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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un modèle murin pour étudier le rôle des fibroblastes associés au cancer dans la croissance tumorale

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61883
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2, 1,2,4
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

Un protocole pour co-injecter des cellules cancéreuses et des fibroblastes et surveiller la croissance tumorale au fil du temps est fourni. Ce protocole peut être utilisé pour comprendre la base moléculaire du rôle des fibroblastes en tant que régulateurs de la croissance tumorale.

Abstract

Les fibroblastes associés au cancer (CAF) peuvent jouer un rôle important dans la croissance tumorale en créant un microenvironnement favorisant la tumeur. Les modèles pour étudier le rôle des CAF dans le microenvironnement tumoral peuvent être utiles pour comprendre l’importance fonctionnelle des fibroblastes, des fibroblastes de différents tissus et des facteurs génétiques spécifiques dans les fibroblastes. Les modèles murins sont essentiels pour comprendre les contributeurs à la croissance et à la progression tumorales dans un contexte in vivo. Ici, un protocole dans lequel les cellules cancéreuses sont mélangées avec des fibroblastes et introduites chez la souris pour développer des tumeurs est fourni. La taille des tumeurs au fil du temps et le poids final de la tumeur sont déterminés et comparés entre les groupes. Le protocole décrit peut fournir plus d’informations sur le rôle fonctionnel des CAF dans la croissance et la progression tumorales.

Introduction

Dans le microenvironnement tumoral, l’un des types de cellules les plus importants est le fibroblaste associé au cancer (CAF)1. Ces fibroblastes associés au carcinome peuvent jouer un rôle suppresseur de tumeur 2,3. Par exemple, les fibroblastes exprimant S100A sécrètent des collagènes qui peuvent encapsuler des substances cancérigènes et protéger contre la formation de carcinomes4. De plus, l’épuisement des myofibroblastes positifs à l’actine α musculaire lisse (SMA) dans le cancer du pancréas provoque une immunosuppression et accélère la progression du cancer du pancréas2. Les CAF peuvent également co-évoluer avec les cellules cancéreuses et favoriser la progression tumorale 5,6,7,8. Les fibroblastes peuvent synthétiser et sécréter des protéines de matrice extracellulaire qui créent un environnement favorisant les tumeurs8. Ces protéines de la matrice extracellulaire peuvent provoquer un raidissement mécanique du tissu, qui est associé à la progression tumorale 9,10. La matrice extracellulaire déposée peut agir comme une barrière physique qui inhibe l’infiltration immunitaire11. Le dépôt de matrice par les CAF a également été associé à l’invasion tumorale, car il a été démontré que la fibronectine générée par les CAF favorise l’invasion tumorale12. Les CAF favorisent l’angiogenèse et recrutent des cellules immunosuppressives dans le microenvironnement tumoral en sécrétant le facteur de croissance transformant β (TGF-β), le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), l’interleukine-6 (IL-6) et le ligand CXC-chimiokine 12 (CXCL12)13,14,15. En raison de leur rôle central dans la promotion de la croissance tumorale, les fibroblastes associés au cancer sont une cible émergente pour la thérapie anticancéreuse 6,16,17,18.

Le protocole ci-dessous décrit une méthode pour tester comment les fibroblastes affectent la croissance des tumeurs dans un modèle murin bien établi et largement utilisé de la croissance tumorale. Afin de comprendre l’importance des fibroblastes dans le microenvironnement tumoral, le protocole standard d’introduction de cellules cancéreuses chez la souris pour surveiller leur croissance a été modifié pour inclure les fibroblastes avec l’introduction des cellules cancéreuses. Les cellules cancéreuses peuvent être introduites par voie sous-cutanée ou intradermique. L’introduction intradermique entraînerait des tumeurs qui proviennent de la peau elle-même. Les xénogreffes dans lesquelles des cellules cancéreuses et des fibroblastes sont co-injectés à des souris représentent un outil méthodologique important pour disséquer le rôle des fibroblastes, des sous-populations de fibroblastes et des facteurs protéiques dans la capacité à favoriser la croissance du cancer 19,20,21. Un protocole détaillé pour la co-injection de cellules cancéreuses et de fibroblastes chez la souris est fourni. Cette méthode peut être utilisée pour comparer la présence ou l’absence de fibroblastes, pour comparer des fibroblastes provenant de différentes sources20, ou pour comparer des fibroblastes avec et sans expression de protéines spécifiques19. Après l’introduction des cellules cancéreuses et des fibroblastes, la taille de la tumeur peut être surveillée au fil du temps. À la fin des expériences, les tumeurs peuvent être disséquées et pesées. En surveillant la croissance tumorale au fil du temps, l’importance de différents facteurs peut être disséquée.

Il existe des approches alternatives possibles pour étudier le rôle des fibroblastes dans la croissance tumorale. À titre d’exemple, il existe des modèles basés sur Cre-loxed qui permettent l’élimination spécifique des tissus des gènes avec des facteurs exprimés préférentiellement dans les fibroblastes. De telles approches offrent également la possibilité d’étudier le rôle de gènes et de voies spécifiques dans les fibroblastes pour la progression tumorale. Par rapport aux approches basées sur Cre-lox, le protocole fourni représenterait une approche beaucoup plus rapide pour surveiller le rôle des fibroblastes, car la croissance tumorale serait surveillée en quelques semaines seulement. L’approche fournie est également beaucoup moins coûteuse car elle ne nécessite pas de générer et de loger des colonies de souris génétiquement modifiées. Le protocole fourni peut être utilisé pour tester rapidement l’effet de knockdown de différents gènes en utilisant des shRNA plutôt que d’avoir besoin de développer des colonies de souris. L’approche fournie est également plus souple car elle permettrait de comparer différents nombres de fibroblastes, différents ratios de cellules cancéreuses et de fibroblastes, d’éliminer différents gènes et même de comparer des fibroblastes de différents sites tissulaires ou espèces. Une approche Cre-lox aurait l’avantage que les fibroblastes sont présents chez les souris dans un contexte plus physiologique.

Le protocole rapporté ici serait utile pour les scientifiques qui cherchent à surveiller les effets des fibroblastes sur la croissance tumorale rapidement et de manière rentable. Ce protocole est particulièrement utile pour les scientifiques qui étudient différents sous-ensembles de fibroblastes ou de fibroblastes provenant de différentes sources sur la croissance tumorale sur la croissance tumorale. S’il est important que l’initiation de la tumeur se produise dans un contexte physiologique, des modèles murins génétiquement modifiés doivent être envisagés.

Il existe plusieurs approches possibles pour effectuer ces expériences. Les souris immunocompétentes peuvent être utilisées comme hôtes, ce qui permettrait d’étudier les interactions fibroblastes-cellules immunitaires. Pour les modèles murins immunocompétents, des cellules cancéreuses de souris et des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) doivent être injectés. L’utilisation de MEF permet également au chercheur de tirer parti du large éventail de souches de souris knock-out pour tester la présence ou l’absence d’un gène d’intérêt. Alternativement, les souris immunodéficientes peuvent être utilisées pour tester le rôle des fibroblastes humains dans la promotion de la croissance des tumeurs chez les souris dérivées de cellules cancéreuses humaines. L’introduction des cellules cancéreuses peut être effectuée par voie sous-cutanée ou orthotopique. Pour le mélanome, comme décrit ci-dessous, le mélange tumeur-fibroblaste peut être injecté par voie intradermique pour une injection orthotopique qui simule plus étroitement l’emplacement dans la peau où un mélanome se développerait.

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Protocol

Toutes les expériences décrites ont été approuvées par le Comité de protection des animaux de l’Université de Californie à Los Angeles.

REMARQUE: Sélectionnez les cellules cancéreuses et les fibroblastes qui correspondent aux souris hôtes pour la souche de souris. Sélectionnez les cellules cancéreuses et les fibroblastes qui correspondent au sexe de la souris hôte. Procurez-vous des souris provenant de colonies de reproduction ou achetez-les auprès de fournisseurs réputés. Introduire des tumeurs chez les souris âgées de ~ 8 à 10 semaines. Les souris à fourrure seront dans la phase télogène ou de repos du cycle du follicule pileux. Prévoyez un rapport de 0,5 à 3 fibroblastes par cellule cancéreuse.

1. Déterminer le nombre approprié de souris à utiliser pour l’expérimentation

  1. Avant d’effectuer les études, effectuer une analyse de puissance pour déterminer le nombre approprié de souris à utiliser pour les études. Utilisez la formule suivante pour déterminer la taille de l’échantillon pour une expérience avec la puissance spécifiée :
    n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
    Si α est le niveau de signification sélectionné (généralement 0,05), alors 1-α/2 = 0,975 et Z = 1,960.
    β est la puissance et si 80% de puissance est souhaitée, alors Z = 0,84.

    ES, l’ampleur de l’effet = \μ1-μ 0\/σ
    où μ 0 est la moyenne sous l’hypothèse H0, μ 1 est la moyenne sous l’hypothèse H1, et σ est l’écart-type du résultat d’intérêt22.
    REMARQUE : Vous trouverez de plus amples renseignements sur le calcul de la taille de l’échantillon22.

2. Générer des cellules cancéreuses pour injection

  1. Déterminez le taux de croissance pertinent à l’aide de l’équation suivante :
    Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t

    Remarque : Un exemple pour les cellules qui doublent en 24 heures est montré
    Temps de doublement = ln(2)/taux de croissance
    24 heures = ln(2)/taux de croissance
    24*taux de croissance = 0,693
    Taux de croissance = 0,693/24 = 0,028875
  2. Déterminer le nombre de cellules cancéreuses à plaquer et la quantité de temps dont les cellules ont besoin avant l’injection.
    REMARQUE: 0,25 à 1 million de cellules cancéreuses sont injectées pour chaque tumeur formée.
  3. Calculer le nombre de jours nécessaires pour générer un nombre suffisant de cellules selon l’équation
    N(t)=N(0)egr*t
    où N(t) est le nombre de cellules au temps t, N(0) est le nombre de cellules au temps 0, gr est le taux de croissance et t est le temps.
    NOTE: Un exemple de ces calculs pour la croissance de 500 000 cellules pour générer 106 cellules dans chacune des 12 tumeurs. Sur la base de ces calculs, 5 jours suffisent pour faire croître le nombre nécessaire de cellules:
    N(t)=N(0)egr*t
    12 x 106 = 500 000e(gr*t)
    12 x 106=500 000e(.028875*t)
    24=e(.028875*x)
    ln(24)=0,028875x
    3,178=0,028875x
    X = 110 heures = 4,59 jours
    Prévoyez plus de temps pour que les cellules se fixent à la plaque et pour les cellules perdues pendant la collecte.
  4. Cellules cancéreuses de la plaque.
    REMARQUE : Portez des gants et des blouses de laboratoire lorsque vous travaillez avec des cellules en culture.
    REMARQUE: Effectuer des manipulations de cellules dans une hotte à flux laminaire pour minimiser l’introduction de microbes de l’air dans les échantillons. Traiter la hotte de culture tissulaire avec de la lumière ultraviolette avant utilisation. Utilisez une technique stérile et uniquement des articles en plastique et des consommables de culture cellulaire stérile tels que des plaques traitées par culture tissulaire, des pipettes et des tubes coniques.
    1. Calculez le nombre et la taille corrects des plaques de culture tissulaire en fonction du nombre de cellules dans le flacon et de la concentration cellulaire souhaitée une fois plaquées.
    2. Étiqueter les plaques de culture tissulaire.
    3. Préparer un bain-marie avec de l’eau à 37 °C.
    4. Appliquer au milieu aliquote dans des tubes coniques et placer au bain-marie à 37 °C. De nombreuses cellules cancéreuses peuvent être cultivées dans le milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
    5. Retirez le nombre requis de flacons de cellules congelées du congélateur d’azote liquide.
      REMARQUE : Utilisez des gants de congélation lorsque vous manipulez des cellules dans un congélateur à azote liquide.
    6. Décongeler rapidement les flacons cellulaires au bain-marie tout en secouant doucement.
      REMARQUE: Ajouter de l’éthanol aux gants lors de la manipulation des flacons pour maintenir la stérilité.
    7. En utilisant une technique stérile dans une hotte de culture tissulaire, pipeter les cellules dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de DMEM + 10% FBS.
    8. Centrifuger le mélange cellulaire à 180 x g pendant 5 minutes.
    9. Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une aspiration stérile ou d’une pipette stérile de 10 mL.
    10. Remettez doucement en suspension les cellules de la pastille dans 1 mL de DMEM + 10% FBS.
    11. Pipeter les cellules en suspension sur une plaque de culture tissulaire marquée avec un p1000 stérile.
    12. À l’aide de pipettes stériles de 10 mL, le milieu pipet avec le sérum dans des plaques de culture tissulaire.
    13. Incuber des plaques de culture tissulaire dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C avec 5% de CO2.
  5. Développer les cellules cancéreuses pour générer suffisamment de cellules cancéreuses pour l’injection.
    REMARQUE: Surveillez les cellules avec la microscopie optique pour la confluence. Trypsiniser tous les deux à trois jours ou au besoin pour empêcher les cellules d’atteindre 100% de confluence. Si un grand nombre de cellules est nécessaire, utilisez des hyperflacons (Tableau des matériaux) pour faire croître un grand nombre de cellules de manière efficace et moyenne. Chaque fois que les cellules doivent être passées, suivez cette procédure :
    1. Retirer le milieu de la plaque à l’aide d’une aspiration stérile ou d’une pipette stérile de 10 mL.
    2. Lavez doucement la plaque en pipetant sur une solution saline tamponnée au phosphate chaud (PBS). Ensuite, retirez le PBS avec une aspiration stérile ou une pipette.
    3. Piper 5 mL de 1x acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans du PBS pour une plaque de 10 cm sur les cellules et incuber pendant 5 minutes à 37 °C.
    4. Retirez les cellules de la plaque avec des tapotements doux pour déloger les cellules de la plaque.
    5. À l’aide d’une pipette stérile de 10 mL, recueillir les cellules dans du DMEM avec du sérum FBS à 10 % dans des tubes coniques.
    6. Centrifuger les tubes coniques à 180 x g pendant 5 minutes.
    7. Retirez le surnageant en le versant. La pastille de cellule doit être visible. Regardez-le pour vous assurer qu’il reste dans le tube.
    8. Remettez les cellules en pâte en suspension en ajoutant 1 mL de DMEM + 10% FBS et en pipetant doucement de haut en bas.
    9. Aliquote a remis les cellules en suspension sur de nouvelles plaques de culture tissulaire de la taille appropriée avec DMEM + 10% FBS (10 ml de milieu conviennent pour une plaque de culture tissulaire de 10 cm).

3. Générer des fibroblastes pour injection

REMARQUE: Les fibroblastes primaires vont sénescent après trop de doublages / passages. Il est important d’utiliser des fibroblastes primaires après un nombre limité de passages ou de doublements. Gardez une trace du nombre de passages ou de doublements que les fibroblastes ont développés à partir de la souris ou de la peau humaine. Utilisez des fibroblastes avec moins de 15 passages pour les fibroblastes dermiques humains primaires. Utilisez des fibroblastes avec moins de 9 passages pour les fibroblastes embryonnaires de souris. Les fibroblastes sont altérés lorsqu’ils deviennent confluents. Trypsiniser les fibroblastes quand ils sont confluents à environ 90%. Les fibroblastes auront des propriétés différentes selon la façon dont ils sont cultivés. De nombreux scientifiques promeuvent la culture sur des substrats physiologiquement plus pertinents que les plaques de culture tissulaire telles que les matrices de collagène 3D qui capturent plus efficacement des environnements semblables à des tissus23,24,25.

  1. Utilisez l’équation de la section 2.1 pour déterminer le taux de croissance des cellules fibroblastiques.
  2. Utilisez l’équation de la section 2.2 pour déterminer le nombre de jours nécessaires pour dilater les fibroblastes.
  3. Plaquez les fibroblastes comme décrit à la rubrique 2.3 en utilisant le milieu approprié le jour approprié pour vous assurer que les cellules cancéreuses et les fibroblastes seront prêts pour l’injection le même jour.
  4. Étendre les fibroblastes dans le milieu approprié pour générer un nombre suffisant de fibroblastes nécessaires en suivant les procédures décrites à la section 2.4.

4. Raser des souris pour préparer les souris à l’injection

REMARQUE: Portez des blouses de laboratoire, des filets à cheveux, des couvre-chaussures et des gants lorsque vous travaillez avec des souris.

  1. Un à deux jours avant l’injection, conformément aux règles du comité institutionnel de protection des animaux, anesthésier les souris. Si vous utilisez de l’isoflurane pour l’anesthésie, utilisez un mélange d’isoflurane etd’O2. Placez les souris dans une chambre d’anesthésie et introduisez un mélange isoflurane (5%)/O2 pour induire l’anesthésie. Ensuite, placez le cône nasal sur l’animal anesthésié pour maintenir le plan chirurgical de l’anesthésie avec un flux constant de mélange isoflurane (2%)/O2 .
  2. Vérifiez les animaux pour vous assurer qu’ils sont dans le plan chirurgical approprié de l’anesthésie en pinçant l’orteil de la souris et en confirmant que la souris ne bouge pas.
  3. À l’aide d’une tondeuse à animaux avec lame chirurgicale #40, retirez doucement la fourrure des positions appropriées sur les flancs des souris en passant la tondeuse à animaux sur la peau plusieurs fois jusqu’à ce que la fourrure soit enlevée.
  4. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles se rétablissent de l’anesthésie.

5. Préparer les cellules cancéreuses et les fibroblastes pour l’injection

REMARQUE : Les cellules cancéreuses et les fibroblastes doivent être injectés dès que possible après le prélèvement, de préférence dans les 30 minutes. Le matin de l’injection, récoltez les cellules cancéreuses et les fibroblastes séparément des plaques de culture tissulaire. Pour chaque type de cellule, procédez comme suit :

  1. Retirer le milieu de la plaque de culture tissulaire par aspiration stérile douce ou en pipetant le milieu.
  2. Pipeter doucement sur 5 ml de PBS sans perturber les cellules. Faites tourbillonner le PBS. Aspirer doucement le PBS par aspiration ou pipeter le PBS.
  3. Pipeter doucement 5 ml de trypsine-EDTA dans du PBS sur la couche cellulaire et incuber pendant 5 minutes à 37 °C.
  4. Retirez les cellules de la plaque avec des tapotements doux pour déloger les cellules. Piper les cellules plusieurs fois avec une pipette de 10 ml et transférer les cellules dans un tube conique contenant du DMEM avec 10% de FBS.
  5. Centrifuger les tubes coniques à 180 x g pendant 5 minutes.
  6. Retirez le surnageant en le versant doucement, en conservant la pastille de cellule. Lavez la pastille de cellule deux fois avec du PBS. Chaque fois, pipeter 10 mL de PBS sur les cellules. Mélanger délicatement avec une pipette p1000.
  7. Centrifuger les cellules comme à l’étape 5.5. Retirez délicatement le PBS à l’aide d’une pipette et répétez.
  8. Remettez en suspension les cellules lavées et granulées dans 1 mL de PBS avec un p1000.
  9. Nettoyez une lame d’hémocytomètre avec de l’alcool et séchez-la.
  10. Piper 100 μL du mélange cellulaire dans un tube et ajouter 400 μL de bleu de trypan à 0,4% pour obtenir une concentration finale de bleu de trypan de 0,32%.
  11. Remplissez doucement les chambres d’un hémocytomètre en verre sous la lamelle de couverture en pipetant le mélange de cellules jusqu’à ce que la chambre soit pleine.
  12. À l’aide d’un microscope, concentrez-vous sur les lignes de grille d’un objectif 10x.
  13. Comptez les cellules vivantes non colorées et les cellules bleues dans un ensemble de 16 carrés.
  14. Comptez les 4 séries de 16 carrés.
  15. Faites la moyenne du nombre de cellules pour les cellules claires et bleues des 4 ensembles de 16 carrés et multipliez par 10 000. Multiplier par 5 pour corriger la dilution 1:5 du bleu de trypan.
  16. Les comptes finaux sont la concentration en cellules/mL pour les cellules viables et mortes. Multipliez par le volume pour déterminer le nombre total de cellules cancéreuses et de fibroblastes. Confirmez que la fraction de cellules viables est de >80%.
  17. Confirmer qu’il y a un nombre suffisant de cellules de mélanome et de fibroblastes pour toutes les injections prévues, en supposant une perte d’échantillon d’au moins 20% pendant les injections.
  18. Transférer le nombre requis de cellules dans un nouveau tube conique et granuler les cellules par centrifugation (180 x g pendant 5 minutes).
  19. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL.
  20. Resuspendre la pastille à la concentration requise dans la quantité appropriée de PBS de qualité United States Pharmacopeia (USP) (50 μL par tumeur pour injection intradermique et 100 μL par tumeur pour injection sous-cutanée).

6. Injecter des cellules cancéreuses et des fibroblastes à la souris

REMARQUE : Si approuvé par le comité de protection des animaux de l’établissement, injecter deux tumeurs dans chaque souris, une sur chaque flanc. Randomisez quelle souris recevra quelle injection sur les flancs droit et gauche. Selon le nombre de souris à injecter, anesthésiez les souris et injectez des cellules cancéreuses et des fibroblastes dans les souris par lots.

  1. Pour l’injection sous-cutanée de cellules cancéreuses
    1. Anesthésier les souris comme décrit à la rubrique 4.1.
    2. Essuyez la peau rasée avec des tampons imbibés d’alcool.
    3. Remplissez une seringue stérile avec le volume désiré de cellules ou de mélange cellulaire et coiffez la seringue avec une aiguille de calibre 27.
      REMARQUE: Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente. Agitez la seringue au besoin pour enlever les bulles. Une fois que les cellules ont été introduites dans la seringue, gardez les cellules à l’intérieur des seringues bien mélangées en inversant continuellement les seringues pour éviter l’agglutination.
    4. Insérez l’aiguille dans la région sous-cutanée sur le flanc de la souris et injectez doucement les cellules dans la souris. Utilisez 100 μL de suspension cellulaire par tumeur pour l’injection sous-cutanée (l’utilisation d’un volume supérieur à 100 μL par injection n’est pas recommandée).
    5. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles se rétablissent de l’anesthésie. Si nécessaire, fournissez aux souris des matériaux isolants supplémentaires tels que des huttes et / ou des coussins chauffants pour aider les souris à récupérer complètement.
  2. Pour les injections intradermiques de cellules cancéreuses
    1. Anesthésier les souris comme décrit à la rubrique 4.1.
    2. Essuyez la peau rasée avec des tampons imbibés d’alcool.
    3. Remplissez une seringue stérile avec le volume désiré de cellules ou de mélange cellulaire et coiffez la seringue avec une aiguille de calibre 27.
      REMARQUE: Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente. Agitez la seringue au besoin pour enlever les bulles. Une fois que les cellules ont été introduites dans la seringue, gardez les cellules à l’intérieur des seringues bien mélangées en inversant continuellement les seringues pour éviter l’agglutination.
    4. Insérez une aiguille de calibre 27 dans la région intradermique de la peau sur le flanc de la souris et injectez doucement les cellules dans la région intradermique de la souris. Utilisez une suspension cellulaire de 50 μL par tumeur pour l’injection intradermique (l’utilisation d’un volume supérieur à 50 μL par injection n’est pas recommandée).
    5. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles se rétablissent de l’anesthésie. S’il y a des signes que les souris sont en détresse, consultez un vétérinaire. Si nécessaire, fournissez aux souris des matériaux isolants supplémentaires tels que des huttes et / ou des coussins chauffants pour aider les souris à récupérer complètement.

7. Surveiller les souris pendant la croissance tumorale

  1. Surveillez quotidiennement les souris pour détecter tout signe de douleur ou de détresse (posture voûtée, tordus, vocalisation, étirement le long de la cage, pression de leur abdomen au fond du sol de la cage ou réticence à se déplacer dans la cage) ou formation d’abcès. S’il y a des signes que les souris sont en détresse, consultez un vétérinaire.
  2. Une fois que les tumeurs sont formées, mesurer le volume tumoral environ tous les deux à trois jours. Mesurez la longueur de la tumeur (le côté le plus long) et la largeur (perpendiculaire à la longueur) avec des étriers.
    REMARQUE : Les meilleures pratiques consistent pour la même personne à effectuer ces mesures tout au long de l’expérience afin de réduire la variabilité des données. Pour les mesures, anesthésier les souris comme décrit à la rubrique 4.1
  3. Calculez les volumes tumoraux avec la formule Volume = 0,5 x (Longueur x Largeur2).

8. Récolter les tumeurs et mesurer le poids des tumeurs

  1. Euthanasier les souris lorsque la croissance tumorale atteint un point final expérimental établi par le Comité de l’institution sur les soins aux animaux. Placez les souris dans une chambre et euthanasiez-les avec un déplacement lent (20-30% par minute) de l’air de la chambre avec du CO2 comprimé pendant une minute après l’arrêt de la respiration.
  2. Effectuer une luxation cervicale sur les souris. Retenez le rongeur sur une surface ferme et plane. Placez un stylo robuste ou un autre objet contre la nuque à la base du crâne. Poussez rapidement vers l’avant et vers le bas avec l’objet retenant la tête tout en tirant vers l’arrière avec la main tenant la base de la queue. Confirmez à la palpation que la moelle épinière est sectionnée.
    REMARQUE: La luxation cervicale doit être effectuée par du personnel de laboratoire expérimenté.
  3. Pour chaque souris de l’expérience, confirmez que la souris n’est plus en vie en vérifiant qu’il n’y a pas de respiration, pas de battement de cœur et pas de réponse à un pincement d’orteil.
  4. À l’aide d’un scalpel stérile et de ciseaux chirurgicaux, excisez toute la tumeur de la souris. Avec des ciseaux chirurgicaux, coupez le tissu non tumoral de la tumeur.
  5. Pesez la tumeur sur une balance analytique et enregistrez le poids de la tumeur.

9. Analyse statistique des volumes tumoraux et des poids tumoraux

  1. Comparer les volumes tumoraux au fil du temps dans chaque groupe avec l’analyse de variance à mesures répétées (ANOVA). Effectuer une analyse par paires si deux tumeurs ont été injectées par souris.
  2. Comparez les poids tumoraux entre les groupes avec ANOVA en utilisant un test bilatéral. Le test post-hoc de Tukey peut ensuite être utilisé pour déterminer quels groupes sont significativement différents les uns des autres. Effectuer une analyse par paires si deux tumeurs ont été injectées par souris.

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Representative Results

Des cellules de mélanome humain A2058 et des fibroblastes dermiques humains primaires ont été cultivés dans des conditions stériles. Les cellules ont été collectées et lavées trois fois avec du PBS. Des souris immunodéficientes (NU/J - souche nue Foxn1) ont été injectées par voie sous-cutanée sur un flanc avec 0,25 million de cellules de mélanome A2058 seulement. Sur l’autre flanc, des souris ont été injectées avec un mélange de 0,25 million de cellules de mélanome A2058 et 0,75 million de fibroblastes. Des cellules ont été injectées à 12 souris immunodéficientes. Les injections dans les flancs gauche et droit ont été randomisées. Les volumes tumoraux ont été surveillés les jours 12, 14, 16, 19 et 21 jours après l’injection (Figure 1A). Lors de l’euthanasie, les tumeurs ont été excisées, imagées (Figure 1B) et pesées (Figure 1C). La présence des fibroblastes entraîne des tumeurs significativement plus grandes.

Figure 1
Figure 1 : Comparaison de la croissance du mélanome en présence et en l’absence de fibroblastes co-injectés. Les cellules de mélanome ont été introduites chez des souris nues avec ou sans fibroblastes cutanés primaires. (A) Tracé du volume tumoral dans le temps pour les mélanomes avec et sans fibroblastes co-injectés. Le volume a été calculé comme 0,5 * longueur * largeur2. Les volumes moyens et l’erreur-type de la moyenne (MEB) sont tracés. L’ANOVA a été réalisée pour déterminer l’importance. (B) Images de tumeurs excisées. (C) Poids définitifs des tumeurs à la fin de l’expérience le jour 21. Les poids moyens et le MEB sont tracés. Un test t bilatéral non apparié a été utilisé pour comparer les poids finaux. * indique p < 0,05, *** indique p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans l’expérience de la figure 1, l’introduction concomitante de fibroblastes dermiques humains avec des cellules de mélanome A2058 humaines a entraîné des tumeurs plus grandes que lorsque les cellules de mélanome ont été introduites sans fibroblastes co-injectés. Cette différence pourrait être facilement détectée en fonction du volume tumoral et du poids de la tumeur. Les résultats sont cohérents avec plusieurs rapports selon lesquels les fibroblastes associés au cancer peuvent favoriser la croissance tumorale 5,6,7,8. En plus des critères d’évaluation discutés ici, tels que le volume tumoral et le poids de la tumeur, des critères d’évaluation supplémentaires peuvent également être surveillés. Des analyses supplémentaires sont également possibles. Par exemple, les tumeurs qui se développent peuvent être collectées en formol pour la fixation, incorporées dans la paraffine et analysées avec de l’hématoxyline et de l’éosine pour l’histologie. Alternativement, les tumeurs développées peuvent être collectées en composé de température de coupe optimale (OCT) pour une analyse plus approfondie avec immunofluorescence pour des protéines spécifiques.

Une limitation importante de ces expériences est que les fibroblastes qui sont co-injectés avec les cellules cancéreuses peuvent sénescent ou mourir après quelques divisions cellulaires. Alternativement, les fibroblastes co-injectés peuvent migrer loin de la tumeur, auquel cas, ils peuvent ne pas affecter la croissance tumorale. Si les fibroblastes sénescent, meurent ou migrent loin de la tumeur, ils deviendront moins abondants avec le temps et l’effet des fibroblastes co-introduits deviendra moins important pour la croissance tumorale. En effet, les cellules cancéreuses introduites devraient recruter des fibroblastes supplémentaires de l’hôte. Pour les expériences dans lesquelles un gène spécifique est renversé ou éliminé dans les fibroblastes introduits, au fil du temps, le recrutement de fibroblastes hôtes qui expriment la protéine codée devrait réduire tout phénotype qui pourrait être observé. Pour surveiller la présence des fibroblastes introduits, les fibroblastes peuvent être génétiquement modifiés pour exprimer une protéine fluorescente telle que GFP26,27. Si les fibroblastes expriment la GFP, la cytométrie en flux peut être utilisée pour surveiller le nombre de fibroblastes présents dans la tumeur différents jours après leur introduction. Comme alternative, l’enzyme luciférase peut être introduite dans les fibroblastes et l’imagerie par bioluminescence peut être utilisée pour surveiller la quantité de fibroblastes chez les souris au fil du temps. Si les fibroblastes sont rapidement éliminés du microenvironnement tumoral, les modèles murins génétiquement modifiés Cre-lox répondraient à cette préoccupation et compléteraient les études décrites.

Si les expériences sont effectuées en introduisant des cellules cancéreuses humaines et des fibroblastes dans des souris nues, le système immunitaire limité devrait avoir un impact significatif sur les résultats. Les souris nues athymiques (NU/J) manquent de lymphocytes T et n’ont donc pas d’immunité à médiation cellulaire. Ils ont également un défaut partiel dans le développement des cellules B. L’immunité à médiation cellulaire, c’est-à-dire la destruction des cellules via les lymphocytes T CD8+ activés, peut jouer un rôle important dans la suppression de la croissance tumorale28,29. Dans des études récentes, l’interaction entre les fibroblastes associés au cancer et les lymphocytes T CD8+ a été signalée30,31,32. L’introduction de cellules cancéreuses de souris et de fibroblastes de souris chez des souris dotées d’un système immunitaire peut être considérée comme une approche alternative qui permettrait de résoudre ce problème.

Une autre approche alternative consiste à utiliser des modèles murins génétiquement modifiés dans lesquels le système Cre-lox est utilisé pour moduler les niveaux ou l’activité de protéines spécifiques dans les fibroblastes de l’hôte. Une telle approche consiste à utiliser des modèles Cre-lox enrichis en fibroblastes avec des pilotes tels que FSP1, Col1a1, Col1a2 ou PDGFRa33,34,35. Avec un modèle de recombinase Cre / lox, il n’y aurait pas de crainte que les fibroblastes injectés meurent ou migrent loin de la tumeur.

Il y a quelques étapes dans le protocole fourni qui sont essentielles à son succès. La croissance des fibroblastes est une partie importante du protocole et est susceptible de contribuer de manière significative au résultat. Les fibroblastes primaires sénescent facilement, et le passage ou les doublements doivent être surveillés attentivement pour s’assurer que les fibroblastes sont dans la phase de croissance exponentielle et n’ont pas sésescé. On s’attend à ce que les fibroblastes sénescents sécrètent des niveaux élevés de cytokines qui peuvent avoir un effet dramatique sur la croissance tumorale36,37,38. Il est donc très important que le numéro de passage soit soigneusement documenté et que les fibroblastes injectés ne soient pas sénescents à moins que le protocole n’exige une analyse des fibroblastes sénescents.

Lorsque les fibroblastes deviennent confluents, on peut s’attendre à ce qu’ils subissent un grand nombre de changements, dont certains seront probablement inversés lorsqu’ils réintégreront le cycle cellulaire 39,40,41,42,43,44. Maintenir les fibroblastes dans un état prolifératif et les diviser lorsqu’ils sont confluents à 90% est important pour s’assurer que les études sont aussi cohérentes que possible. La culture de fibroblastes sur des plaques de culture tissulaire affecte probablement également leur comportement et des alternatives telles que les matrices de collagène 3D devraient être envisagées23,24,25. Les fibroblastes cultivés dans des matrices 3D présentent des schémas de migration sensiblement différents de ceux des fibroblastes cultivés sur des surfaces 2D 45,46,47,48,49, ce qui affecterait probablement leur capacité de promotion tumorale lorsqu’ils sont introduits dans les tumeurs, où les fibroblastes joueront un rôle actif dans l’établissement du microenvironnement de la matrice extracellulaire tumorale50.

L’injection de cellules de mélanome dans la souris par injection intradermique peut produire une croissance tumorale plus reproductible que les injections sous-cutanées. C’est une étape délicate car il y a très peu d’espace dans la région intradermique. Il est important de positionner soigneusement l’aiguille. Si des injections intradermiques sont effectuées, seulement 50 μL de solution sont injectés. Même pour les chercheurs expérimentés, ces injections peuvent fuir. Il est important de noter si chaque injection a fuité afin que, si aucune tumeur ne se forme, elle puisse être éliminée de l’analyse finale.

La préparation des seringues pour injection est une autre étape critique. Il est important de retirer toutes les bulles de la seringue, ce qui peut nécessiter de faire bouger la seringue pour éliminer les bulles. Il est également important que les cellules ne s’agglutinent pas. Retourner les seringues à plusieurs reprises pour éviter l’agglutination.

Un autre aspect délicat de ces expériences est que la mesure du volume tumoral peut varier d’une personne à l’autre. Afin de limiter la variabilité des mesures du volume tumoral, il est utile d’attribuer à un seul membre du laboratoire la responsabilité de prendre toutes les mesures du volume tumoral chez toutes les souris et à tous les points temporels d’une expérience.

Il est préférable d’injecter à des souris des cellules cancéreuses du même sexe que la souris hôte dans la mesure du possible. Il est possible d’utiliser les deux sexes et d’inclure le sexe comme variable dans les modèles ANOVA pour déterminer si le sexe affecte la taille de la tumeur au fil du temps.

Comprendre le microenvironnement tumoral est essentiel pour mieux comprendre la tumorigenèse. Le protocole peut fournir une base pour comprendre le rôle des fibroblastes, des différents types de fibroblastes et des différentes voies au sein des fibroblastes qui peuvent affecter la croissance tumorale. Les résultats de ces expériences peuvent identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui empêcheront les fibroblastes de favoriser la croissance tumorale18.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Coller pour leur contribution utile. H.A.C. était le boursier Milton E. Cassel de la Fondation Rita Allen. Nous remercions NIH/NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanoma Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, Iris Cantor Women’s Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, University of California Cancer Research Coordinating Committee, David Geffen School of Medicine Metabolism Theme Award, le Clinical Translational Science Institute et le Jonsson Comprehensive Cancer Center, Prix de l’innovation du Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills et Ha Gaba), un prix de l’UCLA SPORE in Prostate Cancer (National Cancer Institute of the National Institutes of Health sous le numéro d’attribution P50CA092131), un prix de l’innovation du Broad Stem Cell Center, le Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research de l’UCLA, le programme de formation en biologie des cellules tumorales (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), le programme de dermatologie T32 à UCLA AR071307 et le programme de formation T32 de biologie des cellules musculaires de l’UCLA, de physiopathologie et de thérapeutique 5 T32 AF 65972.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228

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Cancer Research numéro 166 Fibroblastes associés au cancer xénogreffe mélanome injection intradermique orthotopique microenvironnement tumoral
Un modèle murin pour étudier le rôle des fibroblastes associés au cancer dans la croissance tumorale
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Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus,… More

Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus, A., Haley, E., Guinn, E., Vo, A., Le, P., Kesaf, A. E., Nguyen, J., Guo, L., Frederick, D., Sun, Z., Guo, N., Sevier, P., Bilotta, E., Atai, K., Voisin, L., Coller, H. A. A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth. J. Vis. Exp. (166), e61883, doi:10.3791/61883 (2020).

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