Summary
Il genoma mitocondriale del lievito di Baker codifica otto polipeptidi. L'obiettivo del protocollo corrente è etichettarli tutti e successivamente visualizzarli come bande separate.
Abstract
I mitocondri sono organelli essenziali di cellule eucariotiche in grado di respirazione aerobica. Contengono un genoma circolare e un apparato di espressione genica. Un genoma mitocondriale del lievito del fornaio codifica per otto proteine: tre subunità della citocromo c ossidasi (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), tre subunità dell'ATP sintasi (Atp6p, Atp8p e Atp9p), una subunità dell'enzima ubichinolo-citocromo c ossidoreduttasi, citocromo b (Cytb) e proteina ribosomiale mitocondriale Var1p. Lo scopo del metodo qui descritto è quello di etichettare specificamente queste proteine con metinina 35S, separarle per elettroforesi e visualizzare i segnali come bande discrete sullo schermo. La procedura prevede diversi passaggi. In primo luogo, le cellule di lievito vengono coltivate in un mezzo contenente galattosio fino a raggiungere la fase di crescita logaritmica tardiva. Successivamente, il trattamento cicloeximide blocca la traduzione citoplasmatica e consente l'incorporazionedi metoionina 35 S solo nei prodotti di traduzione mitocondriale. Quindi, tutte le proteine vengono estratte dalle cellule di lievito e separate dall'elettroforesi del gel di poliacrilammide. Infine, il gel viene asciugato e incubato con lo schermo di fosforo di stoccaggio. Lo schermo viene scansionato su un fosforimager che rivela le bande. Il metodo può essere applicato per confrontare il tasso di biosintesi di un singolo polipeptide nei mitocondri di un ceppo di lievito mutante rispetto al tipo selvatico, che è utile per studiare i difetti dell'espressione genica mitocondriale. Questo protocollo fornisce preziose informazioni sul tasso di traduzione di tutti gli mRNA mitocondriali del lievito. Tuttavia, richiede diversi controlli ed esperimenti aggiuntivi per trarre conclusioni adeguate.
Introduction
I mitocondri sono gli organelli profondamente coinvolti nel metabolismo di una cellula eucariotica. La loro catena di trasferimento di elettroni fornisce alla cellula ATP, la principale valuta energetica utilizzata in più vie biochimiche. Inoltre, sono coinvolti in apoptosi, sintesi di acidi grassi ed eme e altri processi. La disfunzione dei mitocondri è una fonte ben nota di malattia umana1. Può derivare da mutazioni nei geni nucleari o mitocondriali che codificano componenti strutturali o regolatori degli organelli2. Il lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae è un eccellente organismo modello per lo studio dell'espressione genica mitocondriale per diversi motivi. In primo luogo, il loro genomaè completamente sequenziato 3, ben annotato, e una grande somma di dati è già disponibile in letteratura grazie alla lunga storia di indagini condotte con questo organismo. In secondo luogo, le manipolazioni con il loro genoma nucleare sono relativamente veloci e facili a causa del loro rapido tasso di crescita e del sistema di ricombinazione omologo altamente efficiente. In terzo luogo, il lievito di fornaio S. cerevisiae è uno dei pochi organismi per i quali vengono sviluppate le manipolazioni con genomi mitocondriali. Infine, il lievito di fornaio è un organismo facultativo aerobe-anaerobe, che consente l'isolamento e lo studio di mutanti respiratori difettosi, poiché possono crescere in mezzi contenenti fonti di carbonio fermentabili.
Descriviamo il metodo per studiare l'espressione genica mitocondriale del lievito di fornaio S. cerevisiae al livello trascizionale4. Il suo principio principale deriva da diverse osservazioni. In primo luogo, il genoma mitocondriale del lievito codifica solo otto proteine: tre subunità del citocromo c ossidasi (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), tre subunità dell'ATP sintasi (Atp6p, Atp8p e Atp9p), una subunità dell'enzima ubichinolo-citocromo c ossidoreduttasi, citocromo b (Cytb) e proteina ribosomiale mitocondriale Var1p5. Questo numero è piccolo e tutti possono essere separati per elettroforesi su un singolo gel nelle condizioni appropriate. In secondo luogo, i ribosomi mitocondriali appartengono alla classe procariotica piuttosto che eucariotica 6 e,quindi,la sensibilità agli antibiotici è diversa per i ribosomi citoplasmatici e mitocondriali del lievito. Permette l'inibizione della traduzione citoplasmatica con cicloeximide, fornendo le condizioni quando l'amminoacido etichettato(35S-metonina) è incorporato solo nei prodotti di traduzione mitocondriale. Di conseguenza, l'esperimento fornisce informazioni sul tasso di incorporazione di amminoacidi nelle proteine mitocondriali sintetizzata de novo, riflettendo l'efficienza complessiva della traduzione mitocondriale per ciascuno degli otto prodotti
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Protocol
1. Preparazione della coltura del lievito
- Striature di lievito dalle colture di stock congelate su piatti freschi con il mezzo appropriato. Mettere le piastre in un incubatore di coltura a 30 °C per 24-48 ore.
NOTA: Lascia che i mutanti sensibili alla temperatura crescano alla temperatura permissiva. - Inoculare le colture di lievito in 2 ml di mezzo YPGal (2% peptone, 1% estratto di lievito, 2% di galattosio) dalla striscia fresca in tubi da 15 ml e incubarle durante la notte agitando a 200 giri/min a 30 °C.
- Misurare la densità ottica della coltura ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD600).
- Prendere il volume corrispondente a 0,2 unità di assorbanza in tubi sterili, celle di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente e scartare il supernatante.
- Lavare le cellule con 0,5 mL di acqua sterile con vortice per 5 s. Celle di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Diluire le cellule in 2 mL di mezzo YPGal fresco.
- Incubare l'agitazione a 200 giri/min e 30 °C fino a quando L'OD600 raggiunge i valori di 1,5-1,9.
NOTA: I tassi di crescita del lievito variano, quindi preparati ad aspettare. È ragionevole fare i passi 1.3-1.6 la mattina presto. Di solito ci vogliono 4-5 ore, ma può richiedere più tempo.
2. Incorporazione di isotopi radioattivi
- Trasferire il volume di coltura equivalente a un'unità ottica in un tubo di microcentrifugo. Ruotare i tubi a 3.000 x g per 1 minuto e scartare il supernatante. Lavare con 0,5 mL di acqua sterile con vortice per 5 s.
- Celle di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Resuspend cellule di lievito in 0,5 mL di tampone di traduzione sterile. Posizionare la sospensione in un tubo da 15 ml.
NOTA: Il tampone di traduzione è una soluzione contenente il 2% di galattosio (w/v) e 50 mM di fosfato di potassio con pH 6,0.
- Celle di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Resuspend cellule di lievito in 0,5 mL di tampone di traduzione sterile. Posizionare la sospensione in un tubo da 15 ml.
- Aggiungere cicloeximide alla sospensione cellulare fino ad una concentrazione finale di 0,2 mg/mL. Incubare per 5 min agitando a 200 giri/min e 30 °C per inibire la traduzione citosolica.
NOTA: La soluzione di cicloeximide (20 mg/mL, in etanolo) deve essere preparata fresca prima dell'esperimento. Il cloramfenicolo può essere sostituito con successo con l'anisomicina nella stessa concentrazione7. - Aggiungere 25-30 μCi di 35S-metinina alla sospensione cellulare e incubare per 30 min agitando a 200 giri/min e 30 °C.
NOTA: Può essere utilizzata anche la miscela di 35S-metinina e 35S-cisteina. Pure 35S-methionine si traduce nel segnale più forte e nel miglior rapporto segnale-rumore. Generalmente, la metonina è più efficace della cisteina perché il contenuto di questo amminoacido nelle proteine mitocondriali è più alto. Tuttavia, la miscela EasyTag di 35S-metinina e cisteina è meno costosa e dà risultati comparabili7.
ATTENZIONE: 35S-metinina è radioattiva. Seguire le consuete pratiche di sicurezza per la manipolazione di materiali radioattivi.
NOTA: È noto che l'incorporazione della radioattività raggiunge un limite a causa del quale i segnali totali si livellano nel tempo. Una volta raggiunto questo limite, è quasi impossibile determinare le tariffe con cui vengono sintetizzati i diversi prodotti di traduzione. Per analizzare il tasso di traslazione mitocondriale, è imperativo essere in una condizione in cui l'intensità del segnale aumenta con il tempo di incubazione con 35S-metionina in modo lineare. Per i comuni ceppi di laboratorio di tipo selvatico, il segnale è già saturo per tempi di incubazione molto più brevi dei 30 minuti. I mutanti traslizionali possono comportarsi in modo molto diverso. Si dovrebbe eseguire un corso di tempo per stabilire la cinetica dell'incorporazione di radioattività e quindi il ritmo di traduzione, almeno quando si lavora con un nuovo ceppo. Per questo, si consiglia di prelevare campioni con un intervallo di diversi minuti (ad esempio, 2,5, 5,0, 7,5, 10 e 20 minuti). - Aggiungere metinina "fredda" senza etichetta (la concentrazione finale deve essere di 20 mM) e puromicina (la concentrazione finale deve essere di 1-10 μg/mL) per interrompere l'etichettatura. Incubare per 10 min agitando a 200 giri/min e 30 °C.
NOTA: Questo passaggio è fondamentale per dare ai ribosomi il tempo di finire di tradurre i peptidi. In caso contrario, tutti i polipeptidi più corti della lunghezza intera verranno rilevati con dimensioni diverse. Un esperimento a tempo (pulse-chase) può essere fatto in questo passaggio per determinare la stabilità dei prodotti di traduzione mitocondriale. Per questo, continuare l'incubazione prelevare campioni con un intervallo di 30 min (ad esempio, 30, 60, 90 e 120 min).
3.Lisi cellulare del lievito ed estrazione di proteine
- Raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione a 9.000 x g per 30 s. Lavare le cellule con 0,5 mL di acqua sterile vortice per 5 s. Cellule di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente. Scartare il supernatante.
nota. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i campioni a -20 °C. - Aggiungere 75 μL di tampone dilisi al pellet e al vortice per 5-10 s.
NOTA: Il tampone di lysis è una soluzione di 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoetanolo e 1 mM PMSF in acqua. Evitare un'eccessiva incubazione con tampone di lisi che porta all'idrolisi alcalina delle proteine. Procedere immediatamente al passaggio 3.3. - Aggiungere 500 μL di tampone Tris-HCl da 0,5 M con pH 6,8. Vortice brevemente.
4. Precipitazione delle proteine
ATTENZIONE: Metanolo e cloroformio sono solventi organici. Seguire le consuete pratiche di sicurezza per la manipolazione di sostanze organiche.
- Aggiungere 600 μL di metanolo al campione. Vortice per 5 s.
- Aggiungere 150 μL di cloroformio al campione. Vortice per 5 s.
- Centrifugare i campioni per 2 min a 12.000 x g. Scartare con cura la fase superiore con un campionatore.
- Aggiungere 600 μL di metanolo al campione. Mescolare con attenzione invertendo il tubo più volte.
- Centrifugare i campioni per 2 min a 12.000 x g. Scartare il supernatante.
- Asciugare all'aria il pellet per 2 min a 80 °C.
NOTA: Tutto il liquido deve evaporare. C'è il rischio di avere una separazione aberrante delle proteine nel gel se il pellet è stato asciugato in modo insufficiente. Tuttavia, non è possibile asciugare troppo il pellet, quindi può anche essere conservato durante la notte a 4 °C. - Sciogliere le proteine precipitate in 60 μL di 1 tampone campione di Laemmli.
- Riscaldare per 10 min a 40 °C.
NOTA: Evitare di bollire i campioni a 95 °C, perché ciò causa aggregazione. Se gli aggregati si formano ancora, ruotare i campioni a 12.000 x g per 2 minuti e raccogliere il supernatante. I campioni possono essere conservati a -20 °C. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
5. PAGINA SDS
- Lanciare il gel Laemmli SDS-poliacrilammide al 17,5%.
NOTA: 6 M di urea possono essere aggiunti al gel per risolvere meglio atp8 e atp9. Gradiente 15%-20% gel può anche dare una migliore risoluzione. - Caricare 15 μL (40-50 μg) di ogni campione nelle tasche.
NOTA: Non è necessario misurare la concentrazione proteica se i valori di OD600 erano vicini al passaggio 1.6. In caso meno, misurare le concentrazioni proteiche utilizzando il saggio con reagenti compatibili con i detergenti. - Eseguire il gel in una cella frigorifere fino a quando il colorante blu raggiunge circa il 65% della lunghezza del gel.
NOTA: Per il sistema utilizzato (ad esempio, protean II xi cell), usiamo una delle due modalità: 16-17 h a 5 V / cm o 5 h a 15 V / cm. Nessuna proteine corre più veloce del colorante blu bromofenolo, ma le lunghe corse possono causare la sfocatura dei segnali Atp8 e Atp9. - Macchiare il gel con Coomassie blu brillante e fare una scansione o una foto, che è necessaria come controllo di carico.
NOTA: Un modo alternativo per effettuare un controllo del carico è l'immunoblotting con un anticorpo contro il gene mitocondriale "house-keeping", ad esempio porina 1.
6. Autorarografia
- Asciugare il gel in un gel-essiccatore. Tienilo nella cassetta con uno schermo di fosforo di archiviazione per 3-5 giorni.
NOTA: Un'alternativa allo screening del gel essiccato è il trasferimento di proteine a una membrana di nitrocellulosa mediante elettroblotting e screening in seguito. Si traduce in segnali più forti e bande più nitide. - Scansiona lo schermo su un fosforimager.
NOTA: In alternativa all'imaging al fosforo, la pellicola a raggi X può anche essere utilizzata per rivelare i segnali.
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Representative Results
Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo assegnato prodotti di traduzione mitocondriale da due ceppi di S. cerevisiae: il tipo selvatico (WT) e una cancellazione mutante del gene AIM23 (AIM23Δ), codificando il fattore di iniziazione alla traduzione mitocondriale 3 (Tabella 1)8. I prodotti di traduzione mitocondriale sono stati etichettati e separati radioattivamente in SDS-PAAG9. I campioni sono stati raccolti ogni 2,5 minuti prima della saturazione per costruire un corso di tempo (Figura 1A). Il gel è stato colorato, asciugato e schermato dopo l'esposizione di 5 giorni (Figura 1A).
Nel caso di un esperimento riuscito, l'immagine mostra otto bande assegnate secondo il modello standard4. Tuttavia, le intensità delle singole bande possono essere altamente variabili a seconda della deformazione e delle condizioni sperimentali. Ogni banda corrisponde a un prodotto di traduzione. I dati (Figura 1A) suggeriscono che il ceppo AIM23Δ è in grado di sintesi di proteine mitocondriali perché tutti i prodotti che appaiono nel WT sono visibili in questo mutante. Tuttavia, le intensità delle bande sono diverse dal WT, il che significa che la cancellazione di AIM23 influisce sull'espressione genica mitocondriale8. La colorazione Coomassie Brilliant Blue funge da controllo di carico.
I dati risultanti possono essere quantificati (Figura 1B) per identificare le differenze tra ceppi o condizioni sperimentali utilizzando il software ImageJ10 o ImageQuant. Per questo, vengono calcolati i rapporti del segnale corrispondente a ogni prodotto con il segnale totale. I valori medi e le deviazioni standard sono calcolati in almeno tre esperimenti indipendenti.
La cinetica del ricambio proteico sintetizzato è studiata in un esperimento di inseguimento a impulsi(Figura 1C). I campioni vengono raccolti nei punti di tempo indicati dopo che la reazione di etichettatura è stata interrotta dalla meionina fredda e dalla puromicina nel passaggio 2.4. Questo controllo è necessario per stimare la stabilità dei prodotti perché l'intensità del segnale è il risultato di due processi opposti: la sintesi di nuove catene e la degradazione proteica. L'immunostaining con anticorpi anti-porina 1 è un controllo del carico.
Figura 1: Etichettatura radioattiva rappresentativa dei prodotti di traduzione mitocondriale del lievito. (A) Decorso del tempo di 35incorporazione di S-meionina nelle proteine sintetizzata mitocondrialmente nelle cellule di lievito vivo dei ceppi WT e AIM23Δ. La colorazione Coomassie Brilliant Blue è un controllo di carico. (B) Livelli di proteine codificate mitocondrialmente dopo 5 min di etichettatura con 35S-metinina. L'espressione relativa è normalizzata all'espressione totale dei geni proteici codificati mitocondrialmente. Le barre di errore indicano la deviazione standard della media di almeno tre esperimenti indipendenti. (C) Turnover di proteine sintetizzati mitocondrialmente in caratteri selvatici e ceppi Aim23Δ. L'etichettatura è stata interrotta e i campioni sono stati raccolti nei punti di tempo indicati. L'immunosattenzione con anticorpo anti-porina 1 è un controllo del carico. (D) Esperimento non ottimale con la vecchia 35S-metinina, radioautografia. Figura 1A, B,C sono adattati da8 con piccole modifiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| sforzo | genotipo |
| Wt | MATα mal |
| AIM23Δ | MATα mal, AIM23::KanMX4 |
La tabella 1. Genotipi di ceppi di S. cerevisiae
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Discussion
Le indagini sull'espressione genica occupano una parte centrale nelle moderne scienze della vita. Sono stati sviluppati numerosi metodi che forniscono informazioni su questo complesso processo. Qui, abbiamo descritto il metodo che consente di accedere alla biosintesi proteica nel lievito di fornaio S. cerevisiae mitochondria. Di solito viene applicato per confrontare le efficienze di traduzione degli mRNA nei mitocondri del ceppo di lievito mutante rispetto al tipo selvatico per accedere alle conseguenze della mutazione studiata. Questo è uno degli esperimenti di base che i ricercatori conducono quando studiano la funzione mitocondriale delle cellule di lievito che portano lamutazione suggeritaper influenzare i mitocondri 8,11,12,13. È spesso combinato con le misurazioni del tasso di consumo di ossigeno e del potenziale della membrana mitocondriale. Tuttavia, le informazioni che fornisce non sono sufficienti per distinguere quale fase dell'espressione genica è influenzata. Per scoprirlo è necessaria una serie di esperimenti aggiuntivi. In primo luogo, la valutazione northern blot o RT-qPCR degli mRNA mitocondriali è necessaria per valutare la fase trascrizionale. In secondo luogo, una macchia occidentale di estratti proteici totali con anticorpi specifici dovrebbe essere fatta per valutare il livello proteico. In terzo luogo, l'impulso di 35S-meionina etichettata (calda) deve essere continuato con l'aggiunta di metinina (fredda) senza etichetta (inseguimento) e diversi punti di tempo dovrebbero essere raccolti e analizzati sul gel per studiare la stabilità delle proteine.
Un'analisi accurata dell'espressione genica mitocondriale utilizzando l'etichettaturadell'impulso 35 S richiede reazioni di controllo, specialmente quando il ricercatore non ha l'esperienza di gestirla o lavora con un nuovo ceppo di lievito o un mutante. In questi casi, un buon controllo negativo è un ceppo rho0 privo di DNA mitocondriale. Mostra un'efficiente inibizione del cicloeximide della traduzione citosolica e conferma che il modello di bande è specifico della traduzione mitocondriale. Se il ceppo rho0 non è disponibile, allora suggeriamo di includere il cloramfenicolo insieme al cicloeximide per inibire tutta la sintesi proteica per confermare l'efficienza del cicloeximide e la specificità del modello di bande.
La modifica più vicina del protocollo è l'inseguimento a impulsi quando la coltura viene incubata nello shaker (fase 2.4) più a lungo di quanto suggerito nell'esperimento di impulsi(Figura 1C). Viene utilizzato per studiare il fatturato e la stabilità dei prodotti di traduzione mitocondriale. C'è un'altra modifica del metodo quando l'etichettatura radioattiva viene eseguita in organello, non in vivo4. Suggerisce l'isolamento dei mitocondri dalle cellule di lievito. Questa modifica è più veloce se i mitocondri congelati erano precedentemente riforniti di aliquote. Un altro vantaggio è l'assenza di trattamento cicloeximide, che colpisce diversi aspetti del metabolismo cellulare. Tuttavia, l'isolamento dei mitocondri e il loro congelamento possono perturbo i complessi di traduzione negli organelli fornendo un quadro artificiale. Un'altra importante modifica del protocollo può essere effettuata dopo la separazione dei prodotti di traduzione mitocondriale in gel di poliacrilammide (fase 5). Invece di coomassie Brilliant Blue macchiare e asciugare il gel, la proteina può essere trasferita alla membrana nitrocellulosa elettro-macchia. Ciò si traduce in segnali più forti e nitidi. Il motivo principale è che 35S decade per emissione di particelle beta con penetrazione molto breve, quindi il segnale è facilmente schermato in questo approccio. Le condizioni elettroforetiche possono anche essere modificate per fornire una migliore risoluzione. Un punto è aggiungere urea 6M nel gel, che migliora la separazione tra atp8 e atp914. Un altro modo è usare gel gradiente 15%-20%.
La profilazionetraslizionale 15 è il metodo utilizzato per approfondire le alterazioni della traduzione mitocondriale. Rispetto all'etichettatura radioattiva, consente di stabilire posizioni di ribosomi mitocondriali sull'mRNA, il che consente di trovare il passo esatto (iniziazione, allungamento o terminazione) interessato. Tuttavia, la profilatura è molto più costosa, complicata e dispendiosa in termini di tempo. Razionalmente può essere fatto dopo l'esperimento di incorporazione dell'etichetta, non viceversa. Recentemente, è stato sviluppato un nuovo approccio al monitoraggio della traduzione mitocondriale dellievito 16. Evita il trattamento con cicloeximide, il che è vantaggioso perché tale trattamento influisce sul metabolismo cellulare e sulle vie di segnalazione. Invece dell'incorporazione di amminoacidi con etichetta radioattiva, utilizza l'inserimento di un gene ricodificato per la GFP super-piegata (sfGFP) nel genoma mitocondriale del lievito, che consente la misurazione diretta della traslazione mitocondriale usando la citometria del flusso. Tuttavia, l'applicazione di questo approccio richiede lo speciale ceppo di lievito con DNA mitocondriale modificato contenente sequenza di codifica sfGFP posizionata tra le sequenze di fianco 5'- e 3' di un certo gene mitocondriale.
L'esperimento di incorporazione delle etichette include diversi passaggi critici, che non possono essere compromessi in un esperimento riuscito. In primo luogo, devono essere utilizzate colture di lievito fresco (fase 1.1). Non è consigliabile mantenere i lieviti sui piatti più lunghi di 1 mese; altrimenti, possono comportarsi in modo imprevedibile in questo saggio. In secondo luogo, la soluzione di cicloeximide deve essere preparata fresco prima dell'esperimento e conservata congelata non più di 1 settimana (fase 2.1). La vecchia soluzione perde la sua capacità di inibire la traduzione citoplasmatica risultando in un modello di banda completamente aberrante nella radioautografia. In terzo luogo, 35S-metinina dovrebbe essere fresca e attiva (fase 2.2), altrimenti le intensità delle bande saranno deboli(Figura 1D). Non è consigliabile utilizzare il reagente che ha superato quattro emiti (4 x 87,4 giorni). Evitare di far bollire i campioni proteici a 95 °C come suggeriscono le guide standard per la preparazione del campione (fase 4.8) perché le proteine mitocondriali sono altamente idrofobiche e soggette ad aggregazione.
Ci sono diversi problemi comuni che si possono sperimentare affrontando questo metodo. Il primo è l'intensità debole delle bande sulla radioautografia. Per risolverlo assicurarsi che venga utilizzata una s-meionina fresca 35,venga assunta una quantità sufficiente di cellule di lievito e le proteine non si aggregino nelle tasche sul gel, che può essere controllato dalla colorazione Coomassie. Conservare il gel essiccato con lo schermo per non meno di 3 giorni. Il secondo problema è il modello di banda errato. In caso di incontro, assicurarsi che siano utilizzati piatti di lievito fresco e cicloeximide appena preparato. Tieni presente che le intensità relative delle bande possono variare notevolmente in diversi ceppi di lievito e condizioni di elettroforesi. Non ha molto senso caricare la scala del peso molecolare della proteina sul gel poiché i prodotti di traduzione mitocondriale non vengono mai separati in base alle loro masse molecolari in questa procedura perché sono altamente idrofobi. Pertanto, Cox I (58 kDa) migra più velocemente del Var 1 (47 kDa). A seconda delle condizioni del buffer, le proteine possono persino cambiare posizione con uno dei vicini. Il terzo problema comune è l'immagine sfocata senza bande affilate osservate dopo la colorazione coomassie. Indica gli errori nella fusione del gel, una composizione tampone errata o la degradazione delle proteine nei campioni. Si consiglia di preparare nuovi buffer di gel e running buffer controllando attentamente la composizione e i valori di pH.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dalla Fondazione russa per la ricerca di base, numero di sovvenzione 18-29-07002. P.K. è stato supportato dall'assegnazione statale del Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa, numero di sovvenzione AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. è stato supportato dal Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa, sovvenzione numero 075-15-2019-1659 (Programma del Kurchatov Center of Genome Research). Il lavoro è stato in parte svolto sulle attrezzature acquistate nell'ambito del Programma di Sviluppo dell'Università Statale di Mosca. I.C., S.L., e M.V.B. sono stati inoltre supportati dalla borsa di studio dell'Università Statale di Mosca "Leading Scientific School Noah's Ark".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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