Summary
贝克的酵母线粒体基因组编码了八种多肽。当前协议的目标是将所有这些都标记为单独的频段，然后将其可视化为单独的频段。
Abstract
线粒体是能够有氧呼吸的真核细胞的基本细胞。它们含有圆形基因组和基因表达装置。面包师酵母的线粒体基因组编码八种蛋白质：细胞色素c氧化酶的三个亚单位（Cox1p， 考克斯2p和考克斯3p），ATP合成酶（Atp6p、Atp8p和Atp9p）的三个子单位，是紫基酚-细胞色素c氧化酶、细胞色素b（细胞色素b）和线粒体核糖体蛋白Var1p的子单位。这里描述的方法的目的是用 35S甲氨酸专门标记这些蛋白质，通过电磷分离它们，并将信号可视化为屏幕上的离散带。该过程涉及几个步骤。首先，酵母细胞在含角质的介质中培养，直到它们到达晚期对数生长阶段。其次，环素酰胺治疗阻断细胞质转化，仅允许 35S甲基氨酸在线粒体翻译产品中结合。然后，所有蛋白质都从酵母细胞中提取，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。最后，凝胶干燥并与存储磷屏幕一起孵育。屏幕扫描在荧光仪上，显示带子。该方法可用于比较突变酵母菌株线粒体中单个多肽的生物合成率与野生菌型，这有助于研究线粒体基因表达缺陷。此协议提供了有关所有酵母线粒体 mRNA 翻译速率的宝贵信息。然而，它需要几个控制和额外的实验，以作出适当的结论。
Introduction
线粒体是深陷真核细胞代谢的细胞器。他们的电子传输链为细胞提供ATP，ATP是用于多种生化途径的主要能量货币。此外，他们参与凋亡，脂肪酸和血红素合成，和其他过程。线粒体功能障碍是人类疾病的著名来源。它可以是由于核基因或线粒体基因的突变，编码细胞器2的结构或调节成分。贝克的酵母 糖精 是研究线粒体基因表达的一个很好的模型有机体，原因有几个。首先，他们的基因组被完全测序3，有很好的注释，由于与这种生物体进行的长期调查历史，大量的数据已经在文献中可用。其次，由于其快速的生长速度和高效的同源重组系统，其核基因组的处理相对快速和容易。第三，面包师的酵母 S.脑膜 是少数利用线粒体基因组进行操作的生物之一。最后，面包师的酵母是一种气样-厌食性有机体，它允许分离和研究呼吸缺陷突变体，因为它们可以在含有可发酵碳源的介质中生长。
我们描述了研究面包师酵母 S.cerevisiae 的线粒体基因表达的方法在转化水平4。它的主要原则来自几个观察。首先，酵母线粒体基因组只编码八种蛋白质：细胞色素c氧化酶的三个亚单位（Cox1p， 考克斯2p和Cox3p），ATP合成酶（Atp6p、Atp8p和Atp9p）的三个子单位，ubiquinol-细胞色素c氧化酶、细胞色素b（细胞）和线粒体核糖体蛋白Var1p5的子单位。这个数字很小，在适当条件下，所有凝胶上的电光可以分离。其次，线粒体核糖体属于原核糖体类，而不是真核生物6，因此，酵母细胞质和线粒体核糖体对抗生素的敏感性不同。它允许用环氧化物抑制细胞质转化，为标记的氨基酸（35S-甲基氨酸）仅在线粒体转化产品中结合提供条件。因此，该实验提供了有关线粒体蛋白中氨基酸的吸收率的信息，反映了八种产品中线粒体转化的整体效率。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 酵母文化准备
- 用适当的介质在新鲜盘子上冷冻库存培养物上的条纹酵母。将盘子放入30°C的文化孵化器中，24-48小时。
注意：让对温度敏感的突变体在允许的温度下生长。 - 接种酵母培养物在2 mL的YPGal介质（2%的肽，1%酵母提取物，2%的辣椒素）从新鲜条纹在15 mL管，并孵育他们过夜搅拌在200 rpm在30°C。
- 以 600 nm （OD 600） 的波长测量培养的光学密度。
- 以无菌管中对应0.2吸收单元的体积为例，在室温下以9，000 x g的 颗粒酵母细胞，在室温下丢弃超纳坦。
- 用0.5 mL的无菌水清洗细胞，通过漩涡5s。颗粒酵母细胞在室温下在9，000 x g 30s，并丢弃超纳坦。稀释细胞在2 mL的新鲜YPGal介质。
- 在 OD 600 达到 1.5-1.9 值之前，在 200 rpm 和30 °C 下孵化搅拌。
注意：酵母的增长率各不相同，所以请准备好等待。在清晨采取1.3-1.6步骤是合理的。它通常需要4-5小时，但可能需要更长的时间。
2. 放射性同位素结合
- 传输相当于微中心管中的一个光学单元的培养量。以 3，000 x g 旋转 管子 1 分钟，然后丢弃超纳坦。用 0.5 mL 的无菌水洗净， 漩涡 5 s 。
- 颗粒酵母细胞在室温下在9，000 x g 30s，并丢弃超纳坦。在0.5 mL的无菌翻译缓冲中重新悬念酵母细胞。将悬架放置在 15 mL 管中。
注：翻译缓冲区是一种含有2%辣椒酸（w/v）和50 mM磷酸钾的溶液，pH 6.0。
- 颗粒酵母细胞在室温下在9，000 x g 30s，并丢弃超纳坦。在0.5 mL的无菌翻译缓冲中重新悬念酵母细胞。将悬架放置在 15 mL 管中。
- 将环氧化物添加到细胞悬浮物中，最终浓度为 0.2 毫克/mL。在 200 rpm 和 30 °C 下孵化 5 分钟搅拌，以抑制细胞自体翻译。
注：环氧化物溶液（乙醇中20毫克/mL）应在实验前新鲜制备。氯霉素可以成功地用同浓度7的异霉素替代。 - 在细胞悬浮液中加入35 S-甲氨酸的 25-30微分，在200转/分和30°C下孵育30分钟搅拌。
注：35S-甲基氨酸和35S-半胱氨酸的混合物也可用于。纯35S-甲氨酸导致最强的信号和最好的信号噪声比。一般来说，甲基氨酸比西斯泰因更有效，因为线粒体蛋白中这种氨基酸的含量更高。然而，35S-甲基氨酸和半胱氨酸的EasyTag混合物更便宜，并给出可比的结果7。
警告 ：35S-甲氨酸是放射性的。遵循处理放射性物质的通常安全做法。
注：众所周知，放射性的结合达到了一个极限，因此总信号会随着时间而趋于平止。一旦达到此限制，几乎不可能确定合成不同翻译产品的速率。要分析线粒体转换速率，必须处于信号强度随 35S-甲氨酸的潜伏时间而增加的条件下。对于常见的实验室野生型菌株，信号已经饱和，潜伏时间远短于30分钟。转化突变体的行为可能非常不同。应执行时间过程，以确定放射性结合的动能，从而确定翻译速率，至少在处理新菌株时是这样。为此，我们建议每隔几分钟采集样本（例如，2.5、5.0、7、5、10 和 20 分钟）。 - 添加未标记的"冷"甲基氨酸（最终浓度应为20mM）和紫杉醇（最终浓度应为1-10μg/mL）以阻止标签。在 200 rpm 和 30 °C 下孵化 10 分钟搅拌。
注意：这一步骤对于给核糖体时间完成多肽的翻译至关重要。否则，所有短于全长的多肽都将以不同的尺寸被检测到。在此步骤中可以进行时间过程实验（脉冲追逐），以确定线粒体翻译产品的稳定性。为此，继续以30分钟（例如，30、60、90和120分钟）的间隔采集样品。
3. 酵母细胞裂解和蛋白质提取
- 以9，000 x g 的离心收集酵母细胞，30s。用0.5 mL的无菌水清洗细胞，旋涡5s。在室温下，30s 的颗粒酵母细胞在 9，000 x g。 丢弃超纳坦。
注意。协议可在此处暂停。将样品存放在-20°C。 - 将 75μL 的裂解缓冲器添加到颗粒和漩涡中，达到 5-10 s。
注：裂解缓冲液是1.8 M NaOH、1M β甲醇和1米PMSF在水中的溶液。避免过度孵化与裂解缓冲，导致碱性水解的蛋白质。立即进入步骤 3.3。 - 添加 500μL 的 0.5 M 特里斯-HCl 缓冲区，带 pH 6.8。漩涡短暂。
4. 蛋白质沉淀
注意：甲醇和氯仿是有机溶剂。遵循处理有机物质的通常安全做法。
- 在样品中加入600μL的甲醇。漩涡为5s。
- 向样品中添加 150μL 的氯仿。漩涡为5s。
- 在12，000 x g时将样品离心2分钟。使用取样器小心地丢弃上部。
- 在样品中加入600μL的甲醇。通过多次倒置管子仔细混合。
- 在12，000 x g时将样品离心2分钟。丢弃超纳坦。
- 在 80 °C 下将颗粒空气干燥 2 分钟。
注意：所有的液体都应该蒸发。如果颗粒干燥不足，凝胶中蛋白质有异常分离的风险。但是，不可能将颗粒过度干燥，因此它甚至可以在 4 °C 下存放过夜。 - 溶解沉淀蛋白在60μL的1x莱姆利样品缓冲区。
- 在40°C下加热10分钟。
注意：避免在95°C下煮沸样品，因为这会导致聚合。如果聚合仍然形成，在 12，000 x g 下旋转样品 2 分钟，并收集超纳坦。样品可储存在-20°C。 协议可在此处暂停。
5. SDS页
- 铸造17.5%莱姆利SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
注：6 M尿素可以添加到凝胶中，以解决更好的atp8和atp9。梯度 15%-20% 凝胶也可以给出更好的分辨率。 - 在口袋中加载每个样品的 15 μL （40-50μg）。
注：如果OD600值在第1.6 步接近，则无需测量蛋白质浓度。如果没有，使用与洗涤剂兼容的试剂进行检测来测量蛋白质浓度。 - 在寒冷的房间里运行凝胶，直到蓝色染料达到凝胶长度的大约 65%。
注：对于所使用的系统（例如 Protean II xi 单元），我们使用两种模式中的任何一种：5 V/cm 时的 16-17 小时或 15 V/cm 的 5 小时。没有蛋白质比溴酚蓝色染料跑得快，但长跑会导致 atp8 和 atp9 信号模糊。 - 用库马西明亮的蓝色染色凝胶，并做扫描或照片，这是作为加载控制所必需的。
注：进行装载控制的另一种方法是用抗体对线粒体"保管"基因进行免疫，例如，孔1。
6. 自传
- 将凝胶干燥机干燥。将其保存在带存储磷屏幕的盒式磁带中 3-5 天。
注：筛选干凝胶的替代方案是通过电污迹将蛋白质转移到硝基纤维素膜，然后进行筛选。它产生更强的信号和更清晰的波段。 - 扫描荧光片上的屏幕。
注：作为磷成像的替代品，X射线膜也可用于显示信号。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
按照上述协议，我们从两个 S. Cerevisiae 菌株中分配线粒体翻译产品：野生类型（WT）和 AIM23 基因的突变轴承删除（AIM23Δ），编码线粒体翻译启动因子 3 （表 1）8.线粒体翻译产品在SDS-PAAG9中被放射性标记和分离。样本在饱和前每2.5分钟收集一次，以建立一个时间过程（图1A）。凝胶在为期5天的展览（图1A）后被染色、干燥和筛选。
在实验成功的情况下，图片展示了根据标准模式4分配的8个波段。然而，根据应变和实验条件，单个频段的强度可能变化很大。每个波段对应一个翻译产品。数据（图1A）表明 ，AIM23Δ 菌株能够线粒体蛋白合成，因为WT中出现的所有产品都可见于这种突变体中。然而，波段的强度与WT不同，这意味着 AIM23 的删除会影响线粒体基因表达8。库马西辉煌的蓝色染色作为负载控制。
由此产生的数据可以量化 （图1B），使用 ImageJ10 或 ImageQuant 软件识别菌株或实验条件之间的差异。为此，计算了与每个产品对应的信号与总信号的比率。平均值和标准偏差至少在三个独立实验中计算。
合成蛋白周转的动能在脉冲追逐实验（图1C）中研究。样品在标签反应被冷甲基氨酸和紫杉酸在第2.4步停止后，在指示的时间点收集。这种控制对于估计产品的稳定性是必要的，因为信号的强度是两个相反过程的结果：新链的合成和蛋白质降解。用抗孔1抗体免疫是一种加载控制。
图1：酵母线粒体翻译产品的代表性放射性标签。（A） 在WT和AIM23Δ菌株的活酵母细胞中加入线粒体合成蛋白的35个S-甲基氨酸的时间过程。库马西辉煌的蓝色染色是一个负载控制。（B） 线粒体编码蛋白水平，5分钟后用35S-甲基氨酸标记。相对表达与线粒体编码蛋白质基因的总表达正常化。错误条表示至少三个独立实验的平均值的标准偏差。（C） 野生类型线粒体合成蛋白的周转量和Aim23Δ菌株。标签被停止，样品在指示的时间点收集。用抗孔素1抗体免疫是一种加载控制。（D） 对旧的35S-甲基氨酸、放射性成像术进行次优实验。图1A，B，C改编自8，稍作修改。请点击这里查看此数字的较大版本。
| 应变 | 基因型 |
| 瓦特 | 马塔马尔 |
| AIM23Δ | 马特马尔， AIM23：： 坎姆X4 |
表 1. S. 塞雷维西亚 菌株的基因型
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
基因表达研究在现代生命科学中占有核心地位。已开发出许多方法，为这一复杂的过程提供见解。在这里，我们描述了允许在面包师酵母S.脑线粒体中获取蛋白质生物合成的方法。它通常用于比较突变酵母菌株线粒体中的mRNA的翻译效率与野生类型，以获得研究突变的后果。这是研究人员在研究带有突变的酵母细胞线粒体功能时进行的基本实验之一，该细胞被建议影响线粒体8、11、12、13。它通常与氧气消耗率和线粒体膜潜力的测量相结合。然而，它提供的信息不足以区分基因表达的哪个阶段受到影响。需要一组额外的实验来找出它。首先，对线粒体 mRNA 的北部污点或 RT-qPCR 评估对于评估转录步骤是必要的。其次，应使用具有特定抗体的蛋白质提取物的西层污点来评估蛋白质水平。第三，应继续添加未标记的（冷）甲基氨酸（追逐），并在凝胶上收集和分析几个时间点，以研究蛋白质的稳定性。
使用 35S 脉冲标记准确分析线粒体基因表达需要控制反应，尤其是当研究人员缺乏处理它的经验或与新的酵母菌株或突变体一起工作时。在这些情况下，良好的负控制是一种没有线粒体DNA的 rho0 菌株。它显示了细胞素翻译的有效环氧酰胺抑制，并确认带状模式是线粒体翻译特定的。如果 rho0 菌株不可用，那么我们建议包括氯霉素以及环氧化物，以抑制所有蛋白质合成，以确认环氧化物的效率和带状模式的特异性。
协议最接近的修改是当培养在摇床（步骤 2.4） 中孵化的时间比脉冲实验中建议的要长时脉冲追逐（图 1C）。用于研究线粒体翻译产品的周转率和稳定性。当放射性标记在有机体中完成时，而不是在体内4中，对方法进行了另一次修改。它建议线粒体与酵母细胞分离。这种修改是更快，如果冷冻线粒体以前储存在阿利库特。另一个优点是缺乏环氧化物治疗，这会影响细胞代谢的不同方面。然而，线粒体的分离和冷冻，可以干扰提供人工图像的细胞器中的翻译复合物。在聚丙烯酰胺凝胶中分离线粒体翻译产品（第 5 步）后，可对协议进行另一项重要修改。而不是库马西辉煌的蓝色染色和干燥凝胶，蛋白质可以通过电污染转移到硝基纤维素膜。这会导致更强、更清晰的信号。主要原因是 35S 通过极短的渗透测试版粒子的发射而衰变，因此在此方法中很容易筛选信号。电光条件也可以修改，以提供更好的分辨率。一点是在凝胶中加入6M尿素，这改善了atp8和atp914的分离。另一种方法是使用梯度15%-20%凝胶。
翻译剖析15 是用于深入探讨线粒体翻译变化的方法。与放射性标签相比，它允许在mRNA上建立线粒体核糖体的位置，从而有可能找到受影响的确切步骤（启动、拉长或终止）。然而，剖析要昂贵、复杂和耗时得多。从理性上讲，它可以在标签注册实验后完成，而不是相反。最近，一种监测酵母线粒体翻译的新方法已开发出16种。它避免使用环氧化物治疗，这是有利的，因为这种治疗影响细胞代谢和信号通路。它利用重新编码的基因插入酵母线粒体基因组中，而不是放射性标记的氨基酸，从而能够使用流细胞学直接测量线粒体翻译。然而，这种方法的应用需要特殊的酵母菌株与修改线粒体DNA包含sfGFP编码序列之间放置在5'-和3'侧翼序列之间的某种线粒体基因。
标签注册实验包括几个关键步骤，在成功的实验中不能妥协。首先，应使用新鲜酵母培养物（步骤 1.1）。不建议在盘子上保留酵母超过1个月：否则，他们可以在这个分析中表现得不可预知。其次，循环氧化物溶液应在实验前新鲜准备，并储存冷冻不超过1周（步骤2.1）。旧溶液失去抑制细胞质转换的能力，导致无线电摄影中完全反常的带状模式。第三 ，35S-甲氨酸应是新鲜和活跃的（步骤2.2），否则，波段的强度将较弱（图1D）。不建议使用通过四个半寿命（4 x 87.4 天）的试剂。避免在95°C下煮沸蛋白质样品，因为线粒体蛋白具有高度的疏水性，容易聚集。
有几个共同的问题，你可以体验到处理这种方法。第一个是无线电摄影带的弱强度。为了修复它，确保使用新鲜的 35S-蛋氨酸，采取足够的酵母细胞，蛋白质不聚合在凝胶的口袋里，这可以通过库马西染色控制。将干燥的凝胶与屏幕保持不少于3天。第二个问题是不正确的波段模式。如果遇到这种情况，请确保使用新鲜酵母板和新鲜制备的环氧化物。请记住，带的相对强度在不同的酵母菌株和电磷化条件下可能有很大的不同。将蛋白质分子量阶梯装载在凝胶上毫无意义，因为线粒体转化产品在此过程中从未根据分子质量分离，因为它们具有高度的疏水性。因此，考克斯一号（58千达）的迁移速度比Var 1（47kDa）快。根据缓冲条件，蛋白质甚至可以与一个邻居切换位置。第三个常见问题是模糊的画面，在库马西染色后没有观察到锋利的带子。它表示凝胶铸造中的错误、不正确的缓冲成分或样品中蛋白质的降解。建议准备新的凝胶缓冲器和运行缓冲区仔细检查成分和pH值。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由俄罗斯基础研究基金会资助，赠款编号为18-29-07002。P.K.得到俄罗斯联邦科学和高等教育部国家分配的支持，赠款编号为AAAA-A16-116021660073-5。M.V.P.得到俄罗斯联邦科学和高等教育部的支持，赠款编号为075-15-2019-1659（库尔恰托夫基因组研究中心方案）。这项工作部分是在莫斯科国立大学发展方案框架下购买的设备上完成的。I.C、S.L.和M.V..B还得到了莫斯科国立大学授予的"诺亚方舟领先科学学校"的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al.
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
