Summary
Baker mayası mitokondriyal genom sekiz polipeptid kodlar. Mevcut protokolün amacı, hepsini etiketlemek ve daha sonra bunları ayrı bantlar olarak görselleştirmektir.
Abstract
Mitokondriler, aerobik solunum yapabilen ökaryotik hücrelerin temel organelleridir. Dairesel genom ve gen ifade aparatı içerirler. Fırıncı mayasının mitokondriyal genomları sekiz proteini kodlar: sitokrom c oksidazın üç alt bireyi (Cox1p, Cox2p ve Cox3p), ATP sintazının üç alt bölümü (Atp6p, Atp8p ve Atp9p), ubiquinol-sitokrom c oksitodoreductase enzimi, sitokrom b (Cytb) ve mitokondriyal ribozomal protein Var1p'nin bir alt bölümüdür. Burada açıklanan yöntemin amacı, bu proteinleri özellikle 35S metiyonin ile etiketlemek, elektroforez ile ayırmak ve sinyalleri ekranda ayrık bantlar olarak görselleştirmektir. Yordam birkaç adım içerir. İlk olarak, maya hücreleri geç logaritmik büyüme aşamasına ulaşana kadar galaktoz içeren bir ortamda kültürlenir. Daha sonra, sikloeximide tedavisi sitoplazmik çeviriyi engeller ve sadece mitokondriyal çeviri ürünlerinde 35S metiyonin birleştirilmesine izin verir. Daha sonra, tüm proteinler maya hücrelerinden çıkarılır ve poliakrilamid jel elektroforez ile ayrılır. Son olarak, jel kurutulur ve depolama fosfor ekranı ile inkübe edilir. Ekran, bantları ortaya çıkaran bir fosforimager üzerinde taranır. Yöntem, bir mutant maya suşunun mitokondrilerindeki tek bir polipeptitin biyosentez oranını, mitokondriyal gen ekspresyon kusurlarını incelemek için yararlı olan vahşi tiple karşılaştırmak için uygulanabilir. Bu protokol, tüm maya mitokondriyal mRNA'ların çeviri oranı hakkında değerli bilgiler verir. Bununla birlikte, uygun sonuçlara varmak için çeşitli kontroller ve ek deneyler gerektirir.
Introduction
Mitokondriler, ökaryotik bir hücrenin metabolizmasında derinden yer alan organellerdir. Elektron transfer zincirleri hücreye birden fazla biyokimyasal yolda kullanılan ana enerjik para birimi olan ATP'yi sağlar. Ayrıca, apoptoz, yağ asidi ve heme sentezi ve diğer süreçlerde yer almaktadırlar. Mitokondri disfonksiyonu iyi bilinen bir insan hastalığı kaynağıdır1. Organellerin yapısal veya düzenleyici bileşenlerini kodlayan nükleer veya mitokondriyal genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanabilir2. Fırıncı mayası Saccharomyces cerevisiae, çeşitli nedenlerden dolayı mitokondriyal gen ekspresyonunu incelemek için mükemmel bir model organizmadır. İlk olarak, genomları tamamensıralanmıştır 3, iyi açıklamalı ve bu organizma ile yürütülen uzun araştırma geçmişi sayesinde literatürde büyük miktarda veri zaten mevcuttur. İkincisi, nükleer genomları ile yapılan manipülasyonlar, hızlı büyüme hızları ve yüksek verimli homolog rekombinasyon sistemleri nedeniyle nispeten hızlı ve kolaydır. Üçüncüsü, fırıncı mayası S. cerevisiae, mitokondriyal genomlarla manipülasyonların geliştirildiği birkaç organizmadan biridir. Son olarak, fırıncı mayası, fermente edilebilir karbon kaynakları içeren medyada büyüyebilecekleri için solunum kusurlu mutantların izolasyonu ve incelenmesine izin veren aerobe-anaerobe öğretim üyesi bir organizmadır.
Çeviridüzeyindebaker mayası S. cerevisiae'nin mitokondriyal gen ekspresyonunu inceleme yöntemini açıklıyoruz. Ana prensibi çeşitli gözlemlerden gelir. İlk olarak, maya mitokondriyal genom sadece sekiz proteini kodlar: sitokrom c oksidazın üç alt bireyi (Cox1p, Cox2p ve Cox3p), ATP sintazının üç alt bölümü (Atp6p, Atp8p ve Atp9p), ubiquinol-sitokrom c oksitodoreductase enziminin bir alt bölümü, sitokrom b (Cytb) ve mitokondriyal ribozomal protein Var1p5. Bu sayı küçüktür ve hepsi uygun koşullarda tek bir jel üzerinde elektroforezi ile ayrılabilir. İkincisi, mitokondriyal ribozomlar ökaryotik6yerine prokaryotik sınıfa aittir ve bu nedenle maya sitoplazmik ve mitokondriyal ribozomlar için antibiyotiklere duyarlılık farklıdır. Etiketli amino asidin(35S-metiyonin) sadece mitokondriyal çeviri ürünlerine dahil edildiği koşulları sağlayarak sikloseksüel ile sitoplazmik çevirinin inhibisyonunu sağlar. Sonuç olarak, deney, sekiz ürünün her biri için mitokondriyal çevirinin genel verimliliğini yansıtan, sentezlenen de novo sentezlenen mitokondriyal proteinlerde amino asit indüklenme oranı hakkında bilgi verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Maya kültürü hazırlığı
- Donmuş stok kültürlerinden uygun ortama sahip taze tabaklarda maya serin. Plakaları 24-48 saat boyunca 30 °C'de bir kültür inkübatöre koyun.
NOT: Sıcaklığa duyarlı mutantların izin verilen sıcaklıkta büyümesine izin verin. - Maya kültürlerini 15 mL tüplerdeki taze çizgiden 2 mL YPGal ortamında (%2 pepton, %1 maya özü, %2 galaktoz) aşılayın ve 30 °C'de 200 rpm'de ajite ederek bir gecede kuluçkaya bırakın.
- Kültürün optik yoğunluğunu 600 nm (OD600)dalga boyunda ölçün.
- Steril tüplerde 0,2 absorbans ünitesine karşılık gelen hacmi, oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücrelerini alın ve üstnatant atın.
- Hücreleri 5 sn boyunca girdaplayarak 0,5 mL steril su ile yıkayın. Oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücreleri ve süpernatant atın. Hücreleri 2 mL taze YPGal ortamında seyreltin.
- OD 600 1,5–1,9 değerlerine ulaşana kadar200 rpm ve 30 °C'de ajitasyon yapan kuluçkalayın.
NOT: Maya büyüme oranları değişir, bu yüzden beklemeye hazır olun. Sabahın erken saatlerinde 1.3–1.6 adımlarını atmak mantıklıdır. Genellikle 4-5 saat sürer, ancak daha uzun sürebilir.
2. Radyoaktif izotop şirketleşme
- Bir mikrosantrifüj tüpünde bir optik üniteye eşdeğer kültür hacmini aktarın. Tüpleri 1 dakika boyunca 3.000 x g'da döndürün ve süpernatant atın. 5 sn boyunca girdap yaparak 0,5 mL steril su ile yıkayın.
- Oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücreleri ve süpernatant atın. Maya hücrelerini 0,5 mL steril çeviri tamponunda yeniden biriktirin. Süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
NOT: Çeviri tamponu, pH 6.0 ile %2 galaktoz (w/v) ve 50 mM potasyum fosfat içeren bir çözeltidir.
- Oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücreleri ve süpernatant atın. Maya hücrelerini 0,5 mL steril çeviri tamponunda yeniden biriktirin. Süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
- Hücre süspansiyonuna 0,2 mg/mL'lik son konsantrasyona kadar sikloeximid ekleyin. Sitosolik çeviriyi inhibe etmek için 200 rpm ve 30 °C'de 5 dakika ajitasyon için kuluçkaya yatırın.
NOT: Cycloheximide çözeltisi (etanolde 20 mg/mL) deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır. Kloramfenikol aynı konsantrasyonda anisomycin ile başarıyladeğiştirilebilir 7. - Hücre süspansiyonu için 25-30 μCi 35S-metiyonin ekleyin ve 200 rpm ve 30 °C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
NOT: 35S-metiyonin ve 35S-sistein karışımı da kullanılabilir. Saf 35S-methionine en güçlü sinyal ve en iyi sinyal-gürültü oranı ile sonuçlanır. Genellikle, metiyonin sisteinden daha etkilidir, çünkü bu amino asidin mitokondriyal proteinlerdeki içeriği daha yüksektir. Bununla birlikte, EasyTag 35S-metiyonin ve sistein karışımı daha ucuzdur ve karşılaştırılabilir sonuçlar verir7.
DİkKAT: 35S-metiyonin radyoaktiftir. Radyoaktif maddelerin kullanımı için olağan güvenlik uygulamalarını takip edin.
NOT: Radyoaktivitenin birleştirilmesinin, toplam sinyallerin zaman içinde seviye atladığı bir sınıra ulaştığı iyi bilinmektedir. Bu sınıra ulaşıldıktan sonra, farklı çeviri ürünlerinin sentezlenme oranlarını belirlemek neredeyse imkansızdır. Mitokondriyal çeviri oranını analiz etmek için, doğrusal bir şekilde 35S-metiyonin ile inkübasyon süresi ile sinyal yoğunluğunun arttığı bir durumda olmak zorunludur. Yaygın laboratuvar vahşi tipi suşlar için sinyal, 30 dakikadan çok daha kısa kuluçka süreleri için zaten doymuş durumdadır. Çevirisel mutantlar çok farklı davranabilir. En azından yeni bir suşla çalışırken radyoaktivite birliğinin kinetiğini ve dolayısıyla çeviri oranını belirlemek için bir zaman kursu yapılmalıdır. Bunun için birkaç dakika (örneğin, 2,5, 5,0, 7,5, 10 ve 20 dk) aralıklarla numune almanızı öneririz. - Etiketlemeyi durdurmak için etiketsiz "soğuk" metiyonin (son konsantrasyon 20 mM olmalıdır) ve puromisin (son konsantrasyon 1–10 μg / mL olmalıdır) ekleyin. 200 rpm ve 30 °C'de 10 dakika ajitasyon için kuluçkaya yaslanın.
NOT: Bu adım ribozomlara peptitleri çevirmeyi bitirmeleri için zaman vermek için kritik öneme sahiptir. Aksi takdirde, tam boydan daha kısa tüm polipeptitler farklı bir boyutta tespit edilecektir. Mitokondriyal çeviri ürünlerinin stabilitesini belirlemek için bu adımda bir zaman kursu deneyi (nabız takibi) yapılabilir. Bunun için 30 dakika (örneğin, 30, 60, 90 ve 120 dk) aralıklarla numune almaya devam edin.
3. Maya hücre lizisi ve proteinlerin çıkarılması
- Maya hücrelerini 30 s için 9.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın. Hücreleri 5 sn boyunca girdaplayarak 0,5 mL steril su ile yıkayın. Oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücreleri. Üstnatant atın.
Not. Protokol burada duraklatılabilir. Numuneleri -20 °C'de saklayın. - 5-10 sn boyunca pelet ve girdap için 75 μL lizis tamponu ekleyin.
NOT: Lizis tamponu suda 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoethanol ve 1 mM PMSF çözeltisidir. Proteinlerin alkali hidrolizine yol açan lizis tamponu ile aşırı inkübasyondan kaçının. Hemen 3.3 adımına geçin. - pH 6.8 ile 500 μL 0.5 M Tris-HCl tampon ekleyin. Kısaca Girdap.
4. Proteinlerin çökelttiri
DİkKAT: Metanol ve kloroform organik çözücülerdir. Organik maddelerin kullanımı için olağan güvenlik uygulamalarını takip edin.
- Numuneye 600 μL metanol ekleyin. 5 sn için girdap.
- Numuneye 150 μL kloroform ekleyin. 5 sn için girdap.
- Numuneleri 12.000 x g'da 2 dakika santrifüj edin. Üst fazı bir örnekleyici ile dikkatlice atın.
- Numuneye 600 μL metanol ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek dikkatlice karıştırın.
- Numuneleri 12.000 x g'da 2 dakika santrifüj edin. Üstnatant atın.
- Peletin hava ile 80 °C'de 2 dakika kurutun.
NOT: Tüm sıvı buharlaşmalıdır. Pelet yetersiz kurutulmuşsa jeldeki proteinlerin sapkın bir şekilde ayrılması riski vardır. Bununla birlikte, peletin aşırı kurutılması mümkün değildir, bu nedenle bir gecede 4 ° C'de bile saklanabilir. - Çökülen proteinleri 60 μL 1x Laemmli numune tamponunda çözün.
- 40 °C'de 10 dakika ısıtın.
NOT: Numuneleri 95 °C'de kaynatmaktan kaçının, çünkü bu toplama neden olur. Agregalar hala oluşuyorsa, örnekleri 2 dakika boyunca 12.000 x g'da döndürün ve süpernatant toplayın. Numuneler -20 °C'de saklanabilir. Protokol burada duraklatılabilir.
5. SDS SAYFASI
- %17,5 Laemmli SDS-poliakrilamid jelini atın.
NOT: Daha iyi atp8 ve atp9 çözmek için jel içine 6 M üre eklenebilir. Degrade %15-%20 jeller de daha iyi çözünürlük sağlayabilir. - Ceplerdeki her numunenin 15 μL'sini (40-50 μg) yükleyin.
NOT: OD600 değerleri 1.6. Değilse, deterjan uyumlu reaktiflerle tahlil kullanarak protein konsantrasyonlarını ölçün. - Mavi boya jel uzunluğunun yaklaşık% 65'ine ulaşana kadar jeli soğuk bir odada çalıştırın.
NOT: Kullanılan sistem için (örneğin, Protean II xi hücresi), iki moddan birini kullanırız: 5 V/cm'de 16-17 saat veya 15 V/cm'de 5 saat. Hiçbir protein bromofenol mavi boyasından daha hızlı çalışmaz, ancak uzun çalışma atp8 ve atp9 sinyallerinin bulanıklığına neden olabilir. - Jeli Coomassie parlak mavi ile lekelendirin ve yükleme kontrolü olarak gerekli olan bir tarama veya fotoğraf yapın.
NOT: Yükleme kontrolü yapmanın alternatif bir yolu, örneğin porin 1 gibi mitokondriyal "ev tutma" genine karşı bir antikor ile immünblottingdir.
6. Otoradyografi
- Jeli bir jel kurutucuda kurutun. 3-5 gün boyunca bir depolama fosfor ekranı ile kasette saklayın.
NOT: Kurutulmuş jelin taranmasının bir alternatifi, proteinlerin elektro-şişkinlik ve daha sonra taranarak nitroselüloz bir zara aktarılmasıdır. Daha güçlü sinyaller ve daha keskin bantlarla sonuçlanır. - Ekranı fosforimager üzerinde tarayın.
NOT: Fosfor görüntülemeye alternatif olarak, sinyalleri ortaya çıkarmak için X-ışını filmi de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolün ardından, iki S. cerevisiae suşundan mitokondriyal çeviri ürünleri atadık: vahşi tip (WT) ve AIM23 geninin ( AIM23Δ ) silinmesini taşıyan bir mutant), kodlama mitokondriyal çeviri başlatma faktörü 3 (Tablo 1)8. Mitokondriyal çeviri ürünleri radyoaktif olarak etiketlendi ve SDS-PAAG9'da ayrıldı. Örnekler, bir zaman kursu oluşturmak için doygunluk öncesinde her 2,5 dakikada bir toplanmıştı (Şekil 1A). Jel 5 günlük sergiden sonra boyandı, kurutuldu ve tarandı (Şekil 1A).
Başarılı bir deneme durumunda, resim standart desen4'egöre atanan sekiz bandı gösterir. Bununla birlikte, bireysel bantların yoğunlukları zorlanmaya ve deneysel koşullara bağlı olarak oldukça değişken olabilir. Her bant bir çeviri ürününe karşılık gelir. Veriler (Şekil 1A) AIM23Δ suşunun mitokondriyal protein sentezi yapabileceğini göstermektedir, çünkü WT'de görünen tüm ürünler bu mutantta görülebilir. Bununla birlikte, bantların yoğunlukları WT'den farklıdır, yani AIM23'ün silinmesi mitokondriyal gen ekspresyonunun8. Coomassie Brilliant Blue boyama bir yükleme kontrolü görevi görür.
Elde eden veriler, ImageJ10veya ImageQuant yazılımı kullanılarak suşlar veya deneysel koşullar arasındaki farkları belirlemek için ölçülebilir ( Şekil1B). Bunun için her ürüne karşılık gelen sinyalin toplam sinyale oranları hesaplanır. Ortalama değerler ve standart sapmalar en az üç bağımsız deneyde hesaplanır.
Sentezlenmiş protein cirosunun kinetiği bir nabız kovalama deneyinde incelenmiştir (Şekil 1C). Örnekler, 2.4. adımda soğuk metiyonin ve pürüzlendiricin ile etiketleme reaksiyonunu durdurduktan sonra belirtilen zaman noktalarında toplanır. Bu kontrol, ürünlerin stabilitesini tahmin etmek için gereklidir, çünkü sinyalin yoğunluğu iki zıt işlemin sonucudur: yeni zincirlerin sentezi ve protein bozulması. Anti-porin 1 antikorları ile immünostaining bir yükleme kontrolüdür.
Şekil 1: Maya mitokondriyal çeviri ürünlerinin temsili radyoaktif etiketlemesi. (A) WT ve AIM23Δ suşlarının canlı maya hücrelerinde mitokondriyal olarak sentezlenen proteinlerde 35S-metiyonin birleştirilmesinin zaman seyri. Coomassie Brilliant Blue boyama bir yükleme kontrolüdür. (B) 35S-metiyonin ile 5 dakikalık etiketlemeden sonra mitokondriyal olarak kodlanmış protein seviyeleri. Göreceli ifade, mitokondriyal olarak kodlanmış protein genlerinin toplam ifadesine normalleştirilir. Hata çubukları, en az üç bağımsız denemenin ortalamasının standart sapması olduğunu gösterir. (C) Vahşi tipte ve Aim23Δ suşlarında mitokondriyal olarak sentezlenen proteinlerin cirosu. Etiketleme durduruldu ve numuneler belirtilen zaman noktalarında toplandı. Anti-porin 1 antikor ile immünostaining bir yükleme kontrolüdür. (D) Eski 35S-metiyonin, radyoautografi ile alt optimal deney. Şekil 1A,B, C küçük değişikliklerle8'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Zorlanma | Genotip |
| Wt | MATα mal |
| AIM23Δ | MATα mal, AIM23::KanMX4 |
Tablo 1. S. cerevisiae suşlarının genotipleri
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gen ekspresyasyonu incelemeleri modern yaşam bilimlerinde merkezi bir yer kaplar. Bu karmaşık süreç hakkında fikir veren çok sayıda yöntem geliştirilmiştir. Burada, fırıncı mayası S. cerevisiae mitokondrisinde protein biyosentezine erişmeye izin verme yöntemini tanımladık. Genellikle mutant maya suşunun mitokondrilerindeki mRNA'ların çeviri verimliliklerini, çalışılan mutasyonun sonuçlarına erişmek için vahşi tipe karşı karşılaştırmak için uygulanır. Bu, araştırmacıların mitokondriyi etkilediği önerilen mutasyonu taşıyan maya hücrelerinin mitokondriyal işlevini incelediklerinde yaptıkları temel deneylerden biridir8,11,12,13. Genellikle oksijen tüketim oranı ve mitokondriyal membran potansiyeli ölçümleri ile birleştirilir. Ancak verdiği bilgiler gen ekspresyonunun hangi aşamasından etkilendiğini ayırt etmek için yeterli değildir. Bunu bulmak için bir dizi ek deneme gereklidir. İlk olarak, transkripsiyonel adımı değerlendirmek için mitokondriyal mRNA'ların kuzey lekesi veya RT-qPCR değerlendirmesi gereklidir. İkinci olarak, protein seviyesini değerlendirmek için spesifik antikorlara sahip batılı bir toplam protein özü lekesi yapılmalıdır. Üçüncü olarak, etiketli 35S-methioninin (sıcak) nabzı etiketsiz (soğuk) methionin (kovalamaca) ilavesi ile devam edilmeli ve proteinlerin stabilitesini araştırmak için jel üzerinde birkaç zaman noktası toplanmalı ve analiz edilmelidir.
35S darbe etiketlemesi kullanılarak mitokondriyal gen ekspresyonunun doğru analizi, özellikle araştırmacının onu kullanma deneyimi olmadığında veya yeni bir maya suşu veya mutantla çalıştığında kontrol reaksiyonları gerektirir. Bu durumlarda, iyi negatif kontrol mitokondriyal DNA'dan yoksun bir rho0 suşudur. Sitosolik çevirinin etkili sikloeximide inhibisyonunu gösterir ve bantlama deseninin mitokondriyal çeviriye özgü olduğunu doğrular. Rho 0 suşu mevcut değilse, cycloheximide verimliliğini ve bantlama deseninin özgüllüğünü doğrulamak için tüm protein sentezini inhibe etmek için sikloeximide ile birlikte kloramfenikol dahil etmeyi öneririz.
Protokolün en yakın modifikasyonu, kültür çalkalayıcıda (adım 2.4) nabız deneyinde önerilenden daha uzun süre inkübe edildiğinde nabız takibidir (Şekil 1C). Mitokondriyal çeviri ürünlerinin cirosunu ve istikrarını incelemek için kullanılır. Radyoaktif etiketleme organelloda yapıldığında yöntemin başka bir modifikasyonu vardır, in vivo4. Mitokondrilerin maya hücrelerinden izole edilmesini önerir. Donmuş mitokondriler daha önce aliquots stoklanmışsa bu modifikasyon daha hızlıdır. Diğer bir avantaj, hücresel metabolizmanın farklı yönlerini etkileyen sikloeximide tedavisinin olmamasıdır. Bununla birlikte, mitokondrilerin izolasyonu ve dondurularak çözülmesi, organellerdeki yapay bir resim sağlayan çeviri komplekslerini bozabilir. Protokolün bir diğer önemli modifikasyonu, mitokondriyal çeviri ürünlerinin poliakrilamid jelde ayrılmasından sonra yapılabilir (adım 5). Protein, Coomassie Brilliant Blue'nun jelin boyanıp kurutulmasının yerine, elektro-şişkinlik ile nitroselüloz membrana aktarılabilir. Bu, daha güçlü ve keskin sinyallerle sonuçlanır. Ana neden, 35S'nin çok kısa penetrasyona sahip beta parçacıklarının emisyonu ile çürümesidir, bu nedenle sinyal bu yaklaşımda kolayca taranır. Elektroforetik koşullar da daha iyi çözünürlük sağlamak için değiştirilebilir. Bir nokta, jel içine atp8 ve atp914ayrımını iyileştiren 6M üre eklemektir. Başka bir yol da degrade% 15-% 20 jeller kullanmaktır.
Çevirisel profil oluşturma15, mitokondriyal çevirinin değişikliklerine daha derinlemesine dalmak için kullanılan yöntemdir. Radyoaktif etiketleme ile karşılaştırıldığında, mRNA üzerinde mitokondriyal ribozomların konumlarının oluşturulmasına izin verir, bu da etkilenen tam adımı (başlatma, uzama veya sonlandırma) bulmayı mümkün kılar. Ancak, profil oluşturma çok daha pahalı, karmaşık ve zaman alıcıdır. Rasyonel olarak etiket birleştirme deneyinden sonra yapılabilir, tam tersi değil. Son zamanlarda, mayalı mitokondriyal çeviriyi izlemeye yönelik yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir16. Bu tür bir tedavi hücresel metabolizmayı ve sinyal yollarını etkilediği için avantajlı olan sikloeximid ile tedaviden kaçınır. Radyoaktif olarak etiketlenmiş amino asit birleşmesi yerine, akış sitometrisi kullanılarak mitokondriyal çevirinin doğrudan ölçülmesine izin veren mayalı mitokondriyal genoma süper katlanmış GFP (sfGFP) için yeniden kodlanmış bir gen eklenmesini kullanır. Bununla birlikte, bu yaklaşımın uygulanması, belirli bir mitokondriyal genin 5'- ve 3'- yan dizileri arasına yerleştirilmiş sfGFP kodlama dizisi içeren modifiye mitokondriyal DNA'ya sahip özel maya suşunu gerektirir.
Etiket birleştirme denemesi, başarılı bir denemede tehlikeye atılamayan birkaç kritik adım içerir. İlk olarak, taze maya kültürleri kullanılmalıdır (adım 1.1). Mayaların tabaklarda 1 aydan uzun tutulması önerilmez; aksi takdirde, bu tahlilde tahmin edilemez şekilde davranabilirler. İkincisi, sikloeximide çözeltisi deneyden önce taze hazırlanmalı ve 1 haftadan uzun süre dondurularak saklanmalıdır (adım 2.1). Eski çözüm, radyoautografide tamamen sapkın bir bant deseni ile sonuçlanan sitoplazmik çeviriyi engelleme yeteneğini kaybeder. Üçüncüsü, 35S-methionine taze ve aktif olmalıdır (adım 2.2), aksi takdirde bantların yoğunlukları zayıf olacaktır (Şekil 1D). Dört yarı ömür (4 x 87,4 gün) geçen reaktifin kullanılması önerilmez. Standart numune hazırlama kılavuzlarının önerdiği gibi protein örneklerini 95 °C'de kaynatmaktan kaçının (adım 4.8) çünkü mitokondriyal proteinler son derece hidrofobiktir ve toplanmaya eğilimlidir.
Bu yöntemle ilgili karşılaşabileceğiniz birkaç yaygın sorun vardır. Bunlardan ilki radyoautografideki bantların zayıf yoğunluğudur. Düzeltmek için, taze 35S-metiyoninin kullanıldığından, yeterli miktarda maya hücresi alındığından ve proteinlerin Coomassie lekeleme ile kontrol edilebilen jel üzerindeki ceplerde bir araya gelmediğinden emin olun. Kurutulmuş jeli ekranda en az 3 gün tutun. İkinci sorun yanlış bant desenidir. Karşılaşılırsa, taze maya plakalarının ve taze hazırlanmış sikloeximide kullanıldığından emin olun. Bantların göreli yoğunluklarının farklı maya suşlarında ve elektroforez koşullarında büyük ölçüde değişebileceğini unutmayın. Mitokondriyal çeviri ürünleri bu prosedürde moleküler kütlelerine göre asla ayrılmadığı için protein moleküler ağırlık merdivenini jel üzerine yüklemek çok mantıklı değil, çünkü son derece hidrofobikler. Böylece, Cox I (58 kDa) Var 1'den (47 kDa) daha hızlı göç eder. Tampon koşullarına bağlı olarak, proteinler komşulardan biriyle pozisyon bile değiştirebilir. Üçüncü yaygın sorun, Coomassie lekelenmesinden sonra keskin bantlar gözlenmeden bulanık resimdir. Jelin dökümündeki hataları, yanlış tampon bileşimini veya numunelerdeki proteinlerin bozulmasını gösterir. Kompozisyonu ve pH değerlerini dikkatlice kontrol ederek yeni jel tamponlar ve çalışan tamponlar hazırlamanız önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma, 18-29-07002 numaralı Hibe numarası olan Rusya Temel Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi. P.K., Rusya Federasyonu Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı Devlet Ataması, AAAA-A16-116021660073-5 hibe numarası ile desteklendi. M.V.P., Rusya Federasyonu Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı tarafından 075-15-2019-1659 (Kurchatov Genom Araştırmaları Merkezi Programı) hibe numarası ile desteklendi. Çalışma kısmen Moskova Devlet Üniversitesi Kalkınma Programı çerçevesinde satın alınan ekipmanlar üzerinde yapıldı. I.C., S.L., ve M.V.B. ayrıca Moskova Devlet Üniversitesi tarafından "Önde Gelen Bilim Okulu Nuh'un Gemisi" tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al.
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
