Summary
جينوم الخباز للخميرة الميتوكوندريا يرمز ثمانية من البوليبتيدات. الهدف من البروتوكول الحالي هو تسمية كل منهم وتصورها بعد ذلك كشرائط منفصلة.
Abstract
الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية من الخلايا eukaryotic قادرة على التنفس الهوائية. أنها تحتوي على الجينوم الدائري وأجهزة التعبير الجيني. جينوم الميتوكوندريا من خميرة الخباز يرمز ثمانية بروتينات: ثلاث وحدات فرعية من السيتوكروم سي أوكسيداز (Cox1p، Cox2p، و Cox3p)، ثلاث وحدات فرعية من سينثاز ATP (Atp6p، Atp8p، و Atp9p)، وهي وحدة فرعية من ubiquinol-cytochrome ج إنزيم oxidoreductase، السيتوكروم ب (سيتوب)، والبروتين الريبوزوم الميتوكوندريا Var1p. الغرض من الطريقة المذكورة هنا هو تسمية هذه البروتينات على وجه التحديد مع 35S methionine، وفصلها عن طريق الكهرباء وتصور الإشارات كشرائط منفصلة على الشاشة. يتضمن الإجراء عدة خطوات. أولاً، يتم استزراع خلايا الخميرة في وسط يحتوي على الغالاكتوز حتى تصل إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتأخرة. بعد ذلك ، يمنع علاج cycloheximide الترجمة السيتوبلاسميك ويسمح بإدراج 35S methionine فقط في منتجات الترجمة الميتوكوندريا. ثم يتم استخراج جميع البروتينات من خلايا الخميرة وفصلها بواسطة مادة الجل البولي أكرريلاميد الكهربائي. وأخيرا، يتم تجفيف هلام ومحتضنة مع شاشة الفوسفور التخزين. يتم مسح الشاشة على صورة فوسفورية تكشف عن العصابات. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لمقارنة معدل التركيب الحيوي لبوليبتيد واحد في الميتوكوندريا من سلالة الخميرة متحولة مقابل نوع البرية، وهو أمر مفيد لدراسة عيوب التعبير الجيني الميتوكوندريا. هذا البروتوكول يعطي معلومات قيمة حول معدل الترجمة لجميع mRNAs mRNS mitochondrial الخميرة. ومع ذلك، فإنه يتطلب العديد من الضوابط والتجارب الإضافية لجعل الاستنتاجات السليمة.
Introduction
الميتوكوندريا هي العضيات المشاركة بعمق في عملية التمثيل الغذائي لخلايا النوى. وتزود سلسلة نقل الإلكترونات الخلية باستخدام ATP، وهي العملة النشطة الرئيسية المستخدمة في مسارات كيميائية حيوية متعددة. الى جانب ذلك ، فهي تشارك في موت الخلايا المبرمج ، والأحماض الدهنية والتوليف الهيم ، وغيرها من العمليات. الخلل في الميتوكوندريا هو مصدر معروف للمرض البشري1. يمكن أن تنتج عن الطفرات في الجينات النووية أو الميتوكوندريا ترميز المكونات الهيكلية أو التنظيمية من العضيات2. خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae هو كائن حي نموذجي ممتاز لدراسة التعبير الجيني الميتوكوندريا لأسباب عدة. أولاً، يتم تسلسل الجينوم الخاص بهم بالكامل3، مشروح بشكل جيد ، وهناك مجموعة كبيرة من البيانات متوفرة بالفعل في الأدب بفضل التاريخ الطويل من التحقيقات التي أجريت مع هذا الكائن الحي. ثانياً، التلاعب بجينومهم النووي سريع نسبياً وسهل بسبب معدل نموها السريع ونظام إعادة التركيب المتماثل عالي الكفاءة. ثالثاً، خميرة بيكر S. cerevisiae هي واحدة من الكائنات الحية القليلة التي يتم تطوير التلاعب مع الجينوم الميتوكوندريا. وأخيرا ، خميرة بيكر هو كائن حي أيروب anaerobe الكليات ، والذي يسمح العزلة ودراسة المسوخ المعيبة في الجهاز التنفسي ، لأنها يمكن أن تنمو في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصادر الكربون القابلة للتخمير.
ونحن وصف طريقة لدراسة التعبير الجيني الميتوكوندريا من خميرة بيكر S. cerevisiae في المستوى الترجمي4. ويأتي مبدأها الرئيسي من عدة ملاحظات. أولا ، فإن الجينوم الميتوكوندريا الخميرة ترميز ثمانية فقط من البروتينات : ثلاث وحدات فرعية من cytochrome c oxidase (Cox1p ، Cox2p، و Cox3p)، ثلاث وحدات فرعية من سينثاز ATP (Atp6p، Atp8p، و Atp9p)، وهي وحدة فرعية من ubiquinol-cytochrome ج oxidoreductase انزيم، السيتوكروم ب (سيتوب)، والبروتين الريبوسومي الميتوكوندريا Var1p5. هذا العدد صغير، ويمكن فصل كل منهم بواسطة الكهرباء على هلام واحد في الظروف المناسبة. ثانيا، ينتمي الريبوسومات الميتوكوندريا إلى الطبقة prokaryotic بدلا من6eukaryotic ، وبالتالي ، فإن حساسية للمضادات الحيوية تختلف عن الريبوسومات السيتوبلازمية والخميرة الميتوكوندريا. فهو يسمح بتثبيط الترجمة السيتوبلاسميكية مع السيكلوهيكسيميIDE، وتوفير الظروف عندما يتم دمج الأحماض الأمينية المسماة(35S-methionine) فقط في منتجات الترجمة الميتوكوندريا. ونتيجة لذلك، تعطي التجربة معلومات حول معدل دمج الأحماض الأمينية في بروتينات الميتوكوندريا التي تم تصنيعها في دي نوفو، مما يعكس الكفاءة الكلية لترجمة الميتوكوندريا لكل منتج من المنتجات الثمانية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الخميرة إعداد الثقافة
- خميرة متتالية من الثقافات المجمدة على لوحات جديدة مع المتوسطة المناسبة. وضع لوحات في حاضنة الثقافة في 30 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة.
ملاحظة: دع المسوخ الحساسة لدرجة الحرارة تنمو في درجة الحرارة المتساهلة. - تلقيح الثقافات الخميرة في 2 مل من YPGal المتوسطة (2٪ peptone، 1٪ استخراج الخميرة، 2٪ galactose) من سلسلة جديدة في أنابيب 15 مل واحتضان لهم بين عشية وضحاها التحريض عند 200 دورة في الدقيقة في 30 درجة مئوية.
- قياس الكثافة البصرية للثقافة في طول موجة من 600 نانومتر (OD600).
- تأخذ حجم المقابلة لوحدات امتصاص 0.2 في أنابيب معقمة، بيليه خلايا الخميرة في 9،000 س ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة، والتخلص من عظمى.
- غسل الخلايا مع 0.5 مل من الماء المعقم من خلال دوامة لمدة 5 s. بيليه خلايا الخميرة في 9000 س ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة والتخلص من افرا. تضعف الخلايا في 2 مل من YPGal المتوسطة الطازجة.
- احتضان التحريض عند 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية حتى يصل OD600 إلى 1.5-1.9 قيم.
ملاحظة: تختلف معدلات نمو الخميرة، لذلك تكون على استعداد للانتظار. من المعقول أن تتخذ الخطوات 1.3-1.6 في الصباح الباكر. وعادة ما يستغرق 4-5 ح، ولكن يمكن أن يستغرق وقتا أطول.
2 - إدماج النظائر المشعة
- نقل حجم الثقافة المكافئ لوحدة بصرية واحدة في أنبوب microcentrifuge. تدور الأنابيب في 3000 س ز لمدة 1 دقيقة وتجاهل افرا. غسل مع 0.5 مل من الماء المعقم من خلال دوامة لمدة 5 s.
- بيليه خلايا الخميرة في 9000 س ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة والتخلص من افرا. Resuspend خلايا الخميرة في 0.5 مل من العازلة الترجمة العقيمة. ضع التعليق في أنبوب 15 مل.
ملاحظة: العازلة الترجمة هو حل يحتوي على 2٪ جالاكتوز (ث / الخامس) و 50 mM فوسفات البوتاسيوم مع 6.0 pH.
- بيليه خلايا الخميرة في 9000 س ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة والتخلص من افرا. Resuspend خلايا الخميرة في 0.5 مل من العازلة الترجمة العقيمة. ضع التعليق في أنبوب 15 مل.
- إضافة cycloheximide إلى تعليق الخلية تصل إلى تركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل. احتضان لمدة 5 دقائق التحريض في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية لمنع الترجمة السيتوسوليك.
ملاحظة: يجب إعداد محلول Cycloheximide (20 ملغ/مل، في الإيثانول) طازجة قبل التجربة. يمكن استبدال الكلورامفينيكول بنجاح مع أنيسومايسين في نفس التركيز7. - إضافة 25-30 μCi من 35S-methionine إلى تعليق الخلية واحتضان لمدة 30 دقيقة تهيج في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام خليط من 35S-methionine و 35S-السيستين. 35النقي S-methionine النتائج في أقوى إشارة وأفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء. عموما, الميثيونين هو أكثر فعالية من السيستين لأن محتوى هذه الأحماض الأمينية في البروتينات الميتوكوندريا هو أعلى. ومع ذلك ، فإن مزيج EasyTag من 35S-methionine والسيستيين أقل تكلفة ويعطي نتائج قابلة للمقارنة7.
تنبيه: 35S-الميثيونين مشع. اتباع ممارسات السلامة المعتادة للتعامل مع المواد المشعة.
ملاحظة: من المعروف أن دمج النشاط الإشعاعي يصل إلى حد يرجع إلى أن إجمالي الإشارات يكون على مستوى الزمن. وبمجرد بلوغ هذا الحد، يكاد يكون من المستحيل تحديد المعدلات التي يتم بها تصنيع منتجات الترجمة المختلفة. لتحليل معدل الترجمة الميتوكوندريا، من الضروري أن تكون في حالة تزيد فيها كثافة الإشارة مع وقت الحضانة مع 35S-methionine بطريقة خطية. بالنسبة للسلالات البرية الشائعة من النوع المختبري ، فإن الإشارة مشبعة بالفعل في أوقات الحضانة أقصر بكثير من 30 دقيقة. يمكن أن تتصرف المتحولين الترجمية بشكل مختلف جدا. وينبغي أن يتم تنفيذ دورة زمنية لتحديد حركية دمج النشاط الإشعاعي وبالتالي معدل الترجمة ، على الأقل عند العمل مع سلالة جديدة. لهذا، نقترح أخذ عينات مع فاصل زمني من عدة دقائق (على سبيل المثال، 2.5، 5.0، 7،5، 10، و 20 دقيقة). - إضافة unlabeled "الباردة" الميثيونين (يجب أن يكون التركيز النهائي 20 mM) وpuromycine (يجب أن يكون التركيز النهائي 1-10 ميكروغرام / مل) لوقف وضع العلامات. احتضان لمدة 10 دقيقة تهيج في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لإعطاء الريبوسومات الوقت لإنهاء ترجمة الببتيدات. وإلا، سيتم الكشف عن جميع بوليبيبتيدات أقصر من كامل طول حجم مختلف. يمكن إجراء تجربة في الوقت (نبض مطاردة) في هذه الخطوة لتحديد استقرار منتجات الترجمة الميتوكوندريا. لهذا، مواصلة الحضانة أخذ عينات مع فاصل زمني من 30 دقيقة (على سبيل المثال، 30، 60، 90، و 120 دقيقة).
3. الخميرة خلية تحلل واستخراج البروتينات
- جمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي في 9000 س ز لمدة 30 s. اغسل الخلايا بـ 0.5 مل من الماء المعقم عن طريق الدوامة لمدة 5 ق. بيليه خلايا الخميرة في 9000 س ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المُندفع.
ملاحظه. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا. تخزين العينات في -20 درجة مئوية. - إضافة 75 ميكرولتر من عازلة التحلل إلى بيليه ودوامة لمدة 5-10 s.
ملاحظة: Lysis العازلة هو حل من 1.8 M NaOH، 1 M β-mercaptoethanol، و 1 mM PMSF في الماء. تجنب الحضانة المفرطة مع عازلة التحلل مما يؤدي إلى التحليل المائي القلوية من البروتينات. مباشرة إلى الخطوة 3.3. - أضف 500 ميكرولتر من 0.5 M تريس-HCl العازلة مع 6.8 pH. دوامة لفترة وجيزة.
4- هطول البروتينات
تنبيه: الميثانول والكلوروفورم مذيبات عضوية. اتبع ممارسات السلامة المعتادة للتعامل مع المواد العضوية.
- إضافة 600 ميكرولتر من الميثانول إلى العينة. دوامة لمدة 5 s.
- إضافة 150 μL من الكلوروفورم إلى العينة. دوامة لمدة 5 s.
- أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 2 دقيقة في 12،000 س ز. تجاهل بعناية المرحلة العليا مع العينات.
- إضافة 600 ميكرولتر من الميثانول إلى العينة. تخلط بعناية عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات.
- أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 2 دقيقة في 12،000 س ز. تجاهل المُندفع.
- الهواء الجافة بيليه لمدة 2 دقيقة في 80 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب أن يتبخر كل السائل. هناك خطر أن يكون فصل شاذ من البروتينات في الجل إذا كان بيليه جفت بشكل غير كاف. ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن الإفراط في تجفيف بيليه، لذلك يمكن تخزينها حتى بين عشية وضحاها في 4 °C. - تذوب البروتينات المترسبة في 60 ميكرولتر من 1x Laemmli عينة العازلة.
- سخني لمدة 10 دقائق عند 40 درجة مئوية.
ملاحظة: تجنب غلي العينات عند 95 درجة مئوية، لأن هذا يسبب التجميع. إذا كانت المجاميع لا تزال تشكل، تدور العينات في 12،000 س ز لمدة 2 دقيقة وجمع افرا. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا.
5. SDS-PAGE
- يلقي 17.5٪ Laemmli SDS-polyacrylamide هلام.
ملاحظة: 6 م اليوريا يمكن أن تضاف إلى هلام لحل أفضل atp8 و atp9. يمكن للتدرج 15٪ – 20٪ من المواد الهلامية أيضًا إعطاء دقة أفضل. - قم بتحميل 15 ميكرولتر (40-50 ميكروغرام) من كل عينة في الجيوب.
ملاحظة: ليس من الضروري قياس تركيز البروتين إذا كانت قيم OD600 قريبة في الخطوة 1.6. إذا لم يكن كذلك، قم بقياس تركيزات البروتين باستخدام المقايسة مع الكواشف المتوافقة مع المنظفات. - تشغيل الجل في غرفة باردة حتى تصل الصبغة الزرقاء إلى ما يقرب من 65٪ من طول الجل.
ملاحظة: بالنسبة للنظام المستخدم (على سبيل المثال، خلية Protean II xi)، نستخدم أي من الوضعين: 16-17 ساعة عند 5 V/cm أو 5 ساعات عند 15 V/cm. لا توجد بروتينات تعمل بشكل أسرع من الصبغة الزرقاء البروموفينول، ولكن يمكن أن يؤدي الأشواط الطويلة إلى عدم وضوح إشارات atp8 و atp9. - وصمة عار هلام مع Coomassie الأزرق الرائعة وجعل المسح الضوئي أو الصورة، وهو أمر مطلوب كتحكم التحميل.
ملاحظة: هناك طريقة بديلة لإجراء التحكم في التحميل هي مناعة الجسم المضاد إلى جين "حفظ المنزل" الميتوكوندريا، على سبيل المثال، البورين 1.
6. التصوير الآلي
- جفف الجل في مجفف هلام. احتفظ به في الكاسيت مع شاشة فوسفور تخزين لمدة 3-5 أيام.
ملاحظة: بديل لفحص الجل المجفف هو نقل البروتينات إلى غشاء نيتروسيلولوز عن طريق النشاف الكهربائي وفحصه بعد ذلك. وهو يؤدي إلى إشارات أقوى ونطاقات أكثر حدة. - مسح الشاشة على الفوسفور إيمامر.
ملاحظة: كبديل للتصوير الفوسفوري، يمكن أيضاً استخدام فيلم الأشعة السينية للكشف عن الإشارات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد البروتوكول المذكور أعلاه، قمنا بتعيين منتجات الترجمة الميتوكوندريا من اثنين من سلالات S. cerevisiae: النوع البرية (WT) وحذف تحمل متحولة من الجين AIM23 (AIM23Δ، ترميز عامل بدء الترجمة الميتوكوندريال 3 (الجدول 1)8. وقد تم تصنيف منتجات الترجمة الميتوكوندريا إشعاعيا وفصلت في SDS-PAAG9. تم جمع العينات كل 2.5 دقيقة قبل التشبع لبناء دورة زمنية (الشكل 1A). وكان الجل ملطخة، المجففة، وفحصها بعد المعرض لمدة 5 أيام (الشكل 1A).
في حالة نجاح التجربة، توضح الصورة ثمانية نطاقات تم تعيينها وفقًا للنمط القياسي4. ومع ذلك، يمكن أن تكون كثافة النطاقات الفردية متغيرة للغاية اعتمادا على الإجهاد والظروف التجريبية. ويتوافق كل نطاق مع منتج ترجمة واحد. وتشير البيانات (الشكل 1A)إلى أن سلالة AIM23Δ قادرة على تخليق البروتين الميتوكوندريا لأن جميع المنتجات التي تظهر في WT مرئية في هذا المتحول. ومع ذلك ، فإن شدة النطاقات تختلف عن WT ، مما يعني أن حذف AIM23 يؤثر على التعبير الجيني الميتوكوندريا8. Coomassie الأزرق الرائعة تلطيخ بمثابة عنصر تحكم التحميل.
يمكن قياس البيانات الناتجة عن ذلك(الشكل 1B) لتحديد الاختلافات بين السلالات أو الظروف التجريبية باستخدام برنامج ImageJ10 أو ImageQuant. لهذا، يتم حساب نسب الإشارة المقابلة لكل منتج إلى إجمالي الإشارة. يتم حساب القيم الوسطية والانحرافات المعيارية في ثلاث تجارب مستقلة على الأقل.
تتم دراسة حركيات دوران البروتين المركب في تجربة مطاردة النبض(الشكل 1C). يتم جمع العينات في نقاط الوقت المشار إليها بعد توقف رد فعل وضع العلامات بواسطة الميثيونين البارد والبوريوميسين في الخطوة 2.4. هذا التحكم ضروريّة أن يقدّم الاستقرار من المنتوجات لأنّ الكثافة من الإشارة نتيجة من اثنان عمليات مضادّة: تركيب من سلاسل جديدة وبروتين تدهور. المناعة مع الأجسام المضادة للبورين 1 هو عنصر تحكم في التحميل.
الشكل 1: تسمية مشعة تمثيلية لمنتجات ترجمة الميتوكوندريا الخميرة. (أ)دورة زمنية من 35S-الميثيونين في البروتينات المركبة الميتوكوندريا في خلايا الخميرة الحية من WT و AIM23 Δ السلالات. Coomassie الأزرق الرائعة تلطيخ هو عنصر تحكم التحميل. (ب)مستويات البروتينات المشفرة الميتوكوندريا بعد 5 دقائق وضع العلامات مع 35S-methionine. يتم تطبيع التعبير النسبي إلى التعبير الكلي للجينات البروتينية المشفرة الميتوكوندريا. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري للوسط لثلاث تجارب مستقلة على الأقل. (C) دوران البروتينات توليفها الميتوكوندريا في نوع البرية وسلالات Aim23 Δ. وقد توقف وضع العلامات وتم جمع العينات في النقاط الزمنية المشار إليها. الكبت بالمناعة مع الأجسام المضادة للبورين 1 هو عنصر تحكم في التحميل. (د)دون الأمثل تجربة مع القديم 35S-الميثيونين، التصوير الإشعاعي. الشكل 1A،B، C يتم تكييفها من8 مع تعديلات طفيفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| وتر | الجيني |
| WT | MATα مال |
| AIM23Δ | MATα mal, AIM23::KanMX4 |
الجدول 1- الانبعاثات 1000 الأنماط الجينية لسلالات S. cerevisiae
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحتل تحقيقات التعبير الجيني جزءاً مركزياً في علوم الحياة الحديثة. وقد تم تطوير العديد من الأساليب التي توفر رؤى في هذه العملية المعقدة. هنا، وصفنا الطريقة التي تسمح للوصول إلى البروتين في التركيب الحيوي خميرة بيكر S. cerevisiae الميتوكوندريا. وعادة ما يتم تطبيقه لمقارنة كفاءة الترجمة من mRNAs في الميتوكوندريا من سلالة الخميرة متحولة مقابل نوع البرية للوصول إلى عواقب الطفرة درس. هذه هي واحدة من التجارب الأساسية التي يجريها الباحثون عند دراسة وظيفة الميتوكوندريا لخلايا الخميرة التي تحمل طفرة اقترح للتأثير على الميتوكوندريا8,11,12,13. وغالبا ما يتم الجمع بين ذلك مع قياسات معدل استهلاك الأكسجين وإمكانية غشاء الميتوكوندريا. ومع ذلك، فإن المعلومات التي تقدمها لا تكفي للتمييز بين مرحلة التعبير الجيني المتأثر. مطلوب مجموعة من التجارب الإضافية للعثور عليه. أولاً، من الضروري تقييم اللطخة الشمالية أو تقييم RT-qPCR للملازمات المتقدرة لتقييم الخطوة النسخية. ثانياً، ينبغي القيام بلطخة غربية من إجمالي مستخلصات البروتين مع أجسام مضادة محددة لتقييم مستوى البروتين. ثالثا، ينبغي أن يستمر نبض المسمى 35S-methionine (الساخنة) مع إضافة الميثيونين (الباردة) غير المسمى (مطاردة) وينبغي جمع عدة نقاط زمنية وتحليلها على هلام للتحقيق في استقرار البروتينات.
التحليل الدقيق للتعبير الجيني الميتوكوندريا باستخدام 35نبض S التسمية يتطلب ردود فعل السيطرة، وخصوصا عندما يفتقر الباحث تجربة التعامل معها أو يعمل مع سلالة الخميرة الجديدة أو متحولة. في هذه الحالات، السيطرة السلبية الجيدة هي سلالة rho0 خالية من الحمض النووي الميتوكوندريا. وهو يظهر تثبيط فعال cytosolic السيكولية ويؤكد أن نمط النطاقات هو ترجمة الميتوكوندريا محددة. إذا لم تتوفر سلالة rho0، ثم نقترح بما في ذلك الكلورامفينيكول جنبا إلى جنب مع cycloheximide لتثبيط جميع تخليق البروتين لتأكيد كفاءة السيكلوهيكسيميد وخصوصية نمط النطاقات.
أقرب تعديل للبروتوكول هو مطاردة النبض عندما يتم احتضان الثقافة في شاكر (الخطوة 2.4) أطول مما اقترح في تجربة النبض(الشكل 1C). يتم استخدامه لدراسة دوران واستقرار منتجات الترجمة الميتوكوندريا. هناك تعديل آخر من الأسلوب عندما يتم وضع العلامات المشعة في organello، وليس في vivo4. وهو يشير إلى عزل الميتوكوندريا عن خلايا الخميرة. هذا التعديل هو أسرع إذا تم تخزين الميتوكوندريا المجمدة سابقا في aliquots. ميزة أخرى هي عدم وجود علاج السيكلوهيكسيميميد, الذي يؤثر على جوانب مختلفة من التمثيل الغذائي الخلوي. ومع ذلك ، فإن عزل الميتوكوندريا وتجميد ذوبانها يمكن أن يؤدي إلى إزعاج مجمعات الترجمة في العضيات التي توفر صورة اصطناعية. ويمكن إجراء تعديل هام آخر للبروتوكول بعد فصل منتجات الترجمة الميتوكوندريا في هلام البولي أكريلاميد (الخطوة 5). بدلا من Coomassie الأزرق الرائعة تلطيخ وتجفيف هلام، يمكن نقل البروتين إلى غشاء نيتروسيلولوز عن طريق النشاف الكهربائية. وهذا يؤدي إلى إشارات أقوى وأكثر حدة. والسبب الرئيسي هو أن 35S تسوس عن طريق انبعاث جسيمات بيتا مع اختراق قصيرة جدا، وبالتالي يتم فحص إشارة بسهولة في هذا النهج. يمكن أيضا تعديل الظروف الكهربائية لتوفير دقة أفضل. نقطة واحدة هي إضافة 6M اليوريا في هلام، مما يحسن فصل atp8 و atp914. وهناك طريقة أخرى هي استخدام التدرج 15٪ -20٪ هلام.
التنميط الانتقالي15 هو الأسلوب المستخدم للغوص بشكل أعمق في تعديلات ترجمة الميتوكوندريا. بالمقارنة مع وضع العلامات المشعة، فإنه يسمح بتحديد مواقع الريبوسوم الميتوكوندريا على مرنا، مما يجعل من الممكن العثور على الخطوة الدقيقة (بدء، أو اطالة، أو إنهاء) التي تتأثر. ومع ذلك، التنميط هو أكثر تكلفة وتعقيداً وتستغرق وقتاً طويلاً. يمكن أن يتم ذلك بعقلانية بعد تجربة تأسيس التسمية ، وليس العكس. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت نهج جديد لرصد ترجمة الميتوكوندريا الخميرة16. أنه يتجنب العلاج مع cycloheximide، وهو أمر مفيد لأن هذا العلاج يؤثر على التمثيل الغذائي الخلوي ومسارات الإشارات. بدلا من إدراج الأحماض الأمينية المسمى بالإشعاع، فإنه يستخدم إدراج جين recoded لGFP فائقة مطوية (sfGFP) في الجينوم الميتوكوندريا الخميرة، والذي يسمح القياس المباشر للترجمة الميتوكوندريا باستخدام عملية استئصال النفايات. ومع ذلك ، فإن تطبيق هذا النهج يتطلب سلالة الخميرة الخاصة مع الحمض النووي الميتوكوندريا المعدلة التي تحتوي على تسلسل ترميز sfGFP وضعت بين 5 '- و 3'- تحيط تسلسل من جين ميتوكوندريا معينة.
تتضمن تجربة تأسيس التسمية عدة خطوات حاسمة لا يمكن المساس بها في تجربة ناجحة. أولاً، ينبغي استخدام ثقافات الخميرة الطازجة (الخطوة 1-1). حفظ الخمائر على لوحات أطول من 1 شهر لا ينصح؛ خلاف ذلك، فإنها يمكن أن تتصرف بشكل لا يمكن التنبؤ بها في هذا الفحص. ثانياً، يجب إعداد حل cycloheximide الطازجة قبل التجربة وتخزينها المجمدة لا يزيد عن 1 أسبوع (الخطوة 2.1). الحل القديم يفقد قدرته على منع الترجمة السيتوبلازمية مما أدى إلى نمط الفرقة منحرف تماما في التصوير الإشعاعي. ثالثًا، يجب أن يكون 35S-methionine جديدًا ونشطًا (الخطوة 2.2)، وإلا فإن كثافة النطاقات ستكون ضعيفة(الشكل 1D). لا ينصح باستخدام الكاشف الذي مر أربعة أنصاف عمر (4 × 87.4 يوم). تجنب غلي عينات البروتين عند 95 درجة مئوية كما تشير أدلة إعداد العينات القياسية (الخطوة 4.8) لأن بروتينات الميتوكوندريا شديدة الحساسية وعرضة للتجميع.
هناك العديد من القضايا الشائعة يمكن للمرء أن يواجه التعامل مع هذا الأسلوب. الأول هو شدة ضعيفة من العصابات على التصوير الإشعاعي. لإصلاحه تأكد، أن يتم استخدام 35S-methionine الطازجة، يتم أخذ كمية كافية من خلايا الخميرة، والبروتينات لا تجميعها في جيوب على هلام، والتي يمكن السيطرة عليها من قبل تلطيخ Coomassie. احتفظ بالهلام المجفف مع الشاشة لمدة لا تقل عن 3 أيام. المشكلة الثانية هي نمط الشريط غير صحيح. إذا واجهت، تأكد من أن يتم استخدام لوحات الخميرة الطازجة والسيكلوهيكسيميد الطازجة. نضع في اعتبارنا أن شدة النسبية من العصابات يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا في سلالات الخميرة المختلفة وظروف الكهرباء. فمن المنطقي تحميل سلم الوزن الجزيئي البروتين على هلام منذ يتم فصل منتجات الترجمة الميتوكوندريا أبدا وفقا الكتل الجزيئية في هذا الإجراء لأنها هي الماء. وهكذا، كوكس الأول (58 كيلو Da) يهاجر أسرع من فار 1 (47 كيلو Da). اعتمادا على الظروف العازلة، يمكن للبروتينات حتى تبديل المواقف مع أحد الجيران. القضية الثالثة المشتركة هي الصورة غير الواضحة مع عدم وجود عصابات حادة لوحظت بعد تلطيخ كوماسي. فإنه يشير إلى الأخطاء في صب الجل، وتكوين العازلة غير صحيحة، أو تدهور البروتينات في العينات. من المستحسن إعداد مخازن هلام جديدة وتشغيل المخزن المؤقت بعناية التحقق من التكوين والقيمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الروسية للبحوث الأساسية، منحة رقم 18-29-07002. وكان دعم P.K. من قبل الدولة تكليف وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي، منحة رقم AAAA-A16-116021660073-5. تم دعم M.V.P. من قبل وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي، منحة رقم 075-15-2019-1659 (برنامج مركز كورشاتوف لبحوث الجينوم). وقد تم العمل جزئيا على المعدات التي تم شراؤها في إطار برنامج جامعة موسكو الحكومية للتنمية. I.C، S.L. و M.V.B بالإضافة إلى ذلك تم دعمها من قبل جامعة موسكو الحكومية منحة "المدرسة العلمية الرائدة سفينة نوح".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al.
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
