Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kvantifisere fibrillar kollagenorganisasjon med kurve transformerebaserte verktøy

Published: November 11, 2020 doi: 10.3791/61931
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, Center for Quantitative Cell Imaging, University of Wisconsin-Madison, 2Departments of Medical Physics and Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 3Morgridge Institute for Research, Madison, Wisconsin, 4test, test

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å bruke et kurveglassede, åpen kildekode MATLAB-programvareverktøy for å kvantifisere fibrillar kollagenorganisasjon i den ekstracellulære matrisen av både normalt og sykt vev. Dette verktøyet kan brukes på bilder med kollagenfibre eller andre typer linjelignende strukturer.

Abstract

Fibrillar kollagen er fremtredende ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, og deres topologi endringer har vist seg å være forbundet med utviklingen av et bredt spekter av sykdommer, inkludert bryst, eggstokkene, nyre, og bukspyttkjertelkreft. Fritt tilgjengelige fiber kvantifisering programvareverktøy er hovedsakelig fokusert på beregning av fiber justering eller orientering, og de er underlagt begrensninger som kravet om manuelle trinn, unøyaktighet i påvisning av fiber kanten i støyende bakgrunn, eller mangel på lokalisert funksjon karakterisering. Kollagen fiber kvantisering verktøyet beskrevet i denne protokollen er preget av å bruke en optimal multiskala bilde representasjon aktivert av kurve transformering (CT). Denne algoritmiske tilnærmingen gjør det mulig å fjerne støy fra fibrillar kollagenbilder og forbedring av fiberkanter for å gi steds- og orienteringsinformasjon direkte fra en fiber, i stedet for å bruke den indirekte pikselvise eller vindusvise informasjonen hentet fra andre verktøy. Dette CT-baserte rammeverket inneholder to separate, men koblede pakker kalt "CT-FIRE" og "CurveAlign" som kan kvantifisere fiberorganisasjon på en global interesseregion (ROI) eller individuell fiberbasis. Dette kvantifiseringsrammeverket er utviklet i mer enn ti år og har nå utviklet seg til en omfattende og brukerdrevet kollagenkvantifiseringsplattform. Ved hjelp av denne plattformen kan man måle opptil tretti fiberfunksjoner, inkludert individuelle fiberegenskaper som lengde, vinkel, bredde og retthet, samt bulkmålinger som tetthet og justering. I tillegg kan brukeren måle fibervinkel i forhold til manuelt eller automatisk segmenterte grenser. Denne plattformen tilbyr også flere ekstra moduler, inkludert de for ROI-analyse, automatisk grenseoppretting og etterbehandling. Bruk av denne plattformen krever ikke tidligere erfaring med programmering eller bildebehandling, og den kan håndtere store datasett, inkludert hundrevis eller tusenvis av bilder, noe som muliggjør effektiv kvantifisering av kollagenfiberorganisasjon for biologiske eller biomedisinske applikasjoner.

Introduction

Fibrillar kollagen er fremtredende, strukturelle ECM-komponenter. Deres organisasjon endrer innvirkning vev funksjon og er sannsynlig forbundet med utviklingen av mange sykdommer som spenner fra osteogenese imperfecta1,hjertedysfunksjon 2,og sårheling3 til ulike typer kreft inkludert bryst4,5,6,ovarian7,8, nyre9, og bukspyttkjertelkreft10. Mange etablerte bildemodaliteter kan brukes til å visualisere fibrillar kollagen som andre harmonisk generasjon mikroskopi11,flekker eller fargestoffer i forbindelse med lyse felt eller fluorescensmikroskopi eller polarisert lysmikroskopi12,flytende krystallbasert polariseringmikroskopi (LC-PolScope)13og elektronmikroskopi14. Etter hvert som betydningen av fibrillar kollagenorganisasjon har blitt klarere, og bruken av disse metodene har økt, har behovet for forbedret kollagenfiberanalyse også vokst.

Det har vært mange anstrengelser for å utvikle beregningsmetoder for automatisert måling av fibrillar kollagen. Fritt tilgjengelige programvareverktøy er hovedsakelig fokusert på beregning av fiberjustering eller orientering ved å vedta enten første derivat eller struktur tensor for piksler15,16eller Fourier transform-basert spektrumanalyse for bildefliser17. Alle disse verktøyene er underlagt begrensninger som kravet om manuelle trinn, unøyaktighet i påvisning av fiberkanten i støyende bakgrunn, eller mangel på lokalisert funksjonskarakterisering.

Sammenlignet med andre fritt tilgjengelige åpen kildekode-gratis programvareverktøy, bruker metodene som er beskrevet i denne protokollen CT – en optimal, multiskala, retningsbestemt bilderepresentasjonsmetode – for å fjerne støy fra fibrillarlagenbilder og forbedre eller spore fiberkanter. Informasjon om plassering og orientering kan gis direkte fra en fiber i stedet for ved å bruke den indirekte pikselvise eller vindusvise informasjonen til å utlede beregningene til fiberorganisasjonen. Dette CT-baserterammeverket 18,19,20,21 kan kvantifisere fiberorganisasjon på global, avkastning eller fiberbasis, hovedsakelig via to separate, men koblede pakker kalt "CT-FIRE"18,21 og "CurveAlign"19,21. Når det gjelder implementeringen av programvaren, kan CT-FIRE-koeffisienter på flere skalaer brukes til å rekonstruere et bilde som forbedrer kantene og reduserer støy. Deretter brukes en individuell fiberekstraksjonsalgoritme på det CT-rekonstruerte bildet for å spore fibre for å finne sine representative senterpunkter, utvide fibergrener fra midtpunktene og knytte fibergrener for å danne et fibernettverk. I CurveAlign kan CT-koeffisienter på en brukerspesifisert skala brukes til å spore lokal fiberorientering, der retningen og plasseringen av kurveletter ekstraheres og grupperes for å estimere fiberorienteringen på de tilsvarende stedene. Dette resulterende kvantifiseringsrammeverket er utviklet i mer enn ti år og har utviklet seg sterkt i mange aspekter som funksjonalitet, brukergrensesnitt og modularitet. For eksempel kan dette verktøyet visualisere lokal fiberorientering og lar brukeren måle opptil tretti fiberfunksjoner, inkludert individuelle fiberegenskaper som lengde, vinkel, bredde og retthet, samt bulkmålinger som tetthet og justering. I tillegg kan brukeren måle fibervinkel i forhold til manuelt eller automatisk segmenterte grenser, som for eksempel spiller en viktig rolle i bildebasert biomarkørutvikling i brystkreft22 og kreftstudieri bukspyttkjertelen 10. Denne plattformen inneholder flere funksjonsmoduler, inkludert de for roi-analyse, automatisk grenseoppretting og etterbehandling. ROI-modulen kan brukes til å kommentere ulike former for avkastning og utføre tilsvarende avkastningsanalyse. Som et eksempel på søknad kan den automatiske grenseopprettingsmodulen brukes til å registrere hematoksylin og eosin (H&E) lyse feltbilder med andre harmoniske generasjonsbilder (SHG) og generere bildemasken av tumorgrenser fra de registrerte H&E-bildene. Etterbehandlingsmodulen kan bidra til å lette behandling og integrering av utdatafiler fra individuelle bilder for mulig statistisk analyse.

Denne kvantifiseringsplattformen krever ikke tidligere erfaring med programmering eller bildebehandling og kan håndtere store datasett, inkludert hundrevis eller tusenvis av bilder, noe som muliggjør effektiv kvantifisering av kollagenorganisasjon for biologiske eller biomedisinske applikasjoner. Det har vært mye brukt i ulike forskningsfelt av mange forskere over hele verden, inkludert oss selv. Det er fire hovedpublikasjoner på CT-FIRE og CurveAlign18,19,20,21, hvorav de tre første har blitt sitert 272 ganger (per 2020-05-04 ifølge Google Scholar). En gjennomgang av publikasjonene som siterte denne plattformen (CT-FIRE eller CurveAlign) indikerer at det er omtrent 110 tidsskriftpapirer som direkte brukte den til deres analyse, der ca 35 publikasjoner samarbeidet med gruppen vår, og de andre (~ 75) ble skrevet av andre grupper. For eksempel, denne plattformen ble brukt til følgende studier: brystkreft22,23,24, kreft ibukspyttkjertelen 10,25, nyrekreft9,26, sårheling3,27,28,29,30, eggstokkreft8,31,7, uterosacral ligament32, hypofosfatmisk dentin33, basalcellekarsinom34, hypoksisk sarkom35, bruskvev36, hjertedysfunksjon37, nevroner38, glioblastom39, lymfatiske sammentrekninger40, fibrøse kaktos41, magekreft42, mikrotubuli43og blærefibrose44. Figur 1 demonstrerer kreftavbildningsapplikasjonen av CurveAlign for å finne de tumorrelaterte kollagensignaturenetil brystkreft 19 fra SHG-bildet. Figur 2 beskriver en typisk skjematisk arbeidsflyt for denne plattformen. Selv om disse verktøyene har blitt gjennomgått teknisk18,19,21,og en vanligprotokoll 20 for justering analyse med CurveAlign er også tilgjengelig, en visuell protokoll som demonstrerer alle de essensielle funksjonene kan være nyttig. En visualisert protokoll, som presentert her, vil lette læringsprosessen ved å bruke denne plattformen, samt mer effektivt ta opp bekymringer og spørsmål som brukerne kan ha.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Denne protokollen beskriver bruken av CT-FIRE og CurveAlign for kollagenkvantifisering. Disse to verktøyene har komplementære, men forskjellige, hovedmål og er knyttet sammen til en viss grad. CT-FIRE kan startes fra CurveAlign-grensesnittet for å utføre de fleste operasjoner, bortsett fra avansert etterbehandling og avkastningsanalyse. For full drift av CT-FIRE, bør den lanseres separat.

1. Krav til bildesamling og bilde

MERK: Verktøyet kan behandle en hvilken som helst bildefil med linjelignende strukturer som kan leses av MATLAB uavhengig av bildemodaliteten som brukes til å samle den.

  1. Bruk 8-biters gråtoner som bildetype som standard kjøreparametere er basert på dette formatet.
    MERK: SHG-avbildning er en mye brukt etikettfri og høyoppløselig fibrillaravbildningsmetode i kollagen. SHG bilder fra en brystkreft studie19 vil bli brukt her for demonstrasjon.

2. Programvareinstallasjon og systemkrav

MERK: Både frittstående og kildekodeversjoner er fritt tilgjengelige. Kildekodeversjonen krever en full MATLAB-installasjon, inkludert verktøykasser for signalbehandling, bildebehandling, statistikkanalyse og parallell databehandling. Hvis du vil kjøre kildekodeversjonen, bør alle nødvendige mapper, inkludert noen fra tredjepartskilder, legges til MATLAB-banen. Bruk av det frittstående programmet (APP) anbefales for de fleste brukere, noe som krever en installasjon av en fritt tilgjengelig MATLAB Compiler Runtime (MCR) av spesifisert versjon. Fremgangsmåten for å installere og starte APP er beskrevet nedenfor.

  1. Last ned CT-FIRE versjon 3.0 (CTF3.0) og CurveAlign versjon 5.0 (CA5.0) APP-pakker fra henholdsvis https://eliceirilab.org/software/ctfire/ https://eliceirilab.org/software/curvealign/.
    MERK: Hver pakke inneholder frittstående APP-, manuelle og testbilder.
  2. Følg detaljerte krav og installasjonsinstruksjoner fra nettstedene ovenfor for å installere MATLAB MCR 2018b.
  3. Start APPEN.
    1. For et Windows 64-biters system dobbeltklikker du på APP-ikonet for å starte det.
    2. For et Mac-system følger du følgende trinn for å starte det: Høyreklikk på APP (ctrl-klikk) | Vis pakkeinnhold | Innhold | MacOS-| applauncher (høyreklikk og velg åpen).
      MERK: Andre detaljer kan ses på programvarenettstedene som er oppført i 2.1.

3. Individuell fiberekstraksjon med CT-FIRE

MERK: CT-FIRE bruker CT til å denoise bildet, forbedre fiberkantene, og bruker deretter en fiberekstraksjonsalgoritme for å spore individuelle fibre. Lengde, vinkel, bredde og retthet beregnes for individuelle fibre.

  1. CT-FIRE på enkeltbilde eller flere bilder
    1. Start APPEN som beskrevet i 2.3.
    2. Klikk på Åpne fil(er)-knappen i det viktigste grafiske brukergrensesnittet (GUI, Figur 3A), og velg deretter ett eller flere bilder / eller bildestabler fra ledevinduet. Bruk teknikken som passer for operativsystemet til å velge flere bilder i dialogboksen (f.eks. i Windows holder du nede CTRL mens du velger flere filer).
      MERK: Hvis to eller flere bildefiler er valgt, må alle bildene bruke de samme kjøreparameterne for analysen. Kontroller at alle bildene er anskaffet under samme eller lignende forhold.
    3. Velg alternativer for parallell databehandling ved å merke av for Parallell øverst til høyre for flere bilder analyse.
    4. For bildestakken flytter du glidebryteren under fillisten for å velge stykket som skal analyseres.
    5. Angi egenskaper for løping. Bruk standardparametere for en innledende analyse av enkelte bilder. Hvis du bruker standardparametere, går du til trinn 3.1.6. Hvis du vil angi forskjellige parametere, klikker du på Oppdater-knappen i Parametere-panelet. Følg håndboken for å justere parameterne riktig.
      MERK: De hyppigst justerte parameterne inkluderer bakgrunnsterskelen (thresh_im2) og nucleation søkeradius (s_xlinkbox). Hvis bakgrunnsstøynivået er høyt, setter du thresh_im2 til en større verdi. s_xlinkbox er forbundet med den gjennomsnittlige radiusen til fibrene, angi en mindre verdi for å oppdage tynne fibre.
    6. Klikk på Kjør-knappen.
      MERK: Fremdriftsinformasjonen vises både i informasjonsvinduet og kommandovinduet. Når analysen er fullført, vises utdatatabellen (figur 3B).
    7. Klikk på et element i utdatatabellen for å se histogrammet av fibermål (figur 3C og figur 3F) av bildet, inkludert lengde, bredde, vinkel og retthet.
      MERK: Fiberbildene med fibre lagt over det opprinnelige bildet vises også (figur 3E).
    8. Kontroller undermappen kalt ctFIREout under bildemappen for utdatafilene, inkludert den overlagte bilde ".tiff" -filen, ".csv" -filen og ".mat" -filen.
  2. CT-FIRE-region av interesse (ROI) analyse
    1. Roi-merknad ved hjelp av ROI Manager
      1. Klikk på Åpne fil(er)-knappen i hoved-GUI (Figur 3A) for å laste inn ett eller flere bilder.
      2. Velg bildet som skal kommenteres i fillisten.
      3. Velg ROI Manager i rullegardinmenyen i Roi Options-panelet.
      4. Klikk på RUN-knappen for å starte ROI Manager-modulen (Figur 3A).
      5. I ROI manager GUI (Figur 4A) klikker du på rullegardinmenyen under Draw ROI Menu(d) for å tegne ROIene, en etter en.
        MERK: ROI-figuren kan være rektangel, frihånd, ellipse, polygon eller spesifisert rektangel. Følg instruksjonene på skjermen for å tegne, lagre og avslutte avkastningsmerknad.
      6. Når du har valgt metoden for å tegne avkastningen, drar du det gule rektangelet som vises på det opprinnelige bildet, til ønsket posisjon, og deretter klikker du på Lagre avkastning(er)-knappen eller trykker på tastene for å legge til denne avkastningen i ROI-listen. Denne avkastningen vil automatisk bli navngitt.
      7. Tegn en ny avkastning ved å dra den forrige avkastningen til en ny posisjon, og lagre den som nevnt i 3.2.1.6, eller gjenta trinn 3.2.1.5–3.2.1.6 for å tegne en ny avkastning.
      8. Trykk på x eller velg Ny avkastning?
      9. Merk av i avmerkingsboksene Vis alle og Etiketter for å vise alle de definerte ROIene på listen og navnene deres på det opprinnelige bildet.
      10. Velg avkastningen i ROI-listen for å utføre grunnleggende roi-operasjoner, inkludert Gi nytt navn til roi,Slett roi, lagre roi-tekst,last inn roi fra tekst, lagre roi maske,last roi fra maske og kombiner ROIer.
      11. Kontroller utdatafilen for ROI manager lagret som ".mat" -fil i en undermappe med navnet ROI_management under den opprinnelige bildemappen.
      12. Hvis du vil kommentere et annet bilde i listen over åpnede filer, gjentar du trinn 3.2.1.2–3.2.1.11.
      13. Når merknaden er gjort, lukker du ROI manager GUI og tilbakestiller hoved-GUI ved å klikke på Tilbakestill-knappen i hoved-GUI.
    2. ROI-analyse for ett enkelt bilde i ROI Manager
      1. Hvis full-image CT-FIRE analyse utføres og resultatene er lagret i standardkatalogen, klikk på en eller flere ROIer i ROI-listen, og klikk deretter på ctFIRE ROI Analyzer knappen for å starte Post-ROI analysemodulen.
        MERK: Resultatene lagres automatisk i en undermappe som ligger på \\[bildemappe]\ CTF_ROI\Individual\ROI_post_analysis\.
      2. I popup-vinduet klikker du på Kontroller fibre-knappen for å vise fibre i de valgte ROIene (figur 4B).
      3. Klikk på Plot Statistikk for å vise histogrammer av hver AVKASTNING ( Figur4C). De tilsvarende utgangstallene vises.
      4. Hvis full bilde CT-FIRE analyse ikke er utført, klikk på en eller flere ROIer i ROI-listen, og klikk på Bruk ctFIRE på ROI knappen for å direkte bruke CT-FIRE analyse på de valgte ROIer.
      5. Følg instruksjonene i ledetekstvinduet for å kjøre analysen.
        Merk: Parameterne for å kjøre CT-FIRE sendes gjennom hoved-GUI, og brukeren kan oppdatere kjøreparameterne som beskrevet i trinn 3.1.5 etter behov. Etter at analysen er fullført, vises sammendragsstatistikken for fibermål i utdatatabellen. Resultatene lagres automatisk i en undermappe på \\[bildemappe]\ CTF_ROI\Individual\ROI_analysis\.
    3. ROI-analyse for flere bilder ved hjelp av ROI Analyzer
      1. Følg trinnene i 3.2.1 for å kommentere ROM-er for bildene som skal analyseres.
      2. Åpne ett eller flere bilder ved å klikke på Åpne fil(er)-knappen.
      3. Hvis du vil kjøre roi post analyse når resultatene for fullstendig bildeanalyse er tilgjengelige, klikker du på rullegardinmenyen i Kjør alternativer-panelet og velger alternativet CTF-analysator etter avkastning.
      4. Klikk på KJØR-knappen for å kjøre ROI-analyse for alle de lastede bildene.
      5. Kontroller fremdriftsinformasjonen som vises i meldingsvinduet nederst i gui-en og i kommandovinduet.
      6. Når analysen er fullført, kontrollerer du sammendragsstatistikken for hver avkastning som vises i en utdatatabell.
        MERK: De detaljerte utdatafilene lagres automatisk i en undermappe på \\ [bildemappe]\CTF_ROI\Batch\ROI_post_analysis\.
      7. Hvis du vil kjøre en direkte analyse når resultatene for fullstendig bildeanalyse ikke er tilgjengelige, følger du trinn 3.2.3.1–3.2.3.6, bortsett fra at i trinn 3.2.3.3 velger du alternativet CTF ROI analysererr; i trinn 3.2.3.4, før du klikker på KJØR knappen, oppdatere de løpende parametrene som beskrevet i trinn 3.1.5. Når du har klikket på KJØR-knappen, velger du mellom rektangulær avkastning og roi maske av en hvilken som helst figur i et spørsmålsdialogvindu.
        MERK: Hvis alle de kommenterte ROIene er rektangulære, kan brukeren velge "Rektangulær avkastning". I trinn 3.2.3.6 lagres resultatene for ROI-analysen i en undermappe på \\[bildemappe]\CTF_ROI\Batch\ROI_analysis\.
  3. Etterbehandling med CT-FIRE
    MERK: Etter den vanlige CT-FIRE-analysen beskrevet i 3.1, kan brukeren utføre ytterligere etterbehandling. Uten å kjøre den tidkrevende fiberekstraksjonen igjen, kan regelmessig etterbehandling, beskrevet i 3.3.1, oppdatere noen grunnleggende egenskaper for utdatafigur, mens den avanserte etterbehandlingen beskrevet i 3.3.2 kan visualisere individuelle fibre og deres egenskaper, utføre kompleks tersering blant alle de fire fiberegenskapene, generere sammendragsstatistikk for de valgte fibrene og visualisere de valgte fibrene ved hjelp av et tilpasset fargekart.
    1. Regelmessig etterbehandling med CT-FIRE
      1. Start CT-FIRE-appen, eller klikk på Tilbakestill-knappen etter andre operasjoner for å initialisere CT-FIRE-hovedGUI (Figur 3A).
      2. Merk av for .mat øverst i hoved-GUI-en.
      3. Klikk på Åpne fil(er)-knappen for å velge CT-FIRE output .mat-filen i ctFIREout-undermappen.
        MERK: Hvis det er merket av for flere filer, merkes det automatisk av for Parti. Filnavnet på de tilsvarende bildene vises i bokslisten.
      4. Oppdater alternativene i Kontrollpanelet for utdatafigur.
      5. Behold standardalternativene i Utdataalternativer, som vil sørge for at alle utdatafilene vil bli oppdatert i henhold til det nye settet med parametere satt i 3.3.1.4.
      6. Klikk på Etterbehandling-knappen. Kontroller fremdriftsinformasjonen i meldingsvinduet nederst i hovedgrensesnittet og i kommandovinduet.
      7. Når analysen er fullført, klikker du på et element i utdatatabellen for å se histogrammet av fibermål av bildet, inkludert lengde, bredde, vinkel og retthet.
        MERK: Nye utdatafiler vil overskrive de gamle i ctFIREout-undermappen.
    2. Avansert etterbehandling av CT-FIRE
      1. Start CT-FIRE-appen, eller klikk på Tilbakestill-knappen etter andre operasjoner for å initialisere CT-FIRE-hovedGUI (Figur 3A).
      2. Merk av for OUT.adv øverst i hoved-GUI (figur 3A).
      3. Klikk på Etterbehandling-knappen for å starte den avanserte etterbehandling GUI kalt "Analysis Module" (Figur 5A).
      4. Klikk på Velg fil-knappen for å velge et bilde.
      5. Klikk på Visualiser fibre-knappen for å angi fibernummer basert på etikettene i Tabulatorfiguren Original-fibre .
        MERK: Målene for de valgte fibrene vises i en utdatatabell (figur 5B), og de tilsvarende fibrene vil bli lagt over det opprinnelige bildet som vises i tabulatorfiguren Measured-Fibers (figur 5C).
      6. Klikk på Bekreft/oppdater-knappen for å gå til terskeloperasjonen.
      7. Merk av for terskeling for å aktivere terskelinnstillingene.
      8. Velg ett av de fire terskelalternativene fra rullegardinmenyen.
      9. Angi ønskede terskler i Terskler-panelet for én eller flere fiberegenskaper.
      10. Klikk på Terskel nå-knappen for å bruke de ovennevnte terskelbetingelsene.
      11. Kontroller ledetekstfiguren med navnet som slutter med visualisering av beregninger for å se de valgte fibrene lagt over de opprinnelige bildene med de tilpassede fargekartene som vist i figur 5E.
      12. Gjenta trinn 3.3.2.9–3.3.2.11 for å angi de ønskelige terskler.
      13. Klikk på Lagre fibre-knappen for å lagre den valgte fiberinformasjonen.
        MERK: Tilsvarende valgte fibre vises i tabulatorfiguren Etter Tersklering.
      14. Klikk på Generer statistikk-knappen, og klikk deretter på OK-knappen i popup-vinduet for å generere sammendragsstatistikk.
        MERK: En utdatatabell (figur 5D) viser gjennomsnittsverdien for de valgte fibrene. Annen statistikk over de valgte fibrene lagres i en Excel-fil der plasseringen vises i statusvinduet nederst i denne GUI-en.
      15. Hvis du vil inkludere den valgte individuelle fiberinformasjonen i utdatafilen, merker du av for Generer ark for rådata før du klikker på OK-knappen.
      16. Hvis du vil kombinere resultater fra flere bilder, merker du av for Partimodus eller Stablemodus i trinn 3.3.2.4, og velger flere bilder eller stakker som skal analyseres. hopp over trinn 3.3.2.5–3.3.2.6. I trinn 3.3.2.8–3.3.2.9 angir du terskelbetingelser, men når knapper terskelen nå og Lagre fibre er deaktivert, hopp over trinn 3.3.2.10–3.3.2.13; og til slutt følger du instruksjonene i trinn 3.3.2.14 for å generere sammendragsstatistikk og individuelle fiberegenskaper for de valgte fibrene.

4. Fiberanalyse med CurveAlign

MERK: CurveAlign ble opprinnelig utviklet for å måle vinkler av fibre automatisk med hensyn til brukerdefinerte grenser. Den nåværende versjonen av CurveAlign kan brukes til massevurdering av tetthets- og justeringsbaserte funksjoner i tillegg til den relative vinkelmålingen ved enten å laste inn den individuelle fiberinformasjonen som trekkes ut av CT-FIRE eller direkte ved hjelp av den lokale retningen på kurvelettene. CurveAlign beregner opptil tretti funksjoner knyttet til globale eller lokale funksjoner hovedsakelig inkludert tetthet og justering, samt individuelle fiberegenskaper når CT-FIRE er vedtatt som fibersporingsmetode.

  1. Fiberanalyse med kurver
    1. Start APPEN som beskrevet i 2.3.
    2. Klikk på Tilbakestill-knappen for å tilbakestille APPEN til sin opprinnelige status hvis andre operasjoner er utført.
    3. I hovedforguiden (figur 6A) kontrollererdu alternativet Fiberanalysemetode for å kontrollere at CT er valgt (standardalternativ).
      MERK: I denne modusen utføres CT på bildet, og retningen på hver kurve representerer retningen til en fiber på tilsvarende sted.
    4. Klikk på rullegardinmenyen Grensemetode, og velg grensebehandlingsmodus fra følgende rullegardinmenyalternativer: Ingen grense, CSV-grense og TIFF-grense.
      MERK: Hvis ingen grense er nødvendig, hopper du over dette trinnet. Se 4.3 for hvordan du beregner fibervinkler med hensyn til en grense.
    5. Klikk på Knappen Hent bilde(er) i hoved-GUI (Figur 6A), og velg deretter ett eller flere bilder/eller bildestakker fra ledetekstvinduet. Bruk teknikken som passer for operativsystemet til å velge flere bilder i dialogboksen (f.eks. i Windows holder du nede CTRL mens du velger flere filer).
      MERK: Hvis to eller flere bildefiler er valgt, må alle bildene bruke de samme kjøreparameterne for analyse. Kontroller at alle bildene er anskaffet under samme eller lignende forhold.
    6. For bildestakken flytter du glidebryteren under fillisten for å velge stykket som skal analyseres.
    7. Angi brøkdelen av koe for å beholde. Denne verdien er brøkdelen av de største koeffisientene av CT som skal brukes i fiberanalysen.
      MERK: Hvis bildet har stor variasjon i fiberintensitet eller kontrast, kommenterer du interesseområder med jevn kontrast for fiberanalysen, da denne modusen bare oppdager de lyseste fibrene i et bilde. I tillegg er jo større bildestørrelsen er, angi en mindre verdi for denne brøken.
    8. Behold alle parameterne i Utdataalternativer og andre i Avansert-alternativet som standard. utdatafilene kan være nødvendig i andre fremtidige operasjoner.
    9. Klikk på Kjør-knappen nederst i hoved-GUI (Figur 6A).
      MERK: Fremdriftsinformasjonen vises i et meldingsvindu uthevet i grønn farge nederst. Når prosessen er gjort, vises noen sammendragsstatistikk for hvert bilde i utdatatabellen (figur 6B), og alle utdatafilene lagres automatisk i en undermappe med navnet CA_Out i katalogen til det opprinnelige bildet(e).
    10. Klikk på et element i utdatatabellen (figur 6B) for å se histogrammet (figur 6E) eller kompassplott (figur 6F) av fibervinkler.
      MERK: Overleggsbildet (figur 6C) og varmekart (figur 6D) justering eller vinkel vises også.
    11. Klikk på Tilbakestill-knappen for å kjøre andre operasjoner, eller lukk hoved-GUI for å avslutte APPEN.
  2. Individuell fiberanalyse med CT-FIRE
    MERK: Fremgangsmåten er den samme som den som er beskrevet i avsnitt 4.1, bortsett fra at i trinn 4.1.3 velger du CT-FIRE-relatert fiberanalysemodusog hopper over trinn 4.1.7, da den ikke er aktuelt og er deaktivert i CT-FIRE-modus. Spesielt i trinn 4.1.3 velger du en blant følgende tre CT-FIRE-baserte individuelle fiberanalysemetoder:
    1. Velg CT-FIRE Fibre for å bruke fibersenterpunktet og fibervinkelen til å representere fiberen.
      MERK: Dette alternativet tar ikke hensyn til endringene i fiberorientering langs fiberens lengde.
    2. Velg CT-FIRE endepunkter for å bruke de to endepunktene til en fiber og tilsvarende fibervinkel til å representere fiberen.
      MERK: Sammenlignet med 4.2.1 bruker dette alternativet to posisjoner til å representere en fiber i stedet for en (midtpunktet i fiberen).
    3. Velg CT-FIRE-segmenter for å bruke segmenter av en fiber til å representere fiberen.
      MERK: Hvert segment har lik lengde (satt til 5 piksler som standard i CT-FIRE) samt retningen og plasseringen, noe som gjenspeiler endringen i orientering langs hele fiberens lengde. Dette alternativet ville være det mest tidkrevende, men ville være det beste alternativet blant de tre CT-FIRE-baserte fiberanalysemetodene for å spore endringer i den lokale orienteringen av en svingete fiber.
  3. Relativ justeringsanalyse med grense
    MERK: Sammenlignet med den vanlige analysen uten grenseforhold som er beskrevet i pkt. 4.2 og 4.3, trenger relativ justeringsanalyse med grenseforhold følgende:
    1. I trinn 4.1.3 velger du tiff-grensebetingelsen.
      MERK: Brukeren trenger en tilsvarende grensefil for hvert bilde eller hver stabel. Følg instruksjonene på skjermen for å kommentere enten en CSV-grensefil (kommadelte verdier), x-y-koordinater) eller en tiff-grensefil manuelt. Grensefilene som er opprettet i CurveAlign, lagres automatisk i henhold til filkatalogen og filnavnkonvensjonene som er beskrevet i håndboken. Hvis det finnes et par lysfelt- og SHG-bilder for H&E og SHG, bruker du den automatiske grenseopprettingsmodulen som er beskrevet i del 4.4, til å generere grensefilen.
    2. I Primærparametere-panelet angir du avstanden fra nærmeste grense for å bare evaluere fibrene innenfor dette avstandsområdet.
    3. I Utdataalternativer-panelet merker du av for grense tilknytningsboksen Bdry Assoc for å visualisere punktet på grensen som er knyttet til en fiber, et fibersegment eller kurve.
  4. Automatisk grenseoppretting
    1. Start APPEN som beskrevet i 2.3.
    2. Klikk på Tilbakestill-knappen for å tilbakestille APPEN til sin opprinnelige status hvis andre operasjoner allerede er utført.
    3. Klikk på BD Creation-knappen for å starte den automatiske grenseopprettingsmodulen.
    4. Følg instruksjonene/ledetrådene på skjermen for å opprette grensefilen for ett eller flere bilder basert på et par H&E-lysfelts- og SHG-bilder.
    5. Lukk modulvinduet, eller klikk på Tilbakestill-knappen i hoved-GUI (Figur 6A) for å avslutte denne modulen.
  5. CurveAlign område av interesseanalyse
    1. Roi-merknad ved hjelp av ROI Manager
      1. Klikk på Hent bilde(er)-knappen i hoved-GUI (Figur 6A) for å laste inn ett eller flere bilder.
      2. Velg bildet som skal kommenteres i fillisten.
      3. Klikk på ROI Manager for å starte ROI Manager-modulen (Figur 7A).
      4. Følg trinn 3.2.1.5–3.2.1.13 i avsnitt 3.2.1.
    2. ROI-analyse for ett enkelt bilde i ROI Manager
      1. Hvis fullstendig bilde CurveAlign analyse er utført, og resultatene er lagret i standardkatalogen, klikk på en eller flere ROIer i ROI-listen, og klikk deretter på CA ROI Analyzer knappen for å kjøre Post-ROI analyse.
        MERK: Når analysen er fullført, vises sammendragsstatistikk i en utdatatabell (figur 7C) samt et histogrammet tall (figur 7D) som viser vinkelfordelingen.
      2. Klikk på et element i utdatatabellen for å visualisere fibrene i en gitt avkastning (figur 7B) samt histogrammet av fibervinklene.
      3. Kontroller utdatafilene som er lagret i en undermappe på \\[bildemappe]\ CA_ROI\Individual\ROI_post_analysis\.
      4. Hvis fullbilde CA analyse ikke er utført, klikk på en eller flere ROIer i ROI-listen, og klikk på Bruk CA på ROI knappen for å direkte bruke CA analyse på de valgte ROIer. Følg instruksjonene i ledetekstvinduet for å kjøre analysen.
        MERK: Parameterne for å kjøre CA-analysen sendes gjennom hoveddesing dette. oppdatere de løpende parameterne som er beskrevet i trinn 4.1.7 etter behov. Etter at analysen er fullført, vises resultatene av sammendragsstatistikken for fibermål i utdatatabellen. Resultatene lagres automatisk i en undermappe på \\[bildemappe]\ CA_ROI\Individual\ROI_analysis\.
    3. ROI-analyse for flere bilder ved hjelp av ROI Analyzer
      1. Følg trinnene i 4.5.1 for å kommentere ROIer for bildene som skal analyseres.
      2. Åpne ett eller flere bilder ved å klikke på Hent bilde(er)-knappen.
      3. Hvis du vil kjøre avkastning etter analyse når resultatene for hele bildeanalysen er tilgjengelige, klikker du på ROI Analysis-knappenog velger alternativet AVKASTNING etter behandling .
      4. Kontroller fremdriftsinformasjonen som vises i meldingsvinduet nederst i gui-en og i kommandovinduet.
      5. Når analysen er fullført, kontrollerer du sammendragsstatistikken for hver avkastning som vises i en utdatatabell.
        MERK: De detaljerte utdatafilene lagres automatisk i en undermappe på \\ [bildemappe]\CA_ROI\Batch\ROI_post_analysis\.
      6. Hvis du vil kjøre en direkte analyse med CT-modus når resultatene for fullstendig bildeanalyse ikke er tilgjengelige, følger du trinn 4.5.3.1–4.5.3.5, med unntak av følgende endringer: endre trinn 4.5.3.3 ved å velge alternativet CA på beskåret rektangulær avkastning eller CA på maske med avkastning av en hvilken som helst form. Hvis alle de kommenterte ROIene er rektangulær figur, velger du alternativet Rektangulær avkastning. Etter trinn 4.5.3.2 oppdaterer du de kjørende parameterne, som beskrevet i 4.1.7.
        MERK: Resultatene for roi-analysen lagres i en undermappe på \\ [bildemappe]\CA_ROI\Batch\ROI_analysis\.
  6. Etterbehandling av CurveAlign
    1. Start APPEN som beskrevet i avsnitt 2.3.
    2. Klikk på Tilbakestill-knappen for å tilbakestille APP til sin opprinnelige status hvis andre operasjoner allerede er utført.
    3. Klikk på Etterbehandling-knappen for å starte etterbehandlingsmodulen.
    4. Følg instruksjonene/ledetrådene på skjermen for å kombinere utdatafunksjonene eller verdiene fra forskjellige bilder.
    5. Lukk modulvinduet, eller klikk på Tilbakestill-knappen i hoved-GUI (Figur 6A) for å avslutte denne modulen.

5. Beregnet kjøretid

  1. Vent den estimerte kjøretiden for behandling av et bilde med en størrelse på 1024 piksler x 1024 piksler med moderat fibertetthet. Den faktiske beregningstiden avhenger vanligvis av flere faktorer, inkludert størrelsen på filen, analysemodusen, funksjonene som skal distribueres, den sentrale behandlingsenheten (CPU) typen og mengden tilgjengelig random-access-minne (eller RAM). CT-FIRE individuell fiberekstraksjon tar et par minutter. CurveAlign CT-modus uten grense tar noen sekunder. CurveAlign CT-FIRE fiber eller fiber ender modus uten grense tar titalls sekunder. CurveAlign CT-FIRE fibermodus uten grense tar hundrevis av sekunder. CurveAlign analyse med grensen tar titalls sekunder til flere minutter, avhengig av kompleksiteten av grensene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse metodene har blitt brukt i mange studier. Noen typiske applikasjoner inkluderer: 1) Conklin et al.22 brukte CurveAlign til å beregne tumor-assosiert kollagen signaturer, og fant at kollagen fibre var oftere justert vinkelrett på kanalen omkretsen i ductal karsinom in situ (DCIS) lesjoner; 2) Drifka et al.10 brukte CT-FIRE-modus i CurveAlign å kvantifisere stromal kollagen justering for bukspyttkjertel ductal adenokarsinom og normal / kronisk pankreatitt vev, og fant at det var en økt justering i kreftvev sammenlignet med det i normal / kronisk vev; 3) Alkmin et al.7 brukte CurveAlign å kvantifisere kantete fordelingen av F-actin fibre og samlet kollagen justering fra SHG bilder av ovarian stromal kollagen, og viste at matrise morfologi spiller en viktig rolle i å drive celle motilitet og F-actin justering; 4) LeBert et al.3 påført CT-FIRE på SHG bilder av en sebrafisk sår reparasjon modell og fant en økning i tykkelsen av kollagen fibre etter akutt såret; 5) Devine et al.45 brukte CT-FIRE-modus i CurveAlign for SHG bilder av vokal fold kollagen fra ulike dyremodeller for å måle individuelle fiberegenskaper og generell justering, og viste at svin og hund vokal fold kollagen hadde en høyere justering og retthet dårligere; 6) Keikhosravi et al.13 brukte CurveAlign å kvantifisere kollagen justering i histopathology prøver avbildet med LC-PolScope, og viste at LC-PolScope og SHG er sammenlignbare i form av justering og orientering måling for enkelte typer vev.

Figure 1
Figur 1: Bruke CurveAlign til å finne tumor-assosiert kollagen signaturer fra SHG bilder av en menneskelig brystkreft vev microarray (TMA). (A) Overlegg bilde av en TMA kjerne med SHG bilde (gul) lagt på tilsvarende H & E lyse feltbilde. (B) Regionen av interesse for (A). (C) Det lyse feltbildet av (B). (D)SHG-bildet av (B). Maskensom er knyttet til det lyse feltbildet (C). (E) CurveAlign utgang overlegg bilde som viser tumor grenser (gul) fra (F), representative fiber steder, og orientering (grønne linjer); de blå linjene brukes til å knytte fibre med sine nærmeste grenser. De grønne pilene i (B) og (E) viser fibrene parallelt med tumorgrensen, mens de røde pilene der viser fibrene vinkelrett på grensen. Vektstangen i (A) tilsvarer 200 μm. Bilder i (B)–(F) vises i samme skala, og den representative skalalinjen i (D) tilsvarer 50 μm. Forkortelser: SHG = andre harmoniske generasjon; H&E = hematoksylin og eosin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk arbeidsflyt for kvantifisering av et fibrillar kollagenbilde. (A) SHG-bilde som skal analyseres av CT-FIRE og/ eller CurveAlign. (B) Overlegg bildeutgang ved CT-FIRE. (C) Maskegrensen til (A) er en valgfri CurveAlign-inngang. (D)Overlegg bildeutgang av CurveAlign. Fargelinjene i (B) representerer de ekstraherte fibrene. I (D)angir de grønne linjene plasseringene og retningene til fibrene som er utenfor grensene (gule linjer) og er innenfor den angitte avstanden fra sine nærmeste grenser, de røde linjene er de av andre fibre, og de blå linjene brukes til å knytte fibre til sine nærmeste grenser. Bilder i (A)–(D) vises i samme skala, og den representative skalalinjen i (A) tilsvarer 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: CT-FIRE regelmessig analyse. (A) Hoved GUI. (B) Utdatatabell som viser sammendragsstatistikken. (C) og (F) viser henholdsvis histogrammene av vinkel og bredde. (E) Utdatabilde som viser de ekstraherte fibrene (fargelinjene) lagt over det opprinnelige SHG-bildet (D). Forkortelser: GUI = CT = kurve transformere; grafisk brukergrensesnitt; SHG = andre harmoniske generasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: CT-FIRE ROI management modul. (A) Modul GUI. (B) ROI etter analyse av fire ROIer med forskjellige former som viser fibrene i hver avkastning. (C) ROI histogrammer av forskjellige fiberegenskaper. Forkortelser: CT = kurve transformere; GUI = grafisk brukergrensesnitt; AVKASTNING = interesseområde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: CT-FIRE avansert etterbehandlingsmodul. (A) Modul GUI. (B) Målinger av utvalgte tre fibre. (C) Visualisering av de valgte tre fibrene i (B). (D) Sammendragsstatistikk etter å ha brukt en lengdeterskel (> 60 piksler). (E) Visualisering av fibrene valgt i (D) med lengdebasert fargelinje. Forkortelser: CT = kurve transformere; GUI = grafisk brukergrensesnitt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: CurveJust regelmessig analyse. (A) Hoved GUI. (B) Utdatatabell som viser sammendragsstatistikken. (C) Utdatabilde som viser plasseringene og orienteringen til representative fibre (grønne linjer) og grenser (gule linjer) lagt på det opprinnelige SHG-bildet, de blå linjene brukes til å knytte fibre til sine nærmeste grenser, røde linjer viser plasseringene og retningene til fibrene innenfor en grense eller utenfor langt borte fra grensen (> bruker angitt avstand, for eksempel 250 piksler her). (D) Varmekart av vinkler: rød (> 60 grader), gul (45-60] grader, grønn (10, 45] grader. (E)–(F) viser vinkelfordelingen ved hjelp av henholdsvis histogrammet og kompassplottet. Forkortelser: GUI = grafisk brukergrensesnitt; SHG = andre harmoniske generasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: CurveAlign ROI management modul. (A)Modulen GUI. (B) Fire kommenterte rektangulære ROM-er lagt over det opprinnelige bildet. (C) Avkastning etter analyse utgangstabell. (D)Vinkel histogrammet for hver avkastning. Forkortelser: ROI = interesseområde; GUI = grafisk brukergrensesnitt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver bruken av CT-FIRE og CurveAlign for fibrillar kollagen kvantifisering og kan brukes på et bilde med kollagenfibre eller andre linjelignende eller fiberlignende langstrakte strukturer egnet for analyse av CT-FIRE eller CurveAlign. For eksempel kan elastin eller elastiske fibre behandles på en lignende måte på denne plattformen. Vi har testet begge verktøyene på beregningsmessig genererte syntetiske fibre21. Avhengig av programmet bør brukerne velge analysemodusen som passer best for dataene sine. CT fiber analysemodus kan direkte bruke kurver i CT for å representere fiber plassering og orientering, og det er følsomt for endringer i lokal fiberstruktur. CT-modus kan brukes til å lokalisere fibre og deres orientering under komplekse forhold, for eksempel hvor støynivået er høyt, fiberen er svingete, eller variasjonen i fibertykkelsen er høy. Men siden CT-modus bare plukker opp de lyseste delene av et bilde, vil det savne noen fibre med lavere intensitet når det er stor variasjon i bildeintensiteten.

Dessuten gir CT-modus ikke informasjon om individuelle fibre. I motsetning til CT-modus beregner CT-FIRE-modus individuelle fiberegenskaper og kan analysere alle fibrene hvis intensitet er over en spesifisert terskel. Utfordringene knyttet til CT-FIRE-modus inkluderer: 1) nøyaktigheten av en intakt fiberekstraksjon kan reduseres eller kompromitteres når det er stor variasjon i intensiteten langs en fiber eller fibertykkelsen over et bilde; og 2) den nåværende standardanalysen er beregningsmessig krevende som nevnt i protokollen. Flere detaljer om fordelene og begrensningene ved disse metodene kan sees i våre tidligere publikasjoner20,21.

Når det gjelder nøyaktigheten av fibersporing, kan brukeren hovedsakelig stole på visuell inspeksjon for å sjekke det overlappende bildet der de ekstraherte fibrene eller representative orienteringene er lagt over det opprinnelige bildet. I tillegg, for CT-FIRE, kan brukeren bruke den avanserte etterbehandlingsmodulen til å identifisere egenskapene til utvalgte individuelle fibre, og sammenligne dem med målinger ved hjelp av andre bildeanalyseverktøy som Fiji46. For CurveAlign kan brukeren sammenligne retnings- eller justeringsresultatene med de som beregnes av andre verktøy, for eksempel OrientationJ16 og CytoSpectre17.

Blant funksjonene som er tilgjengelige for utgang av plattformen, er justeringsrelaterte funksjoner mest brukt og er de mest pålitelige og robuste. For å bruke individuelle fiberfunksjoner må brukeren bekrefte utvinningen av representative fiberfunksjoner. Merk at en intakt fiber kan deles inn i flere kortere segmenter i noen tilfeller, som brukeren bør ta hensyn til når du velger fiberanalysemodus eller gjennomfører ytterligere statistisk analyse. Selv når fiberlengden ikke kan brukes direkte som en sammenlignbar egenskap, kan retningen eller bredden på fibersegmenter vektet mot lengdene fortsatt indikere nyttig informasjon. Når det gjelder SHG-bildebehandling, kan numerisk blenderåpning (NA) av objektivobjektivet påvirke påvisning av bredden og lengden på en fiber betydelig, men det har mindre innvirkning på retnings- og justeringsmålingene. I vår erfaring innen SHG-avbildning må vi vanligvis bruke objektiv med 40x forstørrelse eller høyere med NA ≥ 1.0 for å oppnå en robust måling av fibertykkelse.

"Justering" kan tolkes på tre forskjellige måter: 1) justering med hensyn til den positive horisontale retningen kalt "vinkel", alt fra 0 til 180 grader, hvor vinkler nær 0 har lignende orientering til vinkler nær 180 grader; 2) justering med hensyn til en grense som heter "relativ vinkel", alt fra 0 til 90 grader, med 0 grader som indikerer en fiber parallelt med grensen og 90 indikerer en vinkelrett fiber; og 3) justering av fibre med hensyn til hverandre kalt "justeringskoeffisient", alt fra 0 til 1, med 1 indikerer perfekt justerte fibre og mindre verdier som representerer mer tilfeldig fordelte fibre.

Foruten fiberfunksjonene beregnet i denne plattformen, ble det også foreslått noen beregninger basert på teksturanalyse47,48,49 for å kvantifisere ECM-mønstre. Disse teksturrelaterte funksjonene kan gi en alternativ eller ekstra beskrivelse av ECM i enkelte applikasjoner. Utfordringene for utviklingen av denne typen beregninger ligger i samspillet mellom mulig biologisk relevans, lokalisert karakterisering og nøyaktigheten av sporing av individuelle fibre.

For å optimalisere kjøreparameterne og utføre feilsøking, kan brukeren referere til de manuelle, relevantepublikasjonene 20,21 samt FAQ-sidestolpene på GitHub Wiki-sidene i kurverepositoriet: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki. For noen knapper kan det vises et funksjonstips for å veilede brukeren for gjeldende eller neste operasjon når brukeren flytter museikonet over en knapp. Følg informasjonen i GUI- eller kommandovinduet for å utføre feilsøkingen.

For å behandle et stort datasett oppfordres brukeren til å bruke parallelle databehandlingsalternativer, noe som gjør det mulig for verktøyet å behandle flere bilder samtidig. Ett alternativ er å bruke flere CPU-kjerner hvis tilgjengelig på datamaskinen som brukes. Alternativt er en hodeløs versjon av begge APPs gitt og har blitt utarbeidet i kompileringnoden gjennom serveren som holdes på CONDOR-baserte50 Center for High Throughput Computing (CHTC) ved University of Wisconsin-Madison. CHTC-arbeidsflyten for storskala fiberkvantifisering er utviklet, testet og brukt med hell på ekte bildesett bestående av tusenvis av bilder. Brukeren kan tilpasse de hodeløse MATLAB-funksjonene til både CT-FIRE og CurveAlign for å kjøre kvantifisering på andre cloud computing-systemer, inkludert kommersielle tjenester som de som tilbys av Amazon, Google og Microsoft.

De pågående og fremtidige utviklingsretningene inkluderer: 1) inkorporering av dyp læring nevrale nettverk for å trekke ut eller generere syntetiske kollagen fiber bilder av høy kvalitet og forbedre robusthet og nøyaktighet av fiber sporing algoritme; 2) integrering av alle modulene i en omfattende plattform samtidig som koden og dokumentasjonen optimaliseres etter de beste programvareingeniørpraksisene; 3) distribusjon av alle kjernefunksjonene på en cloud computing plattform; 4) forbedring av arbeidsflyten av fiberanalyse ved hjelp av CHTC-tjenesten; og 5) forbedring av funksjonaliteten til syntetisk fiber generator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker mange bidragsytere og brukere til CT-FIRE og CurveAlign gjennom årene, inkludert Dr. Rob Nowak, Dr. Carolyn Pehlke, Dr. Jeremy Bredfeldt, Guneet Mehta, Andrew Leicht, Dr. Adib Keikhosravi, Dr. Matt Conklin, Dr. Jayne Squirrell, Dr. Paolo Provenzano, Dr. Brenda Ogle, Dr. Patricia Keely, Dr. Joseph Szulczewski, Dr. Suzanne Ponik og ytterligere tekniske bidrag fra Swati Anand og Curtis Rueden. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Semiconductor Research Corporation, Morgridge Institute for Research og NIH gir R01CA199996, R01CA181385 og U54CA210190 til K.W.E.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CT-FIRE Univerity of Wisconsin-Madison N/A open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlign University of Wisconsin-Madison N/A open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nadiarnykh, O., et al. Second harmonic generation imaging microscopy studies of osteogenesis imperfecta. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 051805 (2007).
  2. Kouris, N. A., et al. A nondenatured, noncrosslinked collagen matrix to deliver stem cells to the heart. Regenerative Medicine. 6 (5), 569-582 (2011).
  3. LeBert, D. C., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
  4. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  5. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 1 (2008).
  6. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  7. Alkmin, S., et al. Migration dynamics of ovarian epithelial cells on micro-fabricated image-based models of normal and malignant stroma. Acta Biomaterialia. 100, 92-104 (2019).
  8. Campbell, K. R., Campagnola, P. J. Assessing local stromal alterations in human ovarian cancer subtypes via second harmonic generation microscopy and analysis. Journal of Biomedical Optics. 22 (11), 116008 (2017).
  9. Best, S. L., et al. Collagen organization of renal cell carcinoma differs between low and high grade tumors. BMC Cancer. 19 (1), 490 (2019).
  10. Drifka, C. R., et al. Periductal stromal collagen topology of pancreatic ductal adenocarcinoma differs from that of normal and chronic pancreatitis. Modern Pathology. 28 (11), 1470-1480 (2015).
  11. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  12. Arun Gopinathan, P., et al. Study of collagen birefringence in different grades of oral squamous cell carcinoma using picrosirius red and polarized light microscopy. Scientifica. 2015, 1-7 (2015).
  13. Keikhosravi, A., et al. Quantification of collagen organization in histopathology samples using liquid crystal based polarization microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4243-4256 (2017).
  14. Quan, B. D., Sone, E. D. Cryo-TEM analysis of collagen fibrillar structure. Methods in Enzymology. 532, 189-205 (2013).
  15. Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
  16. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  17. Kartasalo, K., et al. CytoSpectre: a tool for spectral analysis of oriented structures on cellular and subcellular levels. BMC Bioinformatics. 16 (1), 1 (2015).
  18. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  19. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  20. Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. Methods for quantifying fibrillar collagen alignment. Methods in Molecular Biology. 1627, 429-451 (2017).
  21. Liu, Y., et al. Fibrillar collagen quantification with curvelet transform based computational methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  22. Conklin, M. W., et al. Collagen alignment as a predictor of recurrence after ductal carcinoma in situ. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. 27 (2), 138-145 (2018).
  23. Jallow, F., et al. Dynamic interactions between the extracellular matrix and estrogen activity in progression of ER+ breast cancer. Oncogene. 38 (43), 6913-6925 (2019).
  24. Smirnova, T., et al. Serpin E2 promotes breast cancer metastasis by remodeling the tumor matrix and polarizing tumor associated macrophages. Oncotarget. 7 (50), 82289 (2016).
  25. Fanous, M., Keikhosravi, A., Kajdacsy-Balla, A., Eliceiri, K. W., Popescu, G. Quantitative phase imaging of stromal prognostic markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1354-1364 (2020).
  26. Jiménez-Torres, J. A., Virumbrales-Muñoz, M., Sung, K. E., Lee, M. H., Abel, E. J., Beebe, D. J. Patient-specific organotypic blood vessels as an in vitro model for anti-angiogenic drug response testing in renal cell carcinoma. EBioMedicine. 42, 408-419 (2019).
  27. Govindaraju, P., Todd, L., Shetye, S., Monslow, J., Puré, E. CD44-dependent inflammation, fibrogenesis, and collagenolysis regulates extracellular matrix remodeling and tensile strength during cutaneous wound healing. Matrix Biology. 75, 314-330 (2019).
  28. Henn, D., et al. Cryopreserved human skin allografts promote angiogenesis and dermal regeneration in a murine model. International Wound Journal. 17 (4), 925-936 (2020).
  29. Rico-Jimenez, J., et al. Non-invasive monitoring of pharmacodynamics during the skin wound healing process using multimodal optical microscopy. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 000974 (2020).
  30. Israel, J. S., et al. Quantification of collagen organization after nerve repair. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (12), (2017).
  31. Rentchler, E. C., Gant, K. L., Drapkin, R., Patankar, M., Campagnola, P. J. Imaging collagen alterations in STICs and high grade ovarian cancers in the fallopian tubes by second harmonic generation microscopy. Cancers. 11 (11), 1805 (2019).
  32. Hu, C., et al. Imaging collagen properties in the uterosacral ligaments of women with pelvic organ prolapse using spatial light interference microscopy (SLIM). Frontiers in Physics. 7, 72 (2019).
  33. Guirado, E., et al. Disrupted protein expression and altered proteolytic events in hypophosphatemic dentin can be rescued by dentin matrix protein 1. Frontiers in Physiology. 11, 82 (2020).
  34. Kiss, N., et al. Quantitative analysis on ex vivo nonlinear microscopy images of basal cell carcinoma samples in comparison to healthy skin. Pathology & Oncology Research. 25 (3), 1015-1021 (2019).
  35. Lewis, D. M., et al. Collagen fiber architecture regulates hypoxic sarcoma cell migration. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 400-409 (2018).
  36. Moura, C. C., Bourdakos, K. N., Tare, R. S., Oreffo, R. O., Mahajan, S. Live-imaging of Bioengineered Cartilage Tissue using Multimodal Non-linear Molecular Imaging. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  37. Murtada, S. I., et al. Paradoxical aortic stiffening and subsequent cardiac dysfunction in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Journal of The Royal Society Interface. 17 (166), 0066 (2020).
  38. Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gómez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
  39. Pointer, K. B., et al. Association of collagen architecture with glioblastoma patient survival. Journal of Neurosurgery. 126 (6), 1812-1821 (2016).
  40. Razavi, M. S., Leonard-Duke, J., Hardie, B., Dixon, J. B., Gleason, R. L. Axial stretch regulates rat tail collecting lymphatic vessel contractions. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  41. Xue, Y., et al. Valve leaflet-inspired elastomeric scaffolds with tunable and anisotropic mechanical properties. Polymers for Advanced Technologies. 31 (1), 94-106 (2020).
  42. Zhou, Z. H., et al. Reorganized collagen in the tumor microenvironment of gastric cancer and its association with prognosis. Journal of Cancer. 8 (8), 1466 (2017).
  43. Zinn, A., et al. The small GTPase RhoG regulates microtubule-mediated focal adhesion disassembly. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  44. Zwaans, B. M., et al. Radiation cystitis modeling: A comparative study of bladder fibrosis radio-sensitivity in C57BL/6, C3H, and BALB/c mice. Physiological Reports. 8 (4), (2020).
  45. Devine, E. E., Liu, Y., Keikhosravi, A., Eliceiri, K. W., Jiang, J. J. Quantitative second harmonic generation imaging of leporine, canine, and porcine vocal fold collagen. The Laryngoscope. 129 (11), 2549-2556 (2019).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. Zeitoune, A. A., et al. Epithelial ovarian cancer diagnosis of second-harmonic generation images: A semiautomatic collagen fibers quantification protocol. Cancer Informatics. 16, (2017).
  48. Wershof, E., et al. Matrix feedback enables diverse higher-order patterning of the extracellular matrix. PLoS Computational Biology. 15 (10), 1007251 (2019).
  49. Mostaço-Guidolin, L. B., et al. Fractal dimension and directional analysis of elastic and collagen fiber arrangement in unsectioned arterial tissues affected by atherosclerosis and aging. Journal of Applied Physiology. 126 (3), 638-646 (2019).
  50. Thain, D., Tannenbaum, T., Livny, M. Distributed computing in practice: the Condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience. 17 (2-4), 323-356 (2005).

Tags

Bioengineering tumormikromiljø ekstracellulær matrise kreft kollagenfiberorganisasjon fibrillar kollagen kvantifisering kurve forvandle andre harmoniske generasjon mikroskopi bildeanalyse programvare
Kvantifisere fibrillar kollagenorganisasjon med kurve transformerebaserte verktøy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying … More

Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools. J. Vis. Exp. (165), e61931, doi:10.3791/61931 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter