Summary
Bakers gær mitokondrie genom koder otte polypeptider. Målet med den aktuelle protokol er at mærke dem alle og efterfølgende visualisere dem som separate bånd.
Abstract
Mitokondrier er essentielle organeller af eukaryote celler, der er i stand til aerobt åndedræt. De indeholder cirkulært genom og genekspressionsapparat. Et mitokondriegenom af bagergær koder otte proteiner: tre underenheder af cytochrom c oxidase (Cox1p, Cox2p, og Cox3p), tre underenheder af ATP synthase (Atp6p, Atp8p, og Atp9p), en underenhed af ubiquinol-cytochrom c oxidoreductase enzym, cytochrom b (Cytb), og mitokondrie ribosomal protein Var1p. Formålet med den her beskrevne metode er specifikt at mærke disse proteiner med 35S methionin, adskille dem ved elektroforese og visualisere signalerne som diskrete bånd på skærmen. Proceduren omfatter flere trin. For det første dyrkes gærceller i et galactoseholdigt medium, indtil de når den sene logaritmiske vækstfase. Dernæst blokerer cykloheximidbehandling cytoplasmisk oversættelse og tillader kun 35S methionininkorporering i mitokondrieoversættelsesprodukter. Derefter udvindes alle proteiner fra gærceller og adskilles af polyacrylamidgelelektrophoresis. Endelig tørres gelen og inkuberes med opbevaringsfosforskærmen. Skærmen scannes på en fosformager, der afslører båndene. Metoden kan anvendes til at sammenligne biosyntesehastigheden af en enkelt polypeptid i mitokondrier af en mutant gærstamme i forhold til den vilde type, hvilket er nyttigt til at studere mitokondrie genekspressionsdefekter. Denne protokol giver værdifulde oplysninger om oversættelseshastigheden for alle gær mitokondrie mRNA'er. Det kræver dog flere kontroller og yderligere eksperimenter at drage ordentlige konklusioner.
Introduction
Mitokondrier er organellerne dybt involveret i metabolismen af en eukaryote celle. Deres elektronoverførselskæde forsyner cellen med ATP, den vigtigste energiske valuta, der bruges i flere biokemiske veje. Desuden er de involveret i apoptose, fedtsyre og hemesyntese og andre processer. Dysfunktion af mitokondrier er en velkendt kilde til menneskelig sygdom1. Det kan skyldes mutationer i nukleare eller mitokondriegener, der kodper strukturelle eller regulerende komponenter i organellerne2. Baker's gær Saccharomyces cerevisiae er en fremragende model organisme til at studere mitokondrie genekspression på grund af flere grunde. For det første er deres genom helt sekventeret3, godt kommenteret, og en stor sum data er allerede tilgængelig i litteraturen takket være den lange historie med undersøgelser udført med denne organisme. For det andet er manipulationerne med deres nukleare genom relativt hurtige og lette på grund af deres hurtige vækstrate og yderst effektive homologe rekombinationssystem. For det tredje er bagergær S. cerevisiae en af de få organismer, for hvilke manipulationerne med mitokondriegenomer udvikles. Endelig bagergær er en aerobe-anaerobe fakultetsorganisme, som tillader isolering og undersøgelse af respiratoriske defekte mutanter, da de kan vokse i medier, der indeholder fermenterbare kulstofkilder.
Vi beskriver metoden til at studere mitokondrie genekspression af bagergær S. cerevisiae på oversættelsesniveau4. Hovedprincippet kommer fra flere bemærkninger. For det første koder gæren mitokondriegenom kun otte proteiner: tre underenheder af cytochrom c oxidase (Cox1p, Cox2p, og Cox3p), tre underenheder af ATP synthase (Atp6p, Atp8p, og Atp9p), en underenhed af ubiquinol-cytochrom c oxidoreductase enzym, cytochrom b (Cytb), og mitokondrie ribosomal protein Var1p5. Dette tal er lille, og alle af dem kan adskilles ved elektroforese på en enkelt gel under passende forhold. For det andet tilhører mitokondrie ribosomer den prokaryote klasse snarere end eukaryote6, og derfor er følsomheden over for antibiotika anderledes for gærcytoplasmiske og mitokondrie ribosomer. Det gør det muligt at hæmme cytoplasmisk oversættelse med cykloheximid, hvilket giver betingelserne, når den mærkede aminosyre (35S-methionin) kun er indarbejdet i mitokondrieoversættelsesprodukter. Som følge heraf giver eksperimentet oplysninger om hastigheden af aminosyreinkorporering i mitokondrieproteiner syntetiseret de novo, hvilket afspejler den samlede effektivitet af mitokondrieoversættelse for hvert af de otte produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gær kultur forberedelse
- Streak gær fra den frosne bestand kulturer på friske plader med passende medium. Sæt pladerne i en dyrkningsinkubator ved 30 °C i 24-48 timer.
BEMÆRK: Lad de temperaturfølsomme mutanter vokse ved den eftergivende temperatur. - Pod gærkulturer i 2 mL YPGal medium (2% peptone, 1% gærekstrakt, 2% galactose) fra den friske stribe i 15 mL rør og inkuber dem natten over agiterende ved 200 rpm ved 30 °C.
- Den optiske tæthed af kulturen måles ved en bølgelængde på 600 nm (OD600).
- Tag volumen svarende til 0,2 absorbans enheder i sterile rør, pellet gærceller på 9.000 x g for 30 s ved stuetemperatur, og kassér supernatant.
- Vask celler med 0,5 mL sterilt vand ved hvirvelstrømning i 5 s. Pellet gærceller ved 9.000 x g i 30 s ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Fortynd celler i 2 mL frisk YPGal medium.
- Inkuber agitering ved 200 omdrejninger i minuttet og 30 °C, indtil OD600 når op på 1,5-1,9 værdier.
BEMÆRK: Gær vækstrater varierer, så vær parat til at vente. Det er rimeligt at tage skridt 1.3-1.6 tidligt om morgenen. Det tager normalt 4-5 timer, men kan tage længere tid.
2. Inkorporering af radioaktiv isotop
- Overfør det dyrkningsvolumen, der svarer til en optisk enhed, i et mikrocentrifugerør. Spin rørene på 3.000 x g i 1 min og kassér supernatanten. Vask med 0,5 mL sterilt vand ved hvirvelstrøm i 5 s.
- Pellet gærceller ved 9.000 x g i 30 s ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Genbrugte gærceller i 0,5 mL steril oversættelsesbuffer. Affjedringen anbringes i et 15 mL rør.
BEMÆRK: Oversættelsesbuffer er en opløsning, der indeholder 2% galactose (w/v) og 50 mM kaliumphosphat med pH 6.0.
- Pellet gærceller ved 9.000 x g i 30 s ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Genbrugte gærceller i 0,5 mL steril oversættelsesbuffer. Affjedringen anbringes i et 15 mL rør.
- Cykloheximid til celleaffjedringen tilsættes op til en endelig koncentration på 0,2 mg/mL. Inkuber i 5 min agiterende ved 200 omdrejninger i minuttet og 30 °C for at hæmme cytosolic oversættelse.
BEMÆRK: Cykloheximidopløsning (20 mg/mL i ethanol) skal tilberedes frisk inden forsøget. Chloramphenicol kan med succes erstattes med anisomycin i samme koncentration7. - Der tilsættes 25-30 μCi på 35S-methionin til cellesuspensionen og inkuberes i 30 min.
BEMÆRK: Blandingen af 35S-methionin og 35S-cystein kan også anvendes. Ren 35S-methionin resulterer i det stærkeste signal og det bedste signal-til-støj-forhold. Generelt er methionin mere effektivt end cystein, fordi indholdet af denne aminosyre i mitokondrieproteiner er højere. EasyTag-blandingen af 35S-methionin og cystein er imidlertid billigere og giver sammenlignelige resultater7.
ADVARSEL: 35S-methionin er radioaktivt. Følg de sædvanlige sikkerhedspraksisser for håndtering af radioaktive materialer.
BEMÆRK: Det er velkendt, at inkorporeringen af radioaktivitet når en grænse, hvorfor de samlede signaler udjævnes over tid. Når denne grænse er nået, er det næsten umuligt at bestemme, hvor ofte de forskellige oversættelsesprodukter syntetiseres. For at analysere hastigheden af mitokondrieoversættelse er det vigtigt at være i en tilstand, hvor signalintensiteten stiger med inkubationstiden med 35S-methionin på en lineær måde. For almindelige laboratoriestammer af vild type er signalet allerede mættet til inkubationstider, der er langt kortere end de 30 min. Translationelle mutanter kan opføre sig meget anderledes. Der bør gennemføres et tidsforløb for at fastslå kinetik af radioaktivitetsinkorporering og dermed oversættelseshastigheden, i det mindste når man arbejder med en ny stamme. Til dette foreslår vi at tage prøver med et interval på flere minutter (f.eks. 2,5, 5,0, 7,5, 10 og 20 min). - Der tilsættes ikke-mærket "kold" methionin (den endelige koncentration skal være 20 mM) og puromycin (den endelige koncentration skal være 1-10 μg/ml) for at stoppe mærkningen. Inkuber i 10 minutters omrøring ved 200 omdrejninger i minuttet og 30 °C.
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at give ribosomer tid til at afslutte oversættelsen af peptider. Ellers vil alle polypeptider, der er kortere end fuld længde, blive opdaget i en anden størrelse. Et tidskursuseksperiment (pulsjagt) kan udføres på dette trin for at bestemme stabiliteten af mitokondrieoversættelsesprodukter. Til dette skal du fortsætte inkubationen ved at tage prøver med et interval på 30 min (f.eks. 30, 60, 90 og 120 min).
3. Gærcelle lysis og udvinding af proteiner
- Indsamle gærceller ved centrifugering ved 9.000 x g i 30 s. Cellerne vaskes med 0,5 mL sterilt vand ved hvirvelstrømning i 5 s. Pellet gærceller ved 9.000 x g i 30 s ved stuetemperatur. Kassér supernatanten.
Bemærk. Protokollen kan sættes på pause her. Prøverne opbevares ved -20 °C. - Der tilsættes 75 μL lysisbuffer til pellet og vortex i 5-10 s.
BEMÆRK: Lysis buffer er en opløsning på 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoethanol og 1 mM PMSF i vand. Undgå overdreven inkubation med lysis buffer, der fører til alkalisk hydrolyse af proteiner. Gå straks videre til trin 3.3. - Der tilsættes 500 μL på 0,5 M Tris-HCl buffer med pH 6,8. Vortex kort.
4. Udfældning af proteiner
ADVARSEL: Methanol og kloroform er organiske opløsningsmidler. Følg de sædvanlige sikkerhedsmetoder for håndtering af organiske stoffer.
- Der tilsættes 600 μL methanol til prøven. Vortex for 5 s.
- Der tilsættes 150 μL chloroform til prøven. Vortex for 5 s.
- Centrifuge prøverne i 2 min ved 12.000 x g. Kassér forsigtigt den øverste fase med en prøvetager.
- Der tilsættes 600 μL methanol til prøven. Bland forsigtigt ved at vende røret flere gange.
- Centrifuge prøverne i 2 min ved 12.000 x g. Kassér supernatanten.
- Pelletlen lufttørres i 2 minutter ved 80 °C.
BEMÆRK: Al væsken skal fordampe. Der er risiko for en afvigende adskillelse af proteiner i gelen, hvis pellet blev tørret utilstrækkeligt. Det er dog ikke muligt at overtørre pelleten, så den kan endda opbevares natten over ved 4 °C. - Udfældede proteiner opløses i 60 μL 1x Laemmli-prøvebuffer.
- Varm i 10 minutter ved 40 °C.
BEMÆRK: Undgå kogning af prøverne ved 95 °C, da dette medfører sammenlægning. Hvis aggregaterne stadig dannes, drej prøverne ved 12.000 x g i 2 minutter og saml supernatanten. Prøverne kan opbevares ved -20 °C. Protokollen kan sættes på pause her.
5. SDS-SIDE
- Støbt 17,5% Laemmli SDS-polyacrylamid gel.
BEMÆRK: 6 M urinstof kan tilsættes til gelen for at løse bedre atp8 og atp9. Gradient 15%-20% geler kan også give bedre opløsning. - 15 μL (40-50 μg) af hver prøve i lommerne.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at måle proteinkoncentrationen, hvis OD600-værdierne var tæt på trin 1.6. Hvis ikke, måle proteinkoncentrationer ved hjælp af analysen med vaskemiddel-kompatible reagenser. - Kør gelen i et koldt rum, indtil det blå farvestof når ca. 65% af gellængden.
BEMÆRK: For det anvendte system (f.eks. Protean II xi celle) bruger vi en af de to tilstande: 16-17 timer ved 5 V/cm eller 5 timer ved 15 V/cm. Ingen proteiner kører hurtigere end bromophenol blå farvestof, men lange løb kan resultere i sløring af atp8 og atp9 signaler. - Plette gelen med Coomassie strålende blå og lav en scanning eller foto, som er påkrævet som en lastekontrol.
BEMÆRK: En alternativ måde at lave en lastekontrol på er immunoblotting med et antistof mod mitokondriegen "husholdning", f.eks.
6. Autoradiografi
- Tør gelen i en geltørrer. Opbevar den i kassetten med en opbevaringsfosforskærm i 3-5 dage.
BEMÆRK: Et alternativ til screening af den tørrede gel er overførsel af proteiner til en nitrocellulosemembran ved elektro-blotting og screening derefter. Det resulterer i stærkere signaler og skarpere bånd. - Scan skærmen på en fosformager.
BEMÆRK: Som et alternativ til fosforbilleddannelse kan røntgenfilm også bruges til at afsløre signalerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den ovenfor beskrevne protokol tildelte vi mitokondrieoversættelsesprodukter fra to S. cerevisiaestammer: den vilde type (WT) og en mutantbærende sletning af AIM23-genet (AIM23Δ), kodning af mitokondrieoversættelsesstartfaktor 3 (tabel 1)8. Mitokondrieoversættelsesprodukter blev radioaktivt mærket og adskilt i SDS-PAAG9. Prøverne blev indsamlet hver 2,5 min før mætning for at opbygge et tidsforløb(Figur 1A). Gelen blev farvet, tørret og screenet efter 5-dages redegørelsen (Figur 1A).
I tilfælde af et vellykket eksperiment demonstrerer billedet otte bånd, der er tildelt i henhold tilstandardmønsteret 4. Intensiteten af de enkelte bånd kan dog være meget varierende afhængigt af belastningen og forsøgsbetingelserne. Hvert bånd svarer til ét oversættelsesprodukt. Dataene (figur 1A) tyder på, at AIM23Δ-stammen er i stand til mitokondrieproteinsyntese, fordi alle produkter, der optræder i WT, er synlige i denne mutant. Intensiteten af båndene er imidlertid forskellig fra WT, hvilket betyder, at sletningen af AIM23 påvirker mitokondriegenekspression8. Coomassie Brilliant Blue farvning fungerer som en lastning kontrol.
De resulterende data kan kvantificeres (Figur 1B) for at identificere forskelle mellem stammer eller eksperimentelle tilstande ved hjælp af ImageJ10- eller ImageQuant-software. Til dette beregnes forholdet mellem det signal, der svarer til hvert produkt, og det samlede signal. Middelværdier og standardafvigelser beregnes i mindst tre uafhængige eksperimenter.
Kinetik af syntetiseret protein omsætning er undersøgt i en puls-chase eksperiment (Figur 1C). Prøverne udtages på de angivne tidspunkter, efter at mærkningsreaktionen er standset af kold methionin og puromycin i trin 2.4. Denne kontrol er nødvendig for at vurdere produkternes stabilitet, fordi signalets intensitet er et resultat af to modsatte processer: syntese af nye kæder og proteinforringelse. Immunostaining med anti-porin 1 antistoffer er en lastning kontrol.
Figur 1: Repræsentativ radioaktiv mærkning af gær mitokondrieoversættelsesprodukter. (A) Tidsforløb med 35S-methionininkorporering i mitokondriesyntetiserede proteiner i levende gærceller af WT- og AIM23Δ-stammer. Coomassie Brilliant Blue farvning er en lastning kontrol. (B) Niveauer af mitokondriekodede proteiner efter 5 minutters mærkning med 35S-methionin. Det relative udtryk normaliseres til det samlede udtryk for mitokondrially kodede proteingener. Fejllinjer angiver standardafvigelsen for gennemsnittet af mindst tre uafhængige eksperimenter. (C) Omsætningen af mitokondriesyntetiserede proteiner i vilde typer og Aim23Δ-stammer. Mærkningen blev stoppet, og prøverne blev indsamlet på de angivne tidspunkter. Immunostaining med anti-porin 1 antistof er en lastekontrol. (D) Suboptimalt forsøg med gammel 35S-methionin, radioautografi. Figur1A,B,C er tilpasset fra 8 med mindre ændringer. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Stamme | Genotype |
| Wt | Matα mal |
| AIM23Δ | MATα mal, AIM23::KanMX4 |
Tabel 1. Genotyper af S. cerevisiae stammer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelser af genekspression indtager en central rolle i moderne biovidenskab. Der er udviklet en lang række metoder, der giver indsigt i denne komplekse proces. Her beskrev vi den metode, der giver adgang til proteinbiosyntese i bagergær S. cerevisiae mitokondrier. Det er normalt anvendes til at sammenligne oversættelse effektivitetsgevinster af mRNA'er i mitokondrier af mutant gær stamme versus vilde type for at få adgang til konsekvenserne af den undersøgte mutation. Dette er et af de grundlæggende eksperimenter, som forskerne udfører, når de studerer mitokondriefunktionen af gærceller, der bærer mutationen, der foreslås at påvirke mitokondrier8,11,12,13. Det kombineres ofte med målinger af iltforbrugshastighed og mitokondriemembranpotentiale. De oplysninger, den giver, er imidlertid ikke tilstrækkelige til at skelne mellem, hvilket stadium af genekspression der påvirkes. Der kræves et sæt yderligere eksperimenter for at finde ud af det. For det første er nordlige blot eller RT-qPCR evaluering af mitokondrie mRNA er nødvendig for at vurdere transskriptionelle trin. For det andet bør der gøres en vestlig skamplet af totale proteinekstrakter med specifikke antistoffer for at vurdere proteinniveauet. For det tredje bør pulsen på mærket 35S-methionin (varm) fortsættes med tilsætning af umærket (kold) methionin (chase), og flere tidspunkter skal indsamles og analyseres på gelen for at undersøge proteinernes stabilitet.
Nøjagtig analyse af mitokondriegensudtryk ved hjælp af 35S pulsmærkning kræver kontrolreaktioner, især når forskeren mangler erfaringen med at håndtere det eller arbejder med en ny gærstamme eller en mutant. I disse tilfælde er god negativ kontrol en rho0 stamme blottet for mitokondrie DNA. Det viser effektiv cykloheximid hæmning af cytosolic oversættelse og bekræfter, at banding mønster er mitokondrie oversættelse specifikke. Hvis rho0-stammen ikke er tilgængelig, foreslår vi, at der inkluderes chloramphenicol sammen med cykloheximide for at hæmme al proteinsyntese for at bekræfte cykloheximideffektivitet og specificitet af båndmønsteret.
Den nærmeste ændring af protokollen er pulsjagten, når kulturen inkuberes i rysteren (trin 2.4) længere end foreslået i pulseksperimentet (Figur 1C). Det bruges til at studere omsætningen og stabiliteten af mitokondrieoversættelsesprodukter. Der er en anden ændring af metoden, når den radioaktive mærkning sker i organello, ikke in vivo4. Det antyder isolering af mitokondrier fra gærceller. Denne ændring er hurtigere, hvis frosne mitokondrier tidligere var på lager i aliquots. En anden fordel er fraværet af cycloheximide behandling, som påvirker forskellige aspekter af cellulær metabolisme. Isolation af mitokondrier og fryseoprydning kan imidlertid forstyrre oversættelseskomplekserne i organellerne, hvilket giver et kunstigt billede. En anden vigtig ændring af protokollen kan ske efter adskillelsen af mitokondrieoversættelsesprodukter i polyacrylamidgel (trin 5). I stedet for Coomassie Brilliant Blue farvning og tørring af gelen, kan proteinet overføres til nitrocellulosemembranen ved elektro-blotting. Dette resulterer i stærkere og skarpere signaler. Hovedårsagen er, at 35S henfalder ved emission af betapartikler med meget kort penetration, så signalet let screenes i denne tilgang. Elektroforatiske tilstande kan også ændres for at give bedre opløsning. Et punkt er at tilføje 6M urinstof i gelen, hvilket forbedrer adskillelsen af atp8 og atp914. En anden måde er at bruge gradient 15%-20% geler.
Translationel profilering15 er den metode, der bruges til at dykke dybere ned i ændringerne af mitokondrieoversættelse. Sammenlignet med radioaktiv mærkning giver det mulighed for at etablere positioner af mitokondrie ribosomer på mRNA, hvilket gør det muligt at finde det nøjagtige trin (indledning, forlængelse eller opsigelse), der påvirkes. Profilering er dog meget dyrere, kompliceret og tidskrævende. Rationelt kan det gøres efter etiketten inkorporering eksperiment, ikke omvendt. For nylig er der udviklet en ny tilgang til overvågning af gær mitokondrieoversættelse16. Det undgår behandling med cykloheximide, hvilket er fordelagtigt, fordi en sådan behandling påvirker cellulær metabolisme og signaleringsveje. I stedet for radioaktivt mærket aminosyre inkorporering, det udnytter indsættelsen af et omkodet gen til super-foldet GFP (sfGFP) i gær mitokondrie genom, som giver mulighed for direkte måling af mitokondrie oversættelse ved hjælp af flow cytometry. Anvendelsen af denne fremgangsmåde kræver imidlertid den særlige gærstamme med modificeret mitokondrie-DNA, der indeholder sfGFP-kodningssekvens placeret mellem 5'- og 3'- flankerende sekvenser af et bestemt mitokondriegen.
Eksperimentet med inkorporering af etiketter omfatter flere kritiske trin, som ikke kan kompromitteres i et vellykket eksperiment. For det første skal der anvendes friske gærkulturer (trin 1.1). At holde gær på pladerne længere end 1 måned anbefales ikke; ellers kan de opføre sig uforudsigeligt i denne analyse. For det andet skal cykloheximidopløsningen tilberedes frisk før forsøget og opbevares frosset ikke længere end 1 uge (trin 2.1). Den gamle opløsning mister sin evne til at hæmme cytoplasmisk oversættelse, hvilket resulterer i et helt afvigende båndmønster i radioautografien. For det tredje skal 35S-methionin være frisk og aktiv (trin 2.2), ellers vil intensiteten af båndene være svag (Figur 1D). Det anbefales ikke at bruge det reagens, der passerede fire halveringstider (4 x 87,4 dage). Proteinprøverne koges ved 95 °C, som det foreslås i standardprøverne til forberedelse (trin 4.8), fordi mitokondrieproteiner er meget hydrofobe og tilbøjelige til sammenlægning.
Der er flere almindelige problemer, man kan opleve beskæftiger sig med denne metode. Den første er den svage intensitet af båndene på radioautografien. For at ordne det skal du sørge for, at der anvendes frisk 35S-methionin, en tilstrækkelig mængde gærceller tages, og proteinerne samles ikke i lommerne på gelen, som kan kontrolleres af Coomassie farvning. Hold den tørrede gel med skærmen i ikke mindre end 3 dage. Det andet problem er det forkerte båndmønster. Hvis det er stødt på, skal du sørge for, at friske gærplader og frisklavet cykloheximid anvendes. Husk, at de relative intensiteter af båndene kan variere meget i forskellige gærstammer og elektroforeseforhold. Det giver ikke megen mening at indlæse proteinmolekylevægtstigen på gelen, da mitokondrieoversættelsesprodukter aldrig adskilles i henhold til deres molekylære masser i denne procedure, fordi de er meget hydrofobe. Således migrerer Cox I (58 kDa) hurtigere end Var 1 (47 kDa). Afhængigt af bufferbetingelserne kan proteinerne endda skifte positioner med en af naboerne. Det tredje almindelige problem er det slørede billede uden skarpe bånd observeret efter Coomassie farvning. Det indikerer fejlene i støbningen af gelen, forkert buffersammensætning eller nedbrydning af proteiner i prøverne. Det anbefales at forberede nye gelbuffere og løbebuffere, der omhyggeligt kontrollerer sammensætningen og pH-værdierne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af den russiske Foundation for Basic Research, tilskud nummer 18-29-07002. P.K. blev støttet af statsopgaven for Den Russiske Føderations ministerium for videnskab og videregående uddannelse, tilskudsnummer AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. blev støttet af Den Russiske Føderations ministerium for videnskab og videregående uddannelse, tilskudsnummer 075-15-2019-1659 (Program of Kurchatov Center of Genome Research). Arbejdet blev delvist udført på det udstyr, der blev købt inden for rammerne af Moskva State University Program of Development. I.C., S.L., og M.V.B. blev desuden støttet af Moskva State University tilskud "Leading Scientific School Noah's Ark".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al.
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
