Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En musmodell för att undersöka rollen av cancerassocierade fibroblaster i tumörtillväxt

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61883
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2, 1,2,4
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

Ett protokoll för att saminjicera cancerceller och fibroblaster och övervaka tumörtillväxt över tid tillhandahålls. Detta protokoll kan användas för att förstå den molekylära grunden för fibroblasternas roll som regulatorer för tumörtillväxt.

Abstract

Cancerassocierade fibroblaster (CAF) kan spela en viktig roll i tumörtillväxt genom att skapa en tumörfrämjande mikromiljö. Modeller för att studera CAF: s roll i tumörmikromiljön kan vara till hjälp för att förstå den funktionella betydelsen av fibroblaster, fibroblaster från olika vävnader och specifika genetiska faktorer i fibroblaster. Musmodeller är viktiga för att förstå bidragsgivarna till tumörtillväxt och progression i ett in vivo-sammanhang. Här tillhandahålls ett protokoll där cancerceller blandas med fibroblaster och införs i möss för att utveckla tumörer. Tumörstorlekar över tid och slutliga tumörvikter bestäms och jämförs mellan grupper. Det beskrivna protokollet kan ge mer insikt i CAF: s funktionella roll i tumörtillväxt och progression.

Introduction

Inom tumörmikromiljön är en av de mest framträdande celltyperna den cancerassocierade fibroblasten (CAF)1. Dessa karcinomassocierade fibroblaster kan spela en tumörsuppressiv roll 2,3. Till exempel utsöndrar S100A-uttryckande fibroblaster kollagener som kan kapsla in cancerframkallande ämnen och skydda mot karcinombildning4. Vidare orsakar utarmning av α-glattmuskelaktin (SMA)-positiva myofibroblaster i bukspottkörtelcancer immunsuppression och påskyndar bukspottkörtelcancerprogression2. CAF kan också utvecklas tillsammans med cancerceller och främja tumörprogression 5,6,7,8. Fibroblaster kan syntetisera och utsöndra extracellulära matrisproteiner som skapar en tumörfrämjande miljö8. Dessa extracellulära matrixproteiner kan orsaka mekanisk förstyvning av vävnaden, vilket är associerat med tumörprogression 9,10. Den deponerade extracellulära matrisen kan fungera som en fysisk barriär som hämmar immuninfiltration11. Matrisdeponering av CAF har också associerats med tumörinvasion eftersom fibronektin genererat av CAF har visat sig främja tumörinvasion12. CAF främjar angiogenes och rekryterar immunsuppressiva celler till tumörmikromiljön genom att utsöndra transformerande tillväxtfaktor-β (TGF-β), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), interleukin-6 (IL-6) och CXC-kemokinligand 12 (CXCL12)13,14,15. På grund av deras centrala roll för att främja tumörtillväxt är cancerassocierade fibroblaster ett framväxande mål för anti-cancerbehandling 6,16,17,18.

Protokollet nedan beskriver en metod för att testa hur fibroblaster påverkar tillväxten av tumörer i en väletablerad och allmänt använd musmodell av tumörtillväxt. För att förstå betydelsen av fibroblaster i tumörmikromiljön modifierades standardprotokollet för införande av cancerceller i möss för att övervaka deras tillväxt för att inkludera fibroblaster med cancercellsintroduktionen. Cancercellerna kan introduceras subkutant eller intradermalt. Intradermal introduktion skulle resultera i tumörer som uppstår från själva huden. Xenotransplantat där cancerceller och fibroblaster saminjiceras i möss utgör ett viktigt metodiskt verktyg för att dissekera fibroblasternas roll, subpopulationer av fibroblaster och proteinfaktorer i förmågan att främja cancertillväxt 19,20,21. Ett detaljerat protokoll för samtidig injektion av cancerceller och fibroblaster i möss tillhandahålls. Denna metod kan användas för att jämföra förekomst eller frånvaro av fibroblaster, för att jämföra fibroblaster från olika källor20 eller för att jämföra fibroblaster med och utan uttryck av specifika proteiner19. Efter cancerceller och fibroblaster introduceras, tumörstorlek kan övervakas över tiden. I slutet av experimenten kan tumörer dissekeras och vägas. Genom att övervaka tumörtillväxt över tid kan betydelsen av olika faktorer dissekeras.

Det finns möjliga alternativa metoder för att studera fibroblasternas roll i tumörtillväxt. Som ett exempel finns det Cre-loxed-baserade modeller som tillhandahåller vävnadsspecifik knockout av gener med drivrutiner som uttrycks företrädesvis i fibroblaster. Sådana tillvägagångssätt ger också möjligheter att undersöka rollen av specifika gener och vägar i fibroblaster för tumörprogression. Jämfört med Cre-lox-baserade tillvägagångssätt skulle det tillhandahållna protokollet representera ett betydligt snabbare tillvägagångssätt för att övervaka fibroblasternas roll eftersom tumörtillväxt skulle övervakas under bara några veckor. Det tillhandahållna tillvägagångssättet är också betydligt billigare eftersom det inte kräver generering och hysning av kolonier av genetiskt modifierade möss. Det tillhandahållna protokollet kan användas för att snabbt testa effekten av knockdown av olika gener med hjälp av shRNA snarare än att behöva utveckla muskolonier. Det tillhandahållna tillvägagångssättet är också mer flexibelt eftersom det skulle möjliggöra en jämförelse av olika antal fibroblaster, olika förhållanden mellan cancerceller och fibroblaster, knockdown av olika gener och till och med jämförelse av fibroblaster från olika vävnadsställen eller arter. Ett Cre-lox-tillvägagångssätt skulle ha fördelen att fibroblasterna finns i mössen i ett mer fysiologiskt sammanhang.

Protokollet som rapporteras här skulle vara värdefullt för forskare som försöker övervaka effekterna av fibroblaster på tumörtillväxt snabbt och kostnadseffektivt. Detta protokoll är särskilt värdefullt för forskare som undersöker olika undergrupper av fibroblaster eller fibroblaster från olika källor på tumörtillväxt på tumörtillväxt. Om det är viktigt att tumörinitiering sker i ett fysiologiskt sammanhang, bör genetiskt modifierade musmodeller övervägas.

Det finns flera möjliga metoder för att utföra dessa experiment. Immunkompetenta möss kan användas som värdar, vilket skulle möjliggöra undersökning av fibroblast-immuncellsinteraktioner. För immunkompetenta musmodeller måste muscancerceller och embryonala fibroblaster (MEF) injiceras. Användningen av MEF gör det också möjligt för utredaren att dra nytta av det stora utbudet av knockout-musstammar för att testa närvaron eller frånvaron av en gen av intresse. Alternativt kan immunbristande möss användas för att testa rollen som humana fibroblaster för att främja tillväxten av tumörer hos möss som härrör från mänskliga cancerceller. Införandet av cancercellerna kan utföras subkutant eller ortotopiskt. För melanom, som beskrivs nedan, kan tumör-fibroblastblandningen injiceras intradermalt för ortotopisk injektion som närmare simulerar den plats i huden där ett melanom skulle utvecklas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla beskrivna experiment godkändes av djurvårdskommittén vid University of California, Los Angeles.

OBS: Välj cancerceller och fibroblaster som matchar värdmössen för musstam. Välj cancerceller och fibroblaster som matchar värdmusens kön. Skaffa möss från avelskolonier eller köp dem från välrenommerade leverantörer. Introducera tumörer i möss som är ~ 8-10 veckors ålder. Möss med päls kommer att vara i telogen- eller vilofas av hårsäckcykeln. Planera för ett förhållande mellan 0,5 och 3 fibroblaster till cancerceller.

1. Bestäm lämpligt antal möss som ska användas för experiment

  1. Innan du utför studierna, utför en effektanalys för att bestämma lämpligt antal möss som ska användas för studierna. Använd följande formel för att bestämma provstorleken för ett experiment med den angivna effekten:
    n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
    Om α är den valda signifikansnivån (vanligtvis 0,05), är 1-α/2 = 0,975 och Z = 1,960.
    β är effekten och om 80% effekt önskas, då Z = 0,84.

    ES, effektstorleken = \μ1-μ 0\/σ
    därμ 0 är medelvärdet under hypotes H0, μ 1 är medelvärdet under hypotes H1 och σ är standardavvikelsen för resultatet av intresse22.
    OBS: Mer information om beräkning av provstorlek finns22.

2. Generera cancerceller för injektion

  1. Bestäm den relevanta tillväxthastigheten med följande ekvation:
    Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t

    Ett exempel för celler som fördubblas på 24 timmar visas
    Fördubblingstid = ln(2)/tillväxttakt
    24 timmar = ln(2)/tillväxthastighet
    24*tillväxttakt = .693
    Tillväxthastighet = .693/24 = .028875
  2. Bestäm antalet cancerceller som ska plattan och hur lång tid cellerna behöver odlas före injektion.
    OBS: 0,25-1 miljoner cancerceller injiceras för varje tumör som bildas.
  3. Beräkna antalet dagar som krävs för att generera ett tillräckligt antal celler enligt ekvationen
    N(t)=N(0)egr*t
    där N (t) är antalet celler vid tiden t, N (0) är antalet celler vid tiden 0, gr är tillväxthastigheten och t är tiden.
    OBS: Ett exempel på dessa beräkningar för att odla 500 000 celler för att generera 106 celler i var och en av 12 tumörer. Baserat på dessa beräkningar är 5 dagar tillräckliga för att odla det nödvändiga antalet celler:
    N(t)=N(0)egr*t
    12 x 106 = 500 000e (gr * t)
    12 x 106=500 000e(.028875*t)
    24=e(.028875*x)
    ln(24)=0,028875x
    3,178=0,028875x
    X=110 timmar= 4,59 dagar
    Tillåt extra tid för celler att fästa på plattan och för celler som går förlorade under insamling.
  4. Platta cancerceller.
    OBS: Använd handskar och labbrockar när du arbetar med odlade celler.
    OBS: Utför cellmanipulationer i en laminär flödeshuv för att minimera införandet av mikrober från luften i proverna. Behandla vävnadsodlingshuven med ultraviolett ljus före användning. Använd steril teknik och endast sterila cellodlingsmaterial och förbrukningsvaror som vävnadskulturbehandlade plattor, pipetter och koniska rör.
    1. Beräkna rätt antal och storlek på vävnadsodlingsplattor baserat på antalet celler i injektionsflaskan och önskad cellkoncentration när den har förplattats.
    2. Märk vävnadsodlingsplattor.
    3. Förbered ett vattenbad med vatten vid 37 °C.
    4. Alikvot medium i koniska rör och placera i vattenbad vid 37 °C. Många cancerceller kan odlas i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS).
    5. Ta bort det önskade antalet injektionsflaskor med frysta celler från frysen med flytande kväve.
      Använd fryshandskar vid hantering av celler i en frys med flytande kväve.
    6. Tina snabbt cellflaskorna i vattenbadet medan du skakar försiktigt.
      OBS: Tillsätt etanol till handskarna medan du hanterar injektionsflaskor för att bibehålla steriliteten.
    7. Använd steril teknik i en vävnadsodlingshuv, pipettera cellerna i ett 15 ml koniskt rör innehållande 10 ml DMEM + 10% FBS.
    8. Centrifugera cellblandningen vid 180 x g i 5 minuter.
    9. Ta försiktigt bort supernatanten med steril avsugning eller en steril 10 ml pipet.
    10. Återsuspendera försiktigt cellerna i pelleten till 1 ml DMEM + 10% FBS.
    11. Pipettera de återsuspenderade cellerna på en märkt vävnadsodlingsplatta med en steril p1000.
    12. Använd sterila 10 ml pipetter, pipetmedium med serum i vävnadsodlingsplattor.
    13. Inkubera vävnadsodlingsplattor i en inkubator för vävnadsodling vid 37 °C med 5 % CO2.
  5. Expandera cancerceller för att generera tillräckligt med cancerceller för injektion.
    OBS: Övervaka celler med ljusmikroskopi för sammanflöde. Trypsinisera varannan tre till tre dagar eller efter behov för att förhindra att cellerna når 100% sammanflöde. Om ett stort antal celler krävs, använd hyperkolvar (Table of Materials) för att odla ett stort antal celler på ett utrymmes- och medeleffektivt sätt. Varje gång cellerna behöver passeras, följ denna procedur:
    1. Ta bort mediet från plattan med steril sugning eller en steril 10 ml pipet.
    2. Tvätta försiktigt plattan genom att pipettera på varm fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta sedan bort PBS med steril sug eller en pipet.
    3. Pipet 5 ml 1x trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i PBS för en 10 cm platta på cellerna och inkubera i 5 minuter vid 37 °C.
    4. Ta bort celler från plattan med försiktiga kranar för att lossa cellerna från plattan.
    5. Använd en steril 10 ml pipetter, samla cellerna i DMEM med 10% FBS-serum i koniska rör.
    6. Centrifugera koniska rör vid 180 x g i 5 minuter.
    7. Ta bort supernatanten genom att hälla av den. Cellpelleten ska vara synlig. Titta på den för att se till att den förblir i röret.
    8. Resuspendera de pelleterade cellerna genom att tillsätta 1 ml DMEM + 10% FBS och pipettera upp och ner försiktigt.
    9. Alikvot återsuspenderade celler på nya vävnadsodlingsplattor av lämplig storlek med DMEM + 10% FBS (10 ml media är lämplig för en 10 cm vävnadsodlingsplatta).

3. Generera fibroblaster för injektion

OBS: Primära fibroblaster kommer att senesce efter för många fördubblingar / passager. Det är viktigt att använda primära fibroblaster efter ett begränsat antal passager eller fördubblingar. Håll reda på antalet passager eller fördubblingar som fibroblasterna har vuxit från musen eller människans hud. Använd fibroblaster med färre än 15 passager för primära humana dermala fibroblaster. Använd fibroblaster med färre än 9 passager för embryonala fibroblaster hos möss. Fibroblaster förändras när de blir sammanflytande. Trypsinisera fibroblasterna när de är cirka 90% sammanflytande. Fibroblaster kommer att ha olika egenskaper beroende på hur de odlas. Många forskare främjar odling på mer fysiologiskt relevanta substrat än vävnadsodlingsplattor, såsom 3D-kollagenmatriser som mer effektivt fångar vävnadsliknande miljöer,23,24,25.

  1. Använd ekvationen i avsnitt 2.1 för att bestämma fibroblastcellernas tillväxthastighet.
  2. Använd ekvationen i avsnitt 2.2 för att bestämma antalet dagar som krävs för att expandera fibroblasterna.
  3. Platta fibroblasterna enligt beskrivningen i avsnitt 2.3 med lämpligt medium på lämplig dag för att säkerställa att cancerceller och fibroblaster är klara för injektion samma dag.
  4. Expandera fibroblasterna i lämpligt medium för att generera ett tillräckligt antal fibroblaster som behövs enligt de procedurer som beskrivs i avsnitt 2.4.

4. Raka möss för att förbereda möss för injektion

OBS: Använd labbrockar, hårnät, skoskydd och handskar när du arbetar med möss.

  1. En till två dagar före injektion, i enlighet med reglerna för den institutionella djurvårdskommittén, bedöva mössen. Om du använder isofluran för anestesi, använd en blandning av isofluran ochO2. Placera mössen i en anestesikammare och inför en isofluran (5%)/O2-blandning för att inducera anestesi. Placera sedan noskonen på det bedövade djuret för att upprätthålla det kirurgiska anestesiplanet med ett konstant flöde av isofluran (2%)/O2-blandning .
  2. Kontrollera djuren för att säkerställa att de befinner sig i lämpligt kirurgiskt anestesiplan genom att klämma musens tå och bekräfta att musen inte rör sig.
  3. Använd en djurklippare med kirurgiskt blad #40, ta försiktigt bort pälsen från lämpliga positioner på mössens flanker genom att föra djurklipparen över huden flera gånger tills pälsen har tagits bort.
  4. Övervaka mössen tills de återhämtar sig från anestesi.

5. Förbered cancerceller och fibroblaster för injektion

OBS: Cancerceller och fibroblaster ska injiceras så snart som möjligt efter insamling, helst inom 30 minuter. På morgonen av injektionen, skörda cancerceller och fibroblaster separat från vävnadsodlingsplattor. Utför följande steg för varje celltyp:

  1. Ta bort mediet från vävnadsodlingsplattan med försiktig steril sugning eller genom att pipettera bort mediet.
  2. Pipet försiktigt på 5 ml PBS utan att störa cellerna. Virvla PBS. Aspirera försiktigt PBS med sug eller pipet av PBS.
  3. Pipettera försiktigt 5 ml trypsin-EDTA i PBS på cellskiktet och inkubera i 5 minuter vid 37 °C.
  4. Ta bort celler från plattan med försiktiga kranar för att lossa cellerna. Pipettera cellerna flera gånger med en 10 ml pipet och överför cellerna till ett koniskt rör innehållande DMEM med 10% FBS.
  5. Centrifugera de koniska rören vid 180 x g i 5 minuter.
  6. Ta bort supernatanten genom att försiktigt hälla av den och behålla cellpelleten. Tvätta cellpelleten två gånger med PBS. Varje gång, pipettera 10 ml PBS på cellerna. Blanda försiktigt med en p1000-pipett.
  7. Centrifugera cellerna enligt steg 5.5. Ta försiktigt bort PBS med en pipett och upprepa.
  8. Återsuspendera de tvättade, pelleterade cellerna i 1 ml PBS med en p1000.
  9. Rengör en hemocytometerglas med alkohol och torka.
  10. Pipettera 100 μL av cellblandningen i ett rör och tillsätt 400 μL 0,4% Trypan blå för en slutlig Trypanblå koncentration på 0,32%.
  11. Fyll försiktigt kamrarna i en glashemocytometer under täckglaset genom att pipettera cellblandningen tills kammaren är full.
  12. Använd ett mikroskop, fokusera på rutnätslinjerna för ett 10x-mål.
  13. Räkna levande, ofärgade celler och blå celler i en uppsättning med 16 rutor.
  14. Räkna alla 4 uppsättningar med 16 rutor.
  15. Genomsnitt cellantalet för de klara och blå cellerna från de 4 uppsättningarna med 16 rutor och multiplicera med 10 000. Multiplicera med 5 för att korrigera för utspädningen 1:5 från Trypan blue.
  16. De slutliga räkningarna är koncentrationen i celler/ml för de viabla och döda cellerna. Multiplicera med volymen för att bestämma det totala antalet cancerceller och fibroblaster. Bekräfta att fraktionen av celler som är livskraftiga är >80%.
  17. Bekräfta att det finns ett tillräckligt antal melanomceller och fibroblaster för alla planerade injektioner, förutsatt minst 20% förlust av provet under injektionerna.
  18. Överför erforderligt antal celler till ett nytt koniskt rör och pellet cellerna genom centrifugering (180 x g i 5 minuter).
  19. Ta bort supernatanten med en 10 ml pipet.
  20. Återsuspendera pelleten vid önskad koncentration i lämplig mängd av PBS i USA:s farmakopé (USP) (50 μL per tumör för intradermal injektion och 100 μL per tumör för subkutan injektion).

6. Injicera cancerceller och fibroblaster i möss

OBS: Om det godkänns av den institutionella djurvårdskommittén, injicera två tumörer i varje mus, en på varje flank. Slumpa vilken mus som ska få vilken injektion på höger och vänster sida. Beroende på antalet möss som ska injiceras, bedöva mössen och injicera cancerceller och fibroblaster i mössen i satser.

  1. För subkutan injektion av cancerceller
    1. Bedövar möss enligt beskrivningen i avsnitt 4.1.
    2. Torka av den rakade huden med alkoholpinnar.
    3. Fyll en steril spruta med önskad volym celler eller cellblandning och täck sprutan med en 27-gauge nål.
      OBS: Se till att inga luftbubblor finns. Snärta sprutan efter behov för att ta bort bubblor. När celler har införts i sprutan, håll cellerna i sprutorna väl blandade genom att kontinuerligt invertera sprutorna för att förhindra klumpning.
    4. För in nålen i det subkutana området på musens flank och injicera försiktigt cellerna i musen. Använd 100 μL cellsuspension per tumör för subkutan injektion (användning av volym mer än 100 μL per injektion rekommenderas inte).
    5. Övervaka mössen tills de återhämtar sig från anestesi. Om det behövs, förse mössen med extra isoleringsmaterial som hyddor och / eller värmedynor för att hjälpa mössen att återhämta sig helt.
  2. För intradermala injektioner av cancerceller
    1. Bedövar möss enligt beskrivningen i avsnitt 4.1.
    2. Torka av den rakade huden med alkoholpinnar.
    3. Fyll en steril spruta med önskad volym celler eller cellblandning och täck sprutan med en 27-gauge nål.
      OBS: Se till att inga luftbubblor finns. Snärta sprutan efter behov för att ta bort bubblor. När celler har införts i sprutan, håll cellerna i sprutorna väl blandade genom att kontinuerligt invertera sprutorna för att förhindra klumpning.
    4. För in en 27-gauge nål i den intradermala regionen av huden på musens flank och injicera försiktigt cellerna i den intradermala regionen i musen. Använd 50 μL cellsuspension per tumör för intradermal injektion (användning av volym mer än 50 μL per injektion rekommenderas inte).
    5. Övervaka mössen tills de återhämtar sig från anestesi. Om det finns tecken på att mössen är i nöd, kontakta en veterinär. Om det behövs, förse mössen med extra isoleringsmaterial som hyddor och / eller värmedynor för att hjälpa mössen att återhämta sig helt.

7. Övervaka möss under tumörtillväxt

  1. Övervaka möss dagligen för tecken på smärta eller nöd (böjd hållning, vridning, vokalisering, sträcker sig längs buren, pressar buken till botten av burgolvet eller ovilja att röra sig runt buren) eller abscessbildning. Om det finns tecken på att mössen är i nöd, kontakta en veterinär.
  2. När tumörer bildas, mäta tumörvolymen ungefär varannan tre till tre dagar. Mät tumörlängd (den längsta sidan) och bredd (vinkelrätt mot längden) med bromsok.
    Bästa praxis är att samma person utför dessa mätningar under hela experimentet för att minska variationen i data. För mätningar, bedöva möss enligt beskrivningen i avsnitt 4.1
  3. Beräkna tumörvolymer med formeln Volym = 0,5 x (Längd x Bredd2).

8. Skörda tumörer och mäta tumörvikter

  1. Avliva möss när tumörtillväxt når en experimentell slutpunkt som fastställts av institutionens kommitté för djurvård. Placera möss i en kammare och avliva dem med långsam (20-30% per minut) förskjutning av kammarluft med komprimerad CO2 i en minut efter andningsuppehåll.
  2. Utför cervikal dislokation på mössen. Håll fast gnagaren på en fast, plan yta. Placera en robust penna eller ett annat föremål mot nacken vid basen av skallen. Tryck snabbt framåt och nedåt med föremålet som håller fast huvudet medan du drar bakåt med handen som håller svansens botten. Bekräfta med palpation att ryggmärgen är avskuren.
    OBS: Cervikal dislokation bör utföras av erfaren laboratoriepersonal.
  3. För varje mus i experimentet, bekräfta att musen inte längre lever genom att kontrollera att det inte finns någon andning, ingen hjärtslag och inget svar på en tåknypa.
  4. Använd en steril skalpell och kirurgisk sax, skära hela tumören från musen. Med kirurgisk sax, trimma icke-tumörvävnad från tumören.
  5. Väg tumören på en analytisk balans och registrera tumörvikten.

9. Statistisk analys av tumörvolymer och tumörvikter

  1. Jämför tumörvolymer över tid i varje grupp med upprepade mått variansanalys (ANOVA). Utför paranalys om två tumörer injicerades per mus.
  2. Jämför tumörvikter mellan grupperna med ANOVA med hjälp av ett tvåsidigt test. Tukeys post-hoc-test kan sedan användas för att bestämma vilka grupper som skiljer sig avsevärt från varandra. Utför paranalys om två tumörer injicerades per mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A2058 humana melanomceller och primära humana dermala fibroblaster odlades under sterila förhållanden. Celler samlades in och tvättades tre gånger med PBS. Immunbristfälliga möss (NU/J - Foxn1 naken stam) injicerades subkutant på en flank med 0,25 miljoner A2058 melanomceller ensamma. På den andra flanken injicerades möss med en blandning av 0,25 miljoner A2058 melanomceller och 0,75 miljoner fibroblaster. Celler injicerades i 12 möss med immunbrist. Injektioner i vänster och höger flank randomiserades. Tumörvolymerna övervakades dag 12, 14, 16, 19 och 21 dagar efter injektion (figur 1A). Vid eutanasi skars tumörer ut, avbildades (figur 1B) och vägdes (figur 1C). Förekomsten av fibroblasterna resulterar i betydligt större tumörer.

Figure 1
Figur 1: Jämförelse av melanomtillväxt i närvaro och frånvaro av saminjicerade fibroblaster. Melanomceller infördes i nakna möss antingen med eller utan primära hudfibroblaster. (A) Diagram över tumörvolym över tid för melanom med och utan saminjicerade fibroblaster. Volymen beräknades som 0,5 * längd * bredd2. Medelvolymer och medelfel (SEM) plottas. ANOVA utfördes för att bestämma betydelsen. (B) Bilder av utskurna tumörer. (C) Slutliga vikter av tumörer i slutet av experimentet på dag 21. Medelvikter och SEM ritas upp. Ett oparat, tvåsidigt t-test användes för att jämföra slutliga vikter. * indikerar p < 0,05, *** indikerar p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I experimentet i figur 1 resulterade samtidig introduktion av humana dermala fibroblaster med humana A2058-melanomceller i större tumörer än när melanomcellerna introducerades utan saminjicerade fibroblaster. Denna skillnad kan lätt detekteras baserat på tumörvolym och tumörvikt. Resultaten överensstämmer med flera rapporter om att cancerassocierade fibroblaster kan främja tumörtillväxt 5,6,7,8. Förutom de effektmått som diskuteras här, såsom tumörvolym och tumörvikt, kan ytterligare effektmått också övervakas. Ytterligare analyser är också möjliga. Till exempel kan tumörerna som utvecklas samlas in i formalin för fixering, paraffinbäddad och analyseras med hematoxylin och eosin för histologi. Alternativt kan de utvecklade tumörerna samlas in i optimal skärtemperaturförening (OCT) för vidare analys med immunofluorescens för specifika proteiner.

En viktig begränsning av dessa experiment är att fibroblasterna som saminjiceras med cancercellerna kan senescera eller dö efter några celldelningar. Alternativt kan saminjicerade fibroblaster migrera bort från tumören, i vilket fall de inte kan påverka tumörtillväxten. Om fibroblasterna senesce, dör eller migrerar bort från tumören, kommer de att bli mindre rikliga med tiden och effekten av de saminförda fibroblasterna blir mindre viktig för tumörtillväxt. Faktum är att de introducerade cancercellerna förväntas rekrytera ytterligare fibroblaster från värden. För experiment där en specifik gen slås ner eller slås ut i de införda fibroblasterna, förväntas rekrytering av värdfibroblaster som uttrycker det kodade proteinet över tid minska eventuell fenotyp som kan observeras. För att övervaka förekomsten av de införda fibroblasterna kan fibroblasterna vara genetiskt konstruerade för att uttrycka ett fluorescerande protein såsom GFP26,27. Om fibroblasterna uttrycker GFP kan flödescytometri användas för att övervaka antalet fibroblaster som finns i tumören olika dagar efter att de införts. Som ett alternativ kan luciferasenzymet införas i fibroblasterna och bioluminiscensavbildning kan användas för att övervaka mängden fibroblaster i mössen över tiden. Om fibroblasterna snabbt elimineras från tumörmikromiljön skulle Cre-lox genetiskt modifierade musmodeller ta itu med detta problem och komplettera de beskrivna studierna.

Om experimenten utförs genom att införa humana cancerceller och fibroblaster i nakna möss, förväntas det begränsade immunsystemet ha en betydande inverkan på resultaten. Athymiska nakna möss (NU / J) saknar T-celler och saknar därför cellmedierad immunitet. De har också en partiell defekt i B-cellutveckling. Cellmedierad immunitet, det vill säga dödande av celler via aktiverade CD8 + T-celler, kan spela en viktig roll i undertryckandet av tumörtillväxt28,29. I nyligen genomförda studier har samspelet mellan cancerassocierade fibroblaster och CD8+ T-celler rapporterats30,31,32. Att introducera muscancerceller och musfibroblaster i möss med ett immunsystem kan betraktas som ett alternativt tillvägagångssätt som skulle ta itu med denna fråga.

Ett annat alternativt tillvägagångssätt är att använda genetiskt modifierade musmodeller där Cre-lox-systemet används för att modulera nivåerna eller aktiviteten hos specifika proteiner i värdfibroblaster. Ett sådant tillvägagångssätt är att använda fibroblastberikade Cre-lox-modeller med drivrutiner som FSP1, Col1a1, Col1a2 eller PDGFRa33,34,35. Med en Cre / lox rekombinasmodell skulle det inte finnas någon oro för att de injicerade fibroblasterna kommer att dö eller migrera bort från tumören.

Det finns några steg i protokollet som är avgörande för dess framgång. Tillväxten av fibroblasterna är en viktig del av protokollet och kommer sannolikt att bidra väsentligt till resultatet. Primära fibroblaster senesce lätt, och passagen eller fördubblingarna måste övervakas noggrant för att säkerställa att fibroblasterna är i exponentiell tillväxtfas och inte har åldrats. Senescenta fibroblaster förväntas utsöndra höga nivåer av cytokiner som kan ha en dramatisk effekt på tumörtillväxt36,37,38. Det är därför av stor vikt att passagenummer dokumenteras noggrant och att de fibroblaster som injiceras inte är senescenta såvida inte protokollet kräver analys av senescenta fibroblaster.

När fibroblaster blir sammanflytande kan de förväntas genomgå ett stort antal förändringar, av vilka några sannolikt kommer att vändas när de återgår till cellcykeln 39,40,41,42,43,44. Att hålla fibroblasterna i ett proliferativt tillstånd och dela upp dem när de är 90% sammanflytande är viktigt för att säkerställa att studierna är så konsekventa som möjligt. Odling av fibroblaster på vävnadsodlingsplattor påverkar sannolikt också deras beteende och alternativ såsom 3D-kollagenmatriser bör övervägas23,24,25. Fibroblaster odlade i 3D-matriser visar väsentligt annorlunda migrationsmönster än fibroblaster odlade på 2D-ytor 45,46,47,48,49, vilket sannolikt skulle påverka deras tumörfrämjande kapacitet när de införs i tumörer, där fibroblasterna kommer att spela en aktiv roll för att etablera tumörens extracellulära matrismikromiljö50.

Injicera melanomceller i musen via intradermal injektion kan ge mer reproducerbar tumörtillväxt än subkutana injektioner. Detta är ett knepigt steg eftersom det finns mycket lite utrymme i den intradermala regionen. Det är viktigt att placera nålen noggrant. Om intradermala injektioner utförs injiceras endast 50 μL lösning. Även för erfarna forskare kan dessa injektioner läcka. Det är viktigt att notera om varje injektion läckt ut så att om ingen tumör bildas kan den elimineras från den slutliga analysen.

Att förbereda sprutor för injektion är ett annat kritiskt steg. Det är viktigt att ta bort alla bubblor från sprutan, vilket kan kräva att sprutan knäpps för att eliminera bubblorna. Det är också viktigt att cellerna inte klumpar sig. Vänd sprutorna upprepade gånger för att förhindra klumpning.

En annan knepig aspekt av dessa experiment är att mätning av tumörvolym kan variera från person till person. För att begränsa variationen i tumörvolymmätningar är det bra att tilldela en enda laboratoriemedlem ansvar för att ta alla tumörvolymmätningar i alla möss och vid alla tidpunkter under ett experiment.

Det är att föredra att injicera möss med cancerceller från samma kön som värdmusen när det är möjligt. Det är möjligt att använda båda könen och inkludera kön som en variabel i ANOVA-modeller för att avgöra om kön påverkar tumörstorlek över tid.

Att förstå tumörmikromiljön är avgörande för att få insikt i tumörgenes. Protokollet kan ge en grund för att förstå fibroblasternas roll, olika typer av fibroblaster och olika vägar inom fibroblaster som kan påverka tumörtillväxten. Resultat från dessa experiment kan identifiera nya terapeutiska mål som förhindrar fibroblaster från att främja tumörtillväxt18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka alla medlemmar i Coller-laboratoriet för hjälpsam input. H.A.C. var Milton E. Cassel-forskaren vid Rita Allen Foundation. Vi erkänner NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanoma Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, Iris Cantor Women's Health Center / UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, University of California Cancer Research Coordinating Committee, David Geffen School of Medicine Metabolism Theme Award, Clinical Translational Science Institute och Jonsson Comprehensive Cancer Center, Innovation Awards från Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills och Ha Gaba), ett pris från UCLA SPORE in Prostate Cancer (National Cancer Institute of National Institutes of Health under Award Number P50CA092131), ett innovationspris från Broad Stem Cell Center, Eli och Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research vid UCLA, utbildningsprogrammet för tumörcellbiologi (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), dermatologi T32-programmet vid UCLA AR071307 och UCLA Muscle Cell Biology, patofysiologi och terapeutik T32 Training Program 5 T32 AF 65972.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, T., et al. Cancer-associated fibroblasts: an emerging target of anti-cancer immunotherapy. Journal of Hematology and Oncololgy. 12 (1), 86 (2019).
  2. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25 (6), 719-734 (2014).
  3. Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
  4. Zhang, J., et al. Fibroblast-specific protein 1/S100A4-positive cells prevent carcinoma through collagen production and encapsulation of carcinogens. Cancer Research. 73 (9), 2770-2781 (2013).
  5. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1503-1523 (2014).
  6. Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
  7. Wang, W., et al. Crosstalk to stromal fibroblasts induces resistance of lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. Clinical Cancer Research. 15 (21), 6630-6638 (2009).
  8. Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
  9. Tsujino, T., et al. Stromal myofibroblasts predict disease recurrence for colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 13 (7), 2082-2090 (2007).
  10. Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nature Medicine. 22 (5), 497-505 (2016).
  11. Cukierman, E., Bassi, D. E. Physico-mechanical aspects of extracellular matrix influences on tumorigenic behaviors. Seminars in Cancer Biology. 20 (3), 139-145 (2010).
  12. Attieh, Y., et al. Cancer-associated fibroblasts lead tumor invasion through integrin-beta3-dependent fibronectin assembly. Journal of Cell Biology. 216 (11), 3509-3520 (2017).
  13. Ahmadzadeh, M., Rosenberg, S. A. TGF-beta 1 attenuates the acquisition and expression of effector function by tumor antigen-specific human memory CD8 T cells. Journal of Immunology. 174 (9), 5215-5223 (2005).
  14. Feig, C., et al. Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 110 (50), 20212-20217 (2013).
  15. Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
  16. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  17. Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontiers in Immunology. 9, 414 (2018).
  18. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  19. Grum-Schwensen, B., et al. Suppression of tumor development and metastasis formation in mice lacking the S100A4(mts1) gene. Cancer Research. 65 (9), 3772-3780 (2005).
  20. Kojima, M., et al. Human subperitoneal fibroblast and cancer cell interaction creates microenvironment that enhances tumor progression and metastasis. PLoS One. 9 (2), 88018 (2014).
  21. Noel, A., et al. Enhancement of tumorigenicity of human breast adenocarcinoma cells in nude mice by matrigel and fibroblasts. British Journal of Cancer. 68 (5), 909-915 (1993).
  22. Sullivan, L. M. Estimation from samples. Circulation. 114 (5), 445-449 (2006).
  23. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  24. Damianova, R., Stefanova, N., Cukierman, E., Momchilova, A., Pankov, R. Three-dimensional matrix induces sustained activation of ERK1/2 via Src/Ras/Raf signaling pathway. Cell Biology International. 32 (2), 229-234 (2008).
  25. Rhee, S. Fibroblasts in three dimensional matrices: cell migration and matrix remodeling. Experimental & Molecular Medicine. 41 (12), 858-865 (2009).
  26. Hoffman, R. M. Application of GFP imaging in cancer. Labortatory Investigation. 95 (4), 432-452 (2015).
  27. Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
  28. Naito, Y., et al. CD8+ T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer. Cancer Research. 58 (16), 3491-3494 (1998).
  29. Fu, C., Jiang, A. Dendritic Cells and CD8 T Cell Immunity in Tumor Microenvironment. Frontiers Immunolofy. 9, 3059 (2018).
  30. Lakins, M. A., Ghorani, E., Munir, H., Martins, C. P., Shields, J. D. Cancer-associated fibroblasts induce antigen-specific deletion of CD8 (+) T Cells to protect tumour cells. Nature Communications. 9 (1), 948 (2018).
  31. Kato, T., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Affect Intratumoral CD8(+) and FoxP3(+) T Cells Via IL6 in the Tumor Microenvironment. Clinical Cancer Research. 24 (19), 4820-4833 (2018).
  32. Gorchs, L., et al. Human Pancreatic Carcinoma-Associated Fibroblasts Promote Expression of Co-inhibitory Markers on CD4(+) and CD8(+) T-Cells. Frontiers Immunology. 10, 847 (2019).
  33. Duscher, D., et al. Fibroblast-Specific Deletion of Hypoxia Inducible Factor-1 Critically Impairs Murine Cutaneous Neovascularization and Wound Healing. Plastic Reconstructive Surgery. 136 (5), 1004-1013 (2015).
  34. Zheng, B., Zhang, Z., Black, C. M., de Crombrugghe, B., Denton, C. P. Ligand-dependent genetic recombination in fibroblasts : a potentially powerful technique for investigating gene function in fibrosis. American Journal of Pathology. 160 (5), 1609-1617 (2002).
  35. Swonger, J. M., Liu, J. S., Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Genetic tools for identifying and manipulating fibroblasts in the mouse. Differentiation. 92 (3), 66-83 (2016).
  36. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
  37. Ortiz-Montero, P., Londono-Vallejo, A., Vernot, J. P. Senescence-associated IL-6 and IL-8 cytokines induce a self- and cross-reinforced senescence/inflammatory milieu strengthening tumorigenic capabilities in the MCF-7 breast cancer cell line. Cell Communication and Signaling. 15 (1), 17 (2017).
  38. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  39. Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biolofy. 4 (3), 83 (2006).
  40. Mitra, M., et al. Alternative polyadenylation factors link cell cycle to migration. Genome Biolofy. 19 (1), 176 (2018).
  41. Lemons, J. M., et al. Quiescent fibroblasts exhibit high metabolic activity. PLoS Biology. 8 (10), 1000514 (2010).
  42. Suh, E. J., et al. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biology. 13 (12), 121 (2012).
  43. Legesse-Miller, A., et al. Quiescent fibroblasts are protected from proteasome inhibition-mediated toxicity. Molecular Biology of the Cell. 23 (18), 3566-3581 (2012).
  44. Evertts, A. G., et al. H4K20 methylation regulates quiescence and chromatin compaction. Molecular Biology of the Cell. 24 (19), 3025-3037 (2013).
  45. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  46. Marinkovic, A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Matrices of physiologic stiffness potently inactivate idiopathic pulmonary fibrosis fibroblasts. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 422-430 (2013).
  47. Tschumperlin, D. J. Fibroblasts and the ground they walk on. Physiology (Bethesda). 28 (6), 380-390 (2013).
  48. Tschumperlin, D. J., et al. Mechanotransduction through growth-factor shedding into the extracellular space. Nature. 429 (6987), 83-86 (2004).
  49. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
  50. Alexander, J., Cukierman, E. Stromal dynamic reciprocity in cancer: intricacies of fibroblastic-ECM interactions. Current Opinions in Cell Biology. 42, 80-93 (2016).

Tags

Cancerforskning Cancerassocierade fibroblaster xenograft melanom intradermal injektion ortotopisk tumörmikromiljö
En musmodell för att undersöka rollen av cancerassocierade fibroblaster i tumörtillväxt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus,… More

Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus, A., Haley, E., Guinn, E., Vo, A., Le, P., Kesaf, A. E., Nguyen, J., Guo, L., Frederick, D., Sun, Z., Guo, N., Sevier, P., Bilotta, E., Atai, K., Voisin, L., Coller, H. A. A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth. J. Vis. Exp. (166), e61883, doi:10.3791/61883 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter