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Cancer Research

ट्यूमर के विकास में कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका की जांच करने के लिए एक माउस मॉडल

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61883
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2, 1,2,4
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स को सह-इंजेक्ट करने और समय के साथ ट्यूमर के विकास की निगरानी करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग ट्यूमर के विकास के नियामकों के रूप में फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका के लिए आणविक आधार को समझने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) ट्यूमर को बढ़ावा देने वाले माइक्रोएन्वायरमेंट बनाकर ट्यूमर के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में सीएएफ की भूमिका का अध्ययन करने के लिए मॉडल फाइब्रोब्लास्ट, विभिन्न ऊतकों से फाइब्रोब्लास्ट और फाइब्रोब्लास्ट में विशिष्ट आनुवंशिक कारकों के कार्यात्मक महत्व को समझने के लिए सहायक हो सकते हैं। माउस मॉडल विवो संदर्भ में ट्यूमर के विकास और प्रगति के योगदानकर्ताओं को समझने के लिए आवश्यक हैं। यहां, एक प्रोटोकॉल जिसमें कैंसर कोशिकाओं को फाइब्रोब्लास्ट के साथ मिलाया जाता है और ट्यूमर विकसित करने के लिए चूहों में पेश किया जाता है। समय के साथ ट्यूमर के आकार और अंतिम ट्यूमर वजन निर्धारित किए जाते हैं और समूहों के बीच तुलना की जाती है। वर्णित प्रोटोकॉल ट्यूमर के विकास और प्रगति में सीएएफ की कार्यात्मक भूमिका में अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

Introduction

ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर, सबसे प्रमुख सेल प्रकार में से एक कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) 1 है। ये कार्सिनोमा से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट ट्यूमर-दमनकारी भूमिका निभा सकते हैं 2,3. उदाहरण के लिए, एस 100 ए-व्यक्त फाइब्रोब्लास्ट कोलेजन का स्राव करते हैं जो कार्सिनोजेन्स को समाहित कर सकते हैं और कार्सिनोमा गठनसे बचा सकते हैं। इसके अलावा, अग्नाशय के कैंसर में α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए) पॉजिटिव मायोफाइब्रोब्लास्ट की कमी इम्यूनोसप्रेशन का कारण बनती है और अग्नाशयके कैंसर की प्रगति में तेजी लाती है। सीएएफ कैंसर कोशिकाओं के साथ सह-विकसित हो सकते हैं और ट्यूमर की प्रगति 5,6,7,8 को बढ़ावा दे सकते हैं। फाइब्रोब्लास्ट बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन को संश्लेषित और स्रावित कर सकते हैं जो ट्यूमर को बढ़ावा देने वाला वातावरण बनातेहैं। ये बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन ऊतक की यांत्रिक कठोरता का कारण बन सकते हैं, जो ट्यूमर की प्रगति 9,10 से जुड़ा हुआ है। जमा बाह्य मैट्रिक्स एक भौतिक बाधा के रूप में कार्य कर सकता है जो प्रतिरक्षा घुसपैठ को रोकता है11. सीएएफ द्वारा मैट्रिक्स जमाव को ट्यूमर आक्रमण के साथ भी जोड़ा गया है क्योंकि सीएएफ द्वारा उत्पन्न फाइब्रोनेक्टिन को ट्यूमर आक्रमणको बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। सीएएफ एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देते हैं और विकास कारक-β (टीजीएफ-β), संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ), इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6), और सीएक्ससी-केमोकाइन लिगैंड 12 (आईएक्ससीएल 12) 13,14,15 को स्रावित करके ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में इम्यूनोसप्रेसिव कोशिकाओं की भर्ती करते हैं। ट्यूमर के विकास को बढ़ावा देने में उनकी केंद्रीय भूमिका के कारण, कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्टकैंसर-विरोधी चिकित्सा 6,16,17,18 के लिए एक उभरते हुए लक्ष्य हैं।

नीचे दिया गया प्रोटोकॉल परीक्षण के लिए एक विधि का वर्णन करता है कि फाइब्रोब्लास्ट ट्यूमर के विकास के एक अच्छी तरह से स्थापित और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले माउस मॉडल में ट्यूमर के विकास को कैसे प्रभावित करते हैं। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में फाइब्रोब्लास्ट के महत्व को समझने के लिए, कैंसर कोशिकाओं को उनके विकास की निगरानी के लिए चूहों में पेश करने के लिए मानक प्रोटोकॉल को कैंसर सेल परिचय के साथ फाइब्रोब्लास्ट को शामिल करने के लिए संशोधित किया गया था। कैंसर कोशिकाओं को चमड़े के नीचे या इंट्राडर्मल रूप से पेश किया जा सकता है। इंट्राडर्मल परिचय के परिणामस्वरूप ट्यूमर होगा जो त्वचा से ही उत्पन्न होता है। जेनोग्राफ्ट्स जिसमें कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स को चूहों में सह-इंजेक्शन दिया जाता है,कैंसर के विकास को बढ़ावा देने की क्षमता में फाइब्रोब्लास्ट, फाइब्रोब्लास्ट ्स की उप-आबादी और प्रोटीन कारकों की भूमिका को विच्छेदित करने के लिए एक महत्वपूर्ण पद्धतिगत उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। चूहों में कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट के सह-इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। इस विधि का उपयोग फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति या अनुपस्थिति की तुलना करने के लिए किया जा सकता है, विभिन्न स्रोतों से फाइब्रोब्लास्ट की तुलना करने के लिए20, या विशिष्ट प्रोटीन19 की अभिव्यक्ति के साथ और बिना फाइब्रोब्लास्ट की तुलना करने के लिए। कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट पेश किए जाने के बाद, ट्यूमर के आकार की निगरानी समय के साथ की जा सकती है। प्रयोगों के अंत में, ट्यूमर को विच्छेदित और तौला जा सकता है। समय के साथ ट्यूमर के विकास की निगरानी करके, विभिन्न कारकों के महत्व को विच्छेदित किया जा सकता है।

ट्यूमर के विकास में फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका का अध्ययन करने के लिए संभावित वैकल्पिक दृष्टिकोण हैं। एक उदाहरण के रूप में, क्रे-लॉक्स्ड आधारित मॉडल हैं जो फाइब्रोब्लास्ट में अधिमान्य रूप से व्यक्त ड्राइवरों के साथ जीन के ऊतक-विशिष्ट नॉकआउट प्रदान करते हैं। इस तरह के दृष्टिकोण ट्यूमर की प्रगति के लिए फाइब्रोब्लास्ट में विशिष्ट जीन और मार्गों की भूमिका की जांच करने के अवसर भी प्रदान करते हैं। क्रे-लॉक्स-आधारित दृष्टिकोणों की तुलना में, प्रदान किया गया प्रोटोकॉल फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका की निगरानी के लिए काफी अधिक तेजी से दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करेगा क्योंकि ट्यूमर के विकास की निगरानी कुछ हफ्तों में की जाएगी। प्रदान किया गया दृष्टिकोण भी काफी कम खर्चीला है क्योंकि इसे आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों की कॉलोनियों को उत्पन्न करने और आवास की आवश्यकता नहीं है। प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग माउस कॉलोनियों को विकसित करने की आवश्यकता के बजाय एसएचआरएनए का उपयोग करके विभिन्न जीनों के वध के प्रभाव का तेजी से परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। प्रदान किया गया दृष्टिकोण भी अधिक लचीला है क्योंकि यह फाइब्रोब्लास्ट की विभिन्न संख्याओं, कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स के विभिन्न अनुपातों, विभिन्न जीनों के वध और यहां तक कि विभिन्न ऊतक साइटों या प्रजातियों से फाइब्रोब्लास्ट की तुलना की अनुमति देगा। क्रे-लॉक्स दृष्टिकोण का लाभ यह होगा कि फाइब्रोब्लास्ट अधिक शारीरिक संदर्भ में चूहों के भीतर मौजूद हैं।

यहां बताया गया प्रोटोकॉल उन वैज्ञानिकों के लिए मूल्यवान होगा जो ट्यूमर के विकास पर फाइब्रोब्लास्ट के प्रभावों की निगरानी करना चाहते हैं और प्रभावी ढंग से लागत करते हैं। यह प्रोटोकॉल ट्यूमर के विकास पर ट्यूमर के विकास पर विभिन्न स्रोतों से फाइब्रोब्लास्ट या फाइब्रोब्लास्ट के विभिन्न उपसमुच्चय की जांच करने वाले वैज्ञानिकों के लिए विशेष रूप से मूल्यवान है। यदि यह महत्वपूर्ण है कि ट्यूमर दीक्षा एक शारीरिक संदर्भ में होती है, तो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल पर विचार किया जाना चाहिए।

इन प्रयोगों को करने के लिए कई संभावित दृष्टिकोण हैं। प्रतिरक्षा-सक्षम चूहों को मेजबान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो फाइब्रोब्लास्ट-प्रतिरक्षा कोशिका इंटरैक्शन की जांच की अनुमति देगा। प्रतिरक्षा-सक्षम माउस मॉडल के लिए, माउस कैंसर कोशिकाओं और माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) को इंजेक्ट किया जाना चाहिए। एमईएफ का उपयोग अन्वेषक को रुचि के जीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का परीक्षण करने के लिए नॉकआउट माउस उपभेदों की विस्तृत श्रृंखला का लाभ उठाने की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, प्रतिरक्षा की कमी वाले चूहों का उपयोग चूहों में ट्यूमर के विकास को बढ़ावा देने में मानव फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है जो मानव कैंसर कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं। कैंसर कोशिकाओं का परिचय चमड़े के नीचे या ऑर्थोटोपिक रूप से किया जा सकता है। मेलेनोमा के लिए, जैसा कि नीचे वर्णित है, ट्यूमर-फाइब्रोब्लास्ट मिश्रण को ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के लिए इंट्राडर्मल रूप से इंजेक्ट किया जा सकता है जो त्वचा के भीतर उस स्थान को अधिक बारीकी से अनुकरण करता है जहां मेलेनोमा विकसित होगा।

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Protocol

वर्णित सभी प्रयोगों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स में पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

नोट: कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट का चयन करें जो माउस तनाव के लिए मेजबान चूहों से मेल खाते हैं। कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट का चयन करें जो मेजबान माउस के लिंग से मेल खाते हैं। प्रजनन कॉलोनियों से चूहों को प्राप्त करें या उन्हें प्रतिष्ठित विक्रेताओं से खरीदें। चूहों में ट्यूमर पेश करें जो ~ 8-10 सप्ताह की उम्र के हैं। फर वाले चूहे बाल कूप चक्र के टेलोजेन या आराम चरण में होंगे। कैंसर कोशिका के लिए 0.5 से 3 फाइब्रोब्लास्ट के अनुपात के लिए योजना बनाएं।

1. प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों की उचित संख्या निर्धारित करें

  1. अध्ययन करने से पहले, अध्ययन के लिए उपयोग करने के लिए चूहों की उचित संख्या निर्धारित करने के लिए एक शक्ति विश्लेषण करें। निर्दिष्ट शक्ति के साथ किसी प्रयोग के लिए नमूना आकार निर्धारित करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें:
    n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
    यदि α महत्व का चयनित स्तर है (आमतौर पर 0.05), तो 1-α/2 = 0.975 और Z = 1.960।
    β शक्ति है और यदि 80% शक्ति वांछित है, तो Z = 0.84 है।

    ईएस, प्रभाव आकार = \μ1-μ 0\/σ
    जहां परिकल्पना एच0 के तहत μ0 माध्य है, μ1 परिकल्पना एच1 के तहत माध्य है, और σ ब्याज22 के परिणाम का मानक विचलन है।
    नोट: नमूना आकार की गणना पर अधिक जानकारी22 पाया जा सकता है।

2. इंजेक्शन के लिए कैंसर कोशिकाओं को उत्पन्न करें

  1. निम्नलिखित समीकरण के साथ प्रासंगिक विकास दर निर्धारित करें:
    Gr = (ln (N(t)/N(0))/t

    नोट: 24 घंटे में दोगुनी होने वाली कोशिकाओं के लिए एक उदाहरण दिखाया गया है
    दोगुना होने का समय = एलएन (2)/विकास दर
    24 घंटे = एलएन (2)/वृद्धि दर
    24* विकास दर = .693
    विकास दर = .693/24 = .028875
  2. प्लेट करने के लिए कैंसर कोशिकाओं की संख्या और इंजेक्शन से पहले कोशिकाओं को विकसित करने की आवश्यकता की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: 0.25-1 मिलियन कैंसर कोशिकाओं को प्रत्येक ट्यूमर के लिए इंजेक्ट किया जाता है।
  3. समीकरण के अनुसार पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक दिनों की संख्या की गणना करें
    N(t)=N(0)egr*t
    जहां N(t) समय t पर कोशिकाओं की संख्या है, N(0) समय 0 पर कोशिकाओं की संख्या है, gr विकास दर है, और t समय है।
    नोट: 12 ट्यूमर में से प्रत्येक में 106 कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए 500,000 कोशिकाओं को बढ़ाने के लिए इन गणनाओं का एक उदाहरण। इन गणनाओं के आधार पर, कोशिकाओं की आवश्यक संख्या विकसित करने के लिए 5 दिन पर्याप्त हैं:
    N(t)=N(0)egr*t
    12 x 106 = 500,000e(gr*t)
    12 x 106 = 500,000e(.028875*t)
    24=e(.028875*x)
    ln(24)=0.028875x
    3.178=0.028875x
    X = 110 घंटे = 4.59 दिन
    कोशिकाओं को प्लेट से जुड़ने और संग्रह के दौरान खो जाने वाली कोशिकाओं के लिए अतिरिक्त समय दें।
  4. प्लेट कैंसर कोशिकाएं।
    नोट: सुसंस्कृत कोशिकाओं के साथ काम करते समय दस्ताने और लैब कोट पहनें।
    नोट: नमूनों में हवा से रोगाणुओं की शुरूआत को कम करने के लिए एक लामिनार प्रवाह हुड में सेल जोड़तोड़ करें। उपयोग करने से पहले पराबैंगनी प्रकाश के साथ ऊतक संवर्धन हुड का इलाज करें। बाँझ तकनीक और केवल बाँझ सेल कल्चर प्लास्टिकवेयर और उपभोग्य सामग्रियों जैसे ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेटों, पिपेट्स और शंक्वाकार ट्यूबों का उपयोग करें।
    1. शीशी में कोशिकाओं की संख्या और एक बार चढ़ाए जाने के बाद वांछित सेल एकाग्रता के आधार पर ऊतक संवर्धन प्लेटों की सही संख्या और आकार की गणना करें।
    2. ऊतक संवर्धन प्लेटों को लेबल करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के साथ एक पानी स्नान तैयार करें।
    4. एलिकोट माध्यम शंक्वाकार ट्यूबों में और 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें। कई कैंसर कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) में उगाया जा सकता है।
    5. तरल नाइट्रोजन फ्रीजर से जमे हुए कोशिकाओं की शीशियों की आवश्यक संख्या को हटा दें।
      नोट: तरल नाइट्रोजन फ्रीजर में कोशिकाओं को संभालते समय फ्रीजर दस्ताने का उपयोग करें।
    6. धीरे-धीरे हिलाते हुए पानी के स्नान में सेल शीशियों को जल्दी से पिघलाएं।
      नोट: बाँझपन बनाए रखने के लिए शीशियों को संभालते समय दस्ताने में इथेनॉल जोड़ें।
    7. एक टिशू कल्चर हुड में बाँझ तकनीक का उपयोग करके, कोशिकाओं को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पाइप करें जिसमें 10 एमएल डीएमईएम + 10% एफबीएस होता है।
    8. सेल मिश्रण को 5 मिनट के लिए 180 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    9. धीरे से बाँझ चूषण या बाँझ 10 एमएल पाइप के साथ सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    10. धीरे से गोली में कोशिकाओं को डीएमईएम + 10% एफबीएस के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें।
    11. पुन: निलंबित कोशिकाओं को बाँझ पी 1000 के साथ एक लेबल ऊतक संस्कृति प्लेट पर पाइप करें।
    12. बाँझ 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके, ऊतक संवर्धन प्लेटों में सीरम के साथ पाइप माध्यम।
    13. 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में टिशू कल्चर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  5. इंजेक्शन के लिए पर्याप्त कैंसर कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कैंसर कोशिकाओं का विस्तार करें।
    नोट: कंफ्लुएंसी के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ कोशिकाओं की निगरानी करें। कोशिकाओं को 100% संगम तक पहुंचने से रोकने के लिए हर दो से तीन दिनों में या आवश्यकतानुसार ट्रिप्सिनाइज करें। यदि बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, तो बड़ी संख्या में कोशिकाओं को अंतरिक्ष- और मध्यम-कुशल तरीके से विकसित करने के लिए हाइपरफ्लैस्क (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें। हर बार जब कोशिकाओं को पारित करने की आवश्यकता होती है, तो इस प्रक्रिया का पालन करें:
    1. बाँझ चूषण या बाँझ 10 एमएल पाइप के साथ प्लेट से माध्यम निकालें।
    2. गर्म फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) पर पाइपिंग करके प्लेट को धीरे से धोएं। फिर पीबीएस को बाँझ चूषण या पिपेट के साथ हटा दें।
    3. कोशिकाओं पर 10 सेमी प्लेट के लिए पीबीएस में 1 एक्स ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) का 5 एमएल पाइपेट 5 एमएल और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. प्लेट से कोशिकाओं को हटाने के लिए कोमल नल के साथ प्लेट से कोशिकाओं को हटा दें।
    5. बाँझ 10 एमएल पाइपेट का उपयोग करके, शंक्वाकार ट्यूबों में 10% एफबीएस सीरम के साथ कोशिकाओं को डीएमईएम में एकत्र करें।
    6. सेंट्रीफ्यूज शंक्वाकार ट्यूब 5 मिनट के लिए 180 x g पर।
    7. सुपरनैटेंट को डालकर निकालें। सेल गोली दिखाई देनी चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए इसे देखें कि यह ट्यूब में रहता है।
    8. 1 एमएल डीएमईएम + 10% एफबीएस जोड़कर और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके पेलेट कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    9. एलिकोट ने डीएमईएम + 10% एफबीएस (10 मिलीलीटर मीडिया 10 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेट के लिए उपयुक्त है) के साथ उपयुक्त आकार की नई ऊतक संस्कृति प्लेटों पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया।

3. इंजेक्शन के लिए फाइब्रोब्लास्ट उत्पन्न करें

नोट: प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट बहुत अधिक दोहरीकरण / मार्ग के बाद कमजोर हो जाएंगे। सीमित संख्या में मार्ग या दोहरीकरण के बाद प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। मार्गों की संख्या या दोगुनी का ट्रैक रखें जो फाइब्रोब्लास्ट माउस या मानव त्वचा से बढ़े हैं। प्राथमिक मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के लिए 15 से कम मार्ग वाले फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करें। माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट के लिए 9 से कम मार्ग वाले फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करें। फाइब्रोब्लास्ट ्स को बदल दिया जाता है जब वे कॉन्फ्लुएंट हो जाते हैं। ट्रिप्सिनाइज फाइब्रोब्लास्ट ्स को तब करता है जब वे लगभग 90% कॉन्फ्लुएंट होते हैं। फाइब्रोब्लास्ट्स में अलग-अलग गुण होंगे जो इस बात पर निर्भर करता है कि वे कैसे सुसंस्कृत हैं। कई वैज्ञानिक ऊतक संवर्धन प्लेटों जैसे 3 डी कोलेजन मैट्रिसेस की तुलना में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक सब्सट्रेट्स पर संवर्धन को बढ़ावा देते हैं जो ऊतक जैसे वातावरण 23,24,25 को अधिक प्रभावी ढंग से कैप्चर करते हैं।

  1. फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के लिए विकास दर निर्धारित करने के लिए खंड 2.1 में समीकरण का उपयोग करें।
  2. फाइब्रोब्लास्ट्स का विस्तार करने के लिए आवश्यक दिनों की संख्या निर्धारित करने के लिए खंड 2.2 में समीकरण का उपयोग करें।
  3. उचित दिन पर उचित माध्यम का उपयोग करके खंड 2.3 में वर्णित फाइब्रोब्लास्ट्स को प्लेट करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कैंसर कोशिकाएं और फाइब्रोब्लास्ट उसी दिन इंजेक्शन के लिए तैयार होंगे।
  4. खंड 2.4 में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद आवश्यक फाइब्रोब्लास्ट की पर्याप्त संख्या उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त माध्यम में फाइब्रोब्लास्ट का विस्तार करें।

4. इंजेक्शन के लिए चूहों को तैयार करने के लिए शेव चूहों

नोट: चूहों के साथ काम करते समय लैब कोट, हेयर नेट, जूते के कवर और दस्ताने पहनें।

  1. इंजेक्शन से एक से दो दिन पहले, संस्थागत पशु देखभाल समिति के नियमों के अनुसार, चूहों को एनेस्थेटाइज करें। यदि संज्ञाहरण के लिए आइसोफ्लुरेन का उपयोग कर रहे हैं, तो आइसोफ्लुरेन और ओ2 के मिश्रण का उपयोग करें। चूहों को संज्ञाहरण कक्ष में रखें और संज्ञाहरण को प्रेरित करने के लिए एक आइसोफ्लुरेन (5%)/ फिर, आइसोफ्लुरेन (2%)/ओ2 मिश्रण के निरंतर प्रवाह के साथ संज्ञाहरण के सर्जिकल प्लेन को बनाए रखने के लिए एनेस्थेटाइज्ड जानवर पर नाक शंकु रखें।
  2. यह सुनिश्चित करने के लिए जानवरों की जांच करें कि वे माउस के पैर की अंगुली को चुटकी मारकर संज्ञाहरण के उपयुक्त सर्जिकल प्लेन में हैं और माउस नहीं हिलता है।
  3. सर्जिकल ब्लेड # 40 के साथ एक पशु क्लिपर का उपयोग करके, धीरे से फर को चूहों के फ्लैंक पर उपयुक्त स्थिति से हटा दें, जब तक कि फर को हटा नहीं दिया जाता है।
  4. चूहों की निगरानी करें जब तक कि वे संज्ञाहरण से ठीक न हो जाएं।

5. इंजेक्शन के लिए कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट तैयार करें

नोट: कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट को संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके इंजेक्शन दिया जाना चाहिए, अधिमानतः 30 मिनट के भीतर। इंजेक्शन की सुबह, ऊतक संवर्धन प्लेटों से अलग-अलग कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट की कटाई करें। प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए निम्न चरणों का पालन करें:

  1. कोमल बाँझ चूषण के साथ या माध्यम से पाइपिंग करके ऊतक संवर्धन प्लेट से माध्यम को हटा दें।
  2. कोशिकाओं को बाधित किए बिना पीबीएस के 5 एमएल पर धीरे से पाइप करें। पीबीएस को घुमाएं। धीरे-धीरे पीबीएस को सक्शन या पिपेट के साथ पीबीएस से अलग करें।
  3. धीरे से पीबीएस में ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 5 एमएल को कोशिकाओं की परत पर डालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. कोशिकाओं को हटाने के लिए कोमल नल के साथ प्लेट से कोशिकाओं को हटा दें। कोशिकाओं को 10 एमएल पिपेट के साथ कई बार पाइप करें और कोशिकाओं को 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम युक्त शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. शंक्वाकार ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 180 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. सेल पेलेट को बनाए रखते हुए, धीरे से डालकर सुपरनैटेंट को हटा दें। सेल पेलेट को पीबीएस के साथ दो बार धोएं। हर बार, कोशिकाओं पर पीबीएस के 10 एमएल पाइप करें। धीरे से पी 1000 पिपेट के साथ मिलाएं।
  7. चरण 5.5 में कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। धीरे से पीबीएस को पिपेट के साथ हटा दें और दोहराएं।
  8. पीबीएस के 1 एमएल में धुली हुई, पेलेट कोशिकाओं को पी 1000 के साथ पुन: निलंबित करें।
  9. अल्कोहल और सूखा के साथ एक हेमोसाइटोमीटर स्लाइड साफ करें।
  10. एक ट्यूब में सेल मिश्रण के 100 μL पाइप करें और 0.32% की अंतिम ट्रिपैन ब्लू एकाग्रता के लिए 0.4% ट्रिपैन ब्लू का 400 μL जोड़ें।
  11. कक्ष के भरे होने तक सेल मिश्रण को पाइप करके कवरस्लिप के नीचे ग्लास हेमोसाइटोमीटर के कक्षों को धीरे से भरें।
  12. माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, 10x उद्देश्य की ग्रिड लाइनों पर ध्यान केंद्रित करें।
  13. 16 वर्गों के एक सेट में जीवित, बिना दाग वाली कोशिकाओं और नीली कोशिकाओं की गणना करें।
  14. 16 वर्गों के सभी 4 सेटों की गणना करें।
  15. 16 वर्गों के 4 सेटों से स्पष्ट और नीली कोशिकाओं के लिए सेल गिनती का औसत निकालें और 10,000 से गुणा करें। ट्रिपैन नीले रंग से 1: 5 कमजोर पड़ने के लिए 5 से गुणा करें।
  16. अंतिम गणना व्यवहार्य और मृत कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं / एमएल में एकाग्रता है। कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए मात्रा से गुणा करें। पुष्टि करें कि व्यवहार्य कोशिकाओं का अंश >80% है।
  17. पुष्टि करें कि नियोजित सभी इंजेक्शनों के लिए मेलेनोमा कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स की पर्याप्त संख्या है, इंजेक्शन के दौरान नमूने का कम से कम 20% नुकसान मानते हुए।
  18. कोशिकाओं की आवश्यक संख्या को एक नए शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेंट्रीफ्यूजेशन (5 मिनट के लिए 180 x g) द्वारा कोशिकाओं को गोली मार दें।
  19. 10 एमएल पाइप के साथ सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  20. संयुक्त राज्य अमेरिका फार्माकोपिया (यूएसपी) ग्रेड पीबीएस (इंट्राडर्मल इंजेक्शन के लिए 50 μL प्रति ट्यूमर और चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए 100 μL प्रति ट्यूमर) की उचित मात्रा में आवश्यक एकाग्रता पर गोली को पुन: निलंबित करें।

6. चूहों में कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट को इंजेक्ट करें

नोट: यदि संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया जाता है, तो प्रत्येक माउस में दो ट्यूमर इंजेक्ट करें, प्रत्येक फ्लैंक पर एक। यादृच्छिक रूप से बताएं कि कौन सा माउस दाएं और बाएं फ्लैंक पर कौन सा इंजेक्शन प्राप्त करेगा। इंजेक्शन के लिए चूहों की संख्या के आधार पर, चूहों को एनेस्थेटाइज करें और बैचों में चूहों में कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट को इंजेक्ट करें।

  1. कैंसर कोशिकाओं के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए
    1. खंड 4.1 में वर्णित चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
    2. शराब के स्वैब से कटी हुई त्वचा को पोंछ लें।
    3. कोशिकाओं या सेल मिश्रण की वांछित मात्रा के साथ एक बाँझ सिरिंज भरें और सिरिंज को 27-गेज सुई से कैप करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं। बुलबुले को हटाने के लिए आवश्यकतानुसार सिरिंज को फ्लिक करें। एक बार जब कोशिकाओं को सिरिंज में पेश किया जाता है, तो झुरमुट को रोकने के लिए सिरिंज को लगातार उलटकर सिरिंज के भीतर कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिश्रित रखें।
    4. माउस के फ्लैंक पर चमड़े के नीचे के क्षेत्र में सुई डालें और धीरे से कोशिकाओं को माउस में इंजेक्ट करें। चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए प्रति ट्यूमर 100 μL सेल निलंबन का उपयोग करें (प्रति इंजेक्शन 100 μL से अधिक मात्रा का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है)।
    5. चूहों की निगरानी करें जब तक कि वे संज्ञाहरण से ठीक न हो जाएं। यदि आवश्यक हो, तो चूहों को झोपड़ियों और / या हीटिंग पैड जैसी अतिरिक्त इन्सुलेट सामग्री प्रदान करें ताकि चूहों को पूरी तरह से ठीक होने में मदद मिल सके।
  2. कैंसर कोशिकाओं के इंट्राडर्मल इंजेक्शन के लिए
    1. खंड 4.1 में वर्णित चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
    2. शराब के स्वैब से कटी हुई त्वचा को पोंछ लें।
    3. कोशिकाओं या सेल मिश्रण की वांछित मात्रा के साथ एक बाँझ सिरिंज भरें और सिरिंज को 27-गेज सुई से कैप करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं। बुलबुले को हटाने के लिए आवश्यकतानुसार सिरिंज को फ्लिक करें। एक बार जब कोशिकाओं को सिरिंज में पेश किया जाता है, तो झुरमुट को रोकने के लिए सिरिंज को लगातार उलटकर सिरिंज के भीतर कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिश्रित रखें।
    4. माउस के फ्लैंक पर त्वचा के इंट्राडर्मल क्षेत्र में एक 27-गेज सुई डालें और धीरे से कोशिकाओं को माउस में इंट्राडर्मल क्षेत्र में इंजेक्ट करें। इंट्राडर्मल इंजेक्शन के लिए प्रति ट्यूमर 50 μL सेल सस्पेंशन का उपयोग करें (प्रति इंजेक्शन 50 μL से अधिक मात्रा का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है)।
    5. चूहों की निगरानी करें जब तक कि वे संज्ञाहरण से ठीक न हो जाएं। यदि संकेत हैं कि चूहे संकट में हैं, तो पशु चिकित्सक से परामर्श करें। यदि आवश्यक हो, तो चूहों को झोपड़ियों और / या हीटिंग पैड जैसी अतिरिक्त इन्सुलेट सामग्री प्रदान करें ताकि चूहों को पूरी तरह से ठीक होने में मदद मिल सके।

7. ट्यूमर के विकास के दौरान चूहों की निगरानी करें

  1. दर्द या संकट के किसी भी संकेत के लिए रोजाना चूहों की निगरानी करें (झुकी हुई मुद्रा, कराहना, मुखर होना, पिंजरे के साथ खींचना, पिंजरे के फर्श के नीचे अपने पेट को दबाना, या पिंजरे के चारों ओर घूमने की अनिच्छा) या फोड़ा गठन। यदि संकेत हैं कि चूहे संकट में हैं, तो पशु चिकित्सक से परामर्श करें।
  2. एक बार ट्यूमर बनने के बाद, लगभग हर दो से तीन दिनों में ट्यूमर की मात्रा को मापें। कैलिपर्स के साथ ट्यूमर की लंबाई (सबसे लंबी तरफ) और चौड़ाई (लंबाई के लंबवत) को मापें।
    नोट: डेटा में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए प्रयोग के दौरान इन मापों को करने के लिए एक ही व्यक्ति के लिए सर्वोत्तम अभ्यास हैं। माप के लिए, खंड 4.1 में वर्णित चूहों को एनेस्थेटाइज करें
  3. सूत्र वॉल्यूम = 0.5 x (लंबाई x चौड़ाई 2) के साथ ट्यूमर वॉल्यूमकी गणना करें।

8. ट्यूमर की कटाई करें और ट्यूमर वजन को मापें

  1. चूहों को इच्छामृत्यु दें जब ट्यूमर की वृद्धि पशु देखभाल पर संस्था समिति द्वारा स्थापित एक प्रयोगात्मक समापन बिंदु तक पहुंच जाती है। चूहों को एक कक्ष में रखें और श्वसन की समाप्ति के बाद एक मिनट के लिए संपीड़ित सीओ 2 के साथ कक्ष की हवा के धीमे (20-30% प्रति मिनट) विस्थापन के साथ उन्हें इच्छामृत्यु दें।
  2. चूहों पर ग्रीवा अव्यवस्था करें। कृंतक को एक दृढ़, सपाट सतह पर रोकें। खोपड़ी के आधार पर गर्दन के पीछे एक मजबूत कलम या किसी अन्य वस्तु को रखें। पूंछ के आधार को पकड़ने वाले हाथ से पीछे की ओर खींचते हुए सिर को नियंत्रित करने वाली वस्तु के साथ जल्दी से आगे और नीचे धक्का दें। धड़कन के साथ पुष्टि करें कि रीढ़ की हड्डी कटी हुई है।
    नोट: सर्वाइकल डिस्लोकेशन अनुभवी प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा किया जाना चाहिए।
  3. प्रयोग में प्रत्येक माउस के लिए, पुष्टि करें कि माउस अब जीवित नहीं है, यह जांचकर कि कोई सांस नहीं है, कोई दिल की धड़कन नहीं है और पैर की अंगुली की चुटकी के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं है।
  4. एक बाँझ स्केलपेल और सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, माउस से पूरे ट्यूमर का उत्पादन करें। सर्जिकल कैंची के साथ, ट्यूमर से गैर-ट्यूमर ऊतक को ट्रिम करें।
  5. एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर ट्यूमर का वजन करें और ट्यूमर के वजन को रिकॉर्ड करें।

9. ट्यूमर की मात्रा और ट्यूमर वजन का सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. विचरण (एनोवा) के बार-बार माप विश्लेषण के साथ प्रत्येक समूह में समय के साथ ट्यूमर की मात्रा की तुलना करें। युग्मित विश्लेषण करें यदि प्रति माउस दो ट्यूमर इंजेक्ट किए गए थे।
  2. दो पूंछ वाले परीक्षण का उपयोग करके एनोवा के साथ समूहों के बीच ट्यूमर वजन की तुलना करें। तुकी के पोस्ट-हॉक परीक्षण का उपयोग तब यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि कौन से समूह एक दूसरे से काफी भिन्न हैं। युग्मित विश्लेषण करें यदि प्रति माउस दो ट्यूमर इंजेक्ट किए गए थे।

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Representative Results

ए 2058 मानव मेलेनोमा कोशिकाओं और प्राथमिक मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट को बाँझ परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया गया था। कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार एकत्र और धोया गया था। इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों (एनयू / जे - फॉक्सएन 1 नग्न तनाव) को अकेले 0.25 मिलियन ए 2058 मेलेनोमा कोशिकाओं के साथ एक फ्लैंक पर चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया था। दूसरे फ्लैंक पर, चूहों को 0.25 मिलियन ए 2058 मेलेनोमा कोशिकाओं और 0.75 मिलियन फाइब्रोब्लास्ट के मिश्रण के साथ इंजेक्ट किया गया था। कोशिकाओं को 12 प्रतिरक्षा-कमी वाले चूहों में इंजेक्ट किया गया था। बाएं और दाएं फ्लैंक में इंजेक्शन यादृच्छिक थे। इंजेक्शन के बाद 12, 14, 16, 19 और 21 दिनों में ट्यूमर की मात्रा की निगरानी की गई (चित्रा 1 ए)। इच्छामृत्यु पर, ट्यूमर को उत्पादित किया गया, चित्रित किया गया (चित्रा 1 बी) और वजन किया गया (चित्रा 1 सी)। फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति के परिणामस्वरूप काफी बड़े ट्यूमर होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: सह-इंजेक्शन फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति और अनुपस्थिति में मेलेनोमा वृद्धि की तुलना। मेलेनोमा कोशिकाओं को प्राथमिक त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के साथ या बिना नग्न चूहों में पेश किया गया था। (ए) सह-इंजेक्शन फाइब्रोब्लास्ट के साथ और बिना मेलेनोमा के लिए समय के साथ ट्यूमर की मात्रा का प्लॉट। वॉल्यूम की गणना 0.5 * लंबाई * चौड़ाई2 के रूप में की गई थी। माध्य (SEM) के माध्य आयतन और मानक त्रुटि प्लॉट किए गए हैं। महत्व निर्धारित करने के लिए एनोवा का प्रदर्शन किया गया था। (बी) उत्पादित ट्यूमर की छवियां। (सी) 21 वें दिन प्रयोग के अंत में ट्यूमर का अंतिम वजन। माध्य भार और एसईएम प्लॉट किए गए हैं। अंतिम वजन की तुलना करने के लिए एक अप्रकाशित, दो पूंछ वाले टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। * p < 0.05 इंगित करता है, *** p < 0.001 को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

चित्रा 1 में प्रयोग में, मानव ए 2058 मेलेनोमा कोशिकाओं के साथ मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट को सह-पेश करने के परिणामस्वरूप मेलेनोमा कोशिकाओं को सह-इंजेक्शन फाइब्रोब्लास्ट के बिना पेश किए जाने की तुलना में बड़े ट्यूमर हुए। ट्यूमर की मात्रा और ट्यूमर के वजन के आधार पर इस अंतर का आसानी से पता लगाया जा सकता है। परिणाम कई रिपोर्टों के अनुरूप हैं कि कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट ट्यूमर के विकास को बढ़ावा दे सकते हैं 5,6,7,8। ट्यूमर की मात्रा और ट्यूमर के वजन जैसे यहां चर्चा किए गए समापन बिंदुओं के अलावा, अतिरिक्त समापन बिंदुओं की भी निगरानी की जा सकती है। अतिरिक्त विश्लेषण भी संभव हैं। उदाहरण के लिए, विकसित होने वाले ट्यूमर को निर्धारण के लिए फॉर्मेलिन में एकत्र किया जा सकता है, पैराफिन-एम्बेडेड और हिस्टोलॉजी के लिए हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, विकसित ट्यूमर को विशिष्ट प्रोटीन के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ आगे के विश्लेषण के लिए इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) में एकत्र किया जा सकता है।

इन प्रयोगों की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि कैंसर कोशिकाओं के साथ सह-इंजेक्शन वाले फाइब्रोब्लास्ट कुछ कोशिका विभाजनों के बाद जीर्ण हो सकते हैं या मर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, सह-इंजेक्शन फाइब्रोब्लास्ट ट्यूमर से दूर पलायन कर सकते हैं, इस मामले में, वे ट्यूमर के विकास को प्रभावित नहीं कर सकते हैं। यदि फाइब्रोब्लास्ट ्स ट्यूमर से अलग हो जाते हैं, मर जाते हैं या दूर चले जाते हैं, तो वे समय के साथ कम प्रचुर मात्रा में हो जाएंगे और सह-पेश किए गए फाइब्रोब्लास्ट का प्रभाव ट्यूमर के विकास के लिए कम महत्वपूर्ण हो जाएगा। दरअसल, पेश किए गए कैंसर कोशिकाओं को मेजबान से अतिरिक्त फाइब्रोब्लास्ट की भर्ती करने की उम्मीद है। उन प्रयोगों के लिए जिनमें एक विशिष्ट जीन को पेश किए गए फाइब्रोब्लास्ट्स में गिरा दिया जाता है या बाहर कर दिया जाता है, समय के साथ, एन्कोडेड प्रोटीन को व्यक्त करने वाले मेजबान फाइब्रोब्लास्ट की भर्ती से किसी भी फेनोटाइप को कम करने की उम्मीद की जाएगी। पेश किए गए फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति की निगरानी करने के लिए, फाइब्रोब्लास्ट को आनुवंशिक रूप से जीएफपी26,27 जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है। यदि फाइब्रोब्लास्ट जीएफपी व्यक्त करते हैं, तो फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग फाइब्रोब्लास्ट की संख्या की निगरानी के लिए किया जा सकता है जो पेश किए जाने के बाद अलग-अलग दिनों में ट्यूमर के भीतर मौजूद होते हैं। एक विकल्प के रूप में, ल्यूसिफेरस एंजाइम को फाइब्रोब्लास्ट्स में पेश किया जा सकता है और बायोलुमिनेसेंस इमेजिंग का उपयोग समय के साथ चूहों में फाइब्रोब्लास्ट की मात्रा की निगरानी के लिए किया जा सकता है। यदि फाइब्रोब्लास्ट ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट से तेजी से समाप्त हो जाते हैं, तो क्रे-लॉक्स आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल इस चिंता को संबोधित करेंगे और वर्णित अध्ययनों के पूरक होंगे।

यदि प्रयोगों को नग्न चूहों में मानव कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट ्स को पेश करके किया जाता है, तो सीमित प्रतिरक्षा प्रणाली के परिणामों पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ने की उम्मीद है। एथिमिक नग्न चूहों (एनयू / जे) में टी कोशिकाओं की कमी होती है और इसलिए कोशिका-मध्यस्थता प्रतिरक्षा की कमी होती है। उनके पास बी सेल विकास में आंशिक दोष भी है। सेल मध्यस्थता प्रतिरक्षा, जो सक्रिय सीडी 8 + टी कोशिकाओं के माध्यम से कोशिकाओं की हत्या है, ट्यूमर के विकास के दमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है 28,29. हाल के अध्ययनों में, कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट और सीडी 8 + टी कोशिकाओं के बीच परस्पर क्रिया 30,31,32 बताई गई है। एक प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ चूहों में माउस कैंसर कोशिकाओं और माउस फाइब्रोब्लास्ट को पेश करना एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में माना जा सकता है जो इस मुद्दे को संबोधित करेगा।

एक अन्य वैकल्पिक दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल का उपयोग करना है जिसमें क्रे-लॉक्स प्रणाली का उपयोग मेजबान फाइब्रोब्लास्ट में विशिष्ट प्रोटीन के स्तर या गतिविधि को संशोधित करने के लिए किया जाता है। ऐसा ही एक दृष्टिकोण एफएसपी 1, कोल 1 ए 1, कोल 1 ए 2, या पीडीजीएफआरए33,34,35 जैसे ड्राइवरों के साथ फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध क्रे-लॉक्स मॉडल का उपयोग करना है। एक क्रे / लॉक्स रिकोम्बिनेस मॉडल के साथ, इस बात की चिंता नहीं होगी कि इंजेक्शन वाले फाइब्रोब्लास्ट मर जाएंगे या ट्यूमर से दूर चले जाएंगे।

प्रोटोकॉल में कुछ कदम हैं जो इसकी सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। फाइब्रोब्लास्ट्स की वृद्धि प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है और परिणाम में महत्वपूर्ण योगदान देने की संभावना है। प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट आसानी से जीर्ण हो जाते हैं, और मार्ग या दोहरीकरण की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि फाइब्रोब्लास्ट घातीय विकास चरण में हैं और जीर्ण नहीं हुए हैं। सेनेसेंट फाइब्रोब्लास्ट्स से साइटोकिन्स के उच्च स्तर का स्राव होने की उम्मीद है जो ट्यूमर के विकास पर नाटकीय प्रभाव डाल सकता है 36,37,38. नतीजतन यह उच्च महत्व का है कि मार्ग संख्या को सावधानीपूर्वक प्रलेखित किया जाता है और यह कि इंजेक्ट किए गए फाइब्रोब्लास्ट ्स तब तक संवेदनशील नहीं होते हैं जब तक कि प्रोटोकॉल सेनेसेंट फाइब्रोब्लास्ट के विश्लेषण के लिए नहीं कहता है।

जब फाइब्रोब्लास्ट ्स कॉन्फ्लुएंट हो जाते हैं, तो उन्हें बड़ी संख्या में परिवर्तनों से गुजरने की उम्मीद की जा सकती है, जिनमें से कुछ संभवतः उलट हो जाएंगे जब वे सेल चक्र 39,40,41,42,43,44 में फिर से प्रवेश करते हैं। फाइब्रोब्लास्ट्स को प्रोलिफेरेटिव अवस्था में बनाए रखना और 90% कॉन्फ्लुएंट होने पर उन्हें विभाजित करना यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि अध्ययन यथासंभव सुसंगत हैं। ऊतक संवर्धन प्लेटों पर फाइब्रोब्लास्ट ्स की खेती भी उनके व्यवहार को प्रभावित करती है और 3 डी कोलेजन मैट्रिसेस जैसेविकल्पों को 23,24,25 माना जाना चाहिए। 3 डी मैट्रिसेस में संवर्धित फाइब्रोब्लास्ट ्स 2 डी सतहों 45,46,47,48,49 पर उगाए गए फाइब्रोब्लास्ट की तुलना में काफी अलग माइग्रेशन पैटर्न दिखाते हैं, जो ट्यूमर में पेश किए जाने पर उनकी ट्यूमर को बढ़ावा देने की क्षमता को प्रभावित करेंगे, जहां फाइब्रोब्लास्ट ट्यूमर बाह्य मैट्रिक्स माइक्रोएन्वायरमेंट50 को स्थापित करने में सक्रिय भूमिका निभाएंगे।

इंट्राडर्मल इंजेक्शन के माध्यम से माउस में मेलेनोमा कोशिकाओं को इंजेक्ट करने से चमड़े के नीचे इंजेक्शन की तुलना में अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ट्यूमर की वृद्धि हो सकती है। यह एक मुश्किल कदम है क्योंकि इंट्राडर्मल क्षेत्र में बहुत कम जगह है। सुई को सावधानीपूर्वक रखना महत्वपूर्ण है। यदि इंट्राडर्मल इंजेक्शन किए जाते हैं, तो केवल 50 μL समाधान इंजेक्ट किया जाता है। अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए भी, ये इंजेक्शन लीक हो सकते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि क्या प्रत्येक इंजेक्शन लीक हुआ था ताकि, यदि कोई ट्यूमर नहीं बनता है, तो इसे अंतिम विश्लेषण से समाप्त किया जा सके।

इंजेक्शन के लिए सिरिंज तैयार करना एक और महत्वपूर्ण कदम है। सिरिंज से सभी बुलबुले को हटाना महत्वपूर्ण है, जिसे बुलबुले को खत्म करने के लिए सिरिंज को फ्लिक करने की आवश्यकता हो सकती है। यह भी महत्वपूर्ण है कि कोशिकाएं झुरमुट न करें। झुरमुट को रोकने के लिए सिरिंज को बार-बार उलटा करें।

इन प्रयोगों का एक और मुश्किल पहलू यह है कि ट्यूमर की मात्रा को मापना एक व्यक्ति से दूसरे व्यक्ति में परिवर्तनशील हो सकता है। ट्यूमर की मात्रा माप में परिवर्तनशीलता को सीमित करने के लिए, एक प्रयोग के दौरान सभी चूहों में और सभी समय बिंदुओं पर सभी ट्यूमर वॉल्यूम माप लेने के लिए एक एकल प्रयोगशाला सदस्य को जिम्मेदारी सौंपना सहायक होता है।

जब भी संभव हो मेजबान माउस के समान लिंग से कैंसर कोशिकाओं के साथ चूहों को इंजेक्ट करना बेहतर होता है। दोनों लिंगों का उपयोग करना और एनोवा मॉडल में एक चर के रूप में सेक्स को शामिल करना संभव है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि सेक्स समय के साथ ट्यूमर के आकार को प्रभावित करता है या नहीं।

ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को समझना ट्यूमरजेनिसिस में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। प्रोटोकॉल फाइब्रोब्लास्ट, विभिन्न प्रकार के फाइब्रोब्लास्ट और फाइब्रोब्लास्ट के भीतर विभिन्न मार्गों की भूमिका को समझने के लिए एक आधार प्रदान कर सकता है जो ट्यूमर के विकास को प्रभावित कर सकते हैं। इन प्रयोगों के निष्कर्ष नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान कर सकते हैं जो फाइब्रोब्लास्ट कोट्यूमर के विकास को बढ़ावा देने से रोकेंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक सहायक इनपुट के लिए कोलर प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं। एच.ए.सी. रीता एलन फाउंडेशन के मिल्टन ई. कैसल विद्वान थे। हम एनआईएच /एनसीआई 1 आर01 सीए 221296-01 ए 1, एनआईएच 1 आर 01 एआर 070245-01 ए 1, मेलेनोमा रिसर्च एलायंस टीम साइंस अवार्ड, कैंसर रिसर्च इंस्टीट्यूट क्लिनिकल लेबोरेटरी इंटीग्रेशन प्रोग्राम अवार्ड, आईरिस कैंटर महिला स्वास्थ्य केंद्र / यूसीएलए सीटीएसआई एनआईएच ग्रांट यूएल 1टीआर 000124, कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय कैंसर अनुसंधान समन्वय समिति, डेविड गेफेन स्कूल ऑफ मेडिसिन मेटाबोलिज्म अवार्ड, क्लिनिकल ट्रांसलेशनल साइंस इंस्टीट्यूट और जॉन्सन कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर को स्वीकार करते हैं। ब्रॉड स्टेम सेल रिसर्च सेंटर (रोज हिल्स और हा गाबा) से नवाचार पुरस्कार, प्रोस्टेट कैंसर में यूसीएलए एसपीओआर (पुरस्कार संख्या पी 50सीए092131 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान) से एक पुरस्कार, ब्रॉड स्टेम सेल सेंटर, एली और एडिथ ब्रॉड सेंटर ऑफ रीजनरेटिव मेडिसिन एंड स्टेम सेल रिसर्च से एक नवाचार पुरस्कार, यूसीएलए में पुनर्योजी चिकित्सा और स्टेम सेल अनुसंधान के एली और एडिथ ब्रॉड सेंटर, ट्यूमर सेल बायोलॉजी ट्रेनिंग प्रोग्राम (यूएसएचएचएस रूथ एल किर्शस्टीन संस्थागत राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार # टी 32 सीए 009056), यूसीएलए एआर 071307 में त्वचाविज्ञान टी 32 कार्यक्रम, और यूसीएलए मांसपेशी कोशिका जीव विज्ञान, पैथोफिज़ियोलॉजी और चिकित्सीय टी 32 प्रशिक्षण कार्यक्रम 5 टी 32 एएफ 65972।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228

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