Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att använda ett curvelet transform-baserat MATLAB-mjukvaruverktyg med öppen källkod för kvantifiering av fibrillär kollagenorganisation i den extracellulära matrisen av både normala och sjuka vävnader. Detta verktyg kan appliceras på bilder med kollagenfibrer eller andra typer av linjeliknande strukturer.
Abstract
Fibrillar kollagener är framträdande extracellulära matris (ECM) komponenter, och deras topologi förändringar har visat sig vara associerade med utvecklingen av ett brett spektrum av sjukdomar inklusive bröst, äggstockscancer, njure och bukspottskörteln cancer. Fritt tillgängliga fiberk kvantifieringsprogramverktyg är främst inriktade på beräkning av fiberjustering eller orientering, och de är föremål för begränsningar som kravet på manuella steg, felaktighet vid upptäckt av fiberkanten i bullrig bakgrund eller brist på lokaliserad funktion karakterisering. Kollagenfiberk kvantifieringsverktyget som beskrivs i detta protokoll kännetecknas av att använda en optimal flerskalas bildrepresentation aktiverad av curvelet transform (CT). Detta algoritmiska tillvägagångssätt gör det möjligt att ta bort brus från fibrillära kollagenbilder och förbättring av fiberkanter för att ge plats- och orienteringsinformation direkt från en fiber, snarare än att använda indirekt pixel-klok eller fönstervis information som erhållits från andra verktyg. Detta CT-baserade ramverk innehåller två separata, men länkade, paket som heter "CT-FIRE" och "CurveAlign" som kan kvantifiera fiberorganisation på global, region av intresse (ROI) eller individuell fiberbas. Detta kvantifieringsramverk har utvecklats i mer än tio år och har nu utvecklats till en omfattande och användardriven kollagenk kvantifieringsplattform. Med hjälp av denna plattform kan man mäta upp till cirka trettio fiberfunktioner inklusive enskilda fiberegenskaper som längd, vinkel, bredd och rakhet, liksom bulkmätningar som densitet och justering. Dessutom kan användaren mäta fibervinkel i förhållande till manuellt eller automatiskt segmenterade gränser. Denna plattform tillhandahåller också flera ytterligare moduler, inklusive moduler för ROI-analys, automatisk gränsskapande och efterbearbetning. Att använda denna plattform kräver inte tidigare erfarenhet av programmering eller bildbehandling, och den kan hantera stora datamängder inklusive hundratals eller tusentals bilder, vilket möjliggör effektiv kvantifiering av kollagenfiberorganisationen för biologiska eller biomedicinska applikationer.
Introduction
Fibrillära kollagener är framträdande, strukturella ECM-komponenter. Deras organisation förändrar påverkan vävnad funktion och är sannolikt associerade med progressionen av många sjukdomar som sträcker sig från osteogenesis imperfecta1,hjärt dysfunktion2, ochsårläkning 3 till olika typer av cancer inklusive bröst4,5,6,äggstockscancer 7,8,njure9, och bukspottskörtelcancer10. Många etablerade bildframställningsmetoder kan användas för att visualisera fibrillärt kollagen såsom andra harmoniska generationensmikroskopi 11,fläckar eller färgämnen i samband med ljust fält eller fluorescensmikroskopi eller polariserad ljusmikroskopi12,flytande kristallbaserad polariseringsmikroskopi (LC-PolScope)13, och elektronmikroskopi14. I och med att vikten av fibrillar kollagenorganisation har blivit tydligare, och användningen av dessa metoder har ökat, har behovet av förbättrade kollagenfiberanalysmetoder också ökat.
Det har gjorts många ansträngningar för att utveckla beräkningsmetoder för automatiserad mätning av fibrillärt kollagen. Fritt tillgängliga programvaruverktyg är främst inriktade på beräkning av fiberjustering eller orientering genom att anta antingen första derivat eller struktur tensor för pixlar15,16, eller Fourier transform-baserad spektrumanalys för bildplattor17. Alla dessa verktyg är föremål för begränsningar som kravet på manuella steg, felaktig upptäckt av fiberkanten i bullrig bakgrund eller brist på lokaliserad funktionskaraktärisering.
Jämfört med andra fritt tillgängliga kostnadsfria programvaruverktyg med öppen källkod använder de metoder som beskrivs i detta protokoll CT – en optimal, mångsidig, riktad bildrepresentationsmetod – för att ta bort brus från fibrillära kollagenbilder och förbättra eller spåra fiberkanter. Information om plats och orientering kan tillhandahållas direkt från en fiber snarare än genom att använda indirekt pixel-klok eller fönstervis information för att härleda fiberorganisationens mätvärden. Detta CT-baserade ramverk18,19,20,21 kan kvantifiera fiberorganisation på global, ROI- eller fiberbasis, främst via två separata, men länkade, paket som heter "CT-FIRE"18,21 och "CurveAlign"19,21. När det gäller implementeringen av programvaran kan CT-KOEfficienter på flera skalor användas för att rekonstruera en bild som förbättrar kanterna och minskar bruset. Sedan tillämpas en individuell fiberutvinningsalgoritm på den CT-rekonstruerade bilden för att spåra fibrer för att hitta sina representativa centrumpunkter, förlänga fibergrenar från mittpunkterna och länka fibergrenar för att bilda ett fibernätverk. I CurveAlign kan CT-koefficienter på en användarspecificerad skala användas för att spåra lokal fiberorientering, där kurvernas orientering och placering extraheras och grupperas för att uppskatta fiberorienteringen på motsvarande platser. Detta resulterande kvantifieringsramverk har utvecklats i mer än tio år och har utvecklats mycket i många aspekter som funktionalitet, användargränssnitt och modularitet. Till exempel kan detta verktyg visualisera lokal fiberorientering och gör det möjligt för användaren att mäta upp till trettio fiberfunktioner inklusive enskilda fiberegenskaper som längd, vinkel, bredd och rakhet, liksom bulkmätningar som densitet och justering. Dessutom kan användaren mäta fibervinkel i förhållande till manuellt eller automatiskt segmenterade gränser, vilket till exempel spelar en viktig roll i bildbaserad biomarkörutveckling i bröstcancer22 och bukspottskörtelcancerstudier10. Den här plattformen tillhandahåller flera funktionsmoduler, inklusive moduler för ROI-analys, automatisk gränsskapande och efterbearbetning. ROI-modulen kan användas för att kommentera olika former av ROI och utföra motsvarande ROI-analys. Som ett applikationsexempel kan den automatiska gränsskapande modulen användas för att registrera hematoxylin- och eosinbilder (H&E) med andra harmoniska generationens (SHG) bilder och generera bildmasken för tumörgränser från de registrerade H&E-bilderna. Efterbehandlingsmodulen kan underlätta bearbetning och integrering av utdatafiler från enskilda bilder för eventuell statistisk analys.
Denna kvantifieringsplattform kräver inte tidigare erfarenhet av programmering eller bildbehandling och kan hantera stora datamängder inklusive hundratals eller tusentals bilder, vilket möjliggör effektiv kvantifiering av kollagenorganisationen för biologiska eller biomedicinska tillämpningar. Det har använts i stor utsträckning inom olika forskningsområden av många forskare över hela världen, inklusive oss själva. Det finns fyra huvudpublikationer på CT-FIRE och CurveAlign18,19,20,21, varav de tre första har citerats 272 gånger (från och med 2020-05-04 enligt Google Scholar). En genomgång av publikationerna som citerade denna plattform (CT-FIRE eller CurveAlign) indikerar att det finns cirka 110 tidskriftspapper som direkt använde den för sin analys, där cirka 35 publikationer samarbetade med vår grupp, och de andra (~ 75) skrevs av andra grupper. Till exempel, Denna plattform användes för följande studier: bröstcancer22, 23,24,bukspottskörtelcancer10,25, njurcancer9,26,sårläkning 3,27,28,29,30, äggstockscancer8,31,7, livmoderns ligament32, hypophosphatemic dentin33 , basalcellskarcinom34, hypoxisk sarkom35,broskvävnad36,hjärtdysfunktion37,nervceller38,glioblastom39,lymfatiska sammandragningar40,fibrösa cacffolds41,magcancer42,mikrotubule43, och urinblåsa fibros44. Figur 1 visar cancer imaging ansökan av CurveAlign för att hitta tumör-associerade kollagen signaturer av bröstcancer19 från SHG bilden. Figur 2 beskriver ett typiskt schematiskt arbetsflöde för den här plattformen. Även om dessa verktyg har granskats tekniskt18,19,21, och ett vanligt protokoll20 för justeringsanalys med CurveAlign är också tillgängligt, kan ett visuellt protokoll som visar alla väsentliga funktioner vara användbart. Ett visualiserat protokoll, som presenteras här, kommer att underlätta inlärningsprocessen för att använda denna plattform samt mer effektivt ta itu med problem och frågor som användare kan ha.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll beskriver användningen av CT-FIRE och CurveAlign för kollagen kvantifiering. Dessa två verktyg har kompletterande, men olika, huvudmål och är i viss mån sammankopplade. CT-FIRE kan lanseras från CurveAlign-gränssnittet för att utföra de flesta operationer förutom avancerad efterbehandling och ROI-analys. För en fullständig drift av CT-FIRE bör den startas separat.
1. Krav på bildsamling och bild
OBS: Verktyget kan bearbeta alla bildfiler med linjeliknande strukturer som kan läsas av MATLAB oavsett den bildbehandlingsmodalitet som används för att samla in den.
- Använd 8-bitars gråskala eftersom bildtypen som standardsparametrar baseras på det här formatet.
OBS: SHG imaging är en allmänt använd etikettfri och högupplöst fibrillär kollagenavbildningsmetod. SHG-bilder från enbröstcancerstudie 19 kommer att användas här för demonstration.
2. Programvaruinstallation och systemkrav
OBS: Både fristående versioner och källkodsversioner är fritt tillgängliga. Källkodsversionen kräver en fullständig MATLAB-installation inklusive verktygslådor med signalbehandling, bildbehandling, statistikanalys och parallell databehandling. För att köra källkodsversionen bör alla nödvändiga mappar, inklusive några från tredjepartskällorna, läggas till i MATLAB-sökvägen. Användning av det fristående programmet (APP) rekommenderas för de flesta användare, vilket kräver en installation av en fritt tillgänglig MATLAB Compiler Runtime (MCR) av angiven version. Proceduren för att installera och starta APPEN beskrivs nedan.
- Ladda ner CT-FIRE version 3.0 (CTF3.0) och CurveAlign Version 5.0 (CA5.0) APP-paket från https://eliceirilab.org/software/ctfire/ respektive https://eliceirilab.org/software/curvealign/.
OBS: Varje paket innehåller fristående APP, manual och testbilder. - Följ de detaljerade kraven och installationsinstruktionerna från ovanstående webbplatser för att installera MATLAB MCR 2018b.
- Starta APPEN.
- För ett Windows 64-bitars system, dubbelklicka på APP-ikonen för att starta den.
- För ett Mac-system följer du följande steg för att starta det: Högerklicka på APP (ctrl-klicka) | Visa paketinnehåll | Innehåll | MacOS | applauncher (högerklicka och välj öppna).
Obs: Andra detaljer kan ses på programvaruwebbplatserna som listas i 2.1.
3. Individuell fiberutsugning med CT-FIRE
OBS: CT-FIRE använder CT för att denoise bilden, förbättra fiberkanterna och sedan använda en fiberutsugningsalgoritm för att spåra enskilda fibrer. Längd, vinkel, bredd och rakhet beräknas för enskilda fibrer.
- CT-FIRE på en bild eller flera bilder
- Starta APPEN enligt beskrivningen i 2.3.
- Klicka på knappen Öppna filer i det huvudsakliga grafiska användargränssnittet (GUI, bild 3A)och välj sedan en eller flera bilder/eller bildstaplar i promptfönstret. Använd den teknik som är lämplig för operativsystemet för att välja flera bilder i dialogrutan (t.ex. i Windows håller du ned CTRL medan du väljer flera filer).
Obs: Om två eller flera bildfiler är markerade måste alla bilder använda samma parametrar som körs för analysen. Se till att alla bilder förvärvas under samma eller liknande förhållanden. - Välj parallella datoralternativ genom att markera kryssrutan Parallell i det övre högra hörnet för analys av flera bilder.
- För bildstacken flyttar du utsnittsreglaget under fillisterutan för att markera det segment som ska analyseras.
- Ange löpande egenskaper. Använd standardparametrar för en första analys av vissa bilder. Om du använder standardparametrar hoppar du till steg 3.1.6. Om du vill ange olika parametrar klickar du på knappen Uppdatera på panelen Parametrar. Följ handboken för att korrekt justera parametrarna.
OBS: De oftast justerade parametrarna inkluderarbakgrundströskeln( thresh_im2 ) och nukleationssökningsradien (s_xlinkbox). Om bakgrundsljudnivån är hög ställer du thresh_im2 ett större värde. s_xlinkbox associeras med fibrernas genomsnittliga radie, ställ in ett mindre värde för att upptäcka tunna fibrer. - Klicka på knappen Kör.
Förloppsinformationen visas i både informationsfönstret och kommandofönstret. När analysen är klar visas utdatatabellen (bild 3B). - Klicka på ett objekt i utdatatabellen för att se histogrammet med fibermått (figur 3C och figur 3F) i bilden inklusive längd, bredd, vinkel och rakhet.
OBS: Fiberbilderna med fibrer överlagrad på originalbilden visas också (Bild 3E). - Kontrollera undermappen med namnet ctFIREout under bildmappen för utdatafilerna, inklusive den överlagda bilden ".tiff"-filen, ".csv"-filen och ".mat"-filen.
- ANALYS AV CT-FIRE-region av intresse (ROI)
- ROI-anteckning med ROI Manager
- Klicka på knappen Öppna filer i huvudgränssnittet (bild3A) föratt läsa in en eller flera bilder.
- Markera den bild som ska kommenteras i fillistan.
- Välj ROI-chefen i listrutan på roi-alternativpanelen.
- Klicka på RUN-knappen för att starta ROI Manager-modulen (Bild 3A).
- I ROI-chefs-GUI(figur 4A)klickar du på rullgardinsmenyn nedan Rita ROI-meny(d)för att rita ROI:erna, en efter en.
ROI-formen kan vara rektangel, frihand, ellips, polygon eller specificerad rektangel. Följ anvisningarna på skärmen för att rita, spara och avsluta ROI-anteckningar. - När du har valt metoden för att rita ROI drar du den gula rektangeln som visas på originalbilden till önskad position och klickar sedan på knappen Spara ROI eller trycker på tangenterna för att lägga till denna ROI i ROI-listan. Denna ROI kommer automatiskt att namnges.
- Rita en ny ROI genom att dra den tidigare AVKASTNINGEN till en ny position och spara den som nämnts i 3.2.1.6, eller upprepa steg 3.2.1.5-3.2.1.6 för att rita en ny ROI.
- Tryck på x eller välj Ny ROI?
- Markera kryssrutorna Visa alla och Etiketter om du vill visa alla definierade ROM-skivor i listan och deras namn på originalbilden.
- Välj ROI i ROI-listan om du vill utföra grundläggande ROI-åtgärder, inklusive Byt namn på ROI, Ta bort ROI, Spara ROI-text, Läs in ROI från text, Spara ROI-mask, Ladda ROI från maskoch Kombinera ROI.
- Kontrollera utdatafilen för ROI-chefen som sparats som ".mat"-fil i en undermapp med namnet ROI_management under den ursprungliga bildmappen.
- Upprepa steg 3.2.1.2–3.2.1.1.11 om du vill kommentera en annan bild i den öppnade fillistan.
- När anteckningen är klar stänger du ROI-chefs-GUI:et och återställer huvudgränssnittet genom att klicka på knappen Återställ i huvudgränssnittet.
- ROI-analys för en enda bild i ROI Manager
- Om CT-FIRE-analys med full bild utförs och resultaten sparas i standardkatalogen klickar du på en eller flera ROIs i ROI-listan och klickar sedan på ctFIRE ROI Analyzer-knappen för att starta analysmodulen Efter ROI.
Obs: Resultaten sparas automatiskt i en undermapp som finns på \\[bildmapp]\ CTF_ROI\Individual\ROI_post_analysis\. - I popup-fönstret klickar du på knappen Kontrollera fibrer för att visa fibrer inom de valda ROIs (Bild 4B).
- Klicka på Plot Statistics för att visa histogram för varje ROI (Figur 4C). Motsvarande utdatasiffror visas.
- Om fullständig CT-FIRE-analys inte har utförts klickar du på en eller flera ROIs i ROI-listan och klickar på knappen Använd ctFIRE på ROI för att direkt tillämpa CT-FIRE-analys på de valda ROIs.
- Kör analysen genom att följa anvisningarna i promptfönstret.
OBS: Parametrarna för att köra CT-FIRE skickas genom huvud-GUI, och användaren kan uppdatera de löpande parametrarna enligt beskrivningen i steg 3.1.5 efter behov. När analysen är klar visas den sammanfattande statistiken över fibermått i utdatatabellen. Resultatet sparas automatiskt i en undermapp som finns på \\[bildmapp]\ CTF_ROI\Individual\ROI_analysis\.
- Om CT-FIRE-analys med full bild utförs och resultaten sparas i standardkatalogen klickar du på en eller flera ROIs i ROI-listan och klickar sedan på ctFIRE ROI Analyzer-knappen för att starta analysmodulen Efter ROI.
- ROI-analys för flera bilder med ROI Analyzer
- Följ stegen i 3.2.1 för att kommentera ROM för de bilder som ska analyseras.
- Öppna en eller flera bilder genom att klicka på knappen Öppna filer.
- Om du vill köra ROI-inläggsanalys när de fullständiga bildanalysresultaten är tillgängliga klickar du på listrutan på panelen Kör alternativ och väljer alternativet CTF efter ROI-analys .
- Klicka på RUN-knappen för att köra ROI-analys för alla laddade bilder.
- Kontrollera förloppsinformationen som visas i meddelandefönstret längst ned i gui-fönstret och i kommandofönstret.
- När analysen är klar kontrollerar du sammanfattningsstatistiken för varje ROI som visas i en utdatatabell.
Obs: De detaljerade utdatafilerna sparas automatiskt i en undermapp som finns på \\ [bildmapp]\CTF_ROI\Batch\ROI_post_analysis\. - Om du vill köra en direktanalys när fullständiga bildanalysresultat inte är tillgängliga följer du steg 3.2.3.1–3.2.3.6, förutom att du i steg 3.2.3.3 väljer alternativet CTF ROI analyzer; i steg 3.2.3.4, innan du klickar på RUN-knappen, uppdaterar du de löpande parametrarna enligt beskrivningen i steg 3.1.5. När du har klickat på RUN-knappen väljer du i ett promptdialogfönster mellan rektangulär ROI- och ROI-mask av vilken form som helst.
OBS: Om alla kommenterade ROIs är rektangulära kan användaren välja "Rektangulär ROI". I steg 3.2.3.6 sparas roi-analysresultaten i en undermapp som finns i \\[bildmapp]\CTF_ROI\Batch\ROI_analysis\.
- ROI-anteckning med ROI Manager
- Efterbehandling med CT-FIRE
OBS: Efter den regelbundna CT-FIRE-analysen som beskrivs i 3.1 kan användaren utföra ytterligare efterbehandling. Utan att köra den tidskrävande fiberutvinningen igen kan regelbunden efterbehandling, beskriven i 3.3.1, uppdatera några grundläggande utdatafiguregenskaper, medan den avancerade efterbehandlingen som beskrivs i 3.3.2 kan visualisera enskilda fibrer och deras egenskaper, utföra komplex tröskel bland alla de fyra fiberegenskaperna, generera sammanfattande statistik över de valda fibrerna och visualisera de valda fibrerna med hjälp av en anpassad färgkarta.- Regelbunden efterbehandling med CT-FIRE
- Starta CT-FIRE-appen eller klicka på knappen Återställ efter andra åtgärder för att initiera CT-FIRE huvud-GUI(Bild 3A).
- Markera kryssrutan .matta högst upp i huvudgränssnittet.
- Klicka på knappen Öppna filer för att välja CT-FIRE-utdata .mat-filen i undermappen ctFIREout.
Om flera filer är markerade markeras kryssrutan Batch automatiskt. Filnamnet på motsvarande bilder visas i rutan. - Uppdatera alternativen på kontrollpanelen För utdatafigurer.
- Behåll standardalternativen i Utdataalternativ, som ser till att alla utdatafiler uppdateras enligt den nya uppsättningen parametrar som anges i 3.3.1.4.
- Klicka på knappen Efterbehandling. Kontrollera förloppsinformationen i meddelandefönstret längst ned i huvudgränssnittet och i kommandofönstret.
- När analysen är klar klickar du på ett objekt i utdatatabellen för att se histogrammet av fibermått på bilden inklusive längd, bredd, vinkel och rakhet.
Obs: Nya utdatafiler kommer att skriva över de gamla i ctFIREout-undermappen.
- Avancerad efterbehandling av CT-FIRE
- Starta CT-FIRE-appen eller klicka på knappen Återställ efter andra åtgärder för att initiera CT-FIRE huvud-GUI(Bild 3A).
- Markera kryssrutan OUT.adv högst upp i huvudgränssnittet (bild 3A).
- Klicka på knappen Efter bearbetning för att starta det avancerade gränssnittet efter bearbetning med namnet " AnalysisModule" (Figur 5A).
- Klicka på knappen Välj fil för att välja en bild.
- Klicka på knappen Visualisera fibrer för att ange fibernummer baserat på etiketterna i tabbfiguren Original-fibrer.
OBS: Mätningarna av de valda fibrerna visas i en utgångstabell (figur 5B), och motsvarande fibrer kommer att överlageras på den ursprungliga bilden som visas i tabbfiguren uppmätta fibrer (Figur 5C). - Klicka på knappen Bekräfta/uppdatera för att gå till tröskelvärdet.
- Markera rutan tröskelvärde för att aktivera tröskelvärdesinställningarna.
- Välj ett av de fyra tröskelvärdena på rullgardinsmenyn.
- Ange önskade tröskelvärden på trösklarna för en eller flera fiberegenskaper.
- Klicka på knappen Tröskelvärde nu för att tillämpa ovanstående tröskelvärden.
- Kontrollera promptfiguren med dess namn som slutar med visualisering av mätvärden för att se de valda fibrerna överlagrade på originalbilderna med de anpassade färgkartorna som visas i figur 5E.
- Upprepa steg 3.3.2.9–3.3.2.11 för att sätta de önskvärda trösklarna.
- Klicka på knappen Spara fibrer för att spara den valda fiberinformationen.
OBS: Motsvarande valda fibrer visas i tabbfiguren efter tröskelvärdet. - Klicka på knappen Generera statistik och klicka sedan på OK-knappen i popup-fönstret för att generera sammanfattande statistik.
OBS: Enutgångstabell ( Figur 5D) visar medelvärdet för de valda fibrerna. Annan statistik över de valda fibrerna sparas i en Excel-fil vars plats visas i statusfönstret längst ned i det här gränssnittet. - Om du vill inkludera den valda enskilda fiberinformationen i utdatafilen markerar du rutan Generera blad för rådata innan du klickar på KNAPPEN OK.
- Om du vill kombinera resultat från flera bilder markerar du rutan Batchläge eller Stapelläge i steg 3.3.2.4 och väljer de flera bilder eller staplar som ska analyseras. hoppa över steg 3.3.2.5–3.3.2.6. I steg 3.3.2.8–3.3.2.9, ställ in tröskelvärden, men eftersom knapptröskeln nu och Spara fibrer är inaktiverade hoppar du över steg 3.3.2.10–3.3.2.13; och slutligen, följ instruktionerna i steg 3.3.2.14 för att generera sammanfattande statistik och enskilda fiberegenskaper hos de valda fibrerna.
- Regelbunden efterbehandling med CT-FIRE
4. Fiberanalys med CurveAlign
OBS: CurveAlign utvecklades ursprungligen för att automatiskt mäta vinklar av fibrer med avseende på användardefinierade gränser. Den nuvarande versionen av CurveAlign kan användas för bulkbedömning av densitets- och justeringsbaserade funktioner utöver den relativa vinkelmätningen genom att antingen ladda den enskilda fiberinformation som extraheras av CT-FIRE eller direkt med hjälp av kurvornas lokala orientering. CurveAlign beräknar upp till trettio funktioner relaterade till globala eller lokala funktioner, främst inklusive densitet och justering samt enskilda fiberegenskaper när CT-FIRE antas som fiberspårningsmetod.
- Fiberanalys med kurvor
- Starta APPEN enligt beskrivningen i 2.3.
- Klicka på knappen Återställ för att återställa APPEN till dess ursprungliga status om andra åtgärder har utförts.
- I huvudgränssnittet (bild 6A), kontrollera alternativet Fiberanalysmetod för att se till att CT är markerat (standardalternativ).
OBS: I det här läget utförs CT på bilden, och orienteringen för varje kurv representerar riktningen på en fiber på motsvarande plats. - Klicka på listrutan Gränsmetod och välj gränsbearbetningsläge i följande rullgardinsmenyalternativ: Ingen gräns, CSV-gräns och TIFF-gräns.
OBS: Om ingen gräns behövs hoppar du över det här steget. Se 4.3 för hur man beräknar fibervinklar med avseende på en gräns. - Klicka på knappen Hämta bilder i huvudgränssnittet (bild 6A)och välj sedan en eller flera bilder/eller bildstaplar i promptfönstret. Använd den teknik som är lämplig för operativsystemet för att välja flera bilder i dialogrutan (t.ex. i Windows håller du ned CTRL medan du väljer flera filer).
Om två eller flera bildfiler är markerade måste alla bilder använda samma parametrar som körs för analys. Se till att alla bilder förvärvas under samma eller liknande förhållanden. - För bildstacken flyttar du utsnittsreglaget under fillisterutan för att markera det segment som ska analyseras.
- Ange den fraktion av coefs som ska behållas. Detta värde är den fraktion av de största koefficienterna för CT som kommer att användas i fiberanalysen.
OBS: Om bilden har en stor variation i fiberintensitet eller kontrast, kommenterar områden av intresse med jämn kontrast för fiberanalysen eftersom detta läge bara upptäcker de ljusaste fibrerna i en bild. Dessutom är den större bildstorleken, ange ett mindre värde för den här fraktionen. - Behåll alla parametrar i utdataalternativen och andra i alternativet Avancerat som standard. Utdatafilerna kan behövas i andra framtida åtgärder.
- Klicka på knappen Kör längst ned i huvud-GUI(bild 6A).
Förloppsinformationen visas i ett meddelandefönster markerat med grön färg längst ned. När processen är klar visas viss sammanfattande statistik för varje bild i utdatatabellen (bild 6B), och alla utdatafiler sparas automatiskt i en undermapp med namnet CA_Out i katalogen för de ursprungliga bilderna. - Klicka på ett objekt i utgångstabellen (Bild 6B) för att se histogrammet (figur 6E) eller kompassdiagrammet (Figur 6F) av fibervinklar.
OBS: Överläggsbilden (Bild 6C) och värmekartan (Bild 6D) för justering eller vinkel kommer också att visas. - Klicka på knappen Återställ för att köra andra åtgärder eller stäng huvudgränssnittet för att avsluta APPEN.
- Individuell fiberanalys med CT-FIRE
OBS: Proceduren är densamma som den som beskrivs i avsnitt 4.1 förutom att i steg 4.1.3 väljer du CT-FIRE-relaterat fiberanalyslägeoch hoppar över steg 4.1.7 eftersom det inte är tillämpligt och inaktiveras i CT-FIRE-läge. Specifikt, i steg 4.1.3, välj en bland följande tre CT-FIRE-baserade individuella fiberanalysmetoder:- Välj CT-FIRE-fibrer för att använda fibercentrumpunkten och fibervinkeln för att representera fibern.
OBS: Detta alternativ tar inte hänsyn till förändringarna i fiberorientering längs fiberns längd. - Välj CT-FIRE Slutpunkter för att använda de två ändpunkterna i en fiber och motsvarande fibervinkel för att representera fibern.
OBS: Jämfört med 4.2.1 använder detta alternativ två positioner för att representera en fiber snarare än en (fiberens mittpunkt). - Välj CT-FIRE Segment för att använda segment av en fiber för att representera fibern.
OBS: Varje segment har en lika lång längd (inställd på 5 pixlar som standard i CT-FIRE) samt dess orientering och plats, vilket återspeglar förändringen i orientering längs hela fiberns längd. Detta alternativ skulle vara det mest tidskrävande, men skulle vara det bästa alternativet bland de tre CT-FIRE-baserade fiberanalysmetoderna för att spåra förändringar i den lokala orienteringen av en kurvig fiber.
- Välj CT-FIRE-fibrer för att använda fibercentrumpunkten och fibervinkeln för att representera fibern.
- Relativ justeringsanalys med gräns
OBS: Jämfört med den regelbundna analys utan gränsförhållanden som beskrivs i avsnitten 4.2 och 4.3 behöver relativ anpassningsanalys med gränsförhållanden följande:- I steg 4.1.3 väljer du tiffgränsvillkoret.
Användaren behöver en motsvarande gränsfil för varje bild eller varje stapel. Följ anvisningarna på skärmen för att manuellt kommentera antingen en CSV-gränsfil (kommaavgränsad värdebaserad, x-y-koordinater) eller en Tiff-gränsfil. De gränsfiler som skapas i CurveAlign sparas automatiskt enligt filkatalogen och filnamnskonventionerna som beskrivs i handboken. Om ett par H&E-ljusfälts- och SHG-avbildningar tillhandahålls använder du modulen automatisk begränsningsskapande som beskrivs i avsnitt 4.4 för att generera gränsfilen. - På panelen Primära parametrar anger du avståndet från närmaste gräns för att endast utvärdera fibrerna inom detta avståndsområde.
- På panelen Utdataalternativ markerar du begränsnings associationsrutan Bdry Assoc för att visualisera punkten på gränsen som är associerad med ett fiber-, fibersegment eller kurv.
- I steg 4.1.3 väljer du tiffgränsvillkoret.
- Automatisk skapande av gränser
- Starta APPEN enligt beskrivningen i 2.3.
- Klicka på knappen Återställ för att återställa APPEN till dess ursprungliga status om andra åtgärder redan har utförts.
- Klicka på knappen BD Creation för att starta modulen för automatisk begränsningsskapande.
- Följ instruktionerna/ledtrådarna på skärmen för att skapa gränsfil för en eller flera bilder baserat på ett par H&E-bilder och SHG-bilder.
- Stäng modulfönstret eller klicka på knappen Återställ i huvudgränssnittet(bild 6A) för attavsluta modulen.
- CurveAlign-regionen av intresseanalys
- ROI-anteckning med ROI Manager
- Klicka på knappen Hämta bilder i huvudgränssnittet (bild6A) föratt läsa in en eller flera bilder.
- Markera den bild som ska kommenteras i fillistan.
- Klicka på ROI-chefen för att starta ROI Manager-modulen (Figur 7A).
- Följ stegen 3.2.1.5–3.2.1.13 i avsnitt 3.2.1.
- ROI-analys för en enda bild i ROI Manager
- Om fullständig curvealign-analys för bilder har utförts och resultaten sparas i standardkatalogen klickar du på en eller flera ROI-objekt i ROI-listan och klickar sedan på knappen CA ROI Analyzer för att köra Post-ROI-analys.
OBS: När analysen är klar visas sammanfattande statistik i en utdatatabell (figur 7C) samt en histogramfigur (figur 7D) som visar vinkelfördelningen. - Klicka på något objekt i utgångstabellen för att visualisera fibrerna i en given ROI (Figur 7B) samt fibervinklarna.
- Kontrollera utdatafilerna som sparats i en undermapp som finns i \\[bildmapp]\ CA_ROI\Individual\ROI_post_analysis\.
- Om fullständig analys av certifikatutfärdaren inte har utförts klickar du på en eller flera ROM-skivor i ROI-listan och klickar på knappen Använd certifikatutfärdare på ROI för att direkt tillämpa CA-analys på de valda ROM-reglerna. Kör analysen genom att följa anvisningarna i promptfönstret.
OBS: Parametrarna för att köra CA-analysen skickas genom huvud-GUI; uppdatera de parametrar som körs som beskrivs i steg 4.1.7 efter behov. När analysen är klar visas resultaten av den sammanfattande statistiken över fibermått i utdatatabellen. Resultatet sparas automatiskt i en undermapp som finns på \\[bildmapp]\ CA_ROI\Individual\ROI_analysis\.
- Om fullständig curvealign-analys för bilder har utförts och resultaten sparas i standardkatalogen klickar du på en eller flera ROI-objekt i ROI-listan och klickar sedan på knappen CA ROI Analyzer för att köra Post-ROI-analys.
- ROI-analys för flera bilder med ROI Analyzer
- Följ stegen i 4.5.1 för att kommentera ROM för de bilder som ska analyseras.
- Öppna en eller flera bilder genom att klicka på knappen Hämta bilder.
- Om du vill köra ROI-inläggsanalys när de fullständiga bildanalysresultaten är tillgängliga klickar du på roi-analysknappen och väljer alternativet ROI efter bearbetning.
- Kontrollera förloppsinformationen som visas i meddelandefönstret längst ned i gui-fönstret och i kommandofönstret.
- När analysen är klar kontrollerar du sammanfattningsstatistiken för varje ROI som visas i en utdatatabell.
Obs: De detaljerade utdatafilerna sparas automatiskt i en undermapp som finns på \\ [bildmapp]\CA_ROI\Batch\ROI_post_analysis\. - Om du vill köra en direktanalys med CT-läge när fullständiga bildanalysresultat inte är tillgängliga följer du steg 4.5.3.1–4.5.3.5, förutom följande ändringar: ändra steg 4.5.3.3 genom att välja alternativcertifikatutfärdare på beskuren rektangulär ROI eller CA på mask med ROI av vilken form som helst. Om alla kommenterade ROM-skivor är rektangulära väljer du alternativet Rektangulär ROI. Efter steg 4.5.3.2 uppdaterar du de löpande parametrarna enligt beskrivningen i 4.1.7.
ROI-analysresultaten sparas i en undermapp som finns i \\ [bildmapp]\CA_ROI\Batch\ROI_analysis\.
- ROI-anteckning med ROI Manager
- Efterbearbetning av CurveAlign
- Starta APPEN enligt beskrivningen i avsnitt 2.3.
- Klicka på knappen Återställ för att återställa APPEN till dess ursprungliga status om andra åtgärder redan har utförts.
- Klicka på knappen Efterbearbetning för att starta efterbehandlingsmodulen.
- Följ instruktionerna/ledtrådarna på skärmen för att kombinera utdatafunktionerna eller värdena från olika bilder.
- Stäng modulfönstret eller klicka på knappen Återställ i huvudgränssnittet(bild 6A) för attavsluta modulen.
5. Beräknad driftstid
- Vänta på den beräknade körtiden för bearbetning av en bild med storleken 1024 pixlar x 1 024 pixlar med måttlig fibertäthet. Den faktiska beräkningstiden beror i allmänhet på flera faktorer, inklusive filens storlek, analysläget, de funktioner som ska distribueras, cpu-typen (Central Processing Unit) och mängden tillgängligt slumpmässigt minne (eller RAM). CT-FIRE individuell fiberutsugning tar ett par minuter. CurveAlign CT-läge utan gräns tar några sekunder. CurveAlign CT-FIRE fiber- eller fiberändläge utan gräns tar tiotals sekunder. CurveAlign CT-FIRE fiberläge utan gränser tar hundratals sekunder. CurveAlign-analys med gräns tar tiotals sekunder till flera minuter, beroende på gränsernas komplexitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dessa metoder har framgångsrikt tillämpats i många studier. Några typiska tillämpningar inkluderar: 1) Conklin et al.22 används CurveAlign för att beräkna tumör-associerade kollagen signaturer, och fann att kollagen fibrer var oftare anpassade vinkelrätt till kanalen omkretsen i duktal carcinom in situ (DCIS) skador; 2) Drifka et al.10 använde CT-FIRE-läget i CurveAlign för att kvantifiera den stromala kollagenjusteringen för bukspottskörteln duktal adenocarcinom och normala/kroniska bukspottkörtelinflammation vävnader, och fann att det fanns en ökad inriktning i cancervävnader jämfört med den i normala/kroniska vävnader; 3) Alkmin et al.7 använde CurveAlign för att kvantifiera vinkelfördelningen av F-aktinfibrer och övergripande kollagenjustering från SHG-bilderna av äggstockscancer stromal kollagen, och visade att matrismorfologi spelar en viktig roll för att driva cellmotilitet och F-aktin justering; 4) LeBert et al.3 applicerade CT-FIRE på SHG-bilderna av en zebrafisk sår reparation modell och fann en ökning av tjockleken på kollagen fibrer efter akut sårning; 5) Devine et al.45 använde CT-FIRE-läget i CurveAlign för SHG-bilder av vokalt vikkollage från olika djurmodeller för att mäta enskilda fiberegenskaper och övergripande inriktning, och visade att svin och hund vokalt vik kollagen hade en högre inriktning och rakhet sämre; 6) Keikhosravi et al.13 använde CurveAlign för att kvantifiera kollagen inriktning i histopatologi prover avbildas med LC-PolScope, och visade att LC-PolScope och SHG är jämförbara när det gäller justering och orientering mätning för vissa typer av vävnad.
Figur 1: Använda CurveAlign för att hitta tumörrelaterade kollagensignaturer från SHG-bilder av en mikroarray för bröstcancervävnad (TMA). (A) Överläggsbild av en TMA-kärna med SHG-bild (gul) överlagrad på motsvarande H&E-ljusfältsbild. b)Den region som är av intresse förA. (C) Den ljusa fältbilden av (B). D)SHG-bilden av (B). (F) Masken som är associerad med den ljusa fältbilden (C). (E) CurveAlign-överläggsbilden som visar tumörgränserna (gula) från (F), representativa fiberplatser och orientering (gröna linjer); de blå linjerna används för att associera fibrer med deras närmaste gränser. De gröna pilarna i (B) och (E) visar fibrerna parallellt med tumörgränsen, medan de röda pilarna där visar fibrerna vinkelrätt mot gränsen. Skalstrecket i (A) motsvarar 200 μm. Bilder i (B)–(F) visas i samma skala, och den representativa skalstrecket i (D) är lika med 50 μm. Förkortningar: SHG = andra harmoniska generationen; H&E = hematoxylin och eosin. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Schematiskt arbetsflöde för kvantifiering av en fibrillär kollagenbild. (A) SHG-bild som ska analyseras av CT-FIRE och/eller CurveAlign. (B) Överlägg bildutgång av CT-FIRE. (C) Maskgränsen för (A) är en valfri CurveAlign-ingång. (D) Överlägg bildutmatning av CurveAlign. Färglinjerna i (B) representerar de extraherade fibrerna. I (D) anger de gröna linjerna placeringen och orienteringarna för fibrer som ligger utanför gränserna (gula linjer) och ligger inom det angivna avståndet från deras närmaste gränser, de röda linjerna är de för andra fibrer och de blå linjerna används för att associera fibrer med deras närmaste gränser. Bilder i (A)–(D) visas i samma skala, och den representativa skalstrecket i (A) är lika med 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: CT-FIRE regelbunden analys. A)Huvud-GUI. (B) Utdatatabell som visar den sammanfattande statistiken. CochFvisar histogrammen med vinkel respektive bredd. (E) Utgångsbild som visar de extraherade fibrerna (färglinjerna) överlagrade på den ursprungliga SHG-bilden (D). Förkortningar: GUI = CT = curvelet transform; grafiskt användargränssnitt. SHG = andra harmoniska generationen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: CT-FIRE ROI-hanteringsmodul. (A)Modul GUI. (B)ROI efter analys av fyra ROI med olika former som visar fibrerna inom varje ROI. (C) ROI histogram av olika fiberegenskaper. Förkortningar: CT = curvelet transform; GUI = grafiskt användargränssnitt; ROI = intresseregion. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: CT-FIRE avancerad efterbehandlingsmodul. (A)Modul GUI. (B)Mätningar av utvalda tre fibrer. C)Visualisering av de utvalda tre fibrerna i (B). (D) Sammanfattande statistik efter tillämpning av ett längdtröskelvärde (>60 pixlar). (E) Visualisering av de fibrer som valts i (D) med längdbaserad färglist. Förkortningar: CT = curvelet transform; GUI = grafiskt användargränssnitt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: CurveAlign regelbunden analys. A)Huvud-GUI. (B) Utdatatabell som visar den sammanfattande statistiken. (C) Utgångsbild som visar platser och orientering för representativa fibrer (gröna linjer) och gränser (gula linjer) överlagrad på den ursprungliga SHG-bilden, de blå linjerna används för att associera fibrer med sina närmaste gränser, röda linjer visar placeringen och orienteringen av fibrer inom en gräns eller utanför långt borta från gränsen (>användarens angivna avstånd, t.ex. 250 pixlar här). (D) Värmekarta över vinklarna: röd (> 60 grader), gul (45–60] grader, grön (10, 45] grader. (E)–(F)visa vinkelfördelningen med histogram- respektive kompassdiagram. Förkortningar: GUI = grafiskt användargränssnitt; SHG = andra harmoniska generationen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 7: CurveAlign ROI-hanteringsmodul. (A) Modul-GUI: et. (B) Fyra kommenterade rektangulära ROIs överlagrad på originalbilden. C)Avkastning på sysselsatt avkastning efter analys. D)Vinkel histogram för varje ROI. Förkortningar: ROI = intresseregion; GUI = grafiskt användargränssnitt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver användningen av CT-FIRE och CurveAlign för fibrillar kollagen kvantifiering och kan tillämpas på alla bilder med kollagen fibrer eller andra linjeliknande eller fiber-liknande långsträckta strukturer som är lämpliga för analys av CT-FIRE eller CurveAlign. Till exempel kan elastin eller elastiska fibrer bearbetas på ett liknande sätt på denna plattform. Vi har testat båda verktygen på beräkningsgenererade syntetiska fibrer21. Beroende på programmet bör användarna välja det analysläge som är mest lämpligt för deras data. CT-fiberanalysläget kan direkt använda kurvletter i CT för att representera fiberläge och orientering, och det är känsligt för förändringar i lokal fiberstruktur. CT-läget kan användas för att lokalisera fibrer och deras orientering under komplexa förhållanden, t.ex. där ljudnivån är hög, fibern är kurvig eller variationen i fibertjocklek är hög. Men eftersom CT-läget bara plockar upp de ljusaste delarna av en bild, skulle det missa vissa fibrer med lägre intensitet när det finns en stor variation i bildintensiteten.
Dessutom ger CT-läget inte information om enskilda fibrer. I motsats till CT-läget beräknar CT-FIRE-läget enskilda fiberegenskaper och kan analysera alla fibrer vars intensitet ligger över en angiven tröskel. Utmaningarna i samband med CT-FIRE-läget inkluderar: 1) noggrannheten hos en intakt fiberutsugning kan minskas eller äventyras när det finns stor variation i intensiteten längs en fiber eller fibertjockleken över en bild; och 2) den nuvarande standardanalysen är beräkningskrävande enligt protokollet. Mer information om fördelarna och begränsningarna med dessa metoder kan ses i våra tidigare publikationer20,21.
När det gäller fiberspårningens noggrannhet kan användaren främst förlita sig på visuell inspektion för att kontrollera den överlappande bilden där de extraherade fibrerna eller representativa orienteringarna överlagrar på originalbilden. För CT-FIRE kan användaren dessutom använda den avancerade efterbehandlingsmodulen för att identifiera egenskaperna hos utvalda enskilda fibrer och jämföra dem med mätningar med hjälp av andra bildanalysverktyg som Fiji46. För CurveAlign kan användaren jämföra orienterings- eller justeringsresultaten med de som beräknas av andra verktyg som OrientationJ16 och CytoSpectre17.
Bland de funktioner som är tillgängliga för utdata från plattformen används justeringsrelaterade funktioner oftast och är de mest tillförlitliga och robusta. För att använda enskilda fiberfunktioner måste användaren bekräfta utvinningen av representativa fiberfunktioner. Observera att en intakt fiber kan delas in i flera kortare segment under vissa omständigheter, vilket användaren bör ta hänsyn till när man väljer fiberanalysläge eller utför ytterligare statistisk analys. Även när fiberlängden inte direkt kan användas som en jämförbar egenskap kan fibersegmentens orientering eller bredd viktade mot deras längd fortfarande indikera användbar information. När det gäller SHG-avbildning kan den numeriska bländaren (NA) av objektivlinsen avsevärt påverka detektionen av en fibers bredd och längd, men det har mindre inverkan på orienterings- och justeringsmätningarna. Enligt vår erfarenhet av SHG-avbildning behöver vi vanligtvis använda objektiv med 40x förstoring eller högre med NA ≥ 1.0 för att uppnå en robust fibertjockleksmätning.
"Justering" kan tolkas på tre olika sätt: 1) justering med avseende på den positiva horisontella riktningen med namnet "vinkel", från 0 till 180 grader, där vinklar nära 0 har liknande orientering som vinklar nära 180 grader; 2) Inriktning med avseende på en gräns som kallas "relativ vinkel", från 0 till 90 grader, med 0 grader som indikerar en fiber som är parallell med gränsen och 90 som indikerar en vinkelrät fiber; och 3) justering av fibrer med avseende på varandra med namnet "justeringskoefficient", från 0 till 1, med 1 som indikerar perfekt anpassade fibrer och mindre värden som representerar mer slumpmässigt fördelade fibrer.
Förutom fiberfunktionerna som beräknats i denna plattform föreslogs också vissa mätvärden baserade påtexturanalys 47,48,49 för att kvantifiera ECM-mönster. Dessa texturrelaterade funktioner kan ge en alternativ eller ytterligare deskriptor av ECM i vissa applikationer. Utmaningarna för utvecklingen av denna typ av mätvärden ligger i samspelet mellan eventuell biologisk relevans, lokaliserad karakterisering och noggrannheten i att spåra enskilda fibrer.
För att optimera de löpande parametrarna och utföra felsökning kan användaren hänvisa till de manuella, relevantapublikationerna 20,21 samt faq-sidofälten på GitHub Wiki-sidorna i curvelets-lagringsplatsen: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki. För vissa knappar kan ett funktionstips visas som vägleder användaren för den aktuella eller nästa åtgärden när användaren flyttar musikonen ovanför en knapp. Följ informationen i gui- eller kommandofönstret för att utföra felsökningen.
För att bearbeta en stor datauppsättning uppmuntras användaren att använda parallella datoralternativ, vilket gör att verktyget kan bearbeta flera avbildningar samtidigt. Ett alternativ är att använda flera CPU-kärnor om de är tillgängliga på datorn som används. Alternativt tillhandahålls en huvudlös version av båda APPs och har framgångsrikt sammanställts i kompileringsnoden via servern som hålls på CONDOR-baserade50 Center for High Throughput Computing (CHTC) vid University of Wisconsin-Madison. CHTC-arbetsflödet för storskalig fiberk kvantifiering har utvecklats, testats och använts framgångsrikt på riktiga bilduppsättningar som består av tusentals bilder. Användaren kan anpassa de huvudlösa MATLAB-funktionerna i både CT-FIRE och CurveAlign för att köra kvantifiering på andra molndatasystem, inklusive kommersiella tjänster som de som erbjuds av Amazon, Google och Microsoft.
De pågående och framtida utvecklingsriktningar inkluderar: 1) införlivande av djupinlärning neurala nätverk för att extrahera eller generera högkvalitativa syntetiska kollagenfiberbilder och förbättra robustheten och noggrannheten hos fiberspårningsalgoritm; 2) Integrering av alla moduler i en omfattande plattform samtidigt som koden och dokumentationen optimeras enligt bästa programvaruteknikpraxis. 3) distribution av alla kärnfunktioner på en molnbaserad datorplattform; 4) Förbättring av arbetsflödet för fiberanalys med hjälp av CHTC-tjänsten; och 5) förbättring av funktionaliteten hos den syntetiska fibergeneratorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar många bidragsgivare och användare till CT-FIRE och CurveAlign genom åren, inklusive Dr. Rob Nowak, Dr. Carolyn Pehlke, Dr. Jeremy Bredfeldt, Guneet Mehta, Andrew Leicht, Dr. Adib Keikhosravi, Dr. Matt Conklin, Dr. Jayne Squirrell, Dr. Paolo Provenzano, Dr. Brenda Ogle, Dr. Patricia Keely, Dr. Joseph Szulczewski, Dr. Suzanne Ponik och ytterligare tekniska bidrag från Swati Anand och Curtis Rueden. Detta arbete stöddes av finansiering från Semiconductor Research Corporation, Morgridge Institute for Research och NIH beviljar R01CA199996, R01CA181385 och U54CA210190 till K.W.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CT-FIRE | Univerity of Wisconsin-Madison | N/A | open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/ |
| CurveAlign | University of Wisconsin-Madison | N/A | open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/ |
References
- Nadiarnykh, O., et al. Second harmonic generation imaging microscopy studies of osteogenesis imperfecta. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 051805 (2007).
- Kouris, N. A., et al. A nondenatured, noncrosslinked collagen matrix to deliver stem cells to the heart. Regenerative Medicine. 6 (5), 569-582 (2011).
- LeBert, D. C., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 1 (2008).
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
- Alkmin, S., et al. Migration dynamics of ovarian epithelial cells on micro-fabricated image-based models of normal and malignant stroma. Acta Biomaterialia. 100, 92-104 (2019).
- Campbell, K. R., Campagnola, P. J. Assessing local stromal alterations in human ovarian cancer subtypes via second harmonic generation microscopy and analysis. Journal of Biomedical Optics. 22 (11), 116008 (2017).
- Best, S. L., et al. Collagen organization of renal cell carcinoma differs between low and high grade tumors. BMC Cancer. 19 (1), 490 (2019).
- Drifka, C. R., et al. Periductal stromal collagen topology of pancreatic ductal adenocarcinoma differs from that of normal and chronic pancreatitis. Modern Pathology. 28 (11), 1470-1480 (2015).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Arun Gopinathan, P., et al. Study of collagen birefringence in different grades of oral squamous cell carcinoma using picrosirius red and polarized light microscopy. Scientifica. 2015, 1-7 (2015).
- Keikhosravi, A., et al. Quantification of collagen organization in histopathology samples using liquid crystal based polarization microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4243-4256 (2017).
- Quan, B. D., Sone, E. D. Cryo-TEM analysis of collagen fibrillar structure. Methods in Enzymology. 532, 189-205 (2013).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Kartasalo, K., et al. CytoSpectre: a tool for spectral analysis of oriented structures on cellular and subcellular levels. BMC Bioinformatics. 16 (1), 1 (2015).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
- Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
- Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. Methods for quantifying fibrillar collagen alignment. Methods in Molecular Biology. 1627, 429-451 (2017).
- Liu, Y., et al. Fibrillar collagen quantification with curvelet transform based computational methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
- Conklin, M. W., et al. Collagen alignment as a predictor of recurrence after ductal carcinoma in situ. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. 27 (2), 138-145 (2018).
- Jallow, F., et al. Dynamic interactions between the extracellular matrix and estrogen activity in progression of ER+ breast cancer. Oncogene. 38 (43), 6913-6925 (2019).
- Smirnova, T., et al. Serpin E2 promotes breast cancer metastasis by remodeling the tumor matrix and polarizing tumor associated macrophages. Oncotarget. 7 (50), 82289 (2016).
- Fanous, M., Keikhosravi, A., Kajdacsy-Balla, A., Eliceiri, K. W., Popescu, G. Quantitative phase imaging of stromal prognostic markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1354-1364 (2020).
- Jiménez-Torres, J. A., Virumbrales-Muñoz, M., Sung, K. E., Lee, M. H., Abel, E. J., Beebe, D. J. Patient-specific organotypic blood vessels as an in vitro model for anti-angiogenic drug response testing in renal cell carcinoma. EBioMedicine. 42, 408-419 (2019).
- Govindaraju, P., Todd, L., Shetye, S., Monslow, J., Puré, E. CD44-dependent inflammation, fibrogenesis, and collagenolysis regulates extracellular matrix remodeling and tensile strength during cutaneous wound healing. Matrix Biology. 75, 314-330 (2019).
- Henn, D., et al. Cryopreserved human skin allografts promote angiogenesis and dermal regeneration in a murine model. International Wound Journal. 17 (4), 925-936 (2020).
- Rico-Jimenez, J., et al. Non-invasive monitoring of pharmacodynamics during the skin wound healing process using multimodal optical microscopy. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 000974 (2020).
- Israel, J. S., et al. Quantification of collagen organization after nerve repair. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (12), (2017).
- Rentchler, E. C., Gant, K. L., Drapkin, R., Patankar, M., Campagnola, P. J. Imaging collagen alterations in STICs and high grade ovarian cancers in the fallopian tubes by second harmonic generation microscopy. Cancers. 11 (11), 1805 (2019).
- Hu, C., et al. Imaging collagen properties in the uterosacral ligaments of women with pelvic organ prolapse using spatial light interference microscopy (SLIM). Frontiers in Physics. 7, 72 (2019).
- Guirado, E., et al. Disrupted protein expression and altered proteolytic events in hypophosphatemic dentin can be rescued by dentin matrix protein 1. Frontiers in Physiology. 11, 82 (2020).
- Kiss, N., et al. Quantitative analysis on ex vivo nonlinear microscopy images of basal cell carcinoma samples in comparison to healthy skin. Pathology & Oncology Research. 25 (3), 1015-1021 (2019).
- Lewis, D. M., et al. Collagen fiber architecture regulates hypoxic sarcoma cell migration. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 400-409 (2018).
- Moura, C. C., Bourdakos, K. N., Tare, R. S., Oreffo, R. O., Mahajan, S. Live-imaging of Bioengineered Cartilage Tissue using Multimodal Non-linear Molecular Imaging. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Murtada, S. I., et al. Paradoxical aortic stiffening and subsequent cardiac dysfunction in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Journal of The Royal Society Interface. 17 (166), 0066 (2020).
- Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gómez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
- Pointer, K. B., et al. Association of collagen architecture with glioblastoma patient survival. Journal of Neurosurgery. 126 (6), 1812-1821 (2016).
- Razavi, M. S., Leonard-Duke, J., Hardie, B., Dixon, J. B., Gleason, R. L. Axial stretch regulates rat tail collecting lymphatic vessel contractions. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
- Xue, Y., et al. Valve leaflet-inspired elastomeric scaffolds with tunable and anisotropic mechanical properties. Polymers for Advanced Technologies. 31 (1), 94-106 (2020).
- Zhou, Z. H., et al. Reorganized collagen in the tumor microenvironment of gastric cancer and its association with prognosis. Journal of Cancer. 8 (8), 1466 (2017).
- Zinn, A., et al. The small GTPase RhoG regulates microtubule-mediated focal adhesion disassembly. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Zwaans, B. M., et al. Radiation cystitis modeling: A comparative study of bladder fibrosis radio-sensitivity in C57BL/6, C3H, and BALB/c mice. Physiological Reports. 8 (4), (2020).
- Devine, E. E., Liu, Y., Keikhosravi, A., Eliceiri, K. W., Jiang, J. J. Quantitative second harmonic generation imaging of leporine, canine, and porcine vocal fold collagen. The Laryngoscope. 129 (11), 2549-2556 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Zeitoune, A. A., et al. Epithelial ovarian cancer diagnosis of second-harmonic generation images: A semiautomatic collagen fibers quantification protocol. Cancer Informatics. 16, (2017).
- Wershof, E., et al. Matrix feedback enables diverse higher-order patterning of the extracellular matrix. PLoS Computational Biology. 15 (10), 1007251 (2019).
- Mostaço-Guidolin, L. B., et al. Fractal dimension and directional analysis of elastic and collagen fiber arrangement in unsectioned arterial tissues affected by atherosclerosis and aging. Journal of Applied Physiology. 126 (3), 638-646 (2019).
- Thain, D., Tannenbaum, T., Livny, M. Distributed computing in practice: the Condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience. 17 (2-4), 323-356 (2005).
