Summary
ここでは、正常組織と疾患組織の両方の細胞外マトリックスでフィブリラーコラーゲン組織を定量化するための曲線変換ベースのオープンソースMATLABソフトウェアツールを使用するプロトコルを提示する。このツールは、コラーゲン繊維や他の種類の線状の構造を持つ画像に適用することができます。
Abstract
フィブリラールコラーゲンは、顕著な細胞外マトリックス(ECM)成分であり、そのトポロジー変化は、乳癌、卵巣癌、腎臓癌および膵臓癌を含む幅広い疾患の進行に関連していることが示されている。自由に利用できる繊維定量化ソフトウェアツールは、主に繊維の配置や向きの計算に焦点を当てており、手動ステップの要件、騒々しい背景での繊維エッジの検出の不正確さ、または局在化された特徴の欠如などの制限の対象となります。このプロトコルで説明するコラーゲン繊維定量ツールは、曲線変換(CT)によって可能になる最適なマルチスケール画像表現を使用して特徴付けられる。このアルゴリズムアプローチにより、他のツールから得られた間接的なピクセル単位またはウィンドウごとの情報を使用するのではなく、繊維から直接位置情報と向き情報を提供するために、フィブリラコラーゲン画像からのノイズの除去とファイバエッジの強化が可能になります。この CT ベースフレームワークには、"CT-FIRE" と "CurveAlign" という名前の 2 つの別個のリンクされたパッケージが含まれ、グローバル、関心領域 (ROI)、または個々のファイバ ベースでファイバー組織を定量化できます。この定量フレームワークは、10年以上にわたって開発され、現在では包括的でユーザー主導のコラーゲン定量プラットフォームへと進化してきました。このプラットフォームを使用すると、長さ、角度、幅、直線などの個々のファイバ特性、密度や位置合わせなどのバルク測定など、最大約30のファイバフィーチャを測定できます。また、手動または自動でセグメント化された境界に対して、ファイバ角度を測定することもできます。このプラットフォームには、ROI 分析、自動境界作成、後処理用のモジュールなど、いくつかの追加モジュールも用意されています。このプラットフォームを使用すると、プログラミングや画像処理の経験が必要ではなく、数百または数千の画像を含む大規模なデータセットを処理することができ、生物学的または生物学的医療用途のためのコラーゲン繊維組織の効率的な定量化を可能にします。
Introduction
フィブリラコラーゲンは顕著で、構造ECM成分である。彼らの組織は、組織機能に影響を与え、骨形成不全1、心臓機能不全2、および創傷治癒3から乳癌4、5、6、卵巣7、8、腎臓9、および膵臓癌10を含む異なるタイプの癌に至るまで、多くの疾患の進行に関連している可能性が高い。確立された多くのイメージングモダリティは、第2高調波発生顕微鏡11のようなフィブリラコラーゲンを可視化するために使用することができ、光場または蛍光顕微鏡または偏光顕微鏡12、液晶系偏光顕微鏡(LC-PolScope)13、および電子顕微鏡14と共に染色または染料。フィブリラコラーゲン組織の重要性が明らかになり、これらの方法の使用が増加し、コラーゲン繊維分析法の改善の必要性も高まっています。
フィブリルコラーゲンの自動測定のための計算方法の開発には多くの取り組みが行われてきました。自由に利用可能なソフトウェアツールは、主に、画像タイル17のピクセル15、16、またはフーリエ変換ベースのスペクトル解析に対して第1微分または構造テンソルのいずれかを採用することにより、繊維の配向または向きの計算に焦点を当てる。これらのツールはすべて、手動ステップの要件、雑多な背景でのファイバー エッジの検出の不正確さ、またはローカライズされた特徴の特徴付けの欠如などの制限の対象となります。
このプロトコルで説明する他の自由なオープンソースフリーソフトウェアツールと比較して、このプロトコルで説明されている方法では、CT(最適なマルチスケール、指向性画像表現法)を使用して、フィブリラのコラーゲン画像からノイズを除去し、ファイバーエッジを強化または追跡します。位置と方向に関する情報は、ピクセル単位またはウィンドウごとの間接的な情報を使用してファイバー編成のメトリックを推測するのではなく、ファイバーから直接提供できます。このCTベースのフレームワーク18、19、20、21は、主に2つの別々のリンクされた「CT-FIRE」18、21と「CurveAlign」19、21という名前のパッケージを介して、グローバル、ROI、またはファイバベースでファイバー組織を定量化することができます。ソフトウェアの実装に関する限り、CT-FIREでは、複数のスケールのCT係数を使用して、エッジを強化し、ノイズを低減する画像を再構築することができます。次に、CT再構成画像に個別の繊維抽出アルゴリズムを適用して、代表的な中心点を見つけ、中心点から繊維枝を伸ばし、繊維枝をリンクしてファイバーネットワークを形成するためのファイバーを追跡します。CurveAlign では、ユーザ指定のスケールの CT 係数を使用してローカルの繊維配向を追跡し、カーブレットの方向と位置を抽出してグループ化し、対応する位置で繊維の配向を推定します。この結果として生じる定量化フレームワークは、10年以上にわたって開発され、機能、ユーザーインターフェイス、モジュール性など、多くの面で大きく進化してきました。たとえば、このツールは、ローカルの繊維配向を視覚化し、長さ、角度、幅、直線などの個々の繊維特性を含む最大 30 のファイバー フィーチャ、密度や位置合わせなどのバルク測定を測定できます。さらに、ユーザは手動または自動でセグメント化された境界に対して繊維角度を測定することができ、これは、例えば、乳癌22および膵臓癌研究10における画像ベースのバイオマーカーの発達において重要な役割を果たす。このプラットフォームは、ROI分析、自動境界作成、後処理用の機能モジュールを含む、いくつかの機能モジュールを提供します。ROIモジュールはROIのさまざまな形状にアノータを付け、対応するROI分析を行うために使用できます。アプリケーションの例として、自動境界作成モジュールを使用して、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)の明るいフィールド画像を第2高調波生成(SHG)画像で登録し、登録されたH&E画像から腫瘍境界の画像マスクを生成することができます。後処理モジュールは、個々の画像からの出力データファイルの処理と統合を容易にして、可能な統計分析を行うことができます。
この定量化プラットフォームは、プログラミングや画像処理の経験を必要とせず、数百または数千の画像を含む大規模なデータセットを処理することができ、生物学的または生物医学的用途のためのコラーゲン組織の効率的な定量化を可能にします。私たちも含め、世界中の多くの研究者によって、さまざまな研究分野で広く利用されています。CT-FIREとCurveAlign18、19、20、21に関する4つの主要な出版物があり、そのうち最初の3つは272回引用されています(Google Scholarによると2020-05-04)。このプラットフォーム(CT-FIREまたはCurveAlign)を引用した出版物のレビューは、約35の出版物が私たちのグループと共同で、他の(〜75)が他のグループによって書かれた分析のために直接使用した約110のジャーナルペーパーがあることを示しています。たとえば、 このプラットフォームは、次の研究のために使用されました: 乳癌22,23,24, 膵臓癌10,25, 腎臓癌9,26, 創傷治癒3,27,28,29,30,卵巣癌8,31,7, 子宮蓋靭帯32,低リンゲン歯腺33, 基底 細胞癌34、低酸素肉腫35、軟骨組織36、心臓機能障害37、ニューロン38、神経膠芽腫39、リンパ収縮40、線維性カッコ軟骨41、胃癌42、微小管43、膀胱線維症44とが挙げられる。図1は、SHG画像から乳癌19の腫瘍関連コラーゲンシグネチャを見つけるためにCurveAlignの癌イメージングアプリケーションを示す。図 2は、このプラットフォームの一般的な概略ワークフローを示しています。これらのツールは技術的には18、19、21、および CurveAlign によるアラインメント分析のための通常のプロトコル20も利用できますが、すべての重要な機能を示すビジュアル プロトコルが役立つ可能性があります。ここで示すように、視覚化されたプロトコルは、このプラットフォームを使用する学習プロセスを容易にし、ユーザーが抱える可能性のある懸念事項や疑問に対してより効率的に対処します。
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Protocol
注: このプロトコルは、コラーゲン定量のための CT-FIRE と CurveAlign の使用について説明します。これら 2 つのツールは、補完的な、しかし異なる主な目標を持ち、ある程度一緒にリンクされています。CT-FIREは、高度な後処理およびROI分析を除くほとんどの操作を行うためにCurveAlignインタフェースから起動することができます。CT-FIREのフル動作のためには、別途起動する必要があります。
1. 画像収集と画像の要件
注: このツールは、MATLAB が読み取り可能なラインのような構造を持つイメージ ファイルを、収集に使用するイメージ のモダリティに関係なく処理できます。
- デフォルトの実行パラメータはこの形式に基づいているため、イメージタイプとして 8 ビットのグレースケールを使用します。
注:SHGイメージングは、広く使用されているラベルフリーで高解像度のフィブリラーコラーゲンイメージング方法です。乳がん研究19 のSHG画像は、デモンストレーションのためにここで使用されます。
2. ソフトウェアのインストールとシステム要件
注: スタンドアロンバージョンとソースコードバージョンの両方を自由に利用できます。ソースコードバージョンでは、信号処理、画像処理、統計分析、並列コンピューティングのツールボックスを含む完全なMATLABインストールが必要です。ソースコードバージョンを実行するには、サードパーティのソースからいくつかのフォルダを含むすべての必要なフォルダを MATLAB パスに追加する必要があります。スタンドアロン アプリケーション (APP) の使用は、ほとんどのユーザーに推奨されます。APPのインストールと起動の手順は以下のとおりです。
- CT-FIRE バージョン 3.0 (CTF3.0) と CurveAlign バージョン 5.0 (CA5.0) の APP パッケージを、それぞれ https://eliceirilab.org/software/ctfire/ と https://eliceirilab.org/software/curvealign/ からダウンロードします。
注: 各パッケージには、スタンドアロンの APP、手動、テストイメージが含まれています。 - 上記の Web サイトの詳細な要件とインストール手順に従って 、MATLAB MCR 2018bをインストールします。
- アプリを起動します。
- Windows 64 ビット システムの場合は 、APP アイコンをダブルクリックして起動します。
- Mac システムの場合は、次の手順に従って起動します|。パッケージコンテンツ|を表示コンテンツ|MacOS |アプリケーションランチャー (右クリックして開く選択) .
注:その他の詳細は、2.1に記載されているソフトウェアのウェブサイトで見ることができます。
CT-FIREによる個別繊維抽出
注: CT-FIRE は CT を使用してイメージのノイズを解除し、ファイバー エッジを強化し、ファイバー抽出アルゴリズムを使用して個々のファイバを追跡します。個々のファイバーについて、長さ、角度、幅、直線が計算されます。
- 単一画像または複数画像のCT-FIRE
- 2.3 の説明に従って、APP を起動します。
- メイングラフィカルユーザーインタフェース(GUI、図3A)の[ファイルを開く]ボタンをクリックし、プロンプトウィンドウから1つ以上のイメージ/またはイメージスタックを選択します。オペレーティング システムに適した方法を使用して、ダイアログボックスで複数のイメージを選択します (Windows では、複数のファイルを選択する際にCtrl キーを押しながら選択します)。
注: 2 つ以上のイメージ ファイルを選択した場合、すべてのイメージで同じ実行パラメータを使用する必要があります。すべての画像が同じまたは類似した条件で取得されていることを確認します。 - 複数の画像解析の右上隅にある [平行] チェックボックスをオンにして、並列計算オプションを選択します。
- イメージ スタックの場合、ファイル リストボックスの下にあるスライス スライダーを動かして、分析するスライスを選択します。
- 実行中のプロパティを設定します。一部の画像の初期分析には、デフォルトのパラメータを使用します。デフォルトのパラメータを使用する場合は、手順3.1.6に進みます。別のパラメータを設定するには、[パラメータ]パネルの[更新]ボタンをクリックします。マニュアルに従って、パラメータを適切に調整します。
注: 最も頻繁に調整されるパラメータには、バックグラウンド閾値(thresh_im2)と核生成検索半径 (s_xlinkbox) が含まれます。バックグラウンドノイズレベルが高い場合は 、thresh_im2 大きい値に設定します。 s_xlinkbox は、繊維の平均半径に関連付け、薄繊維を検出するために小さい値を設定する。 - [ 実行 ] ボタンをクリックします。
注: 進行状況の情報は、情報ウィンドウとコマンド ウィンドウの両方に表示されます。解析が完了すると、出力テーブルが表示されます (図 3B)。 - 出力テーブルの任意の項目をクリックすると、長さ、幅、角度、直線性を含む、イメージのファイバーメジャーのヒストグラム (図 3C および 図 3F)が表示されます。
注: 元のイメージ上にファイバーが重なったファイバーイメージも表示されます(図3E)。 - オーバーレイされたイメージの「.tiff」ファイル、「.csv」ファイル、および「.mat」ファイルを含む出力ファイルの画像フォルダの下にある ctFIREout という名前のサブフォルダを確認します。
- CT-FIRE対象領域(ROI)解析
- ROI マネージャを使用した ROI 注釈
- メイン GUI の [ ファイルを開く ] ボタン (図 3A) をクリックして、1 つまたは複数のイメージをロードします。
- ファイルリストで、コメントを付ける画像を選択します。
- ROIオプションパネルのドロップダウンメニューでROIマネージャを選択します。
- [RUN]ボタンをクリックしてROI マネージャモジュールを起動します (図 3A)。
- ROI マネージャ GUI (図 4A)で 、[ROI メニューの描画](d)の下のドロップダウン メニューをクリックして、ROI を 1 つずつ描画します。
注: ROI シェイプは、四角形、フリーハンド、楕円、多角形、または指定された四角形です。画面の指示に従って、ROI 注釈を描画、保存、および終了します。 - ROI を描画する方法を選択した後、元のイメージに表示される黄色の四角形を目的の位置までドラッグし 、[ROI の保存] ボタンをクリックするか、キー を 押して ROI リストにこの ROI を追加します。この ROI には自動的に名前が付けられます。
- 以前の ROI を新しい位置にドラッグして新しい ROI を引き出し、3.2.1.6 で説明したように保存するか、手順 3.2.1.5 ~ 3.2.1.6 を繰り返して新しい ROI を引き出します。
- [X]を押すか、[ROI] 図形のドロップダウン メニューで [新しい ROI? ] を選択して ROI 注釈を終了します。
- [ すべて表示] と [ラベル] チェックボックスをオンにすると、リストに定義されているすべての ROI が表示され、その名前が元のイメージに表示されます。
- ROI リストの ROI を選択して、ROI の名前変更、ROIの削除、ROIテキストの保存、テキストからの ROI の読み込み、ROI マスクの保存、マスクからの ROI の読み込み、および ROI の組み合わせなどの基本的な ROI 操作を実行します。
- 元のイメージ フォルダの下にある ROI_management という名前のサブフォルダに、".mat" ファイルとして保存された ROI マネージャの出力ファイルを確認します。
- 開いているファイル リスト内の別のイメージにアポイントを付けるには、手順 3.2.1.2 ~ 3.2.1.11 を繰り返します。
- 注釈が完了したら、ROI マネージャ GUI を閉じ、メイン GUI の [リセット ] ボタンをクリックしてメイン GUI をリセットします。
- ROI マネージャでの単一画像の ROI 分析
- フルイメージCT-FIRE解析が実行され、結果がデフォルトディレクトリに保存されている場合は、ROIリストの1つまたは複数のROIをクリックし 、ctFIRE ROIアナライザ ボタンをクリックしてポストROI解析モジュールを起動します。
注 : 結果は\\[image フォルダ]\CTF_ROI\個人\ROI_post_analysis\にあるサブフォルダに自動的に保存されます。 - ポップアップ ウィンドウで、[ファイバのチェック] ボタンをクリックして、選択した ROI 内のファイバーを表示します (図 4B)。
- [ 統計量のプロット ]をクリックして、各ROIのヒストグラムを表示します(図4C)。対応する出力数値が表示されます。
- フルイメージのCT-FIRE解析が行われていない場合は、ROIリストの1つまたは複数のROIをクリックし 、[CTFIREをROIに適用 ]ボタンをクリックして、選択したROIにCT-FIRE分析を直接適用します。
- プロンプトウィンドウの指示に従って、分析を実行します。
注: CT-FIRE を実行するためのパラメータはメイン GUI を通して渡され、ユーザは必要に応じてステップ 3.1.5 で説明されているように、実行中のパラメータを更新できます。解析が完了すると、ファイバーメジャーの要約統計量が出力テーブルに表示されます。結果は \\[image フォルダ]\CTF_ROI\個人\ROI_analysis\にあるサブフォルダに自動的に保存されます。
- フルイメージCT-FIRE解析が実行され、結果がデフォルトディレクトリに保存されている場合は、ROIリストの1つまたは複数のROIをクリックし 、ctFIRE ROIアナライザ ボタンをクリックしてポストROI解析モジュールを起動します。
- ROI アナライザを使用した複数の画像の ROI 分析
- 3.2.1 の手順に従って、解析する画像の ROI にアノーチンブを付けます。
- [ファイルを開く] ボタンをクリックして、1 つまたは複数 の画像を開 きます。
- 完全な画像解析結果が得られたときに ROI ポスト解析を実行するには、[ 実行オプション] パネルのドロップダウン メニューをクリックし、オプション CTF ポスト ROI アナライザを選択します。
- 読み込まれた画像すべてに対して ROI 解析を実行するには 、[RUN] ボタンをクリックします。
- GUI の下部のメッセージ・ウィンドウおよびコマンド・ウィンドウに表示される進捗状況を確認します。
- 分析が完了したら、出力テーブルに表示される各 ROI の要約統計量を確認します。
注 : 詳細な出力ファイルは 、\\ [イメージ フォルダ] \CTF_ROI\Batch\ROI_post_analysis\にあるサブフォルダに自動的に保存されます。 - 完全な画像解析結果が得られなかったときに直接解析を実行するには、手順 3.2.3.1 ~ 3.2.3.6 に従って、手順 3.2.3.3.3 でオプション CTF ROI analyzer を選択します。ステップ 3.2.3.4 で 、RUN ボタンをクリックする前に、ステップ 3.1.5 で説明されているように実行中のパラメーターを更新します。 [RUN] ボタンをクリックした後、プロンプト ダイアログ ウィンドウで、任意の図形の [四角形 ROI] と [ROI マスク]を選択します。
注: 注釈付き ROI がすべて長方形の場合、ユーザーは「長方形の ROI」を選択できます。ステップ 3.2.3.6 では、ROI 分析結果は \\[image フォルダー]\CTF_ROI\Batch\ROI_analysis\にあるサブフォルダに保存されます。
- ROI マネージャを使用した ROI 注釈
- CT-FIREでの後処理
注: 3.1 で説明した通常の CT-FIRE 分析の後、ユーザーはさらに後処理を実行できます。時間のかかるファイバー抽出を再度実行することなく、3.3.1 で説明されている通常の後処理では基本的な出力数値プロパティを更新できますが、3.3.2 で説明されている高度な後処理では個々のファイバーとその特性を視覚化し、4 つのファイバ プロパティの中で複雑なしきい値を実行し、選択したファイバーの要約統計情報を生成し、カスタマイズされたカラー マップを使用して選択したファイバーを視覚化できます。- CT-FIREによる定期的な後処理
- CT-FIREアプリを起動するか、他の操作の後にリセットボタンをクリックしてCT-FIREメインGUIを初期化します(図3A)。
- メイン GUI の上部にある [.mat] チェックボックスをオンにします。
- [ファイルを開く]ボタンをクリックして、ctFIREoutサブフォルダのCT-FIRE出力.matファイルを選択します。
注: 複数のファイルが選択されている場合は、[ バッチ ]チェックボックスが自動的にオンになります。対応する画像のファイル名がボックスリストに表示されます。 - 出力図コントロールパネルのオプションを更新します。
- 出力オプションのデフォルトオプションをそのまま使用して、3.3.1.4 で設定された新しいパラメータセットに従ってすべての出力ファイルが更新されるようにします。
- [後処理] ボタン を クリックします。メイン GUI の下部にあるメッセージ ウィンドウとコマンド ウィンドウで進行状況の情報を確認します。
- 解析が完了したら、出力テーブル内の任意の項目をクリックして、長さ、幅、角度、直線などの画像のファイバーメジャーのヒストグラムを確認します。
注: 新しい出力ファイルは 、ctFIREout サブフォルダ内の古いファイルを上書きします。
- CT-FIREの高度な後処理
- CT-FIREアプリを起動するか、他の操作の後にリセットボタンをクリックしてCT-FIREメインGUIを初期化します(図3A)。
- メイン GUI の上部にあるOUT.advチェックボックスをオンにします (図 3A)。
- [後処理] ボタンをクリックして、"分析モジュール" という名前の高度な後処理 GUI を起動します (図 5A)。
- [ファイルを 選択] ボタンをクリックして、画像を選択します。
- [ファイバーを 視覚化 ]ボタンをクリックして、タブ図 のラベルに基づいてファイバー番号を入力します。
注: 選択したファイバーの測定値は出力テーブル (図 5B)に表示され、対応するファイバーは「計測ファイバー 」という名前のタブ図に示されている元の画像に重ねて表示されます (図 5C)。 - [確認/更新]ボタンをクリックして、しきい値の処理に移動します。
- しきい値の設定を有効にするには、しきい値のチェック ボックスをオンにします。
- ドロップダウン メニューから 4 つのしきい値オプションのいずれかを選択します。
- 1 つまたは複数のファイバー プロパティの [しきい値 ] パネルに必要なしきい値を入力します。
- [ 今すぐしきい値 ] ボタンをクリックして、上記のしきい値条件を適用します。
- 図 5Eに示すように、メトリックの視覚化で終わる名前を示すプロンプトの図をチェックして、選択したファイバーが元の画像上にオーバーレイされ、カスタマイズされたカラーマップが表示されます。
- 望ましいしきい値を設定するためにステップ 3.3.2.2.9 - 3.3.2.11 を繰り返します。
- 選択したファイバー情報を保存するには 、[ファイバーを保存 ]ボタンをクリックします。
注: 対応する選択したファイバーは、[ しきい値後]という名前のタブ図に表示されます。 - [統計の 生成 ] ボタンをクリックし、ポップアップ ウィンドウの [OK] ボタンをクリックして、概要の統計情報を生成します。
メモ:出力テーブル(図5D)は、選択したファイバの平均値を示します。選択したファイバーのその他の統計情報は、この GUI の下部にある ステータス ウィンドウに表示される場所を持つ Excel ファイルに保存されます。 - 選択した個々のファイバー情報を出力ファイルに含めるには、[OK]ボタンをクリックする前に [未加工データのシートを生成] チェックボックスをオンにします。
- 複数の画像の結果を結合するには、ステップ 3.3.2.4 で、[ バッチ モード ] ボックスまたは [スタック モード ] をオンにして、分析する複数のイメージまたはスタックを選択します。手順 3.3.2.5 ~ 3.3.2.6 をスキップします。ステップ 3.3.2.8 ~3.3.2.9 では、しきい値条件を設定しますが、 ボタンのしきい値 と ファイバーの保存 が無効になっているため、手順 3.3.2.10 ~3.3.2.13 をスキップします。最後に、ステップ 3.3.2.14 の指示に従って、選択したファイバーの要約統計量と個々のファイバー特性を生成します。
- CT-FIREによる定期的な後処理
4. カーブアラインによる繊維解析
注: CurveAlign は、ユーザー定義の境界に対してファイバーの角度を自動的に測定するために開発されました。CurveAlignの現在のバージョンは、CT-FIREによって抽出された個々のファイバー情報をロードするか、またはカーブレットのローカル方向を直接使用して、相対角度測定に加えて、密度および線形ベースの特徴のバルク評価に使用できます。CurveAlignは、CT-FIREがファイバトラッキング方式として採用された場合、密度や位置合わせを中心に、主に密度や位置合わせ、個々のファイバ特性を含む、グローバルまたはローカルフィーチャに関連する最大 30 個のフィーチャを計算します。
- カーブレットを使用したファイバー解析
- 2.3 の説明に従って、APP を起動します。
- 他の操作 が行 われている場合は、リセットボタンをクリックしてAPPを初期状態にリセットします。
- メイン GUI (図 6A)で、CTが選択されていることを確認するためにファイバー解析方法オプションをチェックします (デフォルト・オプション)。
注: このモードでは、CT はイメージに対して実行され、各カーブレットの方向は対応する位置でのファイバーの方向を表します。 - [ 境界方法 ] ドロップダウン メニューをクリックし、ドロップダウン メニューオプションから境界処理モードを選択します。
注: 境界が不要な場合は、この手順を省略してください。境界に対する繊維角度の計算方法については、4.3 を参照してください。 - メイン GUI の [ イメージの取得 ] ボタン (図 6A)をクリックし、プロンプト ウィンドウから 1 つ以上のイメージ スタックまたはイメージ スタックを選択します。オペレーティング システムに適した方法を使用して、ダイアログボックスで複数のイメージを選択します (Windows では、複数のファイルを選択する際に Ctrl キー を押しながら選択します)。
注: 2 つ以上のイメージ ファイルを選択した場合、すべてのイメージで同じ実行パラメータを使用して解析する必要があります。すべての画像が同じまたは類似した条件で取得されていることを確認します。 - イメージ スタックの場合、ファイル リストボックスの下にあるスライス スライダーを動かして、分析するスライスを選択します。
- 保持する coefs の分数を入力します。この値は、繊維解析で使用される CT の最大係数の割合です。
注: 画像の繊維強度またはコントラストに大きなばらつきがある場合、このモードでは画像内の最も明るいファイバーのみを検出するので、繊維解析のコントラストを持つ対象領域に注釈を付けます。また、画像サイズが大きいほど、この分数に対して小さい値を設定する。 - 出力オプションのすべてのパラメータと、[詳細設定] オプションのパラメータはすべて既定のままにします。出力ファイルは、将来の操作で必要になる可能性があります。
- メイン GUI の下部にある [実行] ボタンをクリックします (図 6A)。
注: 進行状況の情報は、下部に緑色で強調表示されたメッセージ ウィンドウに表示されます。処理が完了すると、各画像の統計情報の要約が出力テーブル (図 6B)に表示され、すべての出力ファイルは元のイメージのディレクトリに CA_Out という名前のサブフォルダーに自動的に保存されます。 - 出力テーブル (図 6B)の項目をクリックすると、ファイバー角度のヒストグラム (図 6E) またはコンパス プロット (図 6F) が表示されます。
メモ: 整列または角度のオーバーレイ画像(図6C)とヒートマップ(図6D)も表示されます。 - [ リセット ]ボタンをクリックして他の操作を実行するか、メインGUIを閉じてAPPを終了します。
- CT-FIREによる個別繊維解析
注: 手順は、手順 4.1.3 で CT-FIRE 関連のファイバ解析モードを選択し、それが適用されず、CT-FIREモードでは無効にされているので、ステップ 4.1.7 をスキップする点を除いて、セクション 4.1 で説明したものと同じです。具体的には、ステップ 4.1.3 で、次の 3 つの CT-FIRE ベースの個別繊維分析方法から 1 つを選択します。- ファイバーの中心点とファイバー角度を使用してファイバーを表す場合は 、CT-FIRE ファイバー を選択します。
注: このオプションでは、ファイバーの長さに沿った繊維の方向の変化は考慮されません。 - ファイバと対応するファイバー角度の 2 つの端点を使用してファイバーを表す場合は 、CT-FIRE エンドポイント を選択します。
注: 4.2.1 と比較して、このオプションは、1 つ(ファイバーの中心点)ではなく、ファイバを表すために 2 つの位置を使用します。 - ファイバーのセグメントを使用してファイバーを表す場合は 、CT-FIRE セグメント を選択します。
注: 各セグメントは、同じ長さ(CT-FIREではデフォルトで5ピクセルに設定)、その方向と位置があり、ファイバーの全長に沿った方向の変化を反映しています。このオプションは最も時間がかかりますが、曲線ファイバのローカル方向の変化を追跡する 3 つの CT-FIRE ベースのファイバ解析方法の中で最適なオプションです。
- ファイバーの中心点とファイバー角度を使用してファイバーを表す場合は 、CT-FIRE ファイバー を選択します。
- 境界を使用した相対位置合わせ解析
注: セクション 4.2 および 4.3 で説明した境界条件のない通常の解析と比較して、境界条件を使用した相対位置合わせ解析には次の条件が必要です。- ステップ 4.1.3 で、ティフ境界条件を選択します。
注: ユーザーは、各イメージまたは各スタックに対応する境界ファイルが必要になります。画面の指示に従って 、CSV (カンマ区切り値の形式、x-y 座標) 境界ファイルまたは Tiff 境界ファイルのいずれかに手動でコメントを付けます。CurveAlign で作成された境界ファイルは、マニュアルで説明されているファイル ディレクトリとファイルの命名規則に従って自動的に保存されます。H&E の明視野と SHG イメージのペアが提供されている場合は、セクション 4.4 で説明されている自動境界作成モジュールを使用して境界ファイルを生成します。 - [プライマリ パラメータ]パネルで、この距離範囲内のファイバーのみを評価するために、最も近い境界からの距離を入力します。
- 出力オプションパネルで、境界関連付けボックスBdry Assocをオンにして、ファイバー、ファイバーセグメント、またはカーブレットに関連付けられている境界上の点を視覚化します。
- ステップ 4.1.3 で、ティフ境界条件を選択します。
- 自動境界作成
- 2.3 の説明に従って、APP を起動します。
- 他の操作 が既 に実行されている場合は、リセットボタンをクリックしてAPPを初期状態にリセットします。
- 自動境界作成モジュールを起動するには 、[BD作成 ]ボタンをクリックします。
- 画面の指示/手掛かりに従って、H&E の明るいフィールドと SHG 画像のペアに基づいて、1 つまたは複数の画像の境界ファイルを作成します。
- モジュールウィンドウを閉じるか、メインGUIの 「リセット 」ボタン(図6A)をクリックしてこのモジュールを終了します。
- 対象分析の曲線の位置合わせ領域
- ROI マネージャを使用した ROI 注釈
- メイン GUI の [ イメージの取得 ] ボタン (図 6A) をクリックして、1 つまたは複数のイメージを読み込みます。
- ファイルリストで、コメントを付ける画像を選択します。
- ROI マネージャをクリックしてROI マネージャモジュールを起動します (図7A)。
- セクション 3.2.1 の手順 3.2.1-3.2.1.13 に従ってください。
- ROI マネージャでの単一画像の ROI 分析
- フルイメージの CurveAlign 解析が実行され、結果がデフォルト ディレクトリに保存されている場合は、ROI リストの 1 つ以上の ROI をクリックし 、[CA ROI アナライザ] ボタンをクリックして、ポスト ROI 解析を実行します。
注: 解析が完了すると、要約統計量が出力テーブル (図 7C)に表示され、角度分布を示すヒストグラムの図 (図 7D) が表示されます。 - 出力テーブル内の任意の項目をクリックすると、特定の ROI (図 7B)のファイバーと、ファイバー角度のヒストグラムが視覚化されます。
- \\[image フォルダ]\CA_ROI\個人\ROI_post_analysis\にあるサブフォルダに保存されている出力ファイルを確認します。
- フルイメージ CA 解析が実行されていない場合は、ROI リストの 1 つまたは複数の ROI をクリックし 、[ROI に CA を適用]ボタンをクリックして、選択した ROI に CA 解析を直接適用します。プロンプトウィンドウの指示に従って、分析を実行します。
注: CA 分析を実行するためのパラメータは、メイン GUI を通じて渡されます。必要に応じて、ステップ 4.1.7 で説明されている実行中のパラメータを更新します。解析が完了すると、ファイバーメジャーの要約統計量の結果が出力テーブルに表示されます。結果は \\[image フォルダ]\CA_ROI\個人\ROI_analysis\にあるサブフォルダに自動的に保存されます。
- フルイメージの CurveAlign 解析が実行され、結果がデフォルト ディレクトリに保存されている場合は、ROI リストの 1 つ以上の ROI をクリックし 、[CA ROI アナライザ] ボタンをクリックして、ポスト ROI 解析を実行します。
- ROI アナライザを使用した複数の画像の ROI 分析
- 4.5.1 の手順に従って、解析する画像の ROI にアノーチンブを付けます。
- [画像の取得] ボタンをクリックして、1 つまたは複数 の画像を 開きます。
- 画像解析結果全体が利用可能なときに ROI ポスト解析を実行するには 、[ROI 解析 ] ボタンをクリックし 、[ROI 後処理] オプションを選択します。
- GUI の下部のメッセージ・ウィンドウおよびコマンド・ウィンドウに表示される進捗状況を確認します。
- 分析が完了したら、出力テーブルに表示される各 ROI の要約統計量を確認します。
注 : 詳細な出力ファイルは 、\\ [image フォルダー] \CA_ROI\Batch\ROI_post_analysis\にあるサブフォルダに自動的に保存されます。 - 完全な画像解析結果が得られなかったときに CT モードで直接解析を実行するには、次の変更を除く手順 4.5.3.1 ~ 4.5.3.5 に従います。 すべてのアノーセド ROI が長方形の場合は、[四角形の ROI]オプションを選択します。ステップ 4.5.3.2 の後、4.1.7 で説明されているように、実行中のパラメーターを更新します。
注 : ROI 分析結果は、\\ [イメージ フォルダー] \CA_ROI\Batch\ROI_analysis\にあるサブフォルダーに保存されます。
- ROI マネージャを使用した ROI 注釈
- カーブアラインの後処理
- セクション 2.3 の説明に従って、APP を起動します。
- 他の操作 が既 に実行されている場合は、リセットボタンをクリックしてAPPを初期状態にリセットします。
- 後処理ボタンをクリックして、後処理モジュールを起動します。
- 画面の指示/手がかりに従って、さまざまな画像の出力機能または値を組み合わせます。
- モジュールウィンドウを閉じるか、メインGUIの 「リセット 」ボタン(図6A)をクリックしてこのモジュールを終了します。
5. 推定実行時間
- 1024 ピクセル x 1024 ピクセルの画像を中程度のファイバー密度で処理する場合は、推定実行時間を待ちます。実際の計算時間は、一般に、ファイルのサイズ、解析モード、展開する機能、中央処理装置 (CPU) タイプ、および使用可能なランダム アクセス メモリ (または RAM) の量を含む複数の要因に依存します。CT-FIRE個々の繊維抽出には数分かかります。境界のないカーブ整列 CT モードには数秒かかります。境界のない CT-FIRE ファイバまたはファイバーエンドモードをカーブアラインに使用するには、数十秒かかります。境界のない CT-FIRE ファイバ モードをカーブアラインにするのには数百秒かかります。境界を使用した CurveAlign 解析は、境界の複雑さに応じて、数十秒から数分間かかります。
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Representative Results
これらの方法は、多くの研究で正常に適用されています。.いくつかの典型的な用途は、例えば: 1) Conklinら22 腫瘍関連コラーゲンシグネチャを計算するためにCurveAlignを使用し、コラーゲン線維がより頻繁に、その下で管癌(DCIS)病変において管周囲に垂直に整列することを発見した。2) Drifkaら10 は、CurveAlign の CT-FIRE モードを使用して膵管腺癌および正常/慢性膵炎組織の間質コラーゲンアライメントを定量化し、正常/慢性組織と比較して癌組織のアライメントが増加していることを発見した。3) Alkminら7 は、経基性コラーゲンのSHG画像からF-アクチン線維および全体的なコラーゲンアライメントの角分布を定量化するためにCurveAlignを使用し、マトリックス形態が細胞運動およびF-アクチンアライメントを駆動する上で重要な役割を果たしていることを示した。4) LeBertら3 ゼブラフィッシュ創傷修復モデルのSHG画像にCT-FIREを適用し、急性創傷後のコラーゲン線維の厚さの増加を発見した。5) Devineら45 は、個々の繊維特性と全体的なアライメントを測定するために、異なる動物モデルからの声帯コラーゲンの SHG 画像に CurveAlign の CT-FIRE モードを使用し、ブタとイヌの声帯コラーゲンがより高いアライメントと直度性を劣っていることを示した。6) Keikhosraviら13 は、Lc-PolScopeで画像化された組織病理学サンプルにおけるコラーゲンアライメントを定量するためにCurveAlignを使用し、LC-PolScopeおよびSHGがいくつかのタイプの組織の整列および配向測定の点で同等であることを示した。
図1:CurveAlignを使用して、ヒト乳癌組織マイクロアレイ(TMA)のSHG画像から腫瘍関連コラーゲンシグネチャを見つける。(A) 対応するH&E明るいフィールド画像上にSHG画像(黄色)が重なったTMAコアのオーバーレイ画像。(B) 対象地域 (A)(C)の明るいフィールドイメージ (B)(D) の SHG イメージ (B)(F) 明視野画像に関連付けられたマスク (C) 。(E)(F)から腫瘍境界(黄色)、代表的な繊維位置、および方向(緑色の線)を示すCurveAlign出力オーバーレイ画像。青い線は、ファイバーを最も近い境界に関連付けるために使用されます。(B)と(E)の緑色の矢印は、腫瘍境界に平行な繊維を示し、赤い矢印は境界に垂直な繊維を示しています。スケールバー(A)は200μmに等しい。(B)~F)の画像は同じスケールで表示され、(D)の代表的なスケールバーは50μmに等しくなります。略語: SHG = 第二ハーモニック世代;H&E = ヘマトキシリンおよびエオジンこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:フィブリラコラーゲン画像の定量化の概略的なワークフロー。(A) CT-FIREおよび/またはカーブアラインによって分析されるSHG画像。(B)CT-FIREによるオーバーレイ画像出力。(C) (A) のマスク境界は、オプションの CurveAlign 入力です。(D) カーブ整列によるオーバーレイ画像出力。(B) の色の線は、抽出された繊維を表します。(D) では、緑の線は、境界の外側にある繊維の位置と方向 (黄色の線) を示し、その最も近い境界から指定した距離内にある、赤い線は他のファイバーの線、青の線はファイバーを最も近い境界に関連付けるために使用されます。(A)-(D)の画像は同じスケールで表示され、(A)の代表的なスケールバーは200 μmに等しいです。
図3:CT-FIREの定期分析。(A) メイン GUI.(B) 要約統計量を示す出力テーブル。(C)と(F)はそれぞれ角度と幅のヒストグラムを示す。(E)元のSHG画像上に重ね合わせた抽出された繊維(色の線)を示す出力画像(D)。略語: GUI = CT = カーブレット変換;グラフィカルユーザーインターフェイス。SHG = 第2ハーモニック世代。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: CT-FIRE ROI 管理モジュール(A) モジュール GUI。(B) ROI の 4 つの ROI の分析後、各 ROI 内の繊維を示す異なる形状を持つ。(C) 異なる繊維特性のROIヒストグラム。略語: CT = カーブレット変換;GUI = グラフィカル・ユーザー・インターフェースROI = 関心のある地域 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:CT-FIREアドバンスド後処理モジュール(A) モジュール GUI。(B)選択した3つの繊維の測定。(C)で選択した 3 つの繊維の可視化 (B)(D) 長さのしきい値 (>60 ピクセル) を適用した後の要約統計量。(E) 長さベースのカラーバーを使用して選択した繊維の可視化。略語: CT = カーブレット変換;GUI = グラフィカル・ユーザー・インターフェース。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 曲線の整列の通常の分析.(A) メイン GUI.(B) 要約統計量を示す出力テーブル。(C) 元の SHG 画像上に重なった代表的な繊維(緑の線)と境界(黄色の線)の位置と向きを示す出力画像は、青色の線がファイバーを最も近い境界に関連付けるために使用され、赤い線は境界内または境界から遠く離れた繊維の位置と向きを示します(>ユーザー指定距離、例えば、250 ピクセル)。(D) 角度のヒートマップ: 赤 (> 60 度), 黄色 (45 - 60 度), 緑 (10, 45] 度.(E)~(F)は、それぞれヒストグラムとコンパスプロットを用いた角度分布を示す。略語: GUI = グラフィカルユーザーインターフェイス;SHG = 第2ハーモニック世代。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: カーブアライン ROI 管理モジュール(A) モジュール GUI。(B) 元の画像に 4 つのアノーンの長方形の ROI がオーバーレイされます。(C)ROI 後分析出力テーブル。(D) 各 ROI の角度ヒストグラム略語: ROI = 対象地域;GUI = グラフィカル・ユーザー・インターフェース。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、繊維状コラーゲン定量のためのCT-FIREとCurveAlignの使用を記述し、コラーゲン繊維またはCT-FIREまたはCurveAlignによる分析に適した他の線状または繊維状の細長い構造を有する任意の画像に適用することができる。例えば、エラスチンや弾性繊維は、このプラットフォーム上で同様の方法で処理することができます。我々は、計算生成合成繊維21に関する両方のツールをテストした。アプリケーションに応じて、ユーザーはデータに最も適した分析モードを選択する必要があります。CTファイバー解析モードでは、CTのカーブレットを直接使用して繊維の位置と向きを表し、局所的な繊維構造の変化に敏感です。CTモードは、ノイズレベルが高い、繊維が曲がりくねっている、または繊維の厚さのばらつきが高いなど、複雑な条件で繊維とその向きを見つけるために使用することができます。しかし、CTモードは画像の最も明るい部分のみを拾うため、画像強度に大きなばらつきがある場合、強度が低い繊維を見逃す可能性があります。
また、CTモードでは個々のファイバに関する情報は提供されません。CTモードとは対照的に、CT-FIREモードは個々のファイバ特性を計算し、強度が指定されたしきい値を超えているすべてのファイバを解析することができます。CT-FIREモードに関連する課題には、1)画像全体の繊維や繊維の厚さに沿った強度に大きなばらつきがある場合、無傷の繊維抽出の精度が低下または損なわれる可能性があります。2) 現在の標準分析は、プロトコルで述べたように計算上要求が厳しい。これらの方法の利点と制限の詳細については、前の出版物20,21に記載されています。
ファイバートラッキングの精度に関する限り、ユーザーは主に目視検査を利用して、抽出された繊維または代表の向きが元の画像に重なっている重なり合う画像をチェックすることができます。さらに、CT-FIREの場合、ユーザは高度な後処理モジュールを使用して、選択した個々の繊維の特性を識別し、フィジー46のような他の画像解析ツールを使用して測定値と比較することができる。CurveAlign の場合、ユーザーは OrientationJ16 や CytoSpectre17などの他のツールで計算された方向または位置合わせの結果と比較できます。
プラットフォームで出力できる機能の中でも、アライメント関連の機能が最も頻繁に使用され、最も信頼性が高く、堅牢です。個々の繊維特徴を使用するために、ユーザーは代表的な繊維特徴の抽出を確認する必要がある。注意すべきは、ある状況において、インタクトファイバーは複数の短いセグメントに分割され、ユーザは繊維分析モードを選択したり、さらに統計解析を行う際に考慮する必要があります。ファイバ長を同等の特性として直接使用できない場合でも、長さに重み付けされたファイバー セグメントの方向または幅は、有用な情報を示している可能性があります。SHGイメージングに関する限り、対物レンズの数値絞り(NA)は、ファイバの幅と長さの検出に大きな影響を与えますが、方向や位置合わせの測定値への影響は少なくなります。SHGイメージングの経験では、通常、NA ≥1.0で40倍以上の対物レンズを使用して、堅牢な繊維厚さの測定を行う必要があります。
「アライメント」は、3つの異なる方法で解釈できます:1)0度から180度までの正の水平方向に対する位置合わせは、0度から180度に近い角度が180度に近い角度に似ています。2)「相対角度」という名前の境界に対する位置合わせは、0度から90度の範囲で、0度は境界に平行な繊維を示し、90度は垂直な繊維を示す。3)「アライメント係数」と名付けられた繊維のアライメントは0から1の範囲で、1は完全に整列した繊維を示し、よりランダムに分散された繊維を表す小さな値を示す。
このプラットフォームで計算された繊維特性に加えて、テクスチャ分析47、48、49に基づくいくつかのメトリックもECMパターンを定量化するために提案された。テクスチャ関連の機能は、一部のアプリケーションで ECM の代替または追加の記述子を提供できます。この種のメトリックの開発に関する課題は、生物学的関連性、局所的特性、および個々のファイバのトレース精度の相互操作にあります。
実行中のパラメータを最適化し、トラブルシューティングを実行するには、マニュアル、関連する出版物20、21だけでなく、カーブレットリポジトリのGitHub WikiページのFAQサイドバーを参照することができます: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki。一部のボタンでは、ユーザーがマウス アイコンをボタンの上に移動したときに、現在または次の操作に対してユーザーを誘導する関数ヒントが表示されることがあります。GUI またはコマンド・ウィンドウの情報に従って、トラブルシューティングを実行します。
大きなデータセットを処理するには、パラレル コンピューティング オプションを使用して、ツールで複数の画像を同時に処理できるようにすることをお勧めします。1 つのオプションは、使用しているコンピューターで複数の CPU コアを使用することです。また、両方の APP のヘッドレス バージョンが提供され、ウィスコンシン大学マディソン校の CONDOR ベースの 50 ハイ スループット コンピューティング センター (CHTC) に保持されているサーバーを通じてコンパイル ノードで正常にコンパイルされています。大規模な繊維定量化のためのCHTCワークフローは、何千もの画像からなる実際の画像セットに開発、テスト、および使用されています。ユーザーは、CT-FIREとCurveAlignの両方のヘッドレスMATLAB機能を適応させ、アマゾン、グーグル、マイクロソフトが提供する商用サービスを含む他のクラウドコンピューティングシステムで定量化を実行することができます。
進行中および将来の開発の方向性は次のとおりです: 1) 高品質の合成コラーゲン繊維画像を抽出または生成し、繊維トレースアルゴリズムの堅牢性と精度を向上させるディープラーニングニューラルネットワークの組み込み;2) 最高のソフトウェア エンジニアリングの実践に従ってコードとドキュメントを最適化しながら、包括的なプラットフォームにすべてのモジュールの統合;3) クラウド コンピューティング プラットフォーム上のすべてのコア機能の展開;4)CHTCサービスを使用した繊維解析のワークフローの強化。合成繊維発生器の機能向上を5)。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
ロブ・ノワク博士を含め、長年にわたりCT-FIREとCurveAlignに多くの貢献者とユーザーに感謝します。 キャロリン・ペールケ博士、ジェレミー・ブレドフェルト博士、グニート・メータ博士、アンドリュー・ライヒト博士、マット・コンクリン博士、ジェイン・リスル博士、パオロ・プロヴェンツァーノ博士、ブレンダ・オグル博士、パトリシア・キーリー博士、ジョセフ・スズルシェフスキ博士、スザンヌ・パウニク博士この研究は、半導体研究公社、モルグリッジ研究所、NIHがK.W.EにR01CA199996、R01CA181385、U54CA210190を助成金として提供しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CT-FIRE | Univerity of Wisconsin-Madison | N/A | open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/ |
| CurveAlign | University of Wisconsin-Madison | N/A | open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/ |
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