, los fibroblastos coinyectados pueden migrar lejos del tumor, en cuyo caso, pueden no afectar el crecimiento del tumor. Si los fibroblastos senescencian, mueren o migran lejos del tumor, entonces se volverán menos abundantes con el tiempo y el efecto de los fibroblastos cointroducidos será menos importante para el crecimiento del tumor. De hecho, se espera que las células cancerosas introducidas recluten fibroblastos adicionales del huésped. Para experimentos en los que un gen específico es derribado o eliminado en los fibroblastos introducidos, con el tiempo, se espera que el reclutamiento de fibroblastos del huésped que expresan la proteína codificada reduzca cualquier fenotipo que pueda observarse. Para monitorear la presencia de los fibroblastos introducidos, los fibroblastos pueden ser modificados genéticamente para expresar una proteína fluorescente como GFP26,27. Si los fibroblastos expresan GFP, entonces la citometría de flujo se puede usar para monitorear el número de fibroblastos que están presentes dentro del tumor en diferentes días después de su introducción. Como alternativa, la enzima luciferasa se puede introducir en los fibroblastos y las imágenes de bioluminiscencia se pueden utilizar para controlar la cantidad de fibroblastos en los ratones a lo largo del tiempo. Si los fibroblastos se eliminan rápidamente del microambiente tumoral, los modelos de ratón genéticamente modificados Cre-lox abordarían esta preocupación y complementarían los estudios descritos.

Si los experimentos se realizan mediante la introducción de células cancerosas humanas y fibroblastos en ratones desnudos, entonces se espera que el sistema inmunológico limitado tenga un impacto significativo en los resultados. Los ratones desnudos atímicos (NU / J) carecen de células T y, por lo tanto, carecen de inmunidad mediada por células. También tienen un defecto parcial en el desarrollo de células B. La inmunidad mediada por células, es decir, la destrucción de células a través de células T CD8+ activadas, puede desempeñar un papel importante en la supresión del crecimiento tumoral28,29. En estudios recientes, se ha reportado interacción entre fibroblastos asociados al cáncer y células T CD8+30,31,32. La introducción de células de cáncer de ratón y fibroblastos de ratón en ratones con un sistema inmune puede considerarse como un enfoque alternativo que abordaría este problema.

Otro enfoque alternativo es utilizar modelos de ratón genéticamente modificados en los que el sistema Cre-lox se utiliza para modular los niveles o la actividad de proteínas específicas en los fibroblastos del huésped. Uno de estos enfoques es utilizar modelos Cre-lox enriquecidos con fibroblastos con controladores como FSP1, Col1a1, Col1a2 o PDGFRa33,34,35. Con un modelo de recombinasa Cre/lox, no habría preocupación de que los fibroblastos inyectados mueran o migren lejos del tumor.

Hay algunos pasos en el protocolo proporcionados que son críticos para su éxito. El crecimiento de los fibroblastos es una parte importante del protocolo y es probable que contribuya significativamente al resultado. Los fibroblastos primarios se senescen fácilmente, y el paso o las duplicaciones deben controlarse cuidadosamente para garantizar que los fibroblastos estén en la fase de crecimiento exponencial y no hayan senesado. Se espera que los fibroblastos senescentes secreten altos niveles de citoquinas que pueden tener un efecto dramático sobre el crecimiento tumoral36,37,38. En consecuencia, es de gran importancia que el número de pasaje esté cuidadosamente documentado y que los fibroblastos inyectados no sean senescentes a menos que el protocolo requiera el análisis de fibroblastos senescentes.

Cuando los fibroblastos se vuelven confluentes, se puede esperar que sufran un gran número de cambios, algunos de los cuales probablemente se revertirán cuando vuelvan a entrar en el ciclo celular 39,40,41,42,43,44. Mantener los fibroblastos en un estado proliferativo y dividirlos cuando son 90% confluentes es importante para asegurar que los estudios sean lo más consistentes posible. El cultivo de fibroblastos en placas de cultivo de tejidos probablemente también afecta su comportamiento y las alternativas como las matrices de colágeno 3D deben considerarse23,24,25. Los fibroblastos cultivados en matrices 3D muestran patrones de migración sustancialmente diferentes a los fibroblastos cultivados en superficies2D 45,46,47,48,49, lo que probablemente afectaría su capacidad promotora de tumores cuando se introducen en tumores, donde los fibroblastos desempeñarán un papel activo en el establecimiento del microambiente de la matriz extracelular tumoral50.

La inyección de células de melanoma en el ratón mediante inyección intradérmica puede producir un crecimiento tumoral más reproducible que las inyecciones subcutáneas. Este es un paso complicado ya que hay muy poco espacio en la región intradérmica. Es importante colocar cuidadosamente la aguja. Si se realizan inyecciones intradérmicas, solo se inyectan 50 μL de solución. Incluso para los investigadores experimentados, estas inyecciones pueden filtrarse. Es importante tomar nota de si cada inyección se filtró para que, si no se forma tumor, pueda eliminarse del análisis final.

La preparación de jeringas para inyección es otro paso crítico. Es importante eliminar todas las burbujas de la jeringa, lo que puede requerir mover la jeringa para eliminar las burbujas. También es importante que las células no se agrupen. Invierta repetidamente las jeringas para evitar la formación de grumos.

Otro aspecto complicado de estos experimentos es que la medición del volumen del tumor puede ser variable de persona a persona. Para limitar la variabilidad en las mediciones del volumen tumoral, es útil asignar a un solo miembro del laboratorio la responsabilidad de tomar todas las mediciones del volumen tumoral en todos los ratones y en todos los puntos temporales a lo largo de un experimento.

Es preferible inyectar ratones con células cancerosas del mismo sexo que el ratón huésped siempre que sea posible. Es posible utilizar ambos sexos e incluir el sexo como variable en los modelos ANOVA para determinar si el sexo afecta el tamaño del tumor con el tiempo.

Comprender el microambiente tumoral es esencial para obtener información sobre la tumorigénesis. El protocolo puede proporcionar una base para comprender el papel de los fibroblastos, los diferentes tipos de fibroblastos y las diferentes vías dentro de los fibroblastos que pueden afectar el crecimiento tumoral. Los hallazgos de estos experimentos pueden identificar nuevas dianas terapéuticas que evitarán que los fibroblastos promuevan el crecimiento tumoral18.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a todos los miembros del laboratorio Coller por sus útiles aportaciones. H.A.C. fue el becario Milton E. Cassel de la Fundación Rita Allen. Reconocemos NIH/NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Premio Científico del Equipo de la Alianza de Investigación del Melanoma, Premio del Programa de Integración de Laboratorios Clínicos del Instituto de Investigación del Cáncer, el Centro de Salud de la Mujer Iris Cantor/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, Comité Coordinador de Investigación del Cáncer de la Universidad de California, Premio Temático del Metabolismo de la Escuela de Medicina David Geffen, el Instituto de Ciencia Traslacional Clínica y el Centro Oncológico Integral Jonsson, Premios a la innovación del Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills y Ha Gaba), un premio del UCLA SPORE en cáncer de próstata (Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio P50CA092131), un Premio a la Innovación del Broad Stem Cell Center, el Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research en UCLA, el Programa de Capacitación en Biología de Células Tumorales (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), el Programa de Dermatología T32 en UCLA AR071307, y el Programa de Capacitación en Biología de Células Musculares, Fisiopatología y Terapéutica T32 de UCLA 5 T32 AF 65972.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228

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Investigación del cáncer Número 166 Fibroblastos asociados al cáncer xenoinjerto melanoma inyección intradérmica ortotópica microambiente tumoral
Un modelo de ratón para investigar el papel de los fibroblastos asociados al cáncer en el crecimiento tumoral
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Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus,… More

Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus, A., Haley, E., Guinn, E., Vo, A., Le, P., Kesaf, A. E., Nguyen, J., Guo, L., Frederick, D., Sun, Z., Guo, N., Sevier, P., Bilotta, E., Atai, K., Voisin, L., Coller, H. A. A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth. J. Vis. Exp. (166), e61883, doi:10.3791/61883 (2020).

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