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Biochemistry

बेकर के खमीर सैचरोमाइसेस सेरेविसिया में माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम अभिव्यक्ति उत्पादों की लेबलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन

Published: April 11, 2021 doi: 10.3791/62020
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 1
1Department of Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University, 2Institute of Functional Genomics, M.V. Lomonosov Moscow State University, 3National Research Centre "Kurchatov Institute"

Summary

बेकर के खमीर माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम आठ पॉलीपेप्टाइड्स को एन्कोड करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य उन सभी को लेबल करना और बाद में उन्हें अलग बैंड के रूप में कल्पना करना है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रिया एरोबिक श्वसन में सक्षम यूकेरियोटिक कोशिकाओं के आवश्यक ऑर्गेनेल्स हैं। इनमें गोलाकार जीनोम और जीन अभिव्यक्ति उपकरण होते हैं। बेकर के खमीर का एक माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम आठ प्रोटीन को एन्कोड करता है: साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेस (कॉक्स1पी, के तीन उपइकाइट्स कॉक्स 2पी, और कॉक्स 3पी), एटीपी सिंथेस (Atp6p, Atp8p, और Atp9p), ubiquinol-cytochrome c ऑक्सीडोरेक्टेज एंजाइम, साइटोक्रोम बी (Cytb), और माइटोकॉन्ड्रियल रिबोसोमल प्रोटीन Var1p की एक उपइकांत । यहां वर्णित विधि का उद्देश्य विशेष रूप से इन प्रोटीनों को 35एस मेथियोनिन के साथ लेबल करना है, उन्हें इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग करना और स्क्रीन पर असतत बैंड के रूप में संकेतों की कल्पना करना है। प्रक्रिया में कई कदम शामिल हैं। सबसे पहले, खमीर कोशिकाओं को एक गैलेक्टोज युक्त माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है जब तक कि वे देर से लॉगरिथम विकास चरण तक नहीं पहुंच जाते। इसके बाद, साइक्लोहेक्सिमाइड उपचार साइटोप्लाज्मिक अनुवाद को अवरुद्ध करता है और केवल माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों में 35एस मेथियोनिन निगमन की अनुमति देता है। फिर, सभी प्रोटीन खमीर कोशिकाओं से निकाले जाते हैं और पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किए जाते हैं। अंत में, जेल को सूखे और भंडारण फॉस्फोर स्क्रीन के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है। बैंड का खुलासा करने वाले फॉस्फोरमगर पर स्क्रीन को स्कैन किया जाता है। विधि को जंगली प्रकार बनाम उत्परिवर्ती खमीर तनाव के माइटोकॉन्ड्रिया में एक एकल पॉलीपेप्टाइड की बायोसिंथेसिस दर की तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति दोषों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। यह प्रोटोकॉल सभी खमीर माइटोकॉन्ड्रियल mRNAs के अनुवाद दर के बारे में मूल्यवान जानकारी देता है। हालांकि, उचित निष्कर्ष निकालने के लिए कई नियंत्रणों और अतिरिक्त प्रयोगों की आवश्यकता होती है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया एक यूकेरियोटिक सेल के मेटाबोलिज्म में गहराई से शामिल ऑर्गेनेल्स हैं। उनकी इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर चेन एटीपी के साथ सेल की आपूर्ति करती है, जो कई जैव रासायनिक रास्तों में उपयोग की जाने वाली मुख्य ऊर्जावान मुद्रा है। इसके अलावा, वे एपोप्टोसिस, फैटी एसिड और हेम संश्लेषण, और अन्य प्रक्रियाओं में शामिल हैं। माइटोकॉन्ड्रिया की शिथिलता मानव रोग का एक प्रसिद्ध स्रोत है1. इसके परिणामस्वरूप नाभिकीय या माइटोकॉन्ड्रियल जीन में म्यूटेशन हो सकता है जो ऑर्गेनेल्स2के संरचनात्मक या नियामक घटकों को एन्कोडिंग करते हैं । बेकर का खमीर सैचरोमाइसेस सेरेविसिया कई कारणों से माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। सबसे पहले, उनके जीनोम पूरी तरह सेअनुक्रम 3,अच्छी तरह से एनोटेटेड है, और डेटा का एक बड़ा योग पहले से ही इस जीव के साथ किए गए जांच के लंबे इतिहास के लिए धंयवाद साहित्य में उपलब्ध है । दूसरा, उनके परमाणु जीनोम के साथ जोड़तोड़ अपेक्षाकृत तेज और उनकी तेजी से विकास दर और अत्यधिक कुशल अनुरूप पुनर्संयोजन प्रणाली की वजह से आसान कर रहे हैं । तीसरा, बेकर का खमीर एस सेरेविसिया उन कुछ जीवों में से एक है जिनके लिए माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम के साथ जोड़तोड़ विकसित किए जाते हैं। अंत में, बेकर का खमीर एक एरोब-एनारोब संकाय जीव है, जो श्वसन दोषपूर्ण म्यूटेंट के अलगाव और अध्ययन की अनुमति देता है, क्योंकि वे किण्वित कार्बन स्रोतों वाले मीडिया में विकसित हो सकते हैं।

हम ट्रांसलेशनल स्तर 4 पर बेकर के खमीर एस सेरेविसिया की माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने की विधि का वर्णन करतेहैं। इसका मुख्य सिद्धांत कई टिप्पणियों से आता है। सबसे पहले, खमीर माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम केवल आठ प्रोटीन को एन्कोड करता है: साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेस (कॉक्स 1प, के तीन उपइकाइट्स कॉक्स 2पी, और कॉक्स 3पी), एटीपी सिंथेस (Atp6p, Atp8p, और Atp9p), ubiquinol-cytochrome c ऑक्सीडोरेक्टेज एंजाइम, साइटोक्रोम बी (Cytb), और माइटोकॉन्ड्रियल रिबोसोमल प्रोटीन Var1p5की एक उपइकांत । यह संख्या छोटी है, और उन सभी को उचित परिस्थितियों में एक ही जेल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किया जा सकता है। दूसरा, माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम यूकेरियोटिक6के बजाय प्रोकैरियोटिक वर्ग से संबंधित हैं, और इसलिए, एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति संवेदनशीलता खमीर साइटोप्लाज्मिक और माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम्स के लिए अलग है। यह साइक्लोहेक्सिमाइड के साथ साइटोप्लाज्मिक अनुवाद के अवरोध की अनुमति देता है, जब लेबल किए गए अमीनो एसिड(35एस-मेथियोनिन) को केवल माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों में शामिल किया जाता है। नतीजतन, प्रयोग माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन संश्लेषित डी नोवो में अमीनो एसिड निगमन की दर के बारे में जानकारी देता है, जो आठ उत्पादों में से प्रत्येक के लिए माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद की समग्र दक्षता को दर्शाता है।

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Protocol

1. खमीर संस्कृति की तैयारी

  1. उपयुक्त माध्यम के साथ ताजा प्लेटों पर जमे हुए स्टॉक संस्कृतियों से लकीर खमीर। प्लेटों को 24-48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: तापमान के प्रति संवेदनशील म्यूटेंट को अनुमेय तापमान पर बढ़ने दें।
  2. 15 मिलीएल ट्यूबों में ताजा लकीर से वाईपीगल माध्यम (2% पेप्टोन, 1% खमीर निकालने, 2% गैलेक्टोज) के 2 मिलीलन्वल संस्कृतियों में खमीर संस्कृतियों को टीका लगाएं और उन्हें रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम पर उत्तेजित करें।
  3. 600 एनएम (ओडी 600) की तरंगदैर्ध्य पर संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व कोमापें।
  4. बाँझ ट्यूबों में 0.2 अवशोषण इकाइयों के अनुरूप मात्रा लें, कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 9,000 x ग्राम पर गोली खमीर कोशिकाओं, और सुपरनैंट को त्यागें।
  5. 5 एस के लिए भंवर से बाँझ पानी की 0.5 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं। कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 9,000 x ग्राम पर गोली खमीर कोशिकाओं और सुपरनैंट त्यागें। ताजा वाईपीगल माध्यम के 2 एमसीएल में तनु कोशिकाएं।
  6. 200 आरपीएम और 30 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन जब तक ओडी600 1.5-1.9 मान तक पहुंच जाता है।
    नोट: खमीर विकास दर बदलती हैं, तो इंतजार करने के लिए तैयार रहें । सुबह जल्दी 1.3-1.6 कदम बनाना उचित है। यह आमतौर पर 4-5 घंटे लेता है, लेकिन अधिक समय लग सकता है ।

2. रेडियोधर्मी आइसोटोप निगमन

  1. एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में एक ऑप्टिकल इकाई के बराबर संस्कृति की मात्रा स्थानांतरित करें। ट्यूबों को 1 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर स्पिन करें और सुपरनैंट को त्यागें। 5 एस के लिए भंवर से बाँझ पानी के 0.5 एमएल के साथ धोएं।
    1. कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 9,000 x ग्राम पर गोली खमीर कोशिकाओं और सुपरनैंट त्यागें। बाँझ अनुवाद बफर के 0.5 एमएल में खमीर कोशिकाओं को फिर से पेंड करें। निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में रखें।
      नोट: अनुवाद बफर एक समाधान है जिसमें पीएच 6.0 के साथ 2% गैलेक्टोज (w/v) और 50 m पोटेशियम फॉस्फेट होता है।
  2. 0.2 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता तक सेल सस्पेंशन में साइक्लोहेक्सीमाइड जोड़ें। साइटोसोलिक अनुवाद को बाधित करने के लिए 200 आरपीएम और 30 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन करने वाले 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: प्रयोग से पहले साइक्लोहेक्सीमाइड समाधान (20 मिलीग्राम/एमएल, इथेनॉल में) को नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए। क्लोरम्फेनिकोल को सफलतापूर्वक उसी एकाग्रता7में एनिसोमाइसिन के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  3. सेल सस्पेंशन में 35 एस-मेथिओनिन के 25-30माइक्रोन्सी जोड़ें और 200 आरपीएम और 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए आंदोलन करें।
    नोटः 35एस-मेथियोनिन और 35एस-सिस्टीन के मिश्रण का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। शुद्ध 35एस-मेथिन का परिणाम सबसे मजबूत संकेत और सबसे अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात है। आम तौर पर, मेथियोनिन सिस्टीन की तुलना में अधिक प्रभावी होता है क्योंकि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन में इस अमीनो एसिड की मात्रा अधिक होती है। हालांकि, 35एस-मेथियोनाइन और सिस्टीन का ईटटैग मिश्रण कम महंगा है और तुलनीय परिणाम7देता है।
    सावधानी: 35एस-मेथियोनिन रेडियोधर्मी है। रेडियोधर्मी सामग्री से निपटने के लिए सामान्य सुरक्षा प्रथाओं का पालन करें।
    नोट: यह सर्वविदित है कि रेडियोधर्मिता का समावेश एक सीमा तक पहुंचता है जिसके कारण कुल संकेत समय के साथ बंद हो जाते हैं। एक बार जब यह सीमा पहुंच जाती है, तो विभिन्न अनुवाद उत्पादों को संश्लेषित करने वाली दरों का निर्धारण करना लगभग असंभव है। माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद की दर का विश्लेषण करने के लिए, एक ऐसी स्थिति में होना अनिवार्य है जिसमें एक रैखिक तरीके से 35एस-मेथियोनाइन के साथ इनक्यूबेशन के समय के साथ सिग्नल की तीव्रता बढ़ जाती है। आम प्रयोगशाला जंगली प्रकार के उपभेदों के लिए, संकेत पहले से ही इनक्यूबेशन बार के लिए संतृप्त है अभी तक 30 मिनट से कम है । ट्रांसलेशनल म्यूटेंट बहुत अलग व्यवहार कर सकते हैं। रेडियोधर्मिता निगमन की गतिज स्थापित करने के लिए एक समय-पाठ्यक्रम किया जाना चाहिए और इस प्रकार अनुवाद की दर, कम से कम एक नए तनाव के साथ काम करते समय। इसके लिए, हम कई मिनट (जैसे, 2.5, 5.0, 7,5, 10, और 20 मिनट) के अंतराल के साथ नमूने लेने का सुझाव देते हैं।
  4. लेबलिंग को रोकने के लिए अवेलेबल "कोल्ड" मेथियोनिन (अंतिम एकाग्रता 20 mM होनी चाहिए) और प्यूरोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता 1-10 μg/mL होनी चाहिए) जोड़ें। 200 आरपीएम और 30 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन करने वाले 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: पेप्टाइड्स का अनुवाद खत्म करने के लिए राइबोसोम्स समय देने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है। अन्यथा, पूर्ण लंबाई से कम सभी पॉलीपेप्टाइड्स का एक अलग आकार पर पता लगाया जाएगा। माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों की स्थिरता निर्धारित करने के लिए इस चरण में एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग (पल्स-चेस) किया जा सकता है। इसके लिए, 30 मिनट (जैसे, 30, 60, 90, और 120 मिनट) के अंतराल के साथ नमूने लेने के इनक्यूबेशन जारी रखें।

3. खमीर सेल लाइसिस और प्रोटीन की निकासी

  1. 30 एस के लिए 9,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा खमीर कोशिकाओं को इकट्ठा करें। कोशिकाओं को 5 एस के लिए भंवर से बाँझ पानी के 0.5 एमएल से धोएं। कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 9,000 x ग्राम पर गोली खमीर कोशिकाओं। सुपरनेट को त्याग दें।
    नोट। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है। नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. 5-10 एस के लिए गोली और भंवर में लाइसिस बफर के 75 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: लाइसिस बफर पानी में 1.8 एम नाओएच, 1 एम β-मर्केप्टोथेनॉल, और 1 mm PMSF का समाधान है। लाइसिस बफर के साथ अत्यधिक इनक्यूबेशन से बचें जिससे प्रोटीन का क्षारीय हाइड्रोलिसिस होता है। तुरंत 3.3 कदम के लिए आगे बढ़ें।
  3. पीएच 6.8 के साथ 0.5 एम ट्राइस-एचसीएल बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें। भंवर संक्षेप में।

4. प्रोटीन की वर्षा

सावधानी: मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म ऑर्गेनिक सॉल्वैंट्स हैं। कार्बनिक पदार्थों से निपटने के लिए सामान्य सुरक्षा प्रथाओं का पालन करें।

  1. नमूने में मेथनॉल के 600 माइक्रोन जोड़ें। 5 एस के लिए भंवर ।
  2. नमूने में क्लोरोफॉर्म के 150 माइक्रोन जोड़ें। 5 एस के लिए भंवर ।
  3. 12,000 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए नमूनों को सेंट्रलाइज करें। ऊपरी चरण को पारखी के साथ सावधानी से त्यागें।
  4. नमूने में मेथनॉल के 600 माइक्रोन जोड़ें। कई बार ट्यूब को उलटा करके सावधानी से मिलाएं।
  5. 12,000 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए नमूनों को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्याग दें।
  6. हवा- 80 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए गोली को सुखा लें।
    नोट: तरल के सभी वाष्पित होना चाहिए। यदि गोली अपर्याप्त रूप से सूख गई थी तो जेल में प्रोटीन का एक गुमराह पृथक्करण होने का खतरा है। हालांकि, गोली को अधिक सूखना संभव नहीं है, इसलिए इसे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर भी संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. 1x Laemmli नमूना बफर के 60 माइक्रोन में उपजी प्रोटीन भंग।
  8. 40 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्मी।
    नोट: नमूनों को 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालने से बचें, क्योंकि इससे एकत्रीकरण होता है। यदि समुच्चय अभी भी बनाते हैं, तो नमूनों को 2 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर स्पिन करें और सुपरनैंट एकत्र करें। नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।

5. एसडीएस-पेज

  1. 17.5% लैमली एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेल डाली।
    नोट: बेहतर atp8 और atp9 को हल करने के लिए जेल में 6 एम यूरिया जोड़ा जा सकता है। रेडिएंट 15%-20% जैल भी बेहतर रेजोल्यूशन दे सकते हैं।
  2. जेब में प्रत्येक नमूने के 15 माइक्रोन (40-50 माइक्रोन) लोड करें।
    नोट: यह प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए आवश्यक नहीं है अगर OD६०० मान कदम १.६ में बंद थे । यदि नहीं, तो डिटर्जेंट-संगत अभिकर् ती के साथ परख का उपयोग करके प्रोटीन सांद्रता को मापें।
  3. एक ठंडे कमरे में जेल चलाएं जब तक कि नीले रंग की लंबाई लगभग 65% तक न पहुंच जाए।
    नोट: इस्तेमाल की गई प्रणाली (जैसे, प्रोटेन II xi सेल) के लिए, हम दोनों मोड में से किसी का उपयोग करते हैं: 16-17 घंटे 5 V/सेमी पर या 15 वी/सेमी पर 5 घंटे । ब्रोमोफेनॉल ब्लू डाई की तुलना में कोई प्रोटीन तेजी से नहीं चलता है, लेकिन लंबे रन के परिणामस्वरूप atp8 और atp9 संकेतों को धुंधला किया जा सकता है।
  4. कूमासी शानदार नीले रंग के साथ जेल को दाग दें और एक स्कैन या फोटो बनाएं, जो लोडिंग नियंत्रण के रूप में आवश्यक है।
    नोट: लोडिंग नियंत्रण बनाने का एक वैकल्पिक तरीका माइटोकॉन्ड्रियल "हाउस-कीपिंग" जीन, जैसे, पोर्इन 1 के लिए एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोब्लोटिंग है।

6. ऑटोरेडियोग्राफी

  1. जेल-ड्रायर में जेल को सुखाएं। इसे 3-5 दिनों तक स्टोरेज फॉस्फोर स्क्रीन के साथ कैसेट में रखें।
    नोट: सूखे जेल की स्क्रीनिंग का एक विकल्प प्रोटीन का इलेक्ट्रो-ब्लॉटिंग द्वारा नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित करना और उसके बाद स्क्रीनिंग करना है। यह मजबूत संकेतों और तेज बैंड में परिणाम है ।
  2. एक फॉस्फोरमगर पर स्क्रीन को स्कैन करें।
    नोट: फॉस्फोर इमेजिंग के विकल्प के रूप में, सिग्नलों को प्रकट करने के लिए एक्स-रे फिल्म का भी उपयोग किया जा सकता है।

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हमने दो एस सेरेविसिया उपभेदों से माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों को सौंपा: जंगली प्रकार(डब्ल्यूटी)और AIM23 जीन(AIM23,एन्कोडिंग माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद दीक्षा कारक 3 (तालिका 1)8के एक उत्परिवर्ती असर हटाने। माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों को रेडियोधर्मी रूप से लेबल किया गया था और एसडीएस-PAAG9 में अलग किया गया था। नमूने एक समय पाठ्यक्रम(चित्रा 1A)बनाने के लिए संतृप्ति से पहले हर २.५ मिनट एकत्र किए गए थे । जेल दाग, सूख गया था, और 5 दिन प्रदर्शनी(चित्रा 1A) केबाद जांच की ।

एक सफल प्रयोग के मामले में, चित्र मानक पैटर्न4के अनुसार सौंपे गए आठ बैंड को दर्शाता है। हालांकि, तनाव और प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर व्यक्तिगत बैंड की तीव्रता अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकती है। प्रत्येक बैंड एक अनुवाद उत्पाद से मेल खाती है। डेटा(चित्रा 1A)का सुझाव है कि AIM23एं तनाव माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन संश्लेषण में सक्षम है क्योंकि डब्ल्यूटी में प्रदर्शित होने वाले सभी उत्पाद इस उत्परिवर्ती में दिखाई देते हैं। हालांकि, बैंड की तीव्रता डब्ल्यूटीई से अलग है, जिसका अर्थ है कि AIM23 का विलोपन माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति8को प्रभावित करता है। कूमासी ब्रिलियंट ब्लू धुंधला लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।

इमेजजे10या इमेजक्विंट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उपभेदों या प्रायोगिक स्थितियों के बीच मतभेदों की पहचान करने के लिए परिणामी डेटा(चित्रा 1 बी) निर्धारित किया जा सकता है। इसके लिए, कुल सिग्नल के लिए हर उत्पाद के अनुरूप सिग्नल के अनुपात की गणना की जाती है। मतलब मूल्यों और मानक विचलन की गणना कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों में की जाती है।

संश्लेषित प्रोटीन टर्नओवर के काइनेटिक्स का अध्ययन पल्स-चेस प्रयोग(चित्रा 1C)में किया जाता है। स्टेप 2.4 में कोल्ड मेथियोनाइन और प्यूरोमाइसिन द्वारा लेबलिंग रिएक्शन बंद होने के बाद संकेतित समय बिंदुओं पर नमूने एकत्र किए जाते हैं। यह नियंत्रण उत्पादों की स्थिरता का अनुमान लगाने के लिए आवश्यक है क्योंकि संकेत की तीव्रता दो विपरीत प्रक्रियाओं का परिणाम है: नई श्रृंखलाओं और प्रोटीन क्षरण का संश्लेषण। एंटी-पोरिन 1 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेपिंग एक लोडिंग नियंत्रण है।

Figure 1
चित्रा 1: खमीर माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों के प्रतिनिधि रेडियोधर्मी लेबलिंग। 1) डब्ल्यूटीई और AIM23 उपभेदों की जीवित खमीर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल संश्लेषित प्रोटीन में 35एस-मेथियोनिन निगमन का समय पाठ्यक्रम। कूमासी ब्रिलियंट ब्लू धुंधला एक लोडिंग नियंत्रण है। (ख)35S-मेथियोनिन के साथ 5 मिनट लेबलिंग के बाद माइटोकॉन्ड्रियल-एन्कोडेड प्रोटीन का स्तर। सापेक्ष अभिव्यक्ति माइटोकॉन्ड्रियल रूप से एन्कोडेड प्रोटीन जीन की कुल अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत है। त्रुटि सलाखों के कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब के मानक विचलन का संकेत मिलता है। (ग)माइटोकॉन्ड्रियल रूप से जंगली प्रकार और Aim23एं उपभेदों में संश्लेषित प्रोटीन का कारोबार । लेबलिंग रोक दी गई और बताए गए समय बिंदुओं पर नमूने एकत्र किए गए। एंटी-पोरिन 1 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेपिंग एक लोडिंग नियंत्रण है। (घ)पुराने 35S-मेथियोनिन, रेडियोऑटोग्राफी के साथ उप-इष्टतम प्रयोग। चित्रा 1A,बी, सी मामूली संशोधनों के साथ8 से अनुकूलित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तनाव जीनोटाइप
वज़न मैटाα मल
AIM23 MATα मल, AIM23::KanMX4

तालिका 1. एस सेरेविसिया उपभेदों के जीनोटाइप

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Discussion

जीन अभिव्यक्ति की जांच आधुनिक जीवन विज्ञान में एक केंद्रीय भाग पर कब्जा । इस जटिल प्रक्रिया में अंतर्दृष्टि प्रदान करने वाले कई तरीके विकसित किए गए हैं। यहां, हमने बेकर के खमीर एस सेरेविसिया माइटोकॉन्ड्रिया में प्रोटीन बायोसिंथेसिस तक पहुंचने की अनुमति देने वाली विधि का वर्णन किया। यह आमतौर पर अध्ययन उत्परिवर्तन के परिणामों तक पहुंचने के लिए उत्परिवर्ती खमीर तनाव बनाम जंगली प्रकार के माइटोकॉन्ड्रिया में mRNAs की अनुवाद क्षमता की तुलना करने के लिए लागू किया जाता है। शोधकर्ताओं ने माइटोकॉन्ड्रिया8,11 , 12,13 को प्रभावित करने के लिए सुझाए गए उत्परिवर्तन वाले खमीर कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल कार्य का अध्ययन करते समय यहएकमूल प्रयोगोंका संचालन किया है । यह अक्सर ऑक्सीजन की खपत दर और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता के माप के साथ संयुक्त होता है। हालांकि, यह जानकारी प्रदान करता है जीन अभिव्यक्ति के किस चरण प्रभावित है भेद करने के लिए पर्याप्त नहीं है । इसका पता लगाने के लिए अतिरिक्त प्रयोगों का एक सेट आवश्यक है। सबसे पहले, ट्रांसक्रिप्शनल स्टेप का आकलन करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल एमआरएनए का उत्तरी दाग या आरटी-क्यूपीसीआर मूल्यांकन आवश्यक है। दूसरा, प्रोटीन के स्तर का आकलन करने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ कुल प्रोटीन अर्क का एक पश्चिमी दाग किया जाना चाहिए । तीसरा, लेबल 35एस-मेथियोनाइन (गर्म) की नाड़ी को अवेलेबल (ठंडा) मेथियोनाइन (चेस) के अलावा जारी रखा जाना चाहिए और प्रोटीन की स्थिरता की जांच करने के लिए जेल पर कई समय अंक एकत्र किए जाने चाहिए और विश्लेषण किया जाना चाहिए।

35एस पल्स लेबलिंग का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति के सटीक विश्लेषण के लिए नियंत्रण प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता होती है, खासकर जब शोधकर्ता को इसे संभालने के अनुभव का अभाव होता है या एक नए खमीर तनाव या उत्परिवर्ती के साथ काम करता है। इन मामलों में, अच्छा नकारात्मक नियंत्रण माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए से रहित एक rho0 तनाव है। यह साइटोसोलिक अनुवाद के कुशल साइक्लोहेक्सिमाइड अवरोध को दर्शाता है और इस बात की पुष्टि करता है कि बैंडिंग पैटर्न माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद विशिष्ट है। यदि rho0 तनाव उपलब्ध नहीं है, तो हम साइक्लोहेक्सिमाइड के साथ क्लोरम्फेनिकोल सहित साइक्लोहेक्सिमाइड को बाधित करने के लिए साइक्लोहेक्सिमाइड दक्षता और बैंडिंग पैटर्न की विशिष्टता की पुष्टि करने का सुझाव देते हैं।

प्रोटोकॉल का निकटतम संशोधन पल्स-चेस है जब संस्कृति को पल्स प्रयोग(चित्रा 1C)में सुझाए गए से अधिक समय तक शेखर (चरण 2.4) में इनक्यूबेटेड किया जाता है। इसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों के कारोबार और स्थिरता का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। ऑर्गेनेलो में रेडियोधर्मी लेबलिंग किए जाने पर विधि का एक और संशोधन होता है, वीवो4में नहीं। यह खमीर कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव का सुझाव देता है। यह संशोधन तेजी से है अगर जमे हुए माइटोकॉन्ड्रिया को पहले अलीकोट में स्टॉक किया गया था। एक अन्य लाभ साइक्लोहेक्सीमाइड उपचार का अभाव है, जो सेलुलर मेटाबोलिज्म के विभिन्न पहलुओं को प्रभावित करता है। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रिया का अलगाव और फ्रीज-विगलन उन्हें एक कृत्रिम चित्र प्रदान करने वाले ऑर्गेनेल्स में अनुवाद परिसरों को परेशान कर सकता है। एक्क्रिलेमाइड जेल (चरण 5) में माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों के अलग होने के बाद प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण संशोधन किया जा सकता है। कूमासी ब्रिलियंट ब्लू स्टेनिंग और जेल को सुखाने के बजाय, प्रोटीन को इलेक्ट्रो-ब्लॉटिंग द्वारा नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित किया जा सकता है। इसके परिणामस्वरूप मजबूत और तेज संकेत मिलते हैं। इसका मुख्य कारण यह है कि बहुत कम प्रवेश वाले बीटा कणों के उत्सर्जन से 35एस क्षय होते हैं, इसलिए इस दृष्टिकोण में संकेत आसानी से दिखाई जाते हैं। बेहतर संकल्प प्रदान करने के लिए इलेक्ट्रोफोरेटिक स्थितियों को भी संशोधित किया जा सकता है। एक बिंदु जेल में 6M यूरिया जोड़ना है, जो एटीपी 8 और एटीपी914के अलगाव में सुधार करता है। एक और तरीका ढाल 15%-20% जैल का उपयोग कर रहा है।

ट्रांसलेशनल प्रोफाइलिंग15 वह विधि है जो माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद के परिवर्तनों में गहराई से गोता लगाने के लिए उपयोग की जाती है। रेडियोधर्मी लेबलिंग की तुलना में, यह एमआरएनए पर माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम्स की स्थिति स्थापित करने की अनुमति देता है, जिससे प्रभावित होने वाले सटीक चरण (दीक्षा, विस्तार या समाप्ति) को ढूंढना संभव हो जाता है। हालांकि, प्रोफाइलिंग बहुत अधिक महंगा, जटिल और समय लेने वाली है। तर्कसंगत रूप से यह लेबल निगमन प्रयोग के बाद किया जा सकता है, इसके विपरीत नहीं। हाल ही में, खमीर माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद की निगरानी के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण विकसित किया गया है16। यह साइक्लोहेक्सीमाइड के साथ उपचार से बचता है, जो लाभप्रद है क्योंकि इस तरह के उपचार सेलुलर मेटाबोलिज्म और सिग्नलिंग रास्तों को प्रभावित करते हैं। रेडियोधर्मी लेबल अमीनो एसिड निगमन के बजाय, यह खमीर माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम में सुपर-मुड़ा जीएफपी (एसएफजीएफपी) के लिए एक पुनः कोडित जीन के सम्मिलन का उपयोग करता है, जो प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण के आवेदन के लिए संशोधित माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के साथ विशेष खमीर तनाव की आवश्यकता होती है जिसमें 5'और 3'-एक निश्चित माइटोकॉन्ड्रियल जीन के अनुक्रमों के बीच रखा गया एसएफजीएफपी कोडिंग अनुक्रम होता है।

लेबल निगमन प्रयोग में कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं, जिन्हें सफल प्रयोग में समझौता नहीं किया जा सकता है। सबसे पहले, ताजा खमीर संस्कृतियों का उपयोग किया जाना चाहिए (चरण 1.1)। 1 महीने से अधिक समय तक प्लेटों पर खमीर रखना सिफारिश नहीं है; अन्यथा, वे इस परख में अप्रत्याशित व्यवहार कर सकते हैं। दूसरा, साइक्लोहेक्सीमाइड समाधान को प्रयोग से पहले ताजा तैयार किया जाना चाहिए और 1 सप्ताह (चरण 2.1) से अधिक समय तक जमे हुए संग्रहीत किया जाना चाहिए। पुराना समाधान साइटोप्लाज्मिक अनुवाद को बाधित करने की क्षमता खो देता है जिसके परिणामस्वरूप रेडियोऑटोग्राफी में पूरी तरह से गुमराह बैंड पैटर्न होता है। तीसरा, 35एस-मेथियोनाइन ताजा और सक्रिय होना चाहिए (चरण 2.2), अन्यथा, बैंड की तीव्रता कमजोर होगी(चित्रा 1D)। चार आधे जीवन (4 x 87.4 दिन) पारित करने वाले अभिकर् तादार का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है। मानक नमूना तैयारी गाइड सुझाव (चरण 4.8) के रूप में 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन नमूनों को उबालने से बचें क्योंकि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन अत्यधिक हाइड्रोफोबिक होते हैं और एकत्रीकरण के लिए प्रवण होते हैं।

इस विधि से निपटने का अनुभव कर सकते हैं कई आम मुद्दे हैं। पहला रेडियोऑटोग्राफी पर बैंड की कमजोर तीव्रता है। इसे ठीक करने के लिए, कि ताजा 35एस-मेथियोनिन का उपयोग किया जाता है, पर्याप्त मात्रा में खमीर कोशिकाओं को लिया जाता है, और प्रोटीन जेल पर जेब में कुल नहीं होते हैं, जिसे कूमासी धुंधला द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। सूखे जेल को स्क्रीन के साथ 3 दिनों से कम समय के लिए रखें। दूसरा मुद्दा गलत बैंड पैटर्न है । यदि इसका सामना करना पड़ता है, तो सुनिश्चित करें कि ताजा खमीर प्लेटें और ताजा तैयार साइक्लोहेक्सीमाइड का उपयोग किया जाता है। ध्यान रखें कि बैंड की सापेक्ष तीव्रता विभिन्न खमीर उपभेदों और इलेक्ट्रोफोरेसिस स्थितियों में काफी भिन्न हो सकती है। यह थोड़ा समझ में आता है जेल पर प्रोटीन आणविक वजन सीढ़ी लोड के बाद से माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों को इस प्रक्रिया में उनके आणविक जनता के अनुसार अलग नहीं कर रहे है क्योंकि वे अत्यधिक हाइड्रोफोबिक हैं । इस प्रकार, कॉक्स I (58 केडीए) वीएआर 1 (47 केडीए) की तुलना में तेजी से प्रवास करता है। बफर स्थितियों के आधार पर, प्रोटीन पड़ोसियों में से एक के साथ स्थिति भी बदल सकते हैं। तीसरा आम मुद्दा कोई तेज कूमासी धुंधला के बाद मनाया बैंड के साथ धुंधला तस्वीर है । यह जेल की कास्टिंग में गलतियों, गलत बफर संरचना, या नमूनों में प्रोटीन के क्षरण को इंगित करता है। नए जेल बफ़र्स तैयार करने और संरचना और पीएच मूल्यों की सावधानीपूर्वक जांच करने वाले बफर चलाने की सिफारिश की जाती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को रूसी फाउंडेशन फॉर बेसिक रिसर्च, ग्रांट नंबर 18-29-07002 द्वारा वित्त पोषित किया गया था । पीके को रूसी संघ के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय के राज्य असाइनमेंट, अनुदान संख्या एए-ए16-116021660073-5 द्वारा समर्थित किया गया था । M.V.P. को रूसी संघ के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था, अनुदान संख्या 075-15-2019-1659 (कुचतोव सेंटर ऑफ जीनोम रिसर्च का कार्यक्रम)। काम आंशिक रूप से विकास के मास्को राज्य विश्वविद्यालय कार्यक्रम के फ्रेम में खरीदा उपकरणों पर किया गया था । I.C, S.L., और M.V..B अतिरिक्त मास्को राज्य विश्वविद्यालय अनुदान "अग्रणी वैज्ञानिक स्कूल नूह के संदूक" द्वारा समर्थित थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Acrylamide Sigma-Aldrich A9099
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
Bacteriological agar Sigma-Aldrich A5306 
Biowave Cell Density Meter CO8000 BIOCHROM US BE 80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes Sigma-Aldrich Z330361
chloroform Sigma-Aldrich 288306 
cycloheximide Sigma-Aldrich C1988 
D-(+)-Galactose Sigma-Aldrich G5388 
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021 
digital block heater Thermo Scientific 88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution Perkin Elmer NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425 Thermo Scientific 13-864-457
GE Storage Phosphor Screens Sigma-Aldrich GE29-0171-33
L-methionine Sigma-Aldrich M9625 
methanol Sigma-Aldrich 34860 
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological Millipore 91249 
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626 
Pierce 660nm Protein Assay Kit Thermo Scientific 22662
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Protean II xi cell Bio-Rad 1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger Sigma-Aldrich P8833
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Storm 865 phosphor imager GE Healthcare
Trizma base Sigma-Aldrich 93352 
Vacuum Heated Gel Dryer Cleaver Scientific CSL-GDVH
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625 

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 170
बेकर के खमीर <em>सैचरोमाइसेस सेरेविसिया</em> में माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम अभिव्यक्ति उत्पादों की लेबलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन
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Chicherin, I. V., Levitskii, S. A., Baleva, M. V., Krasheninnikov, I. A., Patrushev, M. V., Kamenski, P. A. Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (170), e62020, doi:10.3791/62020 (2021).

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