Summary
Een protocol om kankercellen en fibroblasten samen te injecteren en de tumorgroei in de loop van de tijd te volgen, wordt verstrekt. Dit protocol kan worden gebruikt om de moleculaire basis voor de rol van fibroblasten als regulatoren van tumorgroei te begrijpen.
Abstract
Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) kunnen een belangrijke rol spelen in tumorgroei door het creëren van een tumorbevorderende micro-omgeving. Modellen om de rol van CAFs in de tumormicro-omgeving te bestuderen, kunnen nuttig zijn voor het begrijpen van het functionele belang van fibroblasten, fibroblasten uit verschillende weefsels en specifieke genetische factoren in fibroblasten. Muismodellen zijn essentieel voor het begrijpen van de bijdragen aan tumorgroei en -progressie in een in vivo context. Hier wordt een protocol gegeven waarin kankercellen worden gemengd met fibroblasten en in muizen worden geïntroduceerd om tumoren te ontwikkelen. Tumorgroottes in de loop van de tijd en uiteindelijke tumorgewichten worden bepaald en vergeleken tussen groepen. Het beschreven protocol kan meer inzicht geven in de functionele rol van CAFs in tumorgroei en -progressie.
Introduction
Binnen de micro-omgeving van de tumor is een van de meest prominente celtypen de kanker-geassocieerde fibroblast (CAF)1. Deze carcinoom-geassocieerde fibroblasten kunnen een tumoronderdrukkende rol spelen 2,3. S100A-tot expressie brengende fibroblasten scheiden bijvoorbeeld collageen af die kankerverwekkende stoffen kunnen inkapselen en beschermen tegen carcinoomvorming4. Verder veroorzaakt uitputting van α-gladde spieractine (SMA)-positieve myofibroblasten bij alvleesklierkanker immunosuppressie en versnelt de progressie van alvleesklierkanker2. CAFs kunnen ook co-evolueren met kankercellen en tumorprogressie bevorderen 5,6,7,8. Fibroblasten kunnen extracellulaire matrixeiwitten synthetiseren en afscheiden die een tumorbevorderende omgeving creëren8. Deze extracellulaire matrixeiwitten kunnen mechanische verstijving van het weefsel veroorzaken, wat geassocieerd is met tumorprogressie 9,10. De afgezette extracellulaire matrix kan fungeren als een fysieke barrière die immuuninfiltratie remt11. Matrixafzetting door CAFs is ook in verband gebracht met tumorinvasie, omdat is aangetoond dat fibronectine gegenereerd door CAFs tumorinvasie bevordert12. CAFs bevorderen angiogenese en rekruteren immunosuppressieve cellen naar de micro-omgeving van de tumor door het scheiden van transformerende groeifactor-β (TGF-β), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), interleukine-6 (IL-6) en CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12) 13,14,15. Vanwege hun centrale rol bij het bevorderen van tumorgroei, zijn kanker-geassocieerde fibroblasten een opkomend doelwit voor anti-kankertherapie 6,16,17,18.
Het onderstaande protocol beschrijft een methode om te testen hoe fibroblasten de groei van tumoren beïnvloeden in een goed ingeburgerd en veelgebruikt muismodel van tumorgroei. Om het belang van fibroblasten in de micro-omgeving van de tumor te begrijpen, werd het standaardprotocol voor het introduceren van kankercellen in muizen om hun groei te volgen aangepast om fibroblasten op te nemen met de introductie van kankercellen. De kankercellen kunnen subcutaan of intradermaal worden ingebracht. Intradermale introductie zou resulteren in tumoren die ontstaan uit de huid zelf. Xenografts waarin kankercellen en fibroblasten samen in muizen worden geïnjecteerd, vormen een belangrijk methodologisch hulpmiddel voor het ontleden van de rol van fibroblasten, subpopulaties van fibroblasten en eiwitfactoren in het vermogen om kankergroei te bevorderen 19,20,21. Een gedetailleerd protocol voor co-injectie van kankercellen en fibroblasten in muizen wordt verstrekt. Deze methode kan worden gebruikt om de aan- of afwezigheid van fibroblasten te vergelijken, om fibroblasten uit verschillende bronnen te vergelijken20, of om fibroblasten te vergelijken met en zonder expressie van specifieke eiwitten19. Nadat de kankercellen en fibroblasten zijn geïntroduceerd, kan de tumorgrootte in de loop van de tijd worden gecontroleerd. Aan het einde van de experimenten kunnen tumoren worden ontleed en gewogen. Door de tumorgroei in de loop van de tijd te volgen, kan het belang van verschillende factoren worden ontleed.
Er zijn alternatieve benaderingen mogelijk voor het bestuderen van de rol van fibroblasten in tumorgroei. Als voorbeeld zijn er op Cre-loxed gebaseerde modellen die voorzien in weefselspecifieke knock-out van genen met drivers die bij voorkeur tot expressie komen in fibroblasten. Dergelijke benaderingen bieden ook mogelijkheden om de rol van specifieke genen en routes in fibroblasten voor tumorprogressie te onderzoeken. In vergelijking met op Cre-lox gebaseerde benaderingen, zou het verstrekte protocol een aanzienlijk snellere benadering vertegenwoordigen voor het monitoren van de rol van fibroblasten, omdat tumorgroei gedurende slechts enkele weken zou worden gevolgd. De geboden aanpak is ook aanzienlijk goedkoper omdat het niet nodig is om kolonies van genetisch gemanipuleerde muizen te genereren en te huisvesten. Het verstrekte protocol kan worden gebruikt om snel het effect van knockdown van verschillende genen te testen met behulp van shRNA's in plaats van muizenkolonies te moeten ontwikkelen. De geboden aanpak is ook flexibeler omdat het een vergelijking mogelijk zou maken van verschillende aantallen fibroblasten, verschillende verhoudingen van kankercellen en fibroblasten, knockdown van verschillende genen en zelfs vergelijking van fibroblasten van verschillende weefsellocaties of soorten. Een Cre-lox benadering zou het voordeel hebben dat de fibroblasten in de muizen aanwezig zijn in een meer fysiologische context.
Het hier gerapporteerde protocol zou waardevol zijn voor wetenschappers die de effecten van fibroblasten op tumorgroei snel en kosteneffectief willen volgen. Dit protocol is vooral waardevol voor wetenschappers die verschillende subsets van fibroblasten of fibroblasten uit verschillende bronnen onderzoeken op tumorgroei op tumorgroei. Als het belangrijk is dat tumorinitiatie plaatsvindt in een fysiologische context, dan moeten genetisch gemanipuleerde muismodellen worden overwogen.
Er zijn verschillende mogelijke benaderingen voor het uitvoeren van deze experimenten. Immuun-competente muizen kunnen worden gebruikt als gastheren, wat onderzoek naar fibroblast-immuuncelinteracties mogelijk zou maken. Voor immuun-competente muismodellen moeten muizenkankercellen en muizenembryonale fibroblasten (MEF's) worden geïnjecteerd. Het gebruik van MEF's stelt de onderzoeker ook in staat om te profiteren van het brede scala aan knock-out muizenstammen om de aan- of afwezigheid van een interessant gen te testen. Als alternatief kunnen immuundeficiënte muizen worden gebruikt om de rol van menselijke fibroblasten te testen bij het bevorderen van de groei van tumoren bij muizen die zijn afgeleid van menselijke kankercellen. Introductie van de kankercellen kan subcutaan of orthotopisch worden uitgevoerd. Voor melanoom, zoals hieronder beschreven, kan het tumor-fibroblastmengsel intradermaal worden geïnjecteerd voor orthotopische injectie die de locatie in de huid waar een melanoom zich zou ontwikkelen nauwer simuleert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven experimenten werden goedgekeurd door het Animal Care Committee van de Universiteit van Californië, Los Angeles.
OPMERKING: Selecteer kankercellen en fibroblasten die overeenkomen met de gastheermuizen voor muizenstam. Selecteer kankercellen en fibroblasten die overeenkomen met het geslacht van de gastheermuis. Verkrijg muizen uit broedkolonies of koop ze van gerenommeerde leveranciers. Introduceer tumoren in muizen die ~ 8-10 weken oud zijn. Muizen met vacht bevinden zich in de telogene of rustfase van de haarfollikelcyclus. Plan voor een verhouding van 0,5 tot 3 fibroblasten tot kankercel.
1. Bepaal het juiste aantal muizen dat voor experimenten moet worden gebruikt
- Voordat u de onderzoeken uitvoert, voert u een vermogensanalyse uit om het juiste aantal muizen te bepalen dat voor de onderzoeken moet worden gebruikt. Gebruik de volgende formule om de steekproefgrootte te bepalen voor een experiment met het opgegeven vermogen:
n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
Als α het geselecteerde significantieniveau is (meestal 0,05), dan is 1-α/2 = 0,975 en Z=1,960.
β is het vermogen en als 80% vermogen gewenst is, dan is Z=0,84.
ES, de effectgrootte = \μ1-μ 0\/σ
waarbij μ 0 het gemiddelde is onder hypothese H0, μ 1 het gemiddelde is onder hypothese H1 en σ de standaarddeviatie is van de uitkomst van belang22.
OPMERKING: Meer informatie over het berekenen van de steekproefomvang is te vinden22.
2. Genereer kankercellen voor injectie
- Bepaal de relevante groeisnelheid met de volgende vergelijking:
Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t
OPMERKING: Er wordt een voorbeeld getoond voor cellen die binnen 24 uur verdubbelen
Verdubbelingstijd = ln(2)/groeisnelheid
24 uur = ln(2)/groeisnelheid
24*groeisnelheid = .693
Groeisnelheid = .693/24= .028875 - Bepaal het aantal kankercellen dat moet worden geplaatst en de hoeveelheid tijd die de cellen nodig hebben om te worden gekweekt voorafgaand aan de injectie.
OPMERKING: 0,25-1 miljoen kankercellen worden geïnjecteerd voor elke gevormde tumor. - Bereken het aantal dagen dat nodig is om een voldoende aantal cellen te genereren volgens de vergelijking
N(t)=N(0)egr*t
waarbij N(t) het aantal cellen op tijdstip t is, N(0) het aantal cellen op tijdstip 0, gr de groeisnelheid en t de tijd.
OPMERKING: Een voorbeeld van deze berekeningen voor het kweken van 500.000 cellen om 106 cellen te genereren in elk van de 12 tumoren. Op basis van deze berekeningen is 5 dagen voldoende om het benodigde aantal cellen te laten groeien:
N(t)=N(0)egr*t
12 x 106 = 500.000e(gr*t)
12 x 106=500.000e(.028875*t)
24=e(.028875*x)
ln(24)=0,028875x
3,178 = 0,028875x
X=110 uur= 4,59 dagen
Geef cellen extra tijd om zich aan de plaat te hechten en voor cellen die tijdens het verzamelen verloren gaan. - Plaatkankercellen.
OPMERKING: Draag handschoenen en laboratoriumjassen bij het werken met gekweekte cellen.
OPMERKING: Voer celmanipulaties uit in een laminaire stroomkap om de introductie van microben uit de lucht in de monsters te minimaliseren. Behandel de weefselkweekkap voor gebruik met ultraviolet licht. Gebruik steriele techniek en alleen steriele celkweek plasticware en verbruiksartikelen zoals met weefselkweek behandelde platen, pipetten en conische buizen.- Bereken het juiste aantal en de juiste grootte van weefselkweekplaten op basis van het aantal cellen in de injectieflacon en de gewenste celconcentratie zodra deze is geplateerd.
- Label weefselkweekplaten.
- Bereid een waterbad met water van 37 °C.
- Aliquot medium in conische buizen en in een waterbad bij 37 °C plaatsen. Veel kankercellen kunnen worden gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS).
- Verwijder het vereiste aantal injectieflacons met bevroren cellen uit de vriezer met vloeibare stikstof.
OPMERKING: Gebruik vrieshandschoenen bij het hanteren van cellen in een vriezer met vloeibare stikstof. - Ontdooi de celflacons snel in het waterbad terwijl u zachtjes schudt.
OPMERKING: Voeg ethanol toe aan handschoenen tijdens het hanteren van injectieflacons om de steriliteit te behouden. - Met behulp van steriele techniek in een weefselkweekkap, pipet u de cellen in een conische buis van 15 ml met 10 ml DMEM + 10% FBS.
- Centrifugeer het celmengsel op 180 x g gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant voorzichtig met steriele zuigkracht of een steriele pipet van 10 ml.
- Resuspendeer de cellen in de pellet voorzichtig terug tot 1 ml DMEM + 10% FBS.
- Pipetteer de geresuspendeerde cellen op een gelabelde weefselkweekplaat met een steriele p1000.
- Met behulp van steriele 10 ml pipetten, pipetmedium met serum in weefselkweekplaten.
- Incubeer weefselkweekplaten in een weefselkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Breid kankercellen uit om voldoende kankercellen te genereren voor injectie.
OPMERKING: Controleer cellen met lichtmicroscopie op confluentie. Trypsinize om de twee tot drie dagen of indien nodig om te voorkomen dat de cellen 100% samenvloeiing bereiken. Als er een groot aantal cellen nodig is, gebruik dan hyperflasks (Table of Materials) om een groot aantal cellen op een ruimte- en mediumefficiënte manier te laten groeien. Elke keer dat de cellen moeten worden gepasseerd, volgt u deze procedure:- Verwijder het medium van de plaat met steriele zuiging of een steriele pipet van 10 ml.
- Was de plaat voorzichtig door te pipetteren op warme fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder vervolgens de PBS met steriele zuigkracht of een pipet.
- Pipetteer 5 ml 1x Trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) in PBS voor een plaat van 10 cm op de cellen en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Verwijder cellen van de plaat met zachte tikken om de cellen van de plaat los te maken.
- Gebruik een steriel pipet van 10 ml en verzamel de cellen in DMEM met 10% FBS-serum in conische buizen.
- Centrifugeer conische buizen op 180 x g gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant door het af te gieten. De celkorrel moet zichtbaar zijn. Let erop om er zeker van te zijn dat het in de buis blijft.
- Resuspendeer de gepelletiseerde cellen door 1 ml DMEM + 10% FBS toe te voegen en zachtjes op en neer te pipetteren.
- Aliquot geresuspendeerde cellen op nieuwe weefselkweekplaten van de juiste grootte met DMEM + 10% FBS (10 ml media is geschikt voor een weefselkweekplaat van 10 cm).
3. Genereer fibroblasten voor injectie
OPMERKING: Primaire fibroblasten zullen senesce na te veel verdubbelingen / passages. Het is belangrijk om primaire fibroblasten te gebruiken na een beperkt aantal passages of verdubbelingen. Houd het aantal passages of verdubbelingen bij dat de fibroblasten uit de muis of menselijke huid zijn gegroeid. Gebruik fibroblasten met minder dan 15 passages voor primaire menselijke dermale fibroblasten. Gebruik fibroblasten met minder dan 9 passages voor embryonale fibroblasten van muizen. Fibroblasten worden veranderd wanneer ze confluent worden. Trypsinize de fibroblasten wanneer ze ongeveer 90% confluent zijn. Fibroblasten zullen verschillende eigenschappen hebben, afhankelijk van hoe ze worden gekweekt. Veel wetenschappers promoten het kweken op meer fysiologisch relevante substraten dan weefselkweekplaten zoals 3D-collageenmatrices die weefselachtige omgevingen effectiever vastleggen23,24,25.
- Gebruik de vergelijking in rubriek 2.1 om de groeisnelheid voor de fibroblastcellen te bepalen.
- Gebruik de vergelijking in rubriek 2.2 om het aantal dagen te bepalen dat nodig is om de fibroblasten uit te breiden.
- Plaats de fibroblasten zoals beschreven in rubriek 2.3 met behulp van het juiste medium op de juiste dag om ervoor te zorgen dat kankercellen en fibroblasten op dezelfde dag klaar zijn voor injectie.
- Breid de fibroblasten uit in het juiste medium om een voldoende aantal fibroblasten te genereren dat nodig is volgens de procedures beschreven in rubriek 2.4.
4. Scheer muizen om muizen voor te bereiden op injectie
OPMERKING: Draag laboratoriumjassen, haarnetten, schoenovertrekken en handschoenen wanneer u met muizen werkt.
- Eén tot twee dagen voorafgaand aan de injectie, in overeenstemming met de regels van de Institutional Animal Care Committee, verdoven de muizen. Als u isofluraan gebruikt voor anesthesie, gebruik dan een mengsel van isofluraan en O2. Plaats de muizen in een anesthesiekamer en introduceer een isofluraan (5%)/ O2-mengsel om anesthesie te induceren. Plaats vervolgens de neuskegel op het verdoofde dier om het chirurgische anesthesievlak te behouden met een constante stroom isofluraan (2%) / O 2-mengsel.
- Controleer de dieren om er zeker van te zijn dat ze zich in het juiste chirurgische anesthesievlak bevinden door in de teen van de muis te knijpen en te bevestigen dat de muis niet beweegt.
- Gebruik een tondeuse met chirurgisch mes # 40 en verwijder de vacht voorzichtig van de juiste posities op de flanken van de muizen door de tondeuse meerdere keren over de huid te laten gaan totdat de vacht is verwijderd.
- Controleer de muizen totdat ze herstellen van de anesthesie.
5. Bereid kankercellen en fibroblasten voor op injectie
OPMERKING: Kankercellen en fibroblasten moeten zo snel mogelijk na verzameling worden geïnjecteerd, bij voorkeur binnen 30 minuten. Oogst op de ochtend van de injectie de kankercellen en fibroblasten afzonderlijk van weefselkweekplaten. Voer voor elk celtype de volgende stappen uit:
- Verwijder het medium uit de weefselkweekplaat met zachte steriele zuigkracht of door het medium af te pipetten.
- Pipetteer zachtjes op 5 ml PBS zonder de cellen te verstoren. Draai de PBS. Zuig de PBS voorzichtig af met zuig- of pipetbeweging van de PBS.
- Pipetteer voorzichtig 5 ml Trypsine-EDTA in PBS op de cellaag en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Verwijder cellen van de plaat met zachte tikken om de cellen los te maken. Pipetteer de cellen meerdere keren met een pipet van 10 ml en breng de cellen over naar een conische buis met DMEM met 10% FBS.
- Centrifugeer de conische buizen op 180 x g gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant door het voorzichtig af te gieten en de celkorrel vast te houden. Was de celpellet twee keer met PBS. Pipetteer elke keer 10 ml PBS op de cellen. Meng voorzichtig met een p1000 pipet.
- Centrifugeer de cellen zoals in stap 5.5. Verwijder de PBS voorzichtig met een pipet en herhaal.
- Resuspendeer de gewassen, gepelletiseerde cellen in 1 ml PBS met een p1000.
- Maak een hemocytometerglaasje schoon met alcohol en droog af.
- Pipetteer 100 μL van het celmengsel in een buis en voeg 400 μL 0,4% Trypan blauw toe voor een uiteindelijke Trypan blauwe concentratie van 0,32%.
- Vul voorzichtig de kamers van een glazen hemocytometer onder de dekplaat door het celmengsel te pipetteren totdat de kamer vol is.
- Stel met behulp van een microscoop scherp op de rasterlijnen van een 10x-objectief.
- Tel de levende, niet-gekleurde cellen en blauwe cellen in één set van 16 vierkanten.
- Tel alle 4 sets van 16 vierkanten.
- Gemiddelde van het celgetal voor de heldere en blauwe cellen uit de 4 sets van 16 vierkanten en vermenigvuldig met 10.000. Vermenigvuldig met 5 om te corrigeren voor de 1:5 verdunning van de Trypan blauw.
- De laatste tellingen zijn de concentratie in cellen / ml voor de levensvatbare en dode cellen. Vermenigvuldig met het volume om het totale aantal kankercellen en fibroblasten te bepalen. Bevestig dat de fractie van cellen die levensvatbaar zijn >80% is.
- Bevestig dat er een voldoende aantal melanoomcellen en fibroblasten zijn voor alle geplande injecties, uitgaande van ten minste 20% verlies van monster tijdens de injecties.
- Breng het vereiste aantal cellen over in een nieuwe conische buis en pellet de cellen door centrifugeren (180 x g gedurende 5 minuten).
- Verwijder het supernatant met een pipet van 10 ml.
- Resuspendeer de pellet in de vereiste concentratie in de juiste hoeveelheid PBS van Amerikaanse Farmacopee (USP) (50 μL per tumor voor intradermale injectie en 100 μL per tumor voor subcutane injectie).
6. Injecteer kankercellen en fibroblasten in muizen
OPMERKING: Indien goedgekeurd door het institutionele Animal Care Committee, injecteer twee tumoren in elke muis, één op elke flank. Randomiseer welke muis welke injectie krijgt op de rechter- en linkerflank. Afhankelijk van het aantal muizen dat moet worden geïnjecteerd, verdooft u de muizen en injecteert u kankercellen en fibroblasten in batches in de muizen.
- Voor subcutane injectie van kankercellen
- Verdoof muizen zoals beschreven in rubriek 4.1.
- Veeg de geschoren huid af met alcoholdoekjes.
- Vul een steriele spuit met het gewenste volume cellen of celmengsel en sluit de spuit af met een naald van 27 gauge.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Veeg indien nodig met de spuit om bubbels te verwijderen. Zodra cellen in de spuit zijn ingebracht, houdt u de cellen in de spuiten goed gemengd door de spuiten continu om te keren om klonteren te voorkomen. - Steek de naald in het onderhuidse gebied op de flank van de muis en injecteer de cellen voorzichtig in de muis. Gebruik 100 μL celsuspensie per tumor voor subcutane injectie (het gebruik van een volume van meer dan 100 μL per injectie wordt niet aanbevolen).
- Controleer de muizen totdat ze herstellen van de anesthesie. Voorzie de muizen indien nodig van extra isolatiemateriaal zoals hutten en/of verwarmingskussens om de muizen te helpen volledig te herstellen.
- Voor intradermale injecties van kankercellen
- Verdoof muizen zoals beschreven in rubriek 4.1.
- Veeg de geschoren huid af met alcoholdoekjes.
- Vul een steriele spuit met het gewenste volume cellen of celmengsel en sluit de spuit af met een naald van 27 gauge.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Veeg indien nodig met de spuit om bubbels te verwijderen. Zodra cellen in de spuit zijn ingebracht, houdt u de cellen in de spuiten goed gemengd door de spuiten continu om te keren om klonteren te voorkomen. - Steek een naald van 27 gauge in het intradermale gebied van de huid op de flank van de muis en injecteer de cellen voorzichtig in het intradermale gebied in de muis. Gebruik 50 μL celsuspensie per tumor voor intradermale injectie (het gebruik van een volume van meer dan 50 μL per injectie wordt niet aanbevolen).
- Controleer de muizen totdat ze herstellen van de anesthesie. Als er tekenen zijn dat de muizen in nood zijn, raadpleeg dan een dierenarts. Voorzie de muizen indien nodig van extra isolatiemateriaal zoals hutten en/of verwarmingskussens om de muizen te helpen volledig te herstellen.
7. Controleer muizen tijdens tumorgroei
- Controleer muizen dagelijks op tekenen van pijn of angst (gebogen houding, kronkelen, vocalisatie, zich uitstrekken langs de kooi, hun buik naar de bodem van de kooivloer drukken of terughoudendheid om rond de kooi te bewegen) of abcesvorming. Als er tekenen zijn dat de muizen in nood zijn, raadpleeg dan een dierenarts.
- Zodra tumoren zijn gevormd, meet u het tumorvolume ongeveer elke twee tot drie dagen. Meet de tumorlengte (de langste zijde) en de breedte (loodrecht op de lengte) met remklauwen.
OPMERKING: Het is de beste procedure dat dezelfde persoon deze metingen gedurende het hele experiment uitvoert om de variabiliteit in de gegevens te verminderen. Voor metingen muizen verdoven zoals beschreven in rubriek 4.1 - Bereken tumorvolumes met de formule Volume= 0,5 x (Lengte x Breedte2).
8. Oogst tumoren en meet tumorgewichten
- Euthanaseer muizen wanneer tumorgroei een experimenteel eindpunt bereikt dat is vastgesteld door het comité voor dierverzorging van de instelling. Plaats muizen in een kamer en euthanaseer ze met langzame (20-30% per minuut) verplaatsing van kamerlucht met gecomprimeerd CO2 gedurende één minuut na het stoppen van de ademhaling.
- Voer cervicale dislocatie uit op de muizen. Houd het knaagdier vast op een stevige, vlakke ondergrond. Plaats een stevige pen of een ander voorwerp tegen de achterkant van de nek aan de basis van de schedel. Duw snel naar voren en naar beneden met het voorwerp dat het hoofd vasthoudt terwijl je naar achteren trekt met de hand die de basis van de staart vasthoudt. Bevestig met palpatie dat het ruggenmerg is doorgesneden.
OPMERKING: Cervicale dislocatie moet worden uitgevoerd door ervaren laboratoriumpersoneel. - Bevestig voor elke muis in het experiment dat de muis niet meer leeft door te controleren of er geen ademhaling, geen hartslag en geen reactie op een teenknijper is.
- Gebruik een steriel scalpel en een chirurgische schaar om de hele tumor uit de muis te verwijderen. Knip met een chirurgische schaar niet-tumorweefsel uit de tumor.
- Weeg de tumor op een analytische balans en noteer het tumorgewicht.
9. Statistische analyse van tumorvolumes en tumorgewichten
- Vergelijk tumorvolumes in de loop van de tijd in elke groep met herhaalde metingen analyse van variantie (ANOVA). Voer een gepaarde analyse uit als er twee tumoren per muis zijn geïnjecteerd.
- Vergelijk tumorgewichten tussen de groepen met ANOVA met behulp van een tweezijdige test. De post-hoc test van Tukey kan vervolgens worden gebruikt om te bepalen welke groepen significant van elkaar verschillen. Voer een gepaarde analyse uit als er twee tumoren per muis zijn geïnjecteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A2058 menselijke melanoomcellen en primaire menselijke dermale fibroblasten werden gekweekt onder steriele omstandigheden. Cellen werden verzameld en drie keer gewassen met PBS. Immunodeficiënte muizen (NU/J - Foxn1 naaktstam) werden subcutaan geïnjecteerd op één flank met alleen al 0,25 miljoen A2058 melanoomcellen. Op de andere flank werden muizen geïnjecteerd met een mengsel van 0,25 miljoen A2058-melanoomcellen en 0,75 miljoen fibroblasten. Cellen werden geïnjecteerd in 12 immuun-deficiënte muizen. Injecties in linker- en rechterflank werden gerandomiseerd. Tumorvolumes werden gecontroleerd op dag 12, 14, 16, 19 en 21 dagen na injectie (figuur 1A). Bij euthanasie werden tumoren weggesneden, in beeld gebracht (figuur 1B) en gewogen (figuur 1C). De aanwezigheid van de fibroblasten resulteert in aanzienlijk grotere tumoren.
Figuur 1: Vergelijking van melanoomgroei in de aan- en afwezigheid van co-geïnjecteerde fibroblasten. Melanoomcellen werden geïntroduceerd in naakte muizen, met of zonder primaire huidfibroblasten. (A) Plot van tumorvolume in de loop van de tijd voor melanomen met en zonder co-geïnjecteerde fibroblasten. Volume werd berekend als 0,5*lengte*breedte2. Gemiddelde volumes en standaardfout van het gemiddelde (SEM) worden uitgezet. ANOVA werd uitgevoerd om de significantie te bepalen. (B) Beelden van weggesneden tumoren. (C) Eindgewichten van tumoren aan het einde van het experiment op dag 21. Gemiddelde gewichten en SEM worden uitgezet. Een ongepaarde, tweezijdige t-test werd gebruikt om de uiteindelijke gewichten te vergelijken. * geeft p < 0,05 aan, *** geeft p < 0,001 aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het experiment in figuur 1 resulteerde het co-introduceren van menselijke dermale fibroblasten met menselijke A2058-melanoomcellen in grotere tumoren dan wanneer de melanoomcellen werden geïntroduceerd zonder co-geïnjecteerde fibroblasten. Dit verschil kan gemakkelijk worden gedetecteerd op basis van tumorvolume en tumorgewicht. De resultaten komen overeen met meerdere rapporten dat kanker-geassocieerde fibroblasten tumorgroei kunnen bevorderen 5,6,7,8. Naast de hier besproken eindpunten zoals tumorvolume en tumorgewicht, kunnen ook extra eindpunten worden gemonitord. Aanvullende analyses zijn ook mogelijk. De tumoren die zich ontwikkelen, kunnen bijvoorbeeld worden verzameld in formaline voor fixatie, paraffine-ingebed en geanalyseerd met hematoxyline en eosine voor histologie. Als alternatief kunnen de ontwikkelde tumoren worden verzameld in een optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) voor verdere analyse met immunofluorescentie voor specifieke eiwitten.
Een belangrijke beperking van deze experimenten is dat de fibroblasten die samen met de kankercellen worden geïnjecteerd, na een paar celdelingen kunnen senesceren of afsterven. Als alternatief kunnen co-geïnjecteerde fibroblasten wegtrekken van de tumor, in welk geval ze de tumorgroei mogelijk niet beïnvloeden. Als de fibroblasten senesce, sterven of wegtrekken van de tumor, dan zullen ze na verloop van tijd minder overvloedig worden en zal het effect van de mede-geïntroduceerde fibroblasten minder belangrijk worden voor tumorgroei. Inderdaad, van de geïntroduceerde kankercellen wordt verwacht dat ze extra fibroblasten van de gastheer rekruteren. Voor experimenten waarbij een specifiek gen wordt neergehaald of uitgeschakeld in de geïntroduceerde fibroblasten, zal na verloop van tijd worden verwacht dat rekrutering van gastheerfibroblasten die het gecodeerde eiwit tot expressie brengen, elk fenotype dat kan worden waargenomen, zal verminderen. Om de aanwezigheid van de geïntroduceerde fibroblasten te controleren, kunnen de fibroblasten genetisch worden gemanipuleerd om een fluorescerend eiwit zoals GFP26,27 tot expressie te brengen. Als de fibroblasten GFP tot expressie brengen, kan flowcytometrie worden gebruikt om het aantal fibroblasten te controleren dat aanwezig is in de tumor op verschillende dagen nadat ze zijn geïntroduceerd. Als alternatief kan het luciferase-enzym in de fibroblasten worden geïntroduceerd en kan bioluminescentiebeeldvorming worden gebruikt om de hoeveelheid fibroblasten in de muizen in de loop van de tijd te controleren. Als de fibroblasten snel worden geëlimineerd uit de micro-omgeving van de tumor, zouden cre-lox genetisch gemanipuleerde muismodellen deze zorg aanpakken en de beschreven studies aanvullen.
Als de experimenten worden uitgevoerd door menselijke kankercellen en fibroblasten in naakte muizen te introduceren, zal het beperkte immuunsysteem naar verwachting een aanzienlijke invloed hebben op de resultaten. Athymische naaktmuizen (NU / J) missen T-cellen en missen daarom celgemedieerde immuniteit. Ze hebben ook een gedeeltelijk defect in de ontwikkeling van B-cellen. Celgemedieerde immuniteit, dat wil zeggen het doden van cellen via geactiveerde CD8+ T-cellen, kan een belangrijke rol spelen bij de onderdrukking van tumorgroei28,29. In recente studies is de wisselwerking tussen kanker-geassocieerde fibroblasten en CD8 + T-cellen gemeld30,31,32. Het introduceren van muizenkankercellen en muisfibroblasten in muizen met een immuunsysteem kan worden beschouwd als een alternatieve benadering die dit probleem zou aanpakken.
Een andere alternatieve benadering is om genetisch gemanipuleerde muismodellen te gebruiken waarin het Cre-lox-systeem wordt gebruikt om de niveaus of activiteit van specifieke eiwitten in fibroblasten van de gastheer te moduleren. Een dergelijke benadering is om fibroblast-verrijkte Cre-lox-modellen te gebruiken met stuurprogramma's zoals FSP1, Col1a1, Col1a2 of PDGFRa33,34,35. Met een Cre/lox recombinase-model zou er geen bezorgdheid zijn dat de geïnjecteerde fibroblasten zullen sterven of wegtrekken van de tumor.
Er zijn een paar stappen in het protocol die cruciaal zijn voor het succes ervan. De groei van de fibroblasten is een belangrijk onderdeel van het protocol en zal waarschijnlijk aanzienlijk bijdragen aan de uitkomst. Primaire fibroblasten senesce gemakkelijk, en de passage of verdubbelingen moeten zorgvuldig worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de fibroblasten zich in de exponentiële groeifase bevinden en niet zijn gesenesceerd. Senescente fibroblasten zullen naar verwachting hoge niveaus van cytokines afscheiden die een dramatisch effect kunnen hebben op de tumorgroei36,37,38. Het is daarom van groot belang dat het passagenummer zorgvuldig wordt gedocumenteerd en dat de geïnjecteerde fibroblasten niet senescent zijn, tenzij het protocol vraagt om analyse van senescente fibroblasten.
Wanneer fibroblasten confluent worden, kan worden verwacht dat ze een groot aantal veranderingen ondergaan, waarvan sommige waarschijnlijk zullen worden omgekeerd wanneer ze opnieuw de celcyclus binnenkomen 39,40,41,42,43,44. Het handhaven van de fibroblasten in een proliferatieve toestand en het splitsen ervan wanneer ze voor 90% confluent zijn, is belangrijk om ervoor te zorgen dat de studies zo consistent mogelijk zijn. Het kweken van fibroblasten op weefselkweekplaten heeft waarschijnlijk ook invloed op hun gedrag en alternatieven zoals 3D-collageenmatrices moeten worden beschouwd als23,24,25. Fibroblasten gekweekt in 3D-matrices vertonen aanzienlijk andere migratiepatronen dan fibroblasten gekweekt op 2D-oppervlakken 45,46,47,48,49, wat waarschijnlijk hun tumorbevorderende capaciteit zou beïnvloeden wanneer ze in tumoren worden geïntroduceerd, waar de fibroblasten een actieve rol zullen spelen bij het vaststellen van de tumor extracellulaire matrix micro-omgeving50.
Het injecteren van melanoomcellen in de muis via intradermale injectie kan meer reproduceerbare tumorgroei opleveren dan subcutane injecties. Dit is een lastige stap omdat er heel weinig ruimte is in het intradermale gebied. Het is belangrijk om de naald zorgvuldig te positioneren. Als intradermale injecties worden uitgevoerd, wordt slechts 50 μL oplossing geïnjecteerd. Zelfs voor ervaren onderzoekers kunnen deze injecties lekken. Het is belangrijk om te noteren of elke injectie is gelekt, zodat, als er geen tumor ontstaat, deze uit de uiteindelijke analyse kan worden geëlimineerd.
Het voorbereiden van spuiten voor injectie is een andere kritieke stap. Het is belangrijk om alle bubbels uit de spuit te verwijderen, waardoor het nodig kan zijn om de spuit te vegen om de bubbels te verwijderen. Het is ook belangrijk dat de cellen niet klonteren. Keer de spuiten herhaaldelijk om om klonteren te voorkomen.
Een ander lastig aspect van deze experimenten is dat het meten van tumorvolume van persoon tot persoon kan variëren. Om de variabiliteit in tumorvolumemetingen te beperken, is het nuttig om een enkel laboratoriumlid verantwoordelijk te stellen voor het uitvoeren van alle tumorvolumemetingen bij alle muizen en op alle tijdstippen tijdens een experiment.
Het verdient de voorkeur om muizen waar mogelijk te injecteren met kankercellen van hetzelfde geslacht als de gastheermuis. Het is mogelijk om beide geslachten te gebruiken en seks als variabele op te nemen in ANOVA-modellen om te bepalen of geslacht de tumorgrootte in de loop van de tijd beïnvloedt.
Het begrijpen van de micro-omgeving van de tumor is essentieel voor het verkrijgen van inzicht in tumorigenese. Het protocol kan een basis bieden voor het begrijpen van de rol van fibroblasten, verschillende soorten fibroblasten en verschillende paden binnen fibroblasten die de tumorgroei kunnen beïnvloeden. Bevindingen van deze experimenten kunnen nieuwe therapeutische doelen identificeren die voorkomen dat fibroblasten tumorgroei bevorderen18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen alle leden van het Coller-laboratorium bedanken voor hun nuttige input. H.A.C. was de Milton E. Cassel geleerde van de Rita Allen Foundation. We erkennen NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanoma Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, het Iris Cantor Women's Health Center / UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, University of California Cancer Research Coordinating Committee, David Geffen School of Medicine Metabolism Theme Award, het Clinical Translational Science Institute en Jonsson Comprehensive Cancer Center, Innovation Awards van het Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills en Ha Gaba), een Award van de UCLA SPORE in Prostate Cancer (National Cancer Institute of the National Institutes of Health onder awardnummer P50CA092131), een Innovation Award van het Broad Stem Cell Center, het Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research aan de UCLA, het Tumor Cell Biology Training Program (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), het Dermatology T32 Program aan UCLA AR071307 en het UCLA Muscle Cell Biology, Pathophysiology and Therapeutics T32 Training Program 5 T32 AF 65972.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G Needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
| Alcohol swabs | Fisher Scientific | 326895 | |
| Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 | WAHL Professional | 8787-450A | |
| Athymic nude mice (NU/J) | The Jackson labs | 002019 | These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced. |
| Cancer cells | ATCC | ATCC® CRL-11147™ | This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used. |
| Cell Culture Multi Flasks | Fisher Scientific | 14-826-95 | |
| Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Countess Cell Counting Chamber | Fisher Scientific | C10228 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
| Fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used. |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
| PBS USP grade for injection into mice | Fisher Scientific | 50-751-7476 | |
| Sterile 10 ml serological pipet | Celltreat | 667210B | |
| Sterile 5 ml serological pipet | Celltreat | 229005B | |
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-108 | |
| Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns | Fisher Scientific | 09-740-61A | |
| Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 15400054 | |
| Sterile tissue-culture grade PBS | Fisher Scientific | 50-751-7476 | |
| Sterle 25 ml serological pipet | Celltreat | 667225B | |
| TC treated 100 x 20 mm dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| TC treated 150 x 20 mm dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| TC treated 60 x 15 mm dishes | Genesee Scientific | 25-260 | |
| Trypan blue | Fisher Scientific | C10228 |
References
- Liu, T., et al. Cancer-associated fibroblasts: an emerging target of anti-cancer immunotherapy. Journal of Hematology and Oncololgy. 12 (1), 86 (2019).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25 (6), 719-734 (2014).
- Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Zhang, J., et al. Fibroblast-specific protein 1/S100A4-positive cells prevent carcinoma through collagen production and encapsulation of carcinogens. Cancer Research. 73 (9), 2770-2781 (2013).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D.
- Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
- Wang, W., et al. Crosstalk to stromal fibroblasts induces resistance of lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. Clinical Cancer Research. 15 (21), 6630-6638 (2009).
- Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Tsujino, T., et al. Stromal myofibroblasts predict disease recurrence for colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 13 (7), 2082-2090 (2007).
- Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nature Medicine. 22 (5), 497-505 (2016).
- Cukierman, E., Bassi, D. E. Physico-mechanical aspects of extracellular matrix influences on tumorigenic behaviors. Seminars in Cancer Biology. 20 (3), 139-145 (2010).
- Attieh, Y., et al. Cancer-associated fibroblasts lead tumor invasion through integrin-beta3-dependent fibronectin assembly. Journal of Cell Biology. 216 (11), 3509-3520 (2017).
- Ahmadzadeh, M., Rosenberg, S. A. TGF-beta 1 attenuates the acquisition and expression of effector function by tumor antigen-specific human memory CD8 T cells. Journal of Immunology. 174 (9), 5215-5223 (2005).
- Feig, C., et al. Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 110 (50), 20212-20217 (2013).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontiers in Immunology. 9, 414 (2018).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
- Grum-Schwensen, B., et al. Suppression of tumor development and metastasis formation in mice lacking the S100A4(mts1) gene. Cancer Research. 65 (9), 3772-3780 (2005).
- Kojima, M., et al. Human subperitoneal fibroblast and cancer cell interaction creates microenvironment that enhances tumor progression and metastasis. PLoS One. 9 (2), 88018 (2014).
- Noel, A., et al. Enhancement of tumorigenicity of human breast adenocarcinoma cells in nude mice by matrigel and fibroblasts. British Journal of Cancer. 68 (5), 909-915 (1993).
- Sullivan, L. M.
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Damianova, R., Stefanova, N., Cukierman, E., Momchilova, A., Pankov, R. Three-dimensional matrix induces sustained activation of ERK1/2 via Src/Ras/Raf signaling pathway. Cell Biology International. 32 (2), 229-234 (2008).
- Rhee, S. Fibroblasts in three dimensional matrices: cell migration and matrix remodeling. Experimental & Molecular Medicine. 41 (12), 858-865 (2009).
- Hoffman, R. M.
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
- Naito, Y., et al. CD8+ T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer. Cancer Research. 58 (16), 3491-3494 (1998).
- Fu, C., Jiang, A. Dendritic Cells and CD8 T Cell Immunity in Tumor Microenvironment. Frontiers Immunolofy. 9, 3059 (2018).
- Lakins, M. A., Ghorani, E., Munir, H., Martins, C. P., Shields, J. D. Cancer-associated fibroblasts induce antigen-specific deletion of CD8 (+) T Cells to protect tumour cells. Nature Communications. 9 (1), 948 (2018).
- Kato, T., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Affect Intratumoral CD8(+) and FoxP3(+) T Cells Via IL6 in the Tumor Microenvironment. Clinical Cancer Research. 24 (19), 4820-4833 (2018).
- Gorchs, L., et al. Human Pancreatic Carcinoma-Associated Fibroblasts Promote Expression of Co-inhibitory Markers on CD4(+) and CD8(+) T-Cells. Frontiers Immunology. 10, 847 (2019).
- Duscher, D., et al. Fibroblast-Specific Deletion of Hypoxia Inducible Factor-1 Critically Impairs Murine Cutaneous Neovascularization and Wound Healing. Plastic Reconstructive Surgery. 136 (5), 1004-1013 (2015).
- Zheng, B., Zhang, Z., Black, C. M., de Crombrugghe, B., Denton, C. P. Ligand-dependent genetic recombination in fibroblasts : a potentially powerful technique for investigating gene function in fibrosis. American Journal of Pathology. 160 (5), 1609-1617 (2002).
- Swonger, J. M., Liu, J. S., Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Genetic tools for identifying and manipulating fibroblasts in the mouse. Differentiation. 92 (3), 66-83 (2016).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
- Ortiz-Montero, P., Londono-Vallejo, A., Vernot, J. P. Senescence-associated IL-6 and IL-8 cytokines induce a self- and cross-reinforced senescence/inflammatory milieu strengthening tumorigenic capabilities in the MCF-7 breast cancer cell line. Cell Communication and Signaling. 15 (1), 17 (2017).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biolofy. 4 (3), 83 (2006).
- Mitra, M., et al. Alternative polyadenylation factors link cell cycle to migration. Genome Biolofy. 19 (1), 176 (2018).
- Lemons, J. M., et al. Quiescent fibroblasts exhibit high metabolic activity. PLoS Biology. 8 (10), 1000514 (2010).
- Suh, E. J., et al. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biology. 13 (12), 121 (2012).
- Legesse-Miller, A., et al. Quiescent fibroblasts are protected from proteasome inhibition-mediated toxicity. Molecular Biology of the Cell. 23 (18), 3566-3581 (2012).
- Evertts, A. G., et al. H4K20 methylation regulates quiescence and chromatin compaction. Molecular Biology of the Cell. 24 (19), 3025-3037 (2013).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Marinkovic, A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Matrices of physiologic stiffness potently inactivate idiopathic pulmonary fibrosis fibroblasts. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 422-430 (2013).
- Tschumperlin, D. J. Fibroblasts and the ground they walk on. Physiology (Bethesda). 28 (6), 380-390 (2013).
- Tschumperlin, D. J., et al. Mechanotransduction through growth-factor shedding into the extracellular space. Nature. 429 (6987), 83-86 (2004).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Alexander, J., Cukierman, E. Stromal dynamic reciprocity in cancer: intricacies of fibroblastic-ECM interactions. Current Opinions in Cell Biology. 42, 80-93 (2016).
